Passos na análise de cristais de proteínas por difração de raios-x. Cristalização de Proteinas

Cristalização de Proteinas

Glaucius Oliva

Instituto de Física de São Carlos - USP

Centro de Biotecnologia Molecular Estrutural - CEPID/FAPESP

Passos na análise de cristais de

proteínas por difração de raios-X

• Cristalização

• Coleta de dados de difração de raios-X

• Resolução do problema das fases

 Substituição isomórfica múltipla  Substituição molecular

 MAD

• Interpretação dos mapas de densidade

eletrônica

• Refinamento da Estrutura

Obtaining adequate protein single crystals is the major bottleneck in the process of elucidating a new structure.

Adequate crystals means: • highly ordered

• diffraction to high resolution • suitable size (~0.1mm or less)

Fatos históricos

Friedrich Ludwig Hünefeld

“I have occasionally seen in almost dried blood…  rectangular crystalline structures which under the  microscope had sharp edges and were bright red.”

(1840 – foi o 1º relator de um cristal proteico) John H. Northrop James B. Sumner Wendell M. Stanley

Cristalização proteica: Nobel em 1946 1a. Est. Crist. Biomolecular (B12; 1957): Nobel em 1964 Max Perutz John Kendrew Nobel em 1962. Hemoglobina/Mioglobina 122 anos! Princípios da Cristalização de Proteínas: 1. Proteína pura e homogênea 2. Solubilidade proteica e precipitação

• Contatos hidrofóbicos; salting in e salting out 3. Supersaturação

• Nucleação

4. Crescimento do cristal 5. Qualidade cristalina

• padrão de difração e limite de resolução

Obtenção de Proteinas para

Cristalização

• Obtenção de proteínas solúveis, puras (“grau

cristalização”) e na quantidade necessária

(tipicamente multiplos de miligramas) é o 

gargalo inicial mais crítico para um projeto de 

cristalização de proteinas

• Purificação direta da fonte natural

• Expressão heteróloga recombinante

Produção heteróloga de proteínas ‐ O que é?

Por que é importante produzir proteínas heterólogas? Proteína Pura e Homogênea Fontes mais comuns de heterogeneidade • Contaminadas por DNA ou proteínas não relacionadas • Oxidação das cisteínas • Modificações pós‐traducionais • Estados de oligomerização • Isoformas • População de moléculas mal enoveladas • Flexibilidade estrutural

Temperatura de expressão

77 kDa 50 kDa 98 kDa

Escolha do organismo

Outras proteínas de fusão

Dicas de manipulação de proteínas para

_{cristalização}

• Mantenha‐a pura (> 90‐95% em PAGE) e concentrada (> 10 mg/ml) • Seja gentil com sua proteína:

– Evite a formação de espuma

– Manter em gelo durante o trabalho com ela e armazená‐la  corretamente, evitando ciclos de congelamento / 

descongelamento – Filtro

– Caracterize a pureza, homogeneidade e estabilidade da proteína por PAGE, DLS e / ou MS

– Evite a liofilização

– Evitar o uso de precipitação com sulfato de amônio como etapa final de purificação

Protein

crystal

growth

from

solution:

nucleation



growth

Mas o que significa cristalização? É um fenômeno de transição de fase! Proteína sai da solução para uma fase cristalina, através  da indução de supersaturação (depende da solubilidade  da proteína). Como? • Adição de agente precipitante (batch) • Remoção de água (difusão de vapor) • Troca de solvente (diálise) • Difusão livre por uma interface • Mudança de pH • Combinaçao Remover água da camada de solvatação Diagrama de Fase para a Solubilidade

Parâmetros que afetam solubilidade proteica

• pH

• Temperatura

• Força iônica

• Solventes orgânicos

• Polímeros orgânicos

Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns  parâmetros ‐ pH Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns  parâmetros ‐ pH

Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns  parâmetros ‐ Temperatura • Temperature manipulates solubility and supersaturation of the sample – normal solubility: in low ionic strength solubility increases with  temperature – retrograde solubility: in high ionic strength solubility decreases with  temperature • It is convenient to set up trials at different temperatures, e.g. 4°C and  room temperature (RT) • RT must be as controlled as possible.  • Attention to temperature changes during plate viewing!. In temperatures  other than RT, minimize condensation.

Variables to force supersaturation: 

Temperature

Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns  parâmetros ‐ Sais Forca ionica = Log(S) = β – K_s(I) Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns  parâmetros – Polímeros Orgânicos (PEGs)

Log(S) = β – K_sc_PEG • Não existe pegging in_{• Competição pelas} 

Nucleação e Crescimento A colisão entre moléculas podem induzir  a formação de agregados cristalinos Dis tância (Å) supersaturação Ta manho médio  d a agr eg aç ão Nucleação  crítica Metaestável  zona de nucleação Crescimento cooperativo  Separação (centro) Separação média Diâmetro molecular médio de 40 Å A formação de uma massa crítica que  permita o crescimento cristalino Concentração de lisozima (mg/mL) O processo de cristalização procede em duas fases:  Nucleação e Crescimento Termodinâmica da Cristalização Métodos de Cristalização Difusão de vapor: gota sentada [ppt]gota= [ppt]reservatório 2 A concentração no reservatório  mantem‐se praticamente a mesma [ppt]gota= [ppt]reservatório Reservatório Reservatório O equilíbrio acontece com a difusão de vapor O volume da gota diminui, aumentando a concentração  de ambos precipitante e proteína Gota contém: proteína + sol. reservatório +  aditivos + ligantes + etc...  Reservatório contém: agente precipitante +  solução tamponante + aditivos, etc... Proteína + sol. reservatório: normalmente  1:1, 2:1 e 1:2 § § Exceção para os precipitantes voláteis Ao final do processo (na gota): a) Aumento na [ppt] b) Aumento na [proteína] Energia de ativação para vencer a  barreira da nucleação

Equilíbrio da solução Na maioria das vezes é um processo rápido  horas dias (3 a 5) Independente do precipitante, o processo inicia‐se rapidamente  e desacelera de acordo com a diferença de concentração de  precipitante entre a gota e o reservatório  O equilíbrio é dependente da temperatura Tempo (horas) % equilíbr io Dados experimentais + 4˚C ∆ 25˚C Adaptado de Fowlis et al 1988.  J. Cryst. Growth 90:117. O equilíbrio cessa no momento em que a pressão  osmótica das duas soluções se igualam Diagrama de Cristalização para Difusão de  Vapor Diagrama de Cristalização para Difusão de 

Vapor

Crystallization strategies: how to

_{optimize crystallization trials}

•Sparse Matrix (“random”)

Biased samplings of crystallization parameters selected from literature

•Grid Screens

One or two parameters systematically varied

•Incomplete factorials

all parameters varied

simultaneously and randomly statistically balanced

Exemplo do espaço 3D de Cristalização Matriz Esparsa

• Condições de cristalização são baseadas em um número limitado  de soluções e agentes precipitantes (screens), escolhidos de acordo  relatos científicos de sucesso na cristalização de macromoléculas • Muitos diferentes tipos de screens são disponíveis no mercado • Os screens cobrem uma vasta gama de soluções tamponantes, pH, 

aditibos e agentes precipitantes 

• Nota: screenis do tipo “matrizes esparsas” envolvem uma 

aleatoriedade intencional no tocante às possíveis combinações de  condições que funcionaram anteriormente

JBScreen Family JBScreen Classic  The JBScreen Classic Kits 1‐10 cover 240 (10 kits x 24 conditions each) of the most prominent conditions for protein  crystallization. Their compositions result from mining of literature data of several thousands of crystallized proteins.  JBScreen represents the selected statistically most successful buffers that yielded protein crystals suitable for X‐ray  diffraction. BScreen Basic  Based on the classic sparse matrix crystallization screen published first by Jancarik and Kim in 1991, it contains 96 unique  reagent mixtures for screening a wide range of pH and various salts and precipitants.  JBScreen Membrane  The optimized screen for hydrophobic and membrane proteins JBScreen Kinase  A highly effective crystallization screen based on data analyses of published kinase structures JBScreen Nuc‐Pro  A highly effective sparse matrix screen based upon extensive screening of the PDB, with focus on entries by structural  genomic initiatives, the BMCD and other protocols. JBScreen PEG/Salt  Efficient screening of PEG 3350 and PEG 5000 MME versus 48 different salts JBScreen Pentaerythritol

A systematic crystallization screen based on pentaerythritol polymers as precipitants developed by Ulrike Demmer from  the Max‐Planck‐Institute for Biophysics in Frankfurt.

JBScreen PACT ++ 

Systematic screen for pH, anion, cation testing in the presence of polyehtylene glycol

JBScreen JCSG ++  Optimized sparse matrix screen developed by the Joint Center for Structural Genomics (JCSG) Pi‐Screens  Developed at the MRC Cambridge ‐ Crystallization Screens for soluble and integral membrane proteins based on Pi  sampling strategy JBScreen Wizard  A highly effective random sparse matrix screen for crystallizing proteins, peptides, nucleic acids and macromolecular  complexes Otimização da Condição de Cristalização hit hit Sal contra  PEG screen Sal contra  PEG  screen pH contra  PEG  screen pH contra  PEG  screen

Materiais usados em cristalização de Proteínas mosquito HoneyBee Cristalização em  larga escala Cristalização  manual + ALGUNS EXEMPLOS DE CRISTAIS DE PROTEÍNAS: