resinas foram solvatadas em etanol (1 g / 40 mL) e refluxadas com hidrato de hidrazina (1,2 mL, 36 mmol). Depois de 3 horas de reação, as resinas obtidas (amino-TEG e amino-HD, ou ATEG e AHD) foram filtradas e lavadas com EtOH quente (3 x 10 mL), DMF (3 x 10 mL), EtOH (3 x 10 mL), MeOH (3 x 10 mL) e secas a vácuo.
Obtiveram-se 0.97 e 0,94 g da ATEG e AHD, respectivamente. Os teores de amino grupos, determinados através do método do ácido pícrico e análise elementar estão mostrados na tabela 14.
Tabela 14: Teores de amino grupos por grama das resinas ATEG e AHD determinados por análise elementar e método do ácido pícrico.
Estas duas resinas aminadas, derivadas do TEG e do HD serão empregadas para ensaios comparativos com o DVB e BAR, em termos de propriedades de solvatação e também de síntese de peptídeo-modelo.
4.2.5. Estudos de solvatação das resinas BAR, ATEG e AHD por RPE
Este tópico final de caracterização dos materiais poliméricos obtidos procurou selecionar alguns para estudos de solvatação, através da metodologia da RPE. Deste modo, lotes de BAR, ATEG e AHD, todos com 2% de intercruzamento e tamanho médio dos grãos de 125 µm foram selecionados para este estudo. Estes materiais foram marcados com o derivado paramagnético Fmoc-TOAC já mencionado na parte introdutória, tomando-se a precaução de marcarmos apenas cerca de 5% dos sítios amínicos das três resinas. Esta estratégia evita a ocorrência de interações intermoleculares do marcador, o que afetaria artificialmente as linhas espectrais de RPE (Wertz and Bolton 1972; Schreier, Polnaszek et al. 1978; Berliner and Reuben 1989).
Grau de Substituição (mmol/g) Resina
Análise Elementar Método do Àcido Pícrico
ATEG 0,74 0,75
Esta estratégia de marcação paramagnética de resinas ou peptidil-resinas tem-se mostrado bastante valiosa pois complementa, com vantagens, os estudos efetuados por microscopia dos grãos da resina. Solventes que melhor solvatam as resinas, induzem elevada mobilidade interna da matriz polimérica (Cilli, Marchetto et al. 1997; Cilli, Marchetto et al. 1999; Marchetto, Cilli et al. 2005; Cilli, Vicente et al. 2007) Incluem-se também estudos efetuados variando-se parâmetros como a temperatura durante a síntese (Ribeiro, Schreier et al. 2001) ou em métodos analíticos aplicáveis também na metodologia da síntese peptídica (Cilli, Jubilut et al. 2000).
Partimos de aproximadamente 100 mg de cada uma das resinas e acoplamos Fmoc-TOAC por protocolo convencional da SPFS. As resinas foram posteriormente lavadas com DCM e MeOH e secas em bomba à óleo. Para a leitura dos espectros, as resinas foram embebidas nos solventes DCM, DMF e DMSO, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os espectros de RPE das resinas nestes solventes estão apresentados na Figura 43 e dentre os parâmetros usualmente calculados de RPE para a parte interpretativa da dinâmica do sistema marcado, destacamos a largura do pico central, em Gauss (Wo). Valores deste parâmetro estão destacados na tabela 15.
Considerando-se que quanto menor o valor de Wo, maior a mobilidade do sítio onde se encontra acoplado o marcador de spin, conclui-se pelos dados presentes na tabela 15 que a BAR se solvata bem em solvente apolar como o DCM enquanto que as outras duas resinas já mostram mobilidades maiores nos polares, principalmente em DMF. E em termos comparativos, o TEG se mostrou mais polar pois houve maior mobilidade desta resina, tanto em DMF quanto em DMSO. Diferentemente, o AHD não apresentou boa solvatação em DMSO, indicando menor mobilidade de sua matriz neste solvente polar aprótico. Uma explicação para todos estes dados pode estar relacionado realmente com a estrutura mais polar do ATEG que possui comparativamente, um número maior de átomos de oxigênio em sua estrutura, se comparado ao AHD e também à BAR que não possui nenhum. Além do mais, a análise das estruturas dos grupos responsáveis pelo intercruzamento no TEG e no HD (ver figuras 17 e 22 respectivamente) mostram que são mais longos que o divinilbenzeno, justificando deste modo, a maior mobilidade detectada nestas resinas através da metodologia da RPE.
Figura 43: Espectro de RPE das resinas BAR, ATEG e AHD (2% de intercruzamento), marcadas com Fmoc-TOAC, em DCM, DMF e DMSO.
ATEG-DMS ATEG-DMF 3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540 -8000 -6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 ATEG - DCM BAR - DCM 3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540 -10000 -8000 -6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 BAR - DMF 3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540 -300 -200 -100 0 100 200 300 BAR - DMSO 10G AHD- DMF AHD-DMSO 3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540 -10000 -5000 0 5000 10000 AHD - DCM
Tabela 15: Dados de RPE das resinas solvatadas em DCM, DMF e DMSO. Resina Solvente w0 [G] BAR DCM 1.709 BAR DMF 3.425 BAR DMSO 5.651 ATEG DCM 2.114 ATEG DMF 1.969 ATEG DMSO 2.207 AHD DCM 1.769 AHD DMF 1.961 AHD DMSO 6.754
4.3. Algumas aplicações biológicas dos copolímeros e derivados obtidos
Neste tópico, iniciamos uma parte que terá diversos desdobramentos no decorrer dos próximos anos e que se refere a ensaios de potencialidade de uso dos copolímeros e derivados obtidos. Na presente tese, iniciamos com a comparação de lotes de BAR em termos de eficiência para a síntese peptídica. Estes lotes serão todos de 2% de intercruzamento de divinilbenzeno mas sintetizados em condições diferenciadas (lotes DVB 3, 4, 5 e 6) expostos na tabela 2. O objetivo seria portanto investigar se por exemplo, o tipo de solvente eluente, empregado na síntese do copolímero de partida (DVB) poderia afetar o rendimento final da síntese de um peptídeo-modelo.
Em complemento, as resinas aminadas ATEG e AHD também serão testadas em comparação à BAR, para efeito da síntese do mesmo peptídeo. E finalmente, iniciaremos em caráter preliminar, o teste do copolímero de DVB derivado com grupamentos sulfônicos, sintetizado anteriormente (DVBS2).
Ao final, faremos uma discussão global com perspectivas do uso destes materiais poliméricos, incluindo-se também as possíveis potencialidades para outras finalidades, envolvendo-se inclusive a PEG-BAR que sintetizamos anteriormente.
4.3.1. Comparação de eficiência de síntese peptídica de lotes de BAR com 2% de intercruzamento e provenientes de DVB -3, 4, 5 e 6.
Para este teste comparativo de eficiência sintética com os quatro lotes de BAR (BAR 3, 4, 5 e 6) já mencionados e contendo graus de substituição ao redor de 1,8 mmol/g, utilizamos como peptídeo-modelo, o octapeptídeo angiotensina II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe, AII-NH2) (Timmermans, Wong et al. 1993). As sínteses foram efetuadas pela
química Boc na escala de 0,4 mmol e os aminoácidos His, Tyr, Asp e Arg tiveram as suas cadeias laterais reativas protegidas com os grupamentos tosila (Tos), 2-bromobenziloxicarbonila (2-Br-Z), ciclohexila (OcHx) e (Tos), respectivamente. O sistema de solvente empregado durante o acoplamento foi a mistura DCM/DMF (1:1) utilizando-se dos agentes acoplantes DIC/HOBt, em excesso molar de 2,5 vezes em relação ao teor de amino grupos da resina. Após cerca de 2 h de reação, o acoplamento de todos os resíduos foi monitorado pelo teste qualitativo de ninidrina (Kaiser et al., 1970). As peptidil-resinas foram clivadas em uma única etapa de tratamento com HF anidro (2 h, 0 °C), extraído em 5% ácido acético e liofilizados.
Os peptídeos brutos, em forma de pó branco amorfo, foram caracterizados por HPLC analítico, espectrometria de massa e análise de aminoácidos. Os perfis dos peptídeos brutos obtidos nos quatro lotes de BAR podem ser vistos na figura 44. E o espectro de massa de um deles (BAR 5) está representado, como exemplo, na figura 45, confirmando que o principal pico (PM 1046) é o desejado.
Os rendimentos obtidos, via área do pico desejado no cromatograma de HPLC analítico situou-se na faixa de 40-90%. Embora todos os perfis apresentados estejam razoavelmente bons, podemos observar que uma delas se sobresaiu em relação às demais. A síntese na BAR 5 teve um percentual bem acima da média das outras resinas, atingindo rendimento ao redor de 90% Não encontramos ainda uma explicação plausível para esta diferenciação no rendimento da síntese. Apenas temos como informação que o copolímero que lhe deu origem foi obtido, tendo como solvente eluente da polimerização, a mistura 1:1 de tolueno e n-heptano. Estudos adicionais deverão ser efetuados para um melhor esclarecimento deste importante resultado sintético pois o grau de eficiência foi muito mais elevado que nas sínteses normalmente efetuadas em nosso laboratório.
Figura 44: Perfis em HPLC do peptídeo bruto AII- NH2, sintetizado nas resinas BAR 03,
04, 05 e 06, pela estratégia t-Boc.
BAR04 BAR03
BAR05
800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 m /z 0 100 % 1046 1046 785 1002
Figura 45: Espectro de massa do peptídeo bruto AII- NH2, sintetizado na resina BAR 05.
4.3.2. Comparação de eficiência de síntese peptídica nas resinas ATEG e AHD
As resinas ATEG e AHD obtidas a partir dos copolímeros TEG e HD (2% de intercruzamento), foram também testadas como suporte para síntese do peptídeo AII- NH2,
lançando-se mão agora da química Fmoc, conforme descrito por Kumar (Kumar, Pillai et al. 2000). A escala de síntese foi também de 0,4 mmol e os aminoácidos His, Tyr, Asp e Arg tiveram as suas cadeias laterais reativas protegidas com os grupamentos tritila (Trt), terc-butila (But), terc-butila (But) e 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonila (Pmc), respectivamente. O solvente DMF foi o empregado para a etapa de acoplamento, com DIC/HOBt como agentes acilantes, em excesso molar de 2,5 vezes em relação ao teor de amino grupos da resina. Após cerca de 2 h de reação, os acoplamentos se completaram, sendo os peptídeos clivado com o reagente K por 4 horas (Fields and Noble 1990) e os peptídeos brutos foram caracterizados por HPLC analítico e os perfis obtidos nas duas resinas e os espectros de massa dos peptídeos podem ser vistos nas figuras 46 e 47, respectivamente.
Figura 46: Perfis em HPLC do peptídeo bruto AII- NH2, sintetizado nas resinas (a) ATEG
e (b) AHD pela estratégia Fmoc.
(a)
Figura 47: Espectros de massa do peptídeo AII- NH2, bruto sintetizado nas (a) ATEG e (b)
AHD.
Os rendimentos obtidos, via área do pico desejado no cromatograma de HPLC indicaram razoavel eficiência destas resinas, com 80% e 70% para ATEG e AHD respectivamente, sendo portanto indicativo de que ambas as resinas são apropriadas para o uso em síntese peptídica. Além disso, quanto aos perfis apresentados, embora estejam razoavelmente bons, observamos que a resina ATEG apresentou um percentual acima da resina AHD. 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 m /z 0 100 % 1046 1046 785 1002 (a) (b)
4.3.3. Avaliação cromatográfica do derivado sulfônico do DVB (DVBS2)
A relevância do fenômeno da solvatação de resinas se estende também ao caso de utilização em cromatografias líquidas em coluna. Neste aspecto, o estudo de lotes de resina BAR, com diferentes teores amínicos (Marchetto, Etchegaray et al. 1992), serviu para averiguarmos se a protonação destes grupos afetaria, na dependência de sua quantidade, a característica apolar da matriz polimérica. Comprovou-se que quanto maior o teor de grupos carregados positivamente desta resina, melhor o seu inchamento em solventes polares, incluindo-se a água. Esta constatação nos fez supor que esta resina, originalmente introduzida apenas para a obtenção de peptídeos em meio orgânico, poderia ser também empregada como suporte sólido para cromatografia de troca aniônica, efetuada usualmente em meio aquoso. Comprovando esta hipótese, ensaios de purificação cromatográfica com peptídeos (Etchegaray, Carvalho et al. 1994; Etchegaray, Carvalho et al. 1996) ou outros compostos biológicos contendo cargas negativas foram bem sucedidos em lotes de BAR com teores amínicos protonados acima de 2 mmol/g (Carvalho, Straus et al. 2000; Carvalho, Tersariol et al. 2000; Carvalho, Nakaie et al. 2003; Silva, Etchegaray et al. 2005). Neste mesmo sentido, uma outra resina aminada em estrutura da DVB e denominada aminometil-resina (AMR), introduzida também para uso em síntese peptídica (Mitchell, Kent et al. 1976; Mitchell, Kent et al. 1978), contendo elevado teor amínico se mostrou também um suporte com propriedade de trocadora aniônica (Carvalho, Ianzer et al. 2005).
Como continuação para este tipo de enfoque e estendendo-se para o caso de outros derivados de polímeros de poliestireno, a derivada sulfônica (DVBS2), com teor de 2,4 meq/g, foi também preliminarmente testada para efeito de separação de compostos catiônicos, em meio aquoso.
Parte Experimental
A coluna foi preenchida com 3 g da resina DVBS2 (2,4 meq), perfazendo um total de 7,2 meq de grupamentos negativos (-SO3-), contra 5 mg (aproximadamente 5 µmol) de
cada peptídeo injetado na coluna. Os peptídeos escolhidos foram P1: DEVYEDPF- CONH2, com carga aproximada de -3 em pH 5, que foi empregado como controle para
determinação do volume vazio da coluna e P2: DHVYIHPF-CONH2 com carga +2 nestas
mesmas condições.
Em termos de resultados cromatográficos, iniciamos com experimento de eluição em gradiente ácido de solução 0,02 M NH4Ac pH 5,0 até 20% de ácido acético glacial
(200 mL cada) e o fluxo foi de 30 mL/h. O perfil de eluição dos peptídeos está mostrado na figura 48. Observamos que o peptídeo de carga negativa, que foi utilizado como marcador, saiu normalmente no volume morto da coluna e logo em seguida, mas com ligeira retenção, eluiu o peptídeo com carga positiva.
Análise do perfil obtido indica que na condição cromatográfica testada até o momento, houve fraca interação entre o suporte e o soluto positivo, sugerindo que talvez em outras condições cromatográficas, variando-se a massa da resina, gradiente, fluxo, tipo de soluto, etc, possa-se otimizar a eluição de compostos positivos nesta coluna sulfônica
Figura 48: Cromatografia de troca catiônica de 5 mg (aproximadamente 5 µmol) dos peptídeos P1: DEVYEDPF-CONH2 (-3) e P2: DHVYIHPF-CONH2 (+2) respectivamente,
em coluna contendo 3 g da resina DVBS2 (8,4 meq). Gradiente aquoso ácido linear de 0,02 M de acetato de amônio, pH 5,0 a 20% de ácido acético glacial (200 mL cada). Fluxo de 30.0 mL/h). 400 300 200 100 0 0,15 0,075 0 20 10 0 VOLUME DE ELUIÇÃO (mL) A 27 5n m HO A c ( % ) P1 P2 H O A c 1 0 % Ac OH AcOH 10%
4.4. Teste da Resina DEAE-Macroprep para síntese peptídica e posterior cromatografia em coluna (afinidade e troca aniônica)
Em trabalhos realizados anteriormente pelo nosso grupo (Nakaie, Lanzer et al. 2003), verificamos que a resina comercial de troca aniônica fraca, DEAE-MacroPrep (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA), poderia ser também utilizada como suporte sólido para síntese peptídica. Possivelmente em função da presença de grupamentos amínicos, primários ou secundários, além do terciário DEAE, pressupomos nesta época que os dois primeiros poderiam servir de sítios de interação do aminoácido C-terminal de uma seqüência peptídica. Esta pressuposição parece ter sido confirmada pois foi possível a síntese do octapeptídeo AII e também do segmento repetitivo (NANP)3, que é um epitopo
imunodominante encontrado em esporozoítos do Plasmodium falciparum (Dame, Williams et al. 1984).
Sucintamente, observamos que além da viabilidade destas sínteses: i) o teor destes sítios reativos se situa na faixa de 0,1 mmol/g (contra cerca de 3,5 mmol/g do grupo catiônico DEAE); ii) a química Fmoc é a mais apropriada para a síntese em função da estabilidade física deste material polimérico nesta estratégia de síntese e também por sua boa solvatação em solvente do tipo DMF empregado nesta metodologia; iii) a clivagem final com o reagente K desta estratégia de síntese remove todos os grupamentos protetores das cadeias laterais mas mantêm as cadeias peptídicas presas à resina. Com estas constatações, partimos com sucesso para ensaios de afinidade de anticorpos da malária, empregando-se a peptidil-resina (NANP)3-DEAE-Macroprep, que possui como
característica favorável, o seu alto limite de exclusão dado pela matrix de poliacrilamida (BioRad Co., catálogo).
Apesar destes resultados, alguns experimentos adicionais com outras seqüências não foram bem sucedidos, principalmente na fase do alongamento da cadeia peptídica. Deste modo, procuramos neste tópico final desta tese, examinarmos complementarmente a potencialidade do emprego da resina cromatográfica DEAE-Macroprep para fins de síntese e posterior cromatografia de afinidade de uma outra classe de macromoléculas de interesse biológico em meio aquoso.
O sistema escolhido para testarmos de novo, a viabilidade de síntese peptídica, seguida de cromatografia de afinidade de uma macromolécula envolveu a purificação de alguns tipos de glicosaminoglicanos (GAG) como a heparina (HEP), heparan sulfato (HS) e outros. A estratégia se baseou na constatação anterior (Cardin and Weintraub 1989; Raboudi, Julian et al. 1992) que verificaram que na estrutura de uma proteína de interação com HEP/HS, de peso molecular ao redor de 24.000 Da, identificada por Rohde (Rohde, Julian et al. 1996), existe uma seqüência (RPKAKAKAKAKDQTK) que se liga seletivamente à HEP e certas formas de HS (Liu, Smith et al. 1996).
A proposta a ser examinada foi portanto a de tentarmos sintetizar a seqüência pentadecapeptídica acima mencionada na DEAE-Macroprep e que doravante será denominada HIP-DEAE-Macroprep. Se viável, testaremos a separação por afinidade dos glicosaminoglicanos como a HEP, HS e outros como o condroitin sulfato (CS) e dermatan sulfato (DS) nesta peptidil-resina.
4.4.1. Síntese da HIP-DEAE-Macroprep
Partindo-se de uma escala de 0.3 mmol (3 g da resina DEAE-MacroPrep) e utilizando-se um excesso molar dos reagentes de 10 vezes, os acoplamentos foram efetuados com os reagentes DIC/HOBt e quando necessário, reacoplou-se com HBTU/HOBt/DIEA em DMF. Os grupos protetores das cadeias laterais dos Fmoc aminoácidos utilizados foram: But para Asp e Thr, Pmc para Arg e Trt para a His e Gln. Em inúmeros pontos da seqüência, fez-se necessário realizar reacoplamento. Após o encerramento da síntese, uma alíquota da resina foi tratada com HF anidro para remoção do peptídeo sintetizado e posterior caracterização de sua pureza. O perfil de HPLC analítico apresentado na figura 49 indica uma pureza mínima de cerca de 60%. Dados de espectrometria de massas mostram que o peptídeo obtido foi o esperado m/z: 1668 (teórico); 1668.4 (obtido) e a análise de aminoácidos deu os seguintes valores de proporção relativas: Arg (0.95); Pro (1.01); Lys (5.92); Ala (4.11); Asp (1.16); Gln (1.09); Thr (0.94).
Em função destes resultados, todo o restante da peptidil-resina HIP-DEAE-Macroprep sintetizada foi tratada convencionalmente com o reagente K ((Fields and Noble 1990; King, Fields et al. 1990) por 5 h, à temperatura ambiente, para a remoção de todos os grupos protetores das cadeias laterais dos aminoácidos da seqüência.
Figura 49: Perfil de HPLC do peptídeo bruto RPKAKAKAKAKDQTK, sintetizado na resina comercial DEAE-Macroprep.
4.4.2. Purificação cromatográfica de glicosaminoglicanos com HIP-DEAE-Macroprep
Os GAGs (Brimacombe and Weber 1964) são polímeros lineares de açucares constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas compostas por uma hexosamina (glucosamina ou galactosamina) e um açúcar nitrogenado (ácido D-glucurônico, ácido L -idurônico ou D-galactose) unidos entre si através de ligações glicosídicas. Estes polímeros possuem uma alta densidade de cargas negativas conferidas pela presença de grupamentos carboxílicos dos ácidos urônicos e/ou grupamentos sulfatos. Os principais glicosaminoglicanos ácidos encontrados nos tecidos animais são: condroitim 4-sulfato (CS), condroitim 6-sulfato (CS), dermatam sulfato (DS), heparam sulfato (HS), heparina (HEP), queratam sulfato (QS) e ácido hialurônico (AH). As estruturas desses polímeros podem ser visualizadas na figura 50.
A HEP e o HS são importantes constituintes da matriz extracelular, presentes em vários tecidos, e participam de várias funções, como adesão celular, migração, proliferação, morfogênese e patogenicidade viral entre outras funções (Hassell, Cintron et al. 1983;
Poole 1986; Jackson, Busch et al. 1991; Ruoslahti and Yamaguchi 1991; Templeton 1992). Considerando dessa forma todos esses aspectos e além disso, avaliando-se ainda o importante papel da HEP na medicina como droga antitrombótica e anticoagulante, acreditamos ser essa seqüência, uma opção muito relevante e interessante para o desenvolvimento de uma nova resina de afinidade.
As colunas cromatográficas foram empacotadas e preparadas conforme descrito em Materiais e Métodos. Os lotes de DEAE-Macroprep, sem sequência peptídica ligada e do HIP-DEAE-Macroprep, foram pré-tratados com 20% EtOH em água e lavados extensivamente com o tampão inicial, antes de serem ensaiados de forma a manter a coluna equilibrada (Nakaie, Lanzer et al. 2003).
A capacidade cromatográfica dos suportes DEAE-Macroprep e HIP-DEAE-Macroprep como resina de afinidade foi testada fracionando-se os GAGs: CS, DS, HS e HEP. Aproximadamente 2,5 mg de cada composto foi aplicado em uma coluna contendo 1.9 g de resina equilibrada em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7.4 e empregando-se um gradiente salino de 0 a 2 M de NaCl . O volume coletado por tubo foi de 1.5 ml, em um fluxo de 20 mL/h.
Para a eliminação do sal dos tubos coletados, foi realizado uma nova purificação utilizado-se uma coluna empacotada com a resina comercial DEAE-Sephadex AG50® e a detecção das frações dos GAGs isolados foi confirmado através do reagente DMB e analisado em leitor de Elisa. A leitura das placas foi realizada em 490 nm em um leitor ELX-800 Universal Microplate r (Bio Tek Instruments, Inc. USA).
A figura 51 apresenta o perfil de eluição obtido do fracionamento da mistura CS/DS/HEP nas resinas DEAE-Macroprep e HIP-DEAE-Macroprep. Como podemos observar, o composto CS é rapidamente eluído, seguido de DS e finalmente pela HEP em ambas as resinas. Entretanto, somente na resina HIP-DEAE-Macroprep, a HEP foi claramente separada dos outros solutos, como mostra a figura 51 (B).
Figura 50: Unidades estruturais dos glicosaminoglicanos (CS) (CS) (DS) (AH) (QS) (HS) (HEP)
Figura 51: Perfis cromatográficos da mistura CS/DS/HEP em DEAE-Macroprep (A) e HIP-DEAE-Macroprep (B). Ttampão Tris-HCl 50 mM pH 7.4 e gradiente salino de 0 a 2 M de NaCl e fluxo de 20 mL/h.
Para melhor avaliar a capacidade de fracionamento dessas resinas, um novo ensaio cromatográfico foi realizado, porém utilizando somente o HEP e HS, como solutos (Figura 52). Somente um pico simples foi observado no cromatograma em cada uma das resinas, embora se observe uma maior retenção dos solutos quando eluídos na HIP-DEAE-Macroprep.
Figura 52: Perfis cromatográficos da mistura HEP/HS em DEAE-Macroprep e HIP-DEAE-Macroprep. Ttampão Tris-HCl 50 mM pH 7.4 e gradiente salino de 0 a 2 M de NaCl e fluxo de 20 mL/h. 0 ,0 0 ,2 0 ,4 0 ,6 0 ,8 1 ,0 1 ,2 1 ,4 1 ,6 1 ,8 2 ,0 0 ,0 0 ,1 0 ,2 0 ,3 0 ,4 D E A E H IP (Au) N aC l 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 HEP CS DS NaCl (B) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 HEP CS DS Ab s (Au ) NaCl (A)
Após estes ensaios cromatográficos realizados com estas duas resinas, verificamos que somente estes dados não seriam suficientes para concluirmos se a resina HIP-DEAE-Macroprep foi mais eficiente na purificação do que a DEAE-HIP-DEAE-Macroprep. Decidimos então realizar outros tipos de ensaios determinantes da purificação dos solutos como a separação em gel de agarose e/ou poliacrilamida e se necessário degradação enzimática. (Dietrich, Depaiva et al. 1985; Nader, Porcionatto et al. 1990).
Para verificarmos portanto, se houve uma purificação parcial ou total dos dois compostos, HS e HEP, ou até mesmo de HEP com diferentes pesos moleculares, caracterizamos cada tubo coletado do segundo ensaio de purificação (figura 52), em eletroforese em gel de poliacrilamida e/ou agarose, conforme descrito em Materiais e Métodos.
O primeiro gel corrido, foi de poliacrilamida usando o tampão TBE (Tris 0,9 M; ácido bórico 0,9 M; EDTA 25 mM, pH 8.4/8.6 ). Foram feitas duas aplicações de 5 µL cada e após a corrida, o gel foi corado com azul de toluidina e revelado com 1% AcOH. As amostras foram reveladas no gel e identificadas em papel semi-logarítmico, conforme mostra a figura 53. Este experimento revelou dois aspectos interessantes: primeiro uma diferenciação entre os fracionamentos indicando maior tempo de retenção da HEP na resina HIP-DEAE-Macroprep e segundo, uma separação das amostras com pesos moleculares diferentes após eluição na coluna de HIP-DEAE-Macroprep. Este primeiro ensaio parece confirmar portanto, o perfil observado na separação cromatográfica, indicando dessa forma que houve interação entre o ligante peptídico preso à resina e a HEP.
O segundo gel corrido foi de agarose, usando um tampão de 40 mM de acetato de bário pH 5,8 por 10 minutos, pausa de quinze minutos e depois o gel foi transferido para um tampão de 1,3-diaminopropano acetato (PDA), onde correu por aproximadamente 3 horas. Após esse período, foi colocado em brometo de cetil trimetilamônio (CETAVLON) e posteriormente, a lâmina com o gel foi seca e corada em azul de toluidina, revelando dessa forma as bandas características das amostras aplicadas, conforme podemos ver nas figuras 54 (DEAE-Macroprep) e 55 (HIP-DEAE-Macroprep).
Considerando-se dessa forma, a quantidade de material aplicado nos geis, 12 amostras da resina DEAE-Macroprep, contra 18 amostras aplicadas na resina HIP-DEAE-Macroprep, verificamos portanto, que o material injetado na coluna empacotada com a resina DEAE-Macroprep, apresentou menor interação entre a resina e o soluto, quando
comparado com a resina HIP-DEAE-Macroprep, na qual, foram necessários 18 tubos, para coletar todo o material injetado, mostrando claramente estar ocorrendo maior interação entre os solutos e a resina, como podemos ver pela análise dos géis corridos.
Figura 53- Fracionamento de HS e HP nas resinas HIP-DEAE-Macroprep (●) e DEAE-Macroprep (■)
Continuando ainda com a avaliação comparativa da capacidade de separação dos GAGs em ambas as resinas, todo material coletado, proveniente do segundo fracionamento nas duas resinas e livres de sal, foram agora liofilizados e transferidos para Eppendorfs e ressuspendidos em 20µL de água bidestilada. e posteriormente, foram submetidos a uma degradação enzimática com heparitinase I e II, comumente utilizadas na degradação de HS. (Silva and Dietrich 1975; Dietrich and Dietrich 1976; Nader, Porcionatto et al. 1990), Estes compostos são enzimas obtidas de Flavobacterium heparinum sendo que a heparitinase I degrada extensivamente heparam sulfato ou heparam sulfato N-acetilado, porém não apresenta atividade sobre heparina ou heparina N-acetilada. Esta enzima atua sobre ligações glicosídicas do tipo α(1-4) entre o resíduo de D-glucosamina (N-acetilada ou N-sulfatada) e ácido β-D-glucurônico, Já a heparitinase II atua sobre o heparam sulfato,
1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000
(D
al
tons)
Distância (cm)
Deae HIPCurvas de determinação de peso molecular
por eletroforese em gel de poliacrilamida
quebrando as ligações glicosídicas do tipo α (1-4) entre D-glucosamina acetilada ou N-sulfatada) e ácido α-L-idurônico. A heparitinase II também atua sobre os tetrassacarídeos produzidos pela ação da heparinase sobre a heparina, apresentando dessa forma, uma ampla especificidade. Somente portanto a combinação da duas heparitinases degrada completamente o heparam sulfato. A incubação destas enzimas é feita a 30ºC em tampão etilenodiamino acetato (EDTA) 0,06 M e pH 7,0.
Após o período de degradação enzimática dos compostos, as amostras foram novamente comparadas por eletroforese em gel de agarose. Os resultados estão apresentados nas figuras 56 e 57, onde pode-se observar que a resina HIP-DEAE-Macroprep não só reteve mais fortemente a HEP, mas mais relevante, essa peptidil-resina, parece também, por afinidade, ser capaz de fracionar parcialmente diferentes componentes da heparina (HEP).
Os resultados aqui apresentados parecem indicar claramente estar havendo interação entre o ligante, uma seqüência com afinidade para GAGs e os compostos HS e HEP. Acreditamos que uma confirmação absoluta poderia ser obtida, utilizando-se uma coluna cromatográfica com uma maior quantidade de peptidil-resina ou mesmo com alterações no protocolo cromatográfico. Uma última observação que deve ser feita em termos conclusivos deste tópico, refere-se ao fato de que peptidil-resina estudada, pode estar fracionando os glicosaminoglicanos mencionados por afinidade, conforme discutido, mas também por troca aniônica. Isto se deve ao fato da presença em grande quantidade dos resíduos catiônicos de DEAE, o que deve ser sempre considerado para uma avaliação final da eficiência cromatográfica. De qualquer modo, como comparativamente ao DEAE-Macroprep, a resina contendo o peptídeo HIP pareceu ser mais eficiente no fracionamento, pode-se concluir que houve uma interação por afinidade entre o mesmo e os glicosaminoglicanos estudados.
Figura 54: Perfis de eletroforese em gel de agarose dos compostos HS/HEP eluidos na resina DEAE-Macroprep. Tampão de 40 mM de acetato de bário pH 5,8 e 50 mM de 1,3-diaminopropano acetato (PDA) pH 9,0.
Figura 55. Perfis de eletroforese em gel de agarose dos compostos HS/HEP, eluídos na resina HIP-DEAE-Macroprep. Tampão de 40 mM de acetato de bário pH 5,8 e 50 mM de 1,3-diaminopropano acetato (PDA) pH 9,0.
Figura 56: Perfis de eletroforese em gel de agarose de frações de HS/HEP, eluidos na resina DEAE-Macroprep. (após degradação enzimatica com heparitinase I e II).
Figura 57. Perfis de eletroforese em gel de agarose de frações de HS/HEP, eluídos na resina HIP-DEAE-Macroprep (após degradação enzimatica com heparitinase I e II)
5. CONCLUSÕES
5.1. Síntese dos copolímeros DVB, TEG e HD: efeitos do grau de intercruzamento e do solvente diluente:
a) Em tolueno: i) a síntese do TEG parece ser a mais difícil pois notamos maior índice de ruptura da sua estrutura polimérica em forma de grãos. Os copolímeros DVB e HD apresentaram no geral, rendimentos de síntese maiores. Contra uma média de rendimento ao redor de 50 a 80 g em um total teórico de 100 g, o TEG atingiu média ao redor de 35 g; ii) grãos maiores (600 µm) foram obtidos com bom rendimento no caso do DVB de 0,5% de intercruzamento e HD, com 0,5 e 50% de intercruzamento; iii) grãos menores (125 µm) foram predominantemente obtidos apenas nos lotes de DVB com elevado teor de intercruzamento (10 e 50%);
b) Em tolueno:heptano (1:1): tanto neste sistema de solvente misto quanto em n-heptano, somente houve possibilidade de análise conclusiva nos casos dos copolímeros contendo 2, 10 ou 30% de intercruzamento. Nos de 0,5 e 50%, testou-se apenas a síntese em tolueno, conforme destacado no item anterior. As conclusões retiradas com base neste sistema de solvente misto foram: i) diferentemente das sínteses efetuadas em tolueno puro, notou-se significativa predominância de grãos com tamanhos menores (principalmente de 125 µm). A predominância de grãos com este tamanho ocorreu nos DVB de 2 e 30% de intercruzamento e no TEG de 10%; ii) comparativamente ao tolueno puro, esta mistura se mostrou menos eficiente na obtenção de grãos íntegros mas por outro lado, parece ser o sistema de solvente indicado para a obtenção de grãos de tamanhos menores.
c) Em n-heptano: i) neste solvente, obtiveram-se os piores rendimentos de síntese do copolímero TEG, chegando-se a valores quase nulos em diferentes graus de intercruzamento (2, 10 e 30%); ii) surpreendentemente, a síntese do TEG 50% de intercruzamento deu grãos grandes (600 µm) e, com rendimento ao redor de 70 g em 100 teóricos; iii) como nos demais solventes, o rendimento da síntese de HD se assemelhou mais ao do DVB que ao de TEG, com rendimentos, no geral, mais elevados; iv) o efeito deste solvente é complexo pelo fato de sua eficiência ser dependente do copolímero a ser sintetizado; v) ainda dentro do emprego deste sistema de solvente, observamos a produção
de lotes dos três copolímeros com baixo valor de densidade em relação aos demais lotes. Este dado foi observado no caso dos lotes com reticulação de 10 e 30%, indicando portanto um efeito típico do solvente em polímero com determinado grau de reticulação.
d) Sem solvente eluente: i) pela análise da figura 16, observa-se que comparativamente a outros copolimeros, os DVB com alto grau de intercruzamento apresentam maiores porcentagens de grãos com tamanhos de 600 µm íntegros. Esta tendência não foi observada claramente nos DVB de 2%, sintetizados nos demais solventes.
Em suma, algumas regras ainda não muito claras puderam ser retiradas deste conjunto de resultados. No entanto, baseando em três variáveis (tipo de copolímero, grau de intercruzamento e sistema de solvente), o passo seguinte necessário para uma avaliação mais concreta das regras que governam a obtenção de copolímeros dos tipos aqui estudados, será dependente de novos protocolos experimentais que estão atualmente em curso. Acreditamos que com isto, poderemos adquirir no devido tempo, a autonomia de síntese, evitando-se a importação destes materiais essenciais não somente para a síntese peptídica mas com potencialidades para outras aplicações práticas.
De algum modo, esta fase em que estamos à procura do protocolo experimental apropriado para a obtenção de um determinado copolímero se assemelha muito ao que passamos anos atrás, (Marchetto 1988; Marchetto, Etchegaray et al. 1992), quando, após exaustivos experimentos, encontramos as variáveis necessárias para a obtenção de BAR com um teor amínico desejado, lotes com grupamentos fenilmetilamínicos acima de 2 mmol/g um valor portanto bem mais elevado que os existentes nas demais resinas comerciais e que se situa usualmente na faixa de 0,4 mmol/g. Estas tentativas vieram contra a concepção naquele momento existentes de uma quase impossibilidade do controle do grau de substituição amínica desta resina, mencionada por diferentes autores (Christensen, Schou et al. 1981; Pedroso, Josa et al. 1987). Esperamos que de modo similar, possamos nas próximas etapas, estabelecermos regras bem mais claras de obtenção de um determinado copolímero, com características previamente pré-estabelecidas e necessárias para determinados objetivos.
