Avaliação de anticorpos naturais humanos (xeno-anticorpos)
contra linfócitos de porco
Maria Regina Jobim, Peter J. Morris, Ken Welsh, Luiz Shozo Ozaki, Luiz Fernando Jobim
A presença de anticorpos naturais contra células de porco (xeno-anticorpos) foi analisada em soros de indivíduos normais e de pacientes imunossuprimidos, imunodeficientes primários e renais crônicos hiperimunizados. Em indivíduos normais a média dos títulos observada foi de 1:664. Em 80,9% de pacientes renais transplantados não foi observado redução do título dos xeno-anticorpos após um ano de imunossupressão. Nos pacientes imunodeficientes foi obser-vado um título mais reduzido, mas nunca inferior a 1:1. Após a eliminação dos anticorpos naturais do soro de pacientes renais crônicos hipersensibilizados com antígenos HLA, pela adsorção dos soros com eritrócitos de porco seguido do tratamento com dithiotreitol (DTT), foi obser vado que os anticorpos IgG anti-HLA não reagem com os antígenos de histocompatibilidade das células do porco. As conclusões deste trabalho foram: o título dos xeno-anticorpos em indivíduos normais é muito elevado; a imunossupressão utilizada nos transplantes renais não permite redução da barreira de anticorpos naturais; os imunodeficientes com títulos muito baixos destes anticorpos talvez possam usufruir de trans-plantes xenogênicos; o método de eliminação “in vitro” dos xeno-anticorpos é reproduzível; os soros dos pacientes renais crônicos hiperimunizados com antígenos HLA, não reagem cruzadamente com linfócitos de porco.
Hospital de Clínicas de Porto Alegre - Unidade de Imunologia Endereço para correspondência: Dra. Maria Regina Jobim Rua Ramiro Barcelos 2350 - Porto Alegre 90035-003 Fone: (051) 331-6125 - Fax: (051) 332 8324
(Trabalho realizado no Nuffield Department of Surgery, Universidade de Oxford, Inglaterra)
Xeno-anticorpos; transplante renal; anticorpos naturais humanos Xeno-antibodies; renal transplant; human natural antibodies
I n t r o d u ç ã o
A pesquisa com xeno-transplantes tem recebido
atenção crescente devido à falta de doadores para atender as longas listas de espera para transplantes alogênicos de rins, fígado e coração. A principal bar-reira aos transplantes com órgãos de animais está na presença de anticorpos naturais, presentes desde o nascimento no sangue humano e que reagem contra as células das mais diferentes espécies.
Os xeno-transplantes foram realizados entre diver-sas espécies, tendo sido adotada a nomenclatura de espécies discordantes e concordantes dependendo do nivel de anticorpos naturais (xeno-anticorpos) e o consequente grau de rejeição dos transplantes entre as mesmas. As espécies concordantes com o homem
são os Babuínos, Chimpanzés e Orangotangos. Anticorpos naturais citotóxicos de classe IgM estão presentes no homem contra todas as outras espécies de mamíferos testadas e classificadas como discordan-tes, sendo responsáveis pela rejeição hiperaguda de órgãos transplantados. 1,2 Dependendo da combinação
de espécies, a rejeição do enxerto pode ocorrer em minutos a poucas horas após a revascularização do órgão transplantado. 3,4
Os anticorpos naturais reagem com uma tríade de glicoproteínas conhecidas por gp115-135, na superfície das células endoteliais (CE). A identificação destas glico-proteínas foi feita em CE de porco e, possivelmente, estão presentes em todos os animais discordantes, mas ausentes em células humanas. 5,6 A reação destes
anticorpos com as glicoproteínas na superfície das CE faz com que a cascata do complemento seja ativada, traduzindo-se por um aumento de adesão de leucócitos polimorfonucleares e rápida perturbação celular, evidenciada pelo aumento do fluxo de cálcio, induzindo a ativação das CE com liberação de heparano sulfato proteoglicano que transforma o ambiente vascular de anticoagulante em pró-coagulante. A coagulação intravascular e o extravasamento de células e plasma para o interstício do órgão transplantado são responsáveis pela rejei-ção. 7,8
A porção das glicoproteínas responsável pelo es-tímulo na produção dos anticorpos naturais é o grupo glicídio α-galactosil (Galα1-3Galß1-4GlcNAc-R). 9,10 Os
epítopos α-galactosil são expressos na superfície ce-lular dos mamíferos não primatas, lemuróides e maca-cos da América do Sul (Novo Mundo) não sendo en-contrados em humanos e nos grandes macacos da Ásia e África (Velho Mundo). 11 Ao contrário,
observa-mos os anticorpos anti-Gal exatamente nos últiobserva-mos e são provavelmente decorrentes da estimulação antigênica de bactérias intestinais que expressam es-truturas semelhantes aos epítopos α-galactosil na membrana celular. 11 É possível que a presença dos
anticorpos nestes animais faça parte do sistema de defesa fisiológico preventivo contra a invasão do or-ganismo pelas bactérias intestinais. O padrão de dis-tribuição dos epítopos α-galactosil em mamíferos é o resultado da atividade da enzima α1, 3 galactosiltrans-ferase, que sintetiza os mencionados epítopos junto aos glicolipídios e glicoproteínas utilizando a uridina trifosfato galactose.
Esta barreira natural de anticorpos tem, infeliz-mente, impossibilitado os transplantes com órgãos de
animais e, mesmo entre espécies concordantes, a situ-ação não é satisfatória. Nestes últimos, embora não aconteça a rejeição hiperaguda, os órgãos não são aceitos como os alogênicos, existindo rejeições agu-das e crônicas. A comparação histológica de uma rejeição hiperaguda em xeno-transplantes, com a re-jeição hiperaguda em transplante entre humanos, su-gere um mecanismo semelhante de resposta imunológica.
A experiência clínica da utilização de transplantes com órgãos de animais para o homem aconteceu após 1969. Rins, fígado e coração foram utilizados, mas somente de primatas. A sobrevida mais longa de um xeno-transplante em humanos foi de nove meses, quando o paciente morreu de infecção, mas sem evi-dências de rejeição. 1
A esperança de utilização de órgãos de animais, no futuro, está relacionada à quebra da barreira dos anticorpos naturais com drogas imunossupressoras e/ ou com a obtenção de animais que não expressem os epítopos imunogênicos α-galactosil. Os últimos pode-rão surgir de manipulações por engenharia genética, proporcionando doadores não primatas, transgênicos, sem a atividade da enzima α1, 3 galactosiltransferase. A dificuldade de obtenção de animais concordantes, por estarem em extinção ou serem de difícil procriação em cativeiro, estimula a pesquisa com espécies discor-dantes. O porco tem sido visto como possível doador, devido à sua fácil procriação e serem seus órgãos de tamanhos compatíveis aos do homem.
O objetivo deste trabalho foi pesquisar o título dos anticorpos naturais anti-porco em indivíduos normais, em indivíduos antes e após imunossupressão e em pa-cientes com hipogamaglobulinemia comum variável. Pacientes renais crônicos hiperimunizados com antígenos HLA foram também estudados, procurando-se conhecer o grau de reatividade sorológica contra linfócitos de porco antes e após a retirada da barreira dos anticorpos naturais por adsorção do soro dos paci-entes com eritrócitos de porco e tratamento com ditiotreitol (DTT).
M a t e r i a l e M é t o d o s
Soros
Foram utilizados soros de 18 indivíduos adultos normais, de 21 pacientes renais crônicos na fase pré-transplante (sem imunossupressão terapêutica) e um ano após transplante bem sucedido (com
imunos-supressão), de 7 pacientes com hipogamaglobuli-nemia e de 25 pacientes renais crônicos hiperimuni-zados para o sistema HLA com mais de 85% de reati-vidade contra painel de linfócitos de 40 indivíduos.
Os soros dos indivíduos adultos normais e dos renais crônicos antes e após imunossupressão, assim como os dos hipogamaglobulinêmicos foram diluídos seriadamente até 1:5120 e realizada prova cruzada contra linfócitos totais de 16 porcos provenientes do biotério do Nuffield Department of Surgery, University of Oxford. O soro dos renais crônicos hiperimunizados foram adsorvidos com concentrado de eritrócitos de porco por 3 vezes, nas temperaturas de 22°C por 1 hora, 4°C por 1 hora e a 4°C por 8 horas , para elimi-nar os anticorpos naturais anti-porco. A seguir foi feita a prova cruzada destes soros adsorvidos, tratados e não tratados com 0.001 M de ditiotreitol (DTT), contra linfócitos T e B de 16 porcos.
Linfócitos de porco
Os linfócitos totais de porco foram separados a partir de 10 ml de sangue total desfibrinado com 4 pérolas de vidro para cada 10 ml e levados ao agita-dor por 15 minutos. Foram então diluídos 1:2 em salina normal e aliquotados (7 ml) em tubos de 10 ml. Com o auxílio de pipetas Pasteur foram adicionados ao fundo do tubo 2,5 ml de solução de Ficol-Hypaque. Os linfócitos foram recolhidos após centrifugação por 20 minutos a 400 g e lavados por 7 minutos em PBS contendo 10% de soro do próprio animal. Os eritrócitos ainda presentes foram elimina-dos com solução saturada de Gideon-Goldstein e o número de células acertado para a concentração de 2 milhões por ml.
Fracionamento de linfócitos T e B de porco
Os linfócitos foram separados em sub-populações T e B, por adsorção dos linfócitos B em coluna de lã de nailon aquecida a 37°C por 40 min. As células não aderentes (linfócitos T) foram coletadas após a passa-gem pela coluna de 5 ml de PBS com 5% de soro de porco a 37°C, repetindo-se este procedimento por 3 vezes. As fibras de nailon foram transferidas para uma placa de Petri e penteadas ao mesmo tempo que la-vadas com fluxo de PBS. As células eluídas das fibras de nailon (linfócitos B) foram então coletadas em tubos de ensaio. Os tubos contendo células aderentes (B) e não aderentes (T) foram centrifugados por 400 g durante 5 minutos e as células ressuspensas em PBS a uma concentração entre 1,5 a 2 milhões/ml. Os
linfócitos T e B foram analisados quanto ao grau de pureza por citometria de fluxo (Becton & Dickson) com anticorpos específicos antes de serem utilizados nos testes de prova cruzada. Foram utilizadas células com pureza acima de 90% por este critério (Figura 1).
Prova cruzada de microlinfocitotoxicidade
A prova cruzada utilizada foi a de microlinfoci-totoxicidade complemento-dependente, utilizando-se placas de Terasaki (Robbins Co., USA). O complemen-to de coelho foi adsