UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
Isabel Werle
ESTUDO DO EFEITO ANSIOLÍTICO E ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D EM CAMUNDONGOS
Florianópolis 2021
Isabel Werle
ESTUDO DO EFEITO ANSIOLÍTICO E ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D EM CAMUNDONGOS
Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em Farmácia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para obtenção do título de Farmacêutica.
Orientador: Prof. Dra. Ana Lúcia Severo Rodrigues Coorientador: Dra. Morgana Moretti
Florianópolis 2021
Isabel Werle
ESTUDO DO EFEITO ANSIOLÍTICO E ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D EM CAMUNDONGOS
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Farmacêutica” e aprovado em sua foma final pelo Curso de Farmácia
Florianópolis, 11 de maio de 2021.
________________________ Profª Drª Mareni Rocha Farias
Coordenadora do Curso
Banca Examinadora:
________________________ Profª Drª Ana Lúcia Severo Rodrigues
Orientadora
________________________ Profª Drª Dirleise Colle
Avaliadora
________________________ Profª Drª Priscila Batista da Rosa
Este trabalho é dedicado à minha avó, Adelita (in memoriam) e a todos que buscam melhorar o mundo através da ciência.
AGRADECIMENTOS
Iniciando pelo começo do caminho, agradeço à minha família. Aos meus pais, Ari e Iria, os quais sempre tiveram como prioridade garantir que seus filhos pudessem estudar, apesar da distância e saudade; que ensinaram empatia, bondade e honestidade. Ariel, obrigada por me mostrar o caminho e seguir grande parte dele ao meu lado; por todos os cafés, risotos, cervejas e abraços; por ser amigo além de irmão. Aos meus tios Aline e Lorival, os professores que admiro desde criança, que sempre estiveram comigo e são grandes exemplos. Ao Victor Hugo, obrigada por me fazer querer ser exemplo. Falta vocabulário para expressar o quanto amo vocês.
Obrigada à Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), por todas as oportunidades que oferece, não apenas a mim, mas a sociedade como um todo, proporcionando acesso igualitário à educação de qualidade. Além do conhecimento científico e técnico excelente que obtive, agradeço também pelo crescimento pessoal e experiências vividas aqui, por ensinar resiliência e tornar-se casa.
A todos meus queridos professores, que não são apenas fontes de conhecimento, mas de inspiração, obrigada por não medirem esforços para ensinar e pela construção do pensamento crítico. Levo parte de cada um de vocês comigo, com muito carinho. Aproveito para agradecer especialmente aos professores Dirleise, Priscila e Leandro, que aceitaram contribuir avaliando este trabalho.
Agradeço à Profª Ana Lúcia, orientadora deste trabalho, por me proporcionar a oportunidade de ingressar no encantador mundo da pesquisa, acolhendo-me no Laboratório de Neurobiologia da Depressão (LANED) ainda no começo da graduação; ensinando com muita paciência, amor e dedicação, ela tornou-se essencial para meu crescimento e formação. Também agradeço imensamente à querida Morgana, coorientadora deste trabalho, pelos anos como orientadora de iniciação científica, repletos de ensinamentos tanto no âmbito da pesquisa quanto para a vida. Foi uma honra poder conviver com pesquisadoras de tamanha excelência. Obrigada à todos os pesquisadores do LANED pelos anos de convivência, em especial à Priscila, Vivian e Yasmim, pelas alegrias e conquistas compartilhadas, amparo e carinho, aprendizado, risadas, experimentos e cafés. Agradeço pela amizade construída no LANED, que excedeu a bancada e será levada para a vida.
Aos meus amigos, com os quais partilhei a vida e que sempre foram porto seguro, meu enorme carinho e gratidão. Agradeço principalmente aos que tanto ouviram sobre este trabalho e estiveram ao meu lado (mesmo que fisicamente distantes): Anna, Bruna, Daniela, Giovana, João, Júlia, Marília e Yasmim, amo vocês. Minerva, obrigada pelos ronronares ansiolíticos e companhia.
Por fim, gostaria de agradecer o Centro de Ciências da Saúde e seu corpo técnico, em especial à Rosalba, por todo acolhimento; agradeço o Departamento de Bioquímica do Centro de Ciências Biológicas, onde desenvolvemos os experimentos aqui apresentados. Ainda, pelo suporte, muito obrigada ao CNPq, LAMEB e Biorender.
There was only one species on the planet more intelligent than dolphins, and they spent a lot of their time in behavioral research laboratories running round inside wheels and conducting frighteningly elegant and subtle experiments on man. The fact that once again man completely misinterpreted this relationship was entirely according to these creature’s plans. (ADAMS, 1979)
RESUMO
A depressão e ansiedade são transtornos psiquiátricos que acometem milhões de pessoas no mundo, acarretando sintomas negativos que reduzem a qualidade de vida dos indivíduos afetados. A etiologia destes transtornos ainda não está totalmente elucidada, mas evidências crescentes suportam que há envolvimento do sistema serotonérgico. Existe um amplo arsenal terapêutico para tratamento destes transtornos e muitos dos fármacos atuam sobre o sistema serotonérgico, porém, a demora na remissão dos sintomas e os efeitos adversos consideráveis causados por estes fármacos diminuem a adesão dos pacientes ao tratamento. Assim, a busca por compostos com atividade antidepressiva/ansiolítica e o desenvolvimento de novas terapias clinicamente eficazes é de extrema importância. Neste contexto, a vitamina D tem se mostrado promissora, parecendo possuir atividades relacionadas a melhora nos quadros de depressão e ansiedade, porém, ainda existem poucos estudos explorando esta vitamina. Através do presente trabalho, pretende-se caracterizar os efeitos ansiolíticos e antidepressivos da vitamina D3, além de investigar a participação do sistema serotonérgico nestes efeitos. Aqui, observamos efeito tipo-antidepressivo no teste de suspensão pela cauda decorrente do tratamento repetido por 7 dias com vitamina D (100 UI/Kg) por via oral em camundongos Swiss fêmeas. Ainda, fornecemos evidência de que este efeito envolve o sistema serotonérgico, uma vez que o tratamento dos camundongos com o inibidor da síntese de serotonina p-clorofenilalanina metil éster (PCPA; 100 mg/Kg por 4 dias) aboliu o efeito do tipo-antidepressivo da vitamina D (100 UI/Kg). Por outro lado, o tratamento com diferentes doses desta vitamina (100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg, p.o., por 7 dias) não produziu efeito tipo-ansiolítico nos camundongos submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado. Estudos futuros serão necessários para melhor compreender o efeito da vitamina D nestes transtornos psiquiátricos.
ABSTRACT
Depression and anxiety are psychiatric disorders that affect millions of people around the world, causing negative symptoms that reduce the quality of life of those affected. The etiology of these disorders is not yet fully elucidated, but growing evidence supports the involvement of the serotonergic system. There is a broad therapeutic arsenal for the treatment of these disorders and many of the drugs act on the serotonergic system, but the delay in the remission of symptoms and the considerable adverse effects caused by these drugs decrease the adherence of patients to treatment. Thus, the search for compounds with antidepressant/anxiety activity and the development of new clinically effective therapies is of extreme importance. In this context, Vitamin D has shown to be a promising compound, since it has activities related to the improvement of depression and anxiety, but there are still few studies exploring this nutraceutical. In this study we aim to characterize the anxiolytic and antidepressant effects of Vitamin D3, in addition to investigate the participation of the serotonergic system in these effects. In the present study, we observed an antidepressant-like effect in the tail-suspension test following repeated 7-day treatment with oral Vitamin D (100 IU/Kg) in female Swiss mice. We further provide evidence that this effect involves the serotonergic system, since treatment of the mice with the serotonin synthesis inhibitor p-chlorophenylalanine methyl ester (PCPA; 100 mg/Kg for 4 days) abolished the antidepressant-like effect of vitamin D (100 IU/Kg). On the other hand, treatment with different doses of this vitamin (100 UI/Kg, 300 UI/Kg and 1000 UI/Kg, p.o., for 7 days) did not produce an anxiolytic-like effect in mice subjected to the elevated plus-maze test. Future studies will be needed to better understand the effect of Vitamin D on these psychiatric disorders.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Síntese da Vitamina D a partir do 7-deidrocolesterol 19 Figura 2 - Possíveis mecanismos envolvidos no efeito da Vitamina D sobre a regulação
do humor 23
Figura 3 - Mecanismo de ação dos Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina 27
Figura 4 - Mecanismo de ação dos Benzodiazepínicos 28
Figura 5 - Mecanismo de ação do PCPA 29
Figura 6 - Teste de Suspensão pela Cauda (TSC) 31
Figura 7 - Teste do Campo Aberto (TCA) 32
Figura 8 - Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE) 32
Figura 9 - Curva dose resposta para investigação do efeito tipo-antidepressivo da vitamina D 34
Figura 10 - Avaliação do envolvimento do sistema serotonérgico no efeito tipo-antidepressivo da vitamina D 35
Figura 11- Curva dose resposta para investigação do efeito tipo-ansiolítico agudo da vitamina D 37
Figura 12 - Curva dose resposta para investigação do efeito tipo-ansiolítico repetido da Vitamina D 38
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-HT = 5-hidroxitriptamina ou serotonina 5-HIAA= ácido 5-hidroxiindolacético
DSM-5 = Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais E.P.M = Erro Padrão da Média
i.p.= Intraperitoneal
ISRS = Inibidor Seletivo da Recaptação de Serotonina LCE = Labirinto em Cruz Elevado
MAO = Monoamina Oxidase
PCPA = p-clorofenilalanina metil éster p.o.= Oral
TCA= Teste do Campo Aberto
TSC = Teste da Suspensão pela Cauda VDR = Receptor de Vitamina D
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
1.1 O PAPEL DO SISTEMA SEROTONÉRGICO NOS TRANSTORNOS PSIQUIÁTRICOS 16
1.2 O PAPEL DA VITAMINA D NA ANSIEDADE E NA DEPRESSÃO 18
2 JUSTIFICATIVA 24
3 OBJETIVOS 25
3.1 OBJETIVO GERAL 25
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 25
4 MATERIAL E MÉTODOS 26
4.1 ANIMAIS E CONDIÇÕES DE ALOJAMENTO 26
4.2 FÁRMACOS E TRATAMENTOS 26
4.3 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D 29
4.4 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA SEROTONÉRGICO NO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D 30
4.5 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANSIOLÍTICO DA VITAMINA D 30
4.6 TESTES COMPORTAMENTAIS PARA AVALIAÇÃO DE COMPORTAMENTOS RELACIONADOS À DEPRESSÃO E ANSIEDADE 30
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA 33
5 RESULTADOS 34
5.1 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D 34
5.2 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA SEROTONÉRGICO NO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D 34
5.3 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANSIOLÍTICO DA VITAMINA D ADMINISTRADA AGUDAMENTE 36 5.4 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO
TIPO-ANSIOLÍTICO DECORRENTE DA ADMINISTRAÇÃO REPETIDA DE
VITAMINA D 37
6 DISCUSSÃO 39
7 CONCLUSÃO 46
REFERÊNCIAS 47 APÊNDICE - Aprovação do Projeto de Pesquisa pela Comissão de Ética no Uso de
1 INTRODUÇÃO
Emoções são respostas transitórias a um estímulo específico no ambiente, no corpo ou na mente. Quando um estado emocional é prolongado e torna-se dominante ao longo do tempo, pode-se chamá-lo de humor (KANDEL, 2014).
A depressão é classificada como um transtorno de humor que afeta em torno de 350 milhões de pessoas, sendo considerada a primeira causa de incapacitação no mundo (WHO, 2017). A herdabilidade do transtorno depressivo maior é de cerca de 35% (OTTE et al., 2016). Estima-se que cerca de 17% da população mundial possa desenvolver depressão ao longo da vida (KIECOLT-GLASER E GLASER, 2002; KESSLER et al., 2012), sendo mais comum em mulheres (5,1% de prevalência anual) que em homens (3,6% de prevalência anual) (WHO, 2017). Este transtorno possui relação direta com uma série de comorbidades, sendo também uma das principais causas de morte relacionadas ao suicídio (COLLINS et al., 2011; ISOMETSA et al., 2014).
Caracterizada por uma desregulação das funções afetivas e motivacionais, a depressão tem como principais sintomas o humor deprimido e o comportamento anedônico, este último caracterizado pela diminuição da frequência e capacidade de sentir prazer em atividades antes consideradas prazerosas (WHO, 2017). Normalmente, essas alterações estão acompanhadas por outros sintomas variados, tais como: irritabilidade, tristeza, sentimento de culpa ou baixa autoestima, distúrbios do sono ou do apetite, sensação de cansaço, falta de concentração, disfunção cognitiva, alterações metabólicas, endócrinas e inflamatórias (NESTLER et al., 2002; OTTE et al., 2016).
O diagnóstico da depressão é baseado na sintomatologia clínica. Segundo o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-5), o diagnóstico deste transtorno requer a presença de pelo menos cinco sintomas acima listados, incluindo obrigatoriamente o humor deprimido ou anedonia durante um período de pelo menos duas semanas (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).
A ansiedade é considerada uma resposta habitual fisiológica do ser humano, que se manifesta perante diversos estímulos ambientais, fazendo parte do repertório normal das experiências diárias de qualquer indivíduo sadio, estando associada à tensão muscular, estado de alerta e preparação para potencial perigo futuro (SHIN e LIBERZON, 2010). Porém, quando a resposta a determinado estímulo é desproporcional à causa, persistindo por tempo excedente
ao que seria necessário e interferindo diretamente na qualidade de vida do indivíduo, pode ser considerada patológica (RANG et al., 2016).
Segundo o último relatório da Organização Mundial da Saúde realizado em 2017, estima-se que 3,6% da população mundial sofre do transtorno de ansiedade (prevalência anual), o que equivale a 264 milhões de pessoas afetadas. O mesmo relatório apontou a ansiedade como sendo a sexta maior causa de incapacitação na população mundial. A prevalência é maior nas Américas e, assim como na depressão, as mulheres são mais suscetíveis, possuindo risco duas vezes maior de desenvolver o transtorno, em comparação com os homens. Além disso, a ansiedade é considerada a sexta causa não fatal associada ao prejuízo da saúde (WHO, 2017). Segundo o DSM-5, os transtornos de ansiedade são classificados em: transtorno de ansiedade de separação; agorafobia; mutismo seletivo; fobia específica; transtorno de pânico; transtorno de ansiedade generalizada; transtorno de ansiedade induzido por substância/medicamento; transtorno de ansiedade social; transtorno de ansiedade devido a outra condição médica e transtorno de ansiedade não especificado (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).
O diagnóstico para esse transtorno, assim como na depressão, é realizado baseado na sintomatologia clínica dos pacientes, sendo que cada tipo de ansiedade possui características singulares. Os sintomas mais comuns que caracterizam este transtorno são a ansiedade excessiva, preocupação, angústia, agitação, sensação de aperto, náusea, exaustão, tremores, transpiração excessiva, dificuldade de concentração, irritabilidade e perturbação do sono (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).
A depressão e a ansiedade frequentemente apresentam-se como comorbidades; tal fato determina pior prognóstico. Por vezes, os sintomas destes transtornos podem transitar, variando entre características mais comuns da depressão ou da ansiedade. Até os dias atuais, o diagnóstico é baseado apenas na sintomatologia clínica, apesar da heterogeneidade dos sintomas (MEULEN et al., 2021).
A incorporação de biomarcadores aos atuais métodos de diagnóstico clínico poderiam auxiliar na classificação de transtornos de ansiedade e depressão, bem como na avaliação da resposta do paciente ao tratamento (HUMER; PIEH; PROBST, 2020). Na depressão, evidências crescentes sugerem que níveis plasmáticos de fatores neurotróficos (como por exemplo o BDNF) encontram-se diminuídos, enquanto níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias encontram-se aumentados em pacientes com depressão, sendo que o
tratamento antidepressivo é capaz de reverter ou normalizar estes efeitos (SCHMIDT et al., 2011). Marcadores pró-inflamatórios e níveis séricos de lipídeos parecem estar relacionados à ansiedade (ERJAVEC et al., 2021). Um estudo relatou baixos níveis de HDL no plasma de pacientes diagnosticados com ansiedade; níveis séricos mais altos de triglicerídeos foram observados em pacientes que apresentam ansiedade e depressão como comorbidades, em comparação com pacientes diagnosticados apenas com depressão (WANG et al., 2016). Apesar disso, ainda não existem marcadores com especificidade suficiente para serem considerados patognomônicos.
1.1 O PAPEL DO SISTEMA SEROTONÉRGICO NOS TRANSTORNOS PSIQUIÁTRICOS
A 5-hidroxitriptamina ou serotonina (5-HT) é um neurotransmissor sintetizado nos neurônios serotonérgicos do sistema nervoso central e nas células enterocromafins do trato gastrointestinal pela hidroxilação do aminoácido L-triptofano em 5-hidroxitriptofano que sofre ação da enzima descarboxilase dos L-aminoácidos aromáticos gerando 5-HT. A serotonina é catabolisada pela enzima monoamina oxidase (MAO). As funções mais conhecidas deste neurotransmissor incluem a capacidade de modular o humor, a atenção, o apetite, o sono e a cognição (BORROTO-ESCUELA et al., 2021). A nível sistêmico ela também desempenha ações importantes, como termorregulação, ativação da agregação plaquetária, contrações uterinas, broncoconstrição, vasoconstrição, motilidade gastrointestinal (BORROTO-ESCUELA et al., 2021) e modulação da resposta imune (MONDANELLI; VOLPI, 2021). Neste trabalho, a atuação dessa monoamina no sistema nervoso central será abordada com maior ênfase.
Com relação à etiologia dos transtornos de ansiedade e depressão, sabe-se que há relação genética e ambiental; a herdabilidade destes transtornos corresponde a 31% e 42%, respectivamente (SULLIVAN; NEALE; KENDLER, 2000), envolvendo diversos genes. A alteração que gera o polimorfismo Val66Met do gene do BDNF (uma neurotrofina envolvida na regulação da morte neuronal e plasticidade sináptica), parece estar relacionada ao comportamento tipo-ansioso em modelos animais (CHEN et al., 2006) e maior risco de desenvolvimento de depressão (HWANG et al., 2006; ERJAVEC et al., 2021). No que diz respeito ao sistema serotonérgico, existem polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no receptor 5HT-2A e transportador SLC6A4 que parecem estar envolvidos na resposta ao
tratamento antidepressivo e ansiolítico, além da modulação dos efeitos adversos (LIN e CHEN, 2008).
O desenvolvimento de transtornos de ansiedade e depressão também está associado a alterações em vias dopaminérgicas, serotonérgicas, GABAérgicas, glutamatérgicas, além de alterações do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) (BRAGA et al., 2010; ERJAVEC et al., 2021). O principal fator ambiental desencadeante destes transtornos é o estresse, incluindo estresse emocional decorrente de abuso na infância, além do gerado por problemas financeiros, exposição à violência, uso de drogas de abuso e ainda, doenças físicas (KESSLER, 1997; BERTON e NESTLER, 2006; LI et al., 2016; GOVINDARAJULU et al., 2021; ERJAVEC et al., 2021).
Na ansiedade, supõe-se que há uma diminuição dos níveis de serotonina, o que leva a alterações no sistema dopaminérgico, resultando no aumento da função desta monoamina e culminando com as manifestações dos sintomas de ansiedade, incluindo alerta e hipervigilância (MARGIS et al., 2003; BRAGA et al., 2010). Além disso, sabe-se que na ansiedade ocorre redução da função inibitória GABAérgica, associada ao aumento da transmissão excitatória glutamatérgica, associada a neurotoxicidade. Os benzodiazepínicos são fármacos ansiolíticos que atuam aumentando a transmissão GABAérgica, porém, o uso crônico desta classe medicamentosa está associado ao risco de desenvolvimento de tolerância, dependência e efeitos adversos como sedação. Assim, por vezes os antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) são empregados com sucesso no tratamento dos transtornos de ansiedade, comprovando o envolvimento do sistema serotonérgico neste transtorno (CASSEB et al., 2019).
A depressão, por sua vez, está intimamente relacionada com alterações nos sistemas monoaminérgicos, particularmente com os sistemas serotonérgico e noradrenérgico (WONG e LICINIO, 2001; OTTE et al., 2016). A hipótese monoaminérgica postula que a depressão resulta de uma deficiência de serotonina ou noradrenalina, ou ainda de receptores deficientes para estes neurotransmissores (SCHILDKRAUT, 1965; MANN et al., 1995). Níveis plasmáticos diminuídos de serotonina foram observados em pacientes com depressão (COPPEN e DOOGAN, 1988). Além disso, níveis reduzidos de ácido 5-hidroxiindolacético, um metabólito da serotonina, foram encontrados no líquor de pacientes com depressão (RICCI e WELLMEN, 1990). Muitos pacientes que utilizavam reserpina, um fármaco anti hipertensivo,
desenvolveram depressão devido ao efeito adverso causado por esse medicamento: a depleção de catecolaminas (WONG e LICINIO, 2001; GOVINDARAJULU et al., 2021).
A participação do sistema serotonérgico na etiologia da ansiedade e da depressão é sustentada principalmente pelo fato de que medicamentos que aumentam a concentração de serotonina na fenda sináptica por meio do bloqueio da sua recaptação (ISRS) promovem efeitos ansiolíticos e antidepressivos (BALDESSARINI, 1996; ERJAVEC et al., 2021).
1.2 O PAPEL DA VITAMINA D NA ANSIEDADE E NA DEPRESSÃO
Alguns micronutrientes estão envolvidos em vias metabólicas que afetam o desenvolvimento e função do sistema nervoso, estando associados ao estado de saúde mental. Os principais micronutrientes que parecem exercer ações benéficas em relação aos transtornos de depressão e ansiedade incluem vitaminas do complexo B (B12, B6 e ácido fólico), zinco, magnésio e vitamina D (KRIS-ETHERTON et al., 2020).
A vitamina D é um esteroide lipossolúvel que pode ser obtido através da dieta na forma de ergosterol (vitamina D2) e pelo consumo de alguns alimentos de origem animal na forma de colecalciferol (vitamina D3), bem como em suplementos alimentares. Contudo, a maior parte da vitamina D3 é produzida na pele a partir do 7-dehidrocolesterol mediante exposição aos raios UVB solares (HOSSEIN-NEZHAD e HOLICK, 2013). Uma vez produzida na pele ou ingerida, a vitamina D3 é hidroxilada no fígado pela enzima CYP2R1, gerando 25-hidroxivitamina D e sequencialmente nos rins pela enzima CYP27B1, gerando a forma ativa da vitamina D: 1,25-dihidroxivitamina D (calcitriol) (HOLICK, 2008), conforme ilustrado na Figura 1. Neste trabalho, o calcitriol será referido como vitamina D.
Figura 1: Síntese da vitamina D a partir do 7-dehidrocolesterol
Mediante exposição aos raios UVB solares, o 7-dehidrocolesterol presente na pele é convertido à pré-vitamina D3 e posteriormente à vitamina D3. A vitamina D3, por sua vez, passa para corrente sanguínea (ligada à proteína carreadora de vitamina D) e é hidroxilada no fígado através da isoforma 2R1 do citocromo P450 (CYP2R1), tornando-se a 25-hidroxivitamina D, que é novamente hidroxilada nos rins através da isoforma 27B1 do citocromo P450 (CYP27B1), gerando então a 1,25-dihidroxivitamina D, forma ativa capaz de exercer ações biológicas.
O nível sérico de 25-hidroxivitamina D (forma inativa) é o principal marcador bioquímico utilizado para definir níveis satisfatórios ou deficientes desta vitamina. Níveis séricos de 25-hidroxivitamina D menores que 30 ng/mL são considerados deficientes, enquanto níveis maiores são considerados satisfatórios. Em casos de intoxicações por excesso desta vitamina, os níveis de 25-hidroxivitamina D observados no plasma são maiores que 150 ng/mL (HOLICK, 2007). Pesquisas têm demonstrado que há uma alta prevalência de hipovitaminose D (níveis séricos de 25-hidroxivitamina D menores que 30 ng/ml), a qual é estimada ser superior a 50% na população mundial (MANSON e BASSUK, 2015; WIMALAWANSA, RAZZAQUE e AL-DAGHRI, 2018).
Esta deficiência pode estar relacionada a uma série de consequências envolvendo condições de saúde, incluindo a osteoporose (ELENI et al., 2020) além de outras doenças
crônicas, com destaque às cardíacas (ZHANG et al., 2017), uma vez que a Vitamina D parece ser capaz de melhorar o desfecho clínico de pacientes com doença arterial coronariana (BAHRAMI et al., 2020). Ainda, parece haver relação entre a prevenção (ZHANG et al., 2020) e melhora clínica de pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (PENCKOFER et al., 2017). A possível ação anti-inflamatória desta vitamina tem sido um interessante alvo de estudo; parece ser capaz de prevenir infecções respiratórias agudas (JOLLIFFE et al., 2020) e até possuir relação com a gravidade do desfecho clínico da infecção pelo Sars-Cov-2 (PEREIRA et al., 2020; LIU et al., 2021).
Embora as ações mais conhecidas da vitamina D estejam associadas à regulação da homeostase do cálcio e fosfato, um número crescente de estudos têm mostrado seu envolvimento na função cerebral (conforme resumido na Figura 2), principalmente envolvendo doenças neurodegenerativas (LANDEL et al., 2016) e a depressão (SPEDDING, 2014; CASSEB et al., 2019). Sabe-se que células neuronais e gliais são capazes de converter 25-hidroxivitamina D em 1,25-di25-hidroxivitamina D (forma ativa da vitamina) (BARNARD e COLON-EMERIC, 2010), sugerindo fortemente que a vitamina D é um esteróide neuroativo. No sistema nervoso central, está associada a propriedades neuroprotetoras, modula a produção e liberação de fatores neurotróficos (HUA et al., 2012; CHABAS et al., 2013; TANG et al., 2013; TANG et al., 2015; ERJAVEC et al., 2021), proliferação celular e apoptose (FERON et al., 2005), expressão de genes associados à sinalização GABAérgica e biossíntese de catecolaminas (JIANG et al., 2013).
Além disso, propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias também foram descritas para a vitamina D3 em estudos pré-clínicos (HAYES et al., 2003), e ela é considerada essencial para o balanço e recuperação de homeostase do sistema imune (MICHELE et al., 2020). Um estudo recente reportou que a 1,25-dihidroxivitamina D foi capaz de inibir a expressão do gene relacionado ao transportador de recaptação de serotonina e da enzima monoamina oxidase A (MAO-A)em cultura neuronal em uma linhagem de células serotonérgica, sugerindo que essa vitamina poderia atuar de forma semelhante aos antidepressivos clássicos (SABIR et al., 2018). Reforçando o papel da vitamina D como um neuromodulador, foi demonstrado que no sistema nervoso central existem receptores de vitamina D (VDR) tanto em neurônios quanto em células da glia de roedores e humanos, os quais medeiam suas propriedades neuroprotetoras (GARCION et al., 2002). As regiões cerebrais que possuem esses receptores incluem hipotálamo, substância nigra, córtex pré-frontal e hipocampo, estando as duas últimas intimamente envolvidas na fisiopatologia da ansiedade e da depressão (EYLES et al., 2005).
Além disso, a vitamina D parece estar envolvida na regulação da resposta ao estresse, um dos fatores ambientais mais importantes relacionados a episódios de depressão (CASSEB et al., 2019). Observou-se aumento dos níveis de vitamina D e da expressão de VDR no hipocampo de ratos que apresentaram comportamento tipo-depressivo induzido após 4 semanas de estresse crônico imprevisível, talvez como mecanismo compensatório (JIANG et al., 2013).
Alguns estudos pré-clínicos apresentam evidências indicando um papel da vitamina D na ansiedade. Por exemplo, a deleção genética de receptores da vitamina D (VDR) em camundongos causou comportamento tipo-ansioso no teste do labirinto em cruz elevado em estudo experimental (KALUEFF et al., 2004). Além disso, camundongos knockout para VDR apresentaram um conjunto de respostas consistentes com comportamento tipo-ansioso, sugerindo que a ausência deste receptor apresenta uma íntima relação com o aumento do comportamento tipo-ansioso (MINASYAN et al., 2007), um resultado similar ao encontrado por Kalueff et al. (2006).
Pesquisas envolvendo a associação entre a vitamina D e a depressão são abundantes e apontam para efeitos benéficos desta vitamina neste transtorno. A administração aguda de vitamina D em camundongos reduziu o tempo de imobilidade no teste do nado forçado, um resultado indicativo de efeito tipo-antidepressivo (KAWAURA et al., 2017). Em um outro estudo, ratas ovariectomizadas exibiram comportamento do tipo-antidepressivo e ansiolítico mediante administração de vitamina D durante 14 dias (FEDOTOVA et al., 2016). Reforçando os resultados indicativos de que a vitamina D apresenta propriedade antidepressiva, demonstrou-se que uma dieta deficiente de vitamina D durante o desenvolvimento causou comportamento anedônico em camundongos (FU et al., 2017).
Recentemente foi demonstrado que a administração repetida (7 dias) de vitamina D produziu um efeito tipo-antidepressivo e antioxidante em camundongos submetidos a um modelo de depressão induzido pela administração crônica de corticosterona (CAMARGO et al., 2018). Utilizando o mesmo modelo de depressão, observou-se que o tratamento de 7 dias com vitamina D foi capaz de reverter o comportamento tipo-depressivo induzido pelo modelo, de maneira similar à fluoxetina, além de atenuar a produção de espécies reativas de oxigênio no hipocampo de camundongos fêmeas, reforçando a ação antioxidante decorrente da administração repetida da vitamina D (SOUZA et al., 2019). Corroborando estes achados, Camargo et al. (2020) demonstraram a capacidade da vitamina D em diminuir o comportamento tipo-depressivo e tipo-anedônico induzido pela corticosterona, além de prevenir o aumento do
imunoconteúdo de proteínas relacionadas ao inflamassoma NLRP3 no hipocampo dos animais expostos cronicamente à corticosterona. Também foi observado que a administração crônica de corticosterona foi capaz de reduzir o imunoconteúdo do receptor de glicocorticóides (GR) no hipocampo de camundongos, alteração esta que foi atenuada pelo tratamento repetido com vitamina D, sugerindo que seu mecanismo de ação tipo-antidepressivo pode estar relacionado à modulação dos GR (CAMARGO et al., 2020).
Diferentes grupos de pesquisa relataram que pacientes com sintomas depressivos apresentam níveis reduzidos de 25-hidroxivitamina D (SCHNEIDER et al., 2000; JORDE et al., 2006; HOOGENDIJK et al., 2008). Apesar de alguns resultados contraditórios, a maior parte dos estudos clínicos observacionais confirmam esses achados. Robinson e colaboradores (2014), similar a Pillai e colaboradores (2021), associam baixos níveis de 25-hidroxivitamina D (tanto livre quanto conjugada) no período gestacional ao risco de desenvolvimento e gravidade dos sintomas de depressão pós parto na mãe.
Reforçando esses achados, foi observado que pessoas obesas ou com sobrepeso que receberam suplementação com essa vitamina por um ano exibiram menos sintomas de depressão quando comparados aos indivíduos do grupo controle (JORDE et al., 2008). Contudo, as evidências mais fortes do papel da vitamina D no manejo dos sintomas depressivos vem de ensaios clínicos com suplementação. Um estudo de revisão sistemática contemplando 15 ensaios clínicos randomizados e controlados por placebo encontrou uma melhora estatisticamente significativa dos sintomas de depressão após a suplementação de vitamina D3 (SPEDDING, 2014). Considerando que fortes evidências apontam para um importante efeito da vitamina D sobre o humor, estudos adicionais são necessários para melhor caracterizar os mecanismos ansiolíticos e antidepressivos dessa vitamina.
Figura 2: Possíveis mecanismos envolvidos no efeito da vitamina D sobre a regulação do humor
Evidências apontam que a vitamina D possui atividade antioxidante e anti-inflamatória, além de estar relacionada com a produção de fatores neurotróficos, sinalização do cálcio e biossíntese de monoaminas. Tais ações biológicas parecem exercer importante papel na Ansiedade e Depressão; além disso, áreas encefálicas envolvidas na fisiopatologia destes transtornos expressam VDR e a enzima CYP27B1 do citocromo P450 [córtex cingulado anterior (CCA); córtex pré-frontal ventromedial (CPFvm); hipocampo (Hip); hipotálamo lateral (HL) e Amígdala].
2 JUSTIFICATIVA
A ansiedade e a depressão são transtornos psiquiátricos que acometem uma grande porcentagem da população, acarretando sintomas que afetam negativamente o dia a dia dos pacientes e diminuem sua qualidade de vida. De acordo com o último relatório da Organização Mundial da Saúde feito em 2017, a depressão já é considerada a principal causa de incapacitação na população mundial, afetando cerca de 350 milhões de pessoas no mundo, o que reflete uma prevalência ao longo da vida de cerca de 17% na população mundial. Ambos os transtornos são considerados problemas de saúde globais, sendo necessário um contínuo investimento em pesquisas, medidas de prevenção e tratamento. Apesar dos dados alarmantes sobre esses transtornos, a terapia farmacológica para seu manejo ainda apresenta muitas limitações, uma vez que está associada a uma gama de efeitos adversos e demora na remissão dos sintomas, levando a diminuição da adesão dos pacientes ao tratamento. Portanto, existe grande necessidade de desenvolvimento de terapias ansiolíticas/antidepressivas alternativas ou de substâncias que possam otimizar a eficácia clínica dos tratamentos já existentes.
Uma potencial forma de tratamento conjunto com os antidepressivos clássicos envolve o uso de nutracêuticos, incluindo vitaminas, minerais, ou plantas que promovem efeitos benéficos nos sintomas de depressão. Nesse contexto, a vitamina D tem se mostrado um composto promissor, assim evidenciado em uma série de estudos pré-clínicos e clínicos. Tal vitamina possui propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e neuroprotetoras que podem estar associadas ao seu efeito no humor. Através do presente trabalho, pretende-se caracterizar os efeitos ansiolíticos e antidepressivos da vitamina D, além de investigar a participação do sistema serotonérgico nestes efeitos. Além de contribuir para o avanço no conhecimento dos mecanismos neurobiológicos da ansiedade e depressão, os resultados desse trabalho poderão proporcionar uma associação entre o conhecimento pré-clínico aqui elucidado e clínico observado em outros estudos, visando auxiliar na busca de uma estratégia terapêutica de baixo custo que auxilie na melhora dos sintomas de ansiedade e depressão.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o possível efeito tipo-ansiolítico e tipo-antidepressivo da vitamina D em camundongos Swiss fêmeas.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar uma curva dose resposta para investigar o efeito tipo-antidepressivo da vitamina D no teste de suspensão pela cauda.
Avaliar a participação do sistema serotonérgico no efeito do tipo-antidepressivo da vitamina D.
Realizar uma curva dose resposta para a investigação do efeito tipo-ansiolítico da vitamina D no teste do labirinto em cruz elevado e avaliar se o efeito tipo-ansiolítico ocorre após tratamento agudo e/ou repetido.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS E CONDIÇÕES DE ALOJAMENTO
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina, pesando de 30 a 40 g, com 50-60 dias de idade. Os animais foram mantidos no Biotério Setorial do Departamento de Bioquímica a temperatura de 20°C±2°C com livre acesso a água e comida, em ciclo claro/escuro 12:12 horas. Todas as manipulações foram realizadas entre às 9:00 e 17:00 horas, sendo cada animal utilizado somente uma vez. Os animais tiveram livre acesso à ração comercial para camundongos NUVITAL - Nuvilab CR1 e a água filtrada e potável. Este projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC (CEUA nº 7068180518, apresentado em anexo).
4.2 FÁRMACOS E TRATAMENTOS
4.2.1 Vitamina D
Para investigação do seu efeito tipo-ansiolítico e tipo-antidepressivo, utilizou-se uma formulação comercial de vitamina D (Addera, 5mg/mL). A solução comercial foi inicialmente diluída em óleo mineral, obtendo-se o composto em uma concentração de 10.000 UI/mL. Essa solução foi diluída novamente em óleo mineral para obter-se as concentrações de 10 UI/mL, 30 UI/mL e 100 UI/mL (equivalentes as dose de 100 UI/kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg, respectivamente). A vitamina D foi administrada em um volume de 10 mL por Kg de peso corporal. O tratamento foi administrado por via oral, utilizando seringa de gavagem.
Escolhemos utilizar óleo mineral como diluente para administração da vitamina D por ser inerte em um tratamento de 7 dias. Nas nossas condições de laboratório, foi padronizado que um tratamento de 7 dias com óleo mineral fornece resultados comportamentais estatisticamente similares aos produzidos por um tratamento de 7 dias com água destilada (dados não mostrados), portanto, o controle utilizado (veículo) foi a água destilada.
A fluoxetina foi utilizada como controle positivo nos testes de avaliação de comportamento tipo-antidepressivo. É um dos antidepressivos mais utilizados do mundo, pertencendo à classe dos ISRS. Seu mecanismo de ação baseia-se no aumento das concentrações de serotonina na fenda sináptica devido a inibição dos transportadores de recaptação (RANG et al., 2016), conforme ilustrado na Figura 3. A solução de 10 mg/mL foi diluída em água destilada e a dose utilizada foi de 10 mg/kg, uma vez que estudos prévios do nosso grupo demonstraram que esta dose, administrada por via oral, é efetiva em produzir um comportamento tipo-antidepressivo no teste de suspensão pela cauda em camundongos Swiss fêmeas (MORETTI et al., 2012). No presente trabalho, a fluoxetina foi administrada por via oral, utilizando seringa de gavagem.
Figura 3: Mecanismo de ação dos inibidores seletivos da recaptação de serotonina.
Os ISRS inibem o transportador de receptação da 5-HT, assim, este neurotransmissor permanece por maior tempo na fenda sináptica, aumentando sua função e estimulando mais receptores, o que culmina em um aumento da sua ação.
4.2.3 Diazepam
O diazepam foi utilizado como controle positivo nos testes de avaliação de comportamentos relacionados à ansiedade. É um fármaco ansiolítico amplamente utilizado na
clínica, classificado como benzodiazepínico. Ele atua como modulador alostérico dos receptores GABAA, aumentando a frequência de abertura dos canais de cloreto, resultando no
aumento da transmissão inibitória GABAérgica (RANG et al., 2016), conforme ilustrado na Figura 4. A solução de 2 mg/mL foi diluída em água destilada e a dose utilizada foi de 2 mg/kg, administrada por via oral, através de uma seringa de gavagem. A escolha da dose se baseou em estudos prévios do nosso grupo de pesquisa (FRAGA et al., 2018).
Figura 4 - Mecanismo de ação dos benzodiazepínicos
Os benzodiazepínicos ligam-se ao sítio alostérico dos receptores GABAA, entre as subunidades alfa e beta. Assim, eles são capazes de aumentar a frequência de abertura dos canais de cloreto, aumentando o influxo de cloreto, que resulta no aumento da transmissão inibitória GABAérgica
4.2.4 p-clorofenilalanina metil éster (PCPA)
O inibidor seletivo irreversível da enzima triptofano hidroxilase, PCPA, é empregado como ferramenta farmacológica para depletar serotonina em modelos animais e para avaliar se este neurotransmissor está envolvido no efeito de compostos farmacológicos. Através da inibição enzimática, este composto bloqueia a conversão de L-triptofano em 5-OH-L-triptofano, assim, inibindo a via de síntese da serotonina a partir deste aminoácido (FOLTRAN et al., 2020), conforme ilustrado na Figura 5.
Aqui, a administração de PCPA (100 mg/Kg) foi realizada por via intraperitoneal, uma vez por dia durante 4 dias, conforme padronizado previamente pelo nosso grupo de pesquisa (MACHADO et al., 2012) e corroborando com outros trabalhos utilizando os mesmos testes comportamentais (GALDINO et al., 2015). O PCPA foi diluído em solução salina 0,9% (10 mg/mL) a fim de obter a dose de 100 mg/Kg.
Figura 5: Mecanismo de ação do PCPA
A 5-HT é sintetizada a partir do aminoácido triptofano, cuja primeira reação é catalisada pela enzima triptofano hidroxilase. O PCPA depleta parcialmente a síntese de 5-HT através da inibição seletiva irreversível desta enzima.
4.3 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D
Para determinar a dose mínima efetiva, os animais foram tratados com diferentes doses de vitamina D (100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg), ou veículo (água) uma vez por dia, durante 7 dias. Decorridas 24 horas do último tratamento, os animais foram submetidos ao teste de suspensão pela cauda para avaliação do possível efeito tipo-antidepressivo decorrente da
administração da vitamina D. Após 10 minutos, os mesmos animais foram submetidos ao teste do campo aberto para avaliação da atividade locomotora.
4.4 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA SEROTONÉRGICO NO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D
Para investigar o possível envolvimento do sistema serotonérgico no efeito tipo-antidepressivo da vitamina D, os camundongos foram tratados uma vez por dia, durante 7 dias por via oral com vitamina D (100 UI/Kg, dose efetiva estabelecida após experimento de curva dose resposta), fluoxetina (controle positivo, 10 mg/kg) ou veículo (água). Durante os 4 últimos dias desse período, os animais foram tratados também com o inibidor da síntese de serotonina, PCPA 100 mg/kg ou solução salina (NaCl 0,9%), por via intraperitoneal. Após 24 horas do término dos tratamentos, os animais foram submetidos ao teste da suspensão pela cauda para a avaliação do comportamento tipo-antidepressivo. Após 10 minutos foi realizado o teste do campo aberto para avaliação da atividade locomotora.
4.5 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANSIOLÍTICO DA VITAMINA D
Para avaliar se a vitamina D possui efeito tipo-ansiolítico, os animais foram tratados por via oral (administração única) com diferentes doses de vitamina D (100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg), diazepam (controle positivo, 2 mg/kg) ou veículo (água). Sessenta minutos depois do primeiro tratamento, os animais foram submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado para avaliar se a administração aguda de vitamina D seria capaz de causar um comportamento tipo-ansiolítico. Após 7 dias de tratamento, 24 horas após a última administração, os animais foram submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado para avaliação do comportamento tipo-ansiolítico decorrente do tratamento repetido com vitamina D.
4.6 TESTES COMPORTAMENTAIS PARA AVALIAÇÃO DE
COMPORTAMENTOS RELACIONADOS À DEPRESSÃO E ANSIEDADE
Neste teste, medimos o tempo total de duração da imobilidade de acordo com o método descrito por Steru et al. (1985). Os camundongos, acústica e visualmente isolados, foram suspensos em uma barra horizontal, 50 cm acima do chão por fita adesiva através da cauda e o tempo de imobilidade registrado durante 6 minutos, conforme ilustrado na Figura 6. Os antidepressivos reduzem o tempo de imobilidade dos animais neste teste.
Figura 6: Teste de Suspensão pela Cauda (TSC)
O animal é suspenso através da cauda com fita adesiva e seu tempo de imobilidade é cronometrado durante 6 minutos. (Imagem elaborada por: Ágatha Oliveira Giacomeli)
4.6.2 Teste do Campo Aberto (TCA)
O TCA foi realizado nos mesmos animais submetidos ao TSC, 10 minutos após a realização do último. A exposição a este teste tem por objetivo eliminar a possibilidade de que as alterações no tempo de imobilidade obtidas no TSC ocorram devido a alteração na atividade locomotora causada pelos compostos (falsos positivos ou falsos negativos decorrentes de um efeito psicoestimulante ou depressor, respectivamente). Assim, garantimos que o resultado do tempo de imobilidade seja fidedigno, através de experimentos complementares para avaliação da atividade locomotora dos animais (MACHADO et al., 2012).
Para isso, animais foram posicionados individualmente na periferia da caixa de campo aberto, com dimensões de 40 x 60 x 50 cm, quatro paredes medindo 50 cm de altura e assoalho dividido em 12 quadrantes idênticos marcados por linhas pretas, conforme mostrado na Figura 7. Durante o período de 6 minutos, avaliamos a atividade locomotora do animal através do número total de quadrantes cruzados com as quatro patas. Após a conclusão do teste,
os animais foram removidos do aparato e o assoalho da arena higienizado com solução de etanol a 10%, com o objetivo de eliminar odores de outros animais (RODRIGUES et al., 1996).
Figura 7: Teste do Campo Aberto (TCA)
O animal é posicionado no quadrante 1 e o número de cruzamentos entre os quadrantes é contabilizado durante 6 minutos. (Imagem elaborada por: Ágatha Oliveira Giacomeli)
4.6.3 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
O LCE consiste em uma estrutura em forma de “X” elevada a uma altura de 50 cm da base de apoio, dotada de dois braços abertos e dois braços fechados (Figura 8). Os parâmetros usados para avaliar as medidas de ansiedade foram baseados no comportamento de aversão incondicionada do animal por lugares abertos e erguidos.
O animal foi posicionado no centro do aparato e os parâmetros avaliados, de acordo com Pellow et al. (1985), foram:
1. Tempo de permanência do animal nos braços abertos 2. Número de entradas nos braços abertos
Figura 8: Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
O animal é posicionado no centro do aparato e seu comportamento avaliado através dos parâmetros acima listados, durante 5 minutos.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Inicialmente, foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov, que confirmou a normalidade dos resultados analisados. Os resultados foram expressos como média + E.P.M.. A diferença entre os grupos foi obtida pela análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguida pelo teste post hoc de Tukey, quando apropriado. Valores de p < 0,05 foram considerados como indicativo de significância.
5 RESULTADOS
5.1 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D
O tratamento de 7 dias com vitamina D nas três doses utilizadas (100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg) foi capaz de produzir efeito tipo-antidepressivo no teste de suspensão pela cauda (Figura 9A), sendo os valores de significância obtidos através da ANOVA de uma via [F(3,27) = 11.98, p = 0,00003]. Este efeito é demonstrado a partir da redução do tempo de imobilidade dos camundongos tratados, em comparação com os camundongos do grupo controle, que receberam apenas veículo.
No teste do campo aberto (Figura 9B) não foram observadas diferenças significativas entre os grupos quando aplicada ANOVA de uma via [F(3,27) = 0.498, p = 0.68].
Figura 9: Curva dose resposta para investigação do efeito tipo-antidepressivo da Vitamina D.
Efeito do tratamento repetido com diferentes doses de vitamina D no TSC (9A) e no TCA (9B). Os valores estão expressos como média + E.P.M (n=8). Resultados avaliados por ANOVA de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. **p < 0.01 comparado com o grupo veículo.
5.2 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA SEROTONÉRGICO NO EFEITO TIPO-ANTIDEPRESSIVO DA VITAMINA D
No experimento anterior observamos que o tratamento repetido com a dose de 100 UI/Kg de vitamina D (menor dose utilizada) é capaz de produzir efeito tipo-antidepressivo no
TSC. Assim, esta foi a dose escolhida para avaliar a participação do sistema serotonérgico neste efeito.
Após de 7 dias de tratamento com vitamina D (100 UI/Kg, p.o.), foi possível observar que a vitamina D gerou resultado similar ao do antidepressivo clássico fluoxetina, reduzindo o tempo de imobilidade dos animais no teste de suspensão pela cauda (Figura 10A). Ainda, observamos que a administração de PCPA (100 mg/Kg, i.p.) preveniu o efeito tipo-antidepressivo da vitamina D, assim como da fluoxetina (Figura 10A). Este resultado sugere que o efeito produzido pela vitamina D envolve o sistema serotonérgico.
No teste do campo aberto (Figura 10B), não foram observadas diferenças significativas entre os grupos quando aplicada ANOVA de duas vias. Os valores de significância para ambos os testes estão expressos na Tabela 1.
Figura 10: Avaliação do envolvimento do sistema serotonérgico no efeito tipo-antidepressivo da vitamina D.
Efeito da administração de PCPA (100 mg/Kg, i.p.) sobre o comportamento tipo-antidepressivo induzido pela vitamina D (100 UI/Kg, p.o.) ou fluoxetina (10 mg/Kg, p.o.) no TSC (10A) e no TCA (10B). Os valores estão expressos como média + E.P.M. (n=8). Resultados avaliados por ANOVA de duas vias, seguida do teste post hoc
de Tukey. **p < 0.01 comparado com o grupo controle (veículo + veículo); ##p < 0.01 comparado com o grupo veículo + vitamina D ou veículo + fluoxetina.
Tabela 1 - Resultados da ANOVA de duas vias para avaliação do envolvimento do sistema
serotonérgico no efeito tipo-antidepressivo da Vitamina D.