5.2. Síntese e estudos de derivados dos copolímeros obtidos
Dentre as diversas opções existentes de derivação da estrutura de copolímeros, resolvemos na presente tese, iniciarmos com a obtenção e estudos dos seguintes derivados:
a) Benzidrilamino-resina (BAR): quatro lotes com 2% de intercruzamento mas, obtidos em sistemas de solventes diferenciados, foram sintetizados e avaliados quanto às suas propriedades de solvatação e posteriormente, de eficiência em síntese peptídica. As sínteses deram bons rendimentos, com graus de substituição amínica ao redor de 1,8 mmol/g. Estudos de microscopia (Cilli, Oliveira et al. 1996; Malavolta, Oliveira et al. 2002; Malavolta and Nakaie 2004; Marchetto, Cilli et al. 2005; Nakaie, Malavolta et al. 2006; Cilli, Vicente et al. 2007) indicaram que esta resina apresenta, quando os seus amino grupos estão na forma desprotonada (condição de síntese peptídica –etapa de acoplamento), melhor inchamento em solventes mais apolares, caracterizados por valores de (AN+DN) baixos. Este resultado é indicativo do efeito dominante de sua estrutura poliestirênica, de caráter apolar. Estes dados foram também confirmados por estudos de RPE, através da marcação com o derivado Fmoc-TOAC, onde se observou que esta resina apresentou maior grau de mobilidade de sua estrutura polimérica em solventes também mais apolares (ex., DCM).
b) Polietilenoglicol-BAR (PEG-BAR): partindo-se de um dos lotes da BAR com 2% de intercruzamento e 1,8 mmol/g de teor amínico, este composto foi derivado com diferentes teores de ácido metoxipolietilenoglicólico (PEG), de peso molecular 5 000. A marcação foi efetuada de tal modo que cerca de 50 e 70% dos grupamentos amínicos da BAR fossem acilados com o PEG. O objetivo foi o de assimilarmos uma das estratégias de alteração possível relacionada com a característica de polaridade de um material polimérico, transformando-o em um derivado mais polar. Esta característica pode ser confirmada pela avaliação do grau de inchamento por microscopia dos dois lotes de PEG-BAR em dezenas de sistemas de solventes que abrangeram toda a escala de polaridade de solventes. Quanto maior o teor de PEG incorporado, melhor foi o inchamento em solventes mais polares.
c) Derivado sulfônico do DVB (10 e 50% de intercruzamento): este derivado foi mais um sintetizado, objetivando-se a obtenção de uma resina aniônica que pudesse ser testada para
o fracionamento de compostos catiônicos. Dois lotes foram obtidos com bom rendimento, contendo 1,8 e 2,4 mmol/g de grupamentos sulfônicos por grama em sua estrutura.
d) Derivados aminados do TEG (ATEG) e HD (AHD) (de 2% de intercruzamento): estas resinas foram obtidas para avaliação de suas propriedades de solvatação, via RPE e posterior emprego alternativo na síntese de peptídeos. Confirmando a importância do tipo de intercruzamento efetuado, notaram-se significativas diferenças de mobilidade nas matrizes de suas estruturas poliméricas. A BAR (1,8 mmol/g) e a AHD (0,41 mmolg) se mostraram mais equivalentes, com boa mobilidade em solventes mais apolares e muito ruins no fortemente nucleofílico DMSO, enquanto que a ATEG (0,75 mmol/g), com intercruzamento de diacrilato de tetraetilenoglicol, se mostrou igualmente solvatável tanto em solventes apolares como o DCM quanto nos polares como o DMF e mesmo DMSO. Esta característica pode ser relevante para a aplicação em síntese peptídica pois possui a propriedade de solvatação igualmente eficiente em solventes de características diferenciadas.
5.3. Algumas aplicações biológicas dos derivados de DVB, TEG e HD sintetizados
a) Síntese peptídica comparativa em BAR com 2% de intercruzamento: quatro lotes diferenciando-se apenas quanto ao protocolo de obtenção dos correspondentes copolímeros de partida (sem solvente, com tolueno, com 1:1 tolueno-n-heptano e n-heptano), foram utilizados para a síntese do octapeptídeo modelo angiotensina II (AII). Apenas o lote proveniente da síntese do copolímero obtido no sistema de solvente tolueno-heptano (1:1) apresentou um ótimo rendimento (ao redor de 90%), no peptídeo bruto, mesmo antes da purificação. Não foi possível até o momento, o esclarecimento deste resultado inesperado, se comparado com os obtidos nos outros lotes de BAR.
b) Síntese peptídica comparativa em ATEG e AHD: em conjunto com a BAR que havia apresentado o melhor resultado sintético (cerca de 90% de rendimento), os lotes já descritos de ATEG e AHD também foram utilizados para a síntese da AII. Rendimentos ao redor de 60-70% foram obtidos nestas resinas, respectivamente, sugerindo que são resinas
alternativas para a obtenção de peptídeos mas empregando-se a química Fmoc e não a Boc, como no caso da BAR.
c) Ensaio de cromatografia de troca catiônica com o derivado sulfônico do DVB (DVBS2): este ensaio foi efetuado por enquanto, em apenas uma condição cromatográfica, objetivando a separação de um octapeptídeo de carga positiva em pH 5. Observou-se apenas ligeira retenção deste composto, pelo menos no protocolo experimental testado. Novas tentativas deverão ser feitas, variando-se diferentes parâmetros como o tamanho da coluna, gradiente, etc.
5.4. Ensaios de síntese e purificação cromatográfica de glicosaminoglicanos em HIP-DEAE-Macroprep-resina
a) Com base na constatação de que um pentadecapeptídeo (RPKAKAKAKAKDQTK) pertencente a uma proteína denominada HIP, parece ser a responsável pela afinidade desta proteína à heparina (HEP) e outros glicosaminoglicanos, testou-se a síntese deste peptídeo na resina comercial de troca aniônica DEAE-Macroprep, como já havíamos feito anteriormente com uma outra seqüência peptídica para isolamento, por cromatografia de afinidade de anticorpos contra o Plasmodium falciparum (malária).
b) A síntese desta peptídil-resina necessitou de diversas etapas de reacoplamento de aminoácidos, indicando sérias dificuldades na parte sintética. A análise da pureza do material obtido indicou razoável grau de homogeneidade do peptídeo sintetizado na matriz desta resina comercial (DEAE-Macroprep).
c) Ensaios de purificação cromatográfica indicaram, por diferentes estratégias de caracterização dos produtos fracionados na coluna de HIP-DEAE-Macroprep e em comparação com o DEAE-Macroprep (padrão), que a presença do peptídeo HIP na primeira, favorece o fracionamento da heparina e outros glicosaminoglicanos. Estes resultados confirmam portanto, dados anteriormente obtidos com outra macromolécula biológica e onde, uma resina comercial de de troca iônica como a DEAE-Macroprep pode servir também como suporte sólido, para o fracionamento por afinidade, de macromoléculas de interesse biológico. Uma das vantagens deste protocolo proposto é que
a resina em questão, possui alto grau de estabilidade física e química, associado a um dos maiores limites de exclusão de polímeros conhecidos (maior que 106 Da). Por fim, o fato de poder-se ligar um peptídeo por uma das extremidades, via síntese convencional, evita a heterogeneidade na cromatografia de afinidade, onde, de um modo geral, o ligante é acoplado à matriz do polímero com possibilidade de diversos modos de ligação, reduzindo portanto, a especificidade da peptidil-resina para a separação de macromoléculas, por interações de afinidade.
6. PERSPECTIVAS
O objetivo principal desta tese foi o de investirmos em uma das últimas etapas da metodologia da síntese peptídica efetuada em polímeros e que ainda não temos autonomia. Desde a tecnologia da síntese de alguns derivados de aminoácidos e análogos não naturais até algumas resinas de partida necessárias para a obtenção de peptídeos foram desenvolvidas. Nesta procura pela aquisição de um grau maior de autonomia pelo nosso grupo, restava a parte correspondente à síntese do copolímero de partida para posterior derivação e emprego na obtenção de peptídeos. Esta estratégia também nos pareceu atraente no sentido da possibilidade destes derivados ou mesmo dos próprios copolímeros, poderem ser empregados para outras finalidades de cunho principalmente biológico.
Deste modo, em termos de perspectiva de emprego dos materiais produzidos nesta tese, além da parte de síntese de peptídeos (como a BAR, PEG-BAR, ATEG e AHD), outros poderão ser por exemplo, matrizes de cromatografias de troca iônica (DVBS, BAR ou mesmo a PEG-BAR). Na realidade, os resultados obtidos deixam antever em alguns casos, uma multiplicidade de usos. Diversos dados ainda não estão muito esclarecidos em termos de regras de síntese como é o caso da obtenção dos próprios copolímeros. Neste aspecto, outros protocolos experimentais deverão ser necessariamente desenvolvidos para um melhor esclarecimento das regras que devem governar a síntese destes materiais, dependente do tipo de copolímero, do grau de intercruzamento e do sistema de solvente eluente.
Sabe-se atualmente que a moderna metodologia da química combinatória (Hermkens, Ottenheijm et al. 1996; Thompson and Ellman 1996) lança mão de materiais poliméricos para o desenvolvimento de novas drogas terapêuticas, principalmente as de tamanhos mais reduzidos. A combinação desta estratégia com a da “biblioteca” de peptídeos (Lam, Salmon et al. 1991; Jung and Becksickinger 1992) pode fazer com que, milhares de compostos possam ser simultaneamente sintetizados ancorados em resinas, servindo para uma posterior etapa de avaliação das seqüências específicas para servirem de estruturas de reconhecimento de substratos/inibidores enzimáticos, de anticorpos e outras macromoléculas de interesse biológico.
Ainda no tocante à perspectiva da aplicação cromatográfica, já mencionamos a utilização da aminometil-resina (AMR) (Carvalho et al. 2005), inicialmente introduzida
apenas para a síntese peptídica mas que serve também para cromatografia de afinidade. Um outro exemplo neste sentido, é o do emprego de materiais poliméricos com características específicas que servem para a complexa metodologia da determinação de biodisponibilidade/bioequivalência de medicamentos no plasma de pacientes. Esta técnica, atualmente em grande evidência pelo fato de abranger o ensaio tanto de drogas novas quanto os já estabelecidos como os já comercializados como os genéricos e similares, envolve a comprovação do efeito in vivo dos mesmos, através de protocolos experimentais específicos. Esta técnica envolve tratamentos especiais do sangue retirado do paciente, seguida da etapa de extração sólido-líquido para separação da droga de outros componentes do plasma e posterior determinação de sua concentração e demais parâmetros farmacocinéticos, via HPLC e espectrometria de massa. Esta estratégia de extração sólido-líquido é a mais vantajosa pois é mais rápida, reduz o uso de solventes orgânicos e consiste na passagem do plasma contendo o medicamento por pequenos cartuchos porosos de material resistente, onde se acondicionam alguns tipos de polímeros granulares com propriedades para a retenção das drogas e eliminação de sais e outras moléculas fisiológicas.
A desvantagem neste caso, reside no fato destes cartuchos serem todos importados, de custo bastante elevado. Acreditamos que, em função das características que possam apresentar os polímeros a serem obtidos, poderão ser empregados para esta finalidade dentro dos cartuchos mencionados. Alguns resultados já coletados e apresentados com o DVB, TEG e HD ou mesmo de alguns de seus derivados, indicaram razoável capacidade de solvatação também em meio aquoso ou misturados com alguns solventes orgânicos polares como é o caso da acetonitrila ou MeOH. Estes dados são indicativos de que existem possibilidades de emprego destas resinas para estes ensaios de bioequivalêcia de medicamentos na etapa de extração sólido-líquido.
Em termos conclusivos, acreditamos que o campo abrangido por esta tese, é de amplo espectro, com potencialidades de aplicação em diferentes sub-áreas. Algumas já estão em andamento e acreditamos que podemos ter futuramente, diferentes tipos de materiais poliméricos, úteis para diversos campos de aplicação tecnológica.
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