TSC: A ANOVA de duas vias demonstrou efeito significativo para o tratamento com PCPA, tratamento com os antidepressivos (vitamina D e fluoxetina) e para a interação entre PCPA e antidepressivos. TCA: A ANOVA de duas vias não demonstrou efeito significativo para o tratamento com PCPA, tratamento com os antidepressivos (vitamina D e fluoxetina) e para a interação entre PCPA e antidepressivos.
5.3 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANSIOLÍTICO DA VITAMINA D ADMINISTRADA AGUDAMENTE
No teste do LCE, a ANOVA de uma via demonstrou significância nos parâmetros porcentagem de entrada nos braços abertos [F(4,40) = 3.690, p = 0,011] e porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos do aparato [F(4,40) = 14.145, p < 0,0000002]. A análise post hoc indicou que apenas o tratamento agudo com diazepam (controle positivo, 2 mg/Kg) foi capaz de produzir efeito tipo-ansiolítico no teste, demonstrado pelo aumento significativo dos parâmetros: porcentagem de entradas (Figura 11A) e de tempo de permanência (Figura 11B) dos animais nos braços abertos do labirinto.
PCPA Antidepressivos Interação PCPA x
Antidepressivos TSC [F(1,43) = 17.167, p = 0,000157] [F(2,43) = 7.254, p = 0,001930] [F(2,43) = 1.546, p = 0,048127] TCA [F(1,43) = 0.619, p = 0.24] [F(2,43) = 1.447, p = 0.43] [F(2,43) = 0.251, p = 0.25]
Figura 11: Curva dose resposta para investigação do efeito tipo-ansiolítico decorrente da administração aguda da vitamina D.
Efeito do tratamento agudo com diferentes doses de vitamina D (100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg, p.o.) e diazepam (2 mg/Kg, v.o.) no LCE. Parâmetro de porcentagem de entrada nos braços abertos (11A) e porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos (11B). Os valores estão expressos como média + E.P.M (n=8). Resultados avaliados por ANOVA de uma via, seguida do post hoc de Tukey. *p < 0.05 e **p < 0.01, comparado com o grupo veículo.
5.4 CURVA DOSE RESPOSTA PARA INVESTIGAÇÃO DO EFEITO TIPO-ANSIOLÍTICO DECORRENTE DA ADMINISTRAÇÃO REPETIDA DE VITAMINA D
Não foi observada diferença significativa entre os grupos após administração repetida (7 dias) de vitamina D (100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg) ou diazepam (2 mg/Kg), tanto na porcentagem de entrada nos braços abertos (Figura 12A) quanto na porcentagem de tempo de permanência do animal nos braços abertos do aparato (Figura 12B).
A ANOVA de uma via não demonstrou significância nos parâmetros porcentagem de entrada nos braços abertos [F(4,35) = 1.341, p = 0.27] e porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos do aparato [F(4,35) = 0.428, p = 0.78].
Figura 12: Curva dose resposta para investigação do efeito tipo-ansiolítico decorrente da administração repetida da vitamina D.
Efeito do tratamento repetido com diferentes doses de vitamina D (100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg, v.o.) e diazepam (2 mg/Kg, v.o.) no LCE. Parâmetro de porcentagem de entrada nos braços abertos (12A) e porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos (12B). Os valores estão expressos como média + E.P.M (n=8). Resultados avaliados por ANOVA de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey.
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho demonstrou que o tratamento repetido com vitamina D é capaz de produzir efeito tipo-antidepressivo em camundongos no teste de suspensão pela cauda, corroborando com estudos prévios (SOUZA et al., 2019). Ainda, este efeito parece estar relacionado ao sistema serotonérgico, uma vez que o mesmo foi prevenido pela inibição parcial da síntese de serotonina pelo tratamento com PCPA. Ainda, a vitamina D administrada de forma aguda ou repetida não produziu efeito tipo-ansiolítico nas doses aqui utilizadas no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos Swiss fêmeas.
Vale ressaltar que estudos utilizando fêmeas, como este, são necessários para gerar resultados de maior equidade, representatividade e um conhecimento translacional acerca de qualquer tema. Em especial, nas neurociências, animais machos são utilizados com uma frequência seis vezes maior que as fêmeas (BEERY et al., 2011). Tal fato gera um viés envolvendo diversos fatores, incluindo efeitos adversos de fármacos utilizados na clínica e até mesmo nos testes comportamentais, uma vez que a maioria deles foram validados há décadas, quando o uso exclusivo de roedores machos era a prática padrão (SHANSKY; MURPHY, 2021).
Neste trabalho, o tratamento repetido (7 dias) com vitamina D nas doses de 100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg produziu efeito tipo-antidepressivo em camundongos Swiss fêmeas no teste de suspensão pela cauda (TSC). No experimento da curva dose-resposta (Figura 9), todas as doses testadas foram capazes de reduzir significativamente o tempo de imobilidade dos animais submetidos ao TSC, sem alterar a atividade locomotora dos mesmos animais no TCA, em comparação com o grupo controle (água).
O TSC utiliza o tempo de imobilidade do animal suspenso pela cauda como parâmetro comportamental, sendo que, quando um tratamento é capaz de reduzir o tempo de imobilidade, podemos inferir que ele produz efeito tipo-antidepressivo, desde que seja descartada a possibilidade de um resultado falso positivo devido a um efeito psicoestimulante. Este teste é amplamente utilizado para avaliar o efeito tipo-antidepressivo de diversos fármacos, incluindo os ISRS, possuindo maior sensibilidade para tal finalidade, em comparação com outros testes de avaliação de compostos com potencial antidepressivo, como por exemplo o teste do nado forçado (POLLAK et al., 2010).
prévios que o tratamento agudo com a dose de 1000 UI/kg de vitamina D não produz efeito tipo-antidepressivo nos camundongos submetidos ao TSC (CAMARGO et al., 2018). O mesmo estudo demonstrou que o tratamento de 7 dias com vitamina D (100 UI/Kg) produziu efeito tipo-antidepressivo no TSC e teste do nado forçado em um modelo de depressão induzido pela administração crônica de corticosterona (CAMARGO et al., 2018). Assim, visando a redução do uso de animais, realizamos apenas o tratamento repetido (7 dias), cujos resultados aqui obtidos corroboram com outros descritos na literatura.
Souza et al. (2019) relataram um resultado muito similar em curva dose-resposta, uma vez que após tratamento de 7 dias com vitamina D nas doses de 100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg, os camundongos Swiss fêmeas apresentaram comportamento tipo-antidepressivo, observado a partir da redução do tempo de imobilidade no TSC, em comparação com o controle. Este resultado foi similar ao encontrado após tratamento com o antidepressivo clássico Fluoxetina (10 mg/kg). Ainda, no mesmo estudo, o tratamento repetido com vitamina D (100 UI/Kg) foi capaz de reverter o comportamento tipo-depressivo induzido pela administração crônica (21 dias) de corticosterona, além de reduzir significativamente a produção de espécies reativas de oxigênio no hipocampo dos animais, de maneira similar à fluoxetina.
Em um modelo de depressão induzido por inflamação, através da inoculação de Bacilo Calmette-Guérin (BCG), Saleh et al. (2021) observaram comportamento tipo-antidepressivo decorrente de uma única administração via intraperitoneal de vitamina D (60.000 IU/Kg) 15 dias após administração (ação de longo prazo), mas não 3 dias após administração (ação de curto prazo), no TSC, sem alterar a atividade locomotora, avaliada no TCA.
O mecanismo de ação da vitamina D no sistema nervoso central ainda não está totalmente elucidado. São poucos os estudos pré-clínicos e clínicos que avaliam mecanisticamente a ação antidepressiva decorrente da suplementação com a vitamina. Esta ação parece estar envolvida com neuroimunomodulação, neuroplasticidade, redução do estresse oxidativo, produção de fatores neurotróficos, sinalização do cálcio e síntese de monoaminas (CASSEB et al., 2019).
Em estudos clínicos há evidências de que a hipovitaminose D pode estar relacionada à fisiopatologia da depressão, por meio de diversas maneiras: alteração da homeostase do cálcio em neurônios, gerando por consequência um desbalanço entre os sistemas glutamatérgico e GABAérgico; efeito pró-inflamatório da deficiência de vitamina D, culminando na redução da síntese do peptídeo antioxidante glutationa (GSH) no encéfalo e ativando cascatas inflamatórias; alteração da microbiota intestinal, que influencia indiretamente nos níveis de
serotonina; alteração direta dos níveis encefálicos de serotonina pela modulação de enzimas limitantes da sua síntese (MICHELE et al., 2020). Quando consideramos que os transtornos de humor possuem relação sazonal (dependente da exposição a luz solar), podemos observar que a variação dos níveis de vitamina D ocorre de maneira similar à variação dos níveis de serotonina, indicando possível correlação (LOGAN et al., 2013; LUIKX et al., 2013; MICHELE et al., 2020).
Buscando investigar o envolvimento do sistema serotonérgico na ação antidepressiva da vitamina D, a fim de melhor elucidar os possíveis mecanismos de ação da vitamina, realizamos o experimento utilizando o inibidor da síntese de serotonina PCPA. Em meados de 1966, um estudo realizado por Koe e colaboradores, com suporte da companhia Pfizer, demonstrou redução significativa na concentração de serotonina encefálica, acompanhada de redução nos níveis do metabólito ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HTIAA), em ratos submetidos ao tratamento com PCPA (100 mg/Kg, i.p.) durante 3 dias consecutivos. Um efeito similar foi observado em camundongos e cachorros. O mesmo estudo demonstrou que tal efeito ocorre devido a inibição seletiva da enzima triptofano hidroxilase, primeira enzima da via de síntese da serotonina a partir do aminoácido triptofano. Existem duas isoformas da triptofano hidroxilase (TPH), sendo a TPH2 específica dos neurônios. Embora o PCPA seja capaz de bloquear ambas isoformas, a TPH2 parece ser mais sensível ao tratamento (FOLTRAN et al., 2020).
Após administração única (150 mg/Kg, i.p.) de PCPA, ocorreu depleção de 30% a 50% da síntese de 5-HT em ratos (DATLA et al, 1996), porém, esta redução ocorre de forma lenta e cumulativa, demandando no mínimo 3 dias de tratamento (100 mg/Kg, i.p.) para atingir um platô de diminuição dos níveis de 5-HT, produzindo então, depleção significativa do conteúdo desta monoamina (equivalente a 67% - 70%) em camundongos (KOSTRZEWA, et al., 1975; KOE, et al., 1996).
Considerando que a administração de PCPA (100 mg/kg, i.p.) uma vez por dia, durante 4 dias, bloqueia a TPH, resultando em depleção significativa da síntese de serotonina (MACHADO et al., 2012; GALDINO et al., 2015), se o efeito tipo-antidepressivo observado após tratamento com Vitamina D envolver o sistema serotonérgico, o tratamento com PCPA impedirá esta ação, uma vez que a síntese estará inibida.
Na curva dose-resposta, estabelecemos que a dose mínima efetiva da vitamina para tratamento repetido é de 100 UI/Kg, assim, esta foi a utilizada para o experimento subsequente.
Como demonstrado na Figura 10A, o grupo tratado com veículo + vitamina D, similar ao tratado com veículo + fluoxetina, apresentou redução do tempo de imobilidade dos animais no TSC, em comparação ao grupo que recebeu apenas veículo. Isso representa o efeito tipo-antidepressivo produzido mediante administração repetida de vitamina D (100 UI/Kg) e do antidepressivo clássico fluoxetina (10 mg/Kg). Tal efeito não ocorreu nos grupos que receberam PCPA + vitamina D e PCPA + fluoxetina, sendo que o tempo de imobilidade destes animais no TSC foi significativamente maior quando comparado aos grupos que receberam vitamina D e fluoxetina, mas não PCPA. No TCA, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos quanto à atividade locomotora (Figura 10 B).
Vale ressaltar que qualquer administração que requer manipulação dos animais gera certo estresse, o que é prejudicial em termos de viés dos resultados. A fim de melhorar este aspecto dos experimentos, alguns estudos com diferentes protocolos já demonstraram eficácia na depleção de serotonina por meio da ingestão voluntária de PCPA em alimento palatável (FOLTRAN et al., 2020), fato a ser considerado no desenho experimental de estudos futuros.
Sabir et al. (2018) demonstraram em cultura neuronal de células serotonérgicas que a Vitamina D foi capaz de inibir a expressão do gene relacionado ao transportador de recaptação de serotonina e da enzima MAO-A, sugerindo que a atuação desta vitamina assemelha-se a dos antidepressivos clássicos. O resultado obtido aqui, em modelo animal, é similar ao observado na cultura celular, evidenciando que o efeito antidepressivo da vitamina D parece envolver o sistema serotonérgico.
Este resultado é de extrema relevância por demonstrar que o mecanismo antidepressivo da vitamina D parece envolver o sistema serotonérgico. Assim, esta vitamina parece atuar de maneira similar ao ISRS fluoxetina, porém sem seus efeitos adversos, que por vezes dificultam a adesão dos pacientes ao tratamento. A suplementação com esta vitamina pode ser uma alternativa importante como tratamento conjunto aos antidepressivos clássicos, possivelmente permitindo redução das doses e, consequentemente, dos efeitos adversos, melhorando a eficácia do tratamento clínico. Como perspectiva futura, seria interessante avaliar se existe sinergismo entre a vitamina D e fluoxetina para confirmar ou descartar esta hipótese.
Khoraminya e colaboradores (2013) conduziram um estudo clínico envolvendo pacientes com depressão que possuíam deficiência de vitamina D, no qual foi possível demonstrar que a suplementação desta vitamina associada ao tratamento com fluoxetina obteve efeito positivo, diminuindo a gravidade da depressão, bem como causando redução do risco de suicídio (TARIQ et al., 2011).
A vitamina D possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias importantes e compostos capazes de diminuir o estresse oxidativo e neuroinflamação podem ser candidatos promissores para o tratamento da ansiedade (SANTOS et al., 2019). Apesar disso, estudos pré-clínicos e pré-clínicos avaliando o efeito tipo-ansiolítico da vitamina D são escassos e apresentam resultados contraditórios, por isso, mais estudos acerca do tema são necessários para compreender esta relação.
Realizamos dois experimentos para avaliar o possível efeito tipo-ansiolítico da vitamina D no teste do LCE, através dos parâmetros de porcentagem de entrada e porcentagem de tempo de permanência do animal nos braços abertos do aparato. Foram testadas as doses de 100 UI/Kg, 300 UI/Kg e 1000 UI/Kg de vitamina D, além de diazepam (2 mg/kg) como controle positivo. Inicialmente, avaliamos se este tratamento agudo produz efeito tipo-ansiolítico. Conforme demonstrado na Figura 11, apenas o tratamento agudo com diazepam foi capaz de produzir tal efeito, tanto na porcentagem de entrada (Figura 11A) quanto na porcentagem de tempo de permanência (Figura 11B) do animal nos braços abertos do aparato. Posteriormente, avaliamos o possível efeito do mesmo tratamento quando administrado de forma repetida, durante 7 dias. Também não foi observado efeito tipo-ansiolítico (Figura 12) em ambos os parâmetros avaliados. Mediante tratamento repetido, até mesmo o ansiolítico clássico diazepam não produziu efeito, em comparação com o grupo controle, sugerindo que o tratamento repetido com esse fármaco é capaz de gerar tolerância, como já demonstrado por LEGGIO et al. (2015). Desta forma, mais estudos acerca do efeito tipo-ansiolítico desta vitamina são necessários, utilizando uma faixa de doses mais ampla, tempo de tratamento prolongado e empregando outros testes de ansiedade, a fim de caracterizar se a vitamina D é desprovida de efeito ansiolítico.
Na clínica, alguns estudos observaram que há relação entre baixos níveis séricos de 25-hidroxivitamina D e ansiedade (KARONOVA et al., 2015; HAN et al., 2018; PU et al., 2018), porém, estes estudos envolvem outras comorbidades, assim, não podemos dizer que esta relação é específica da fisiopatologia da ansiedade.
Em estudos pré-clínicos, o teste do LCE é amplamente utilizado para avaliação do comportamento tipo-ansioso e triagem de novos compostos terapêuticos. Este teste é baseado na tendência natural dos roedores em evitar situações potencialmente perigosas. Normalmente, os animais tendem a evitar entrar nos braços abertos do aparato, preferindo permanecer por maior tempo nos braços fechados, onde sentem-se mais protegidos. O aumento do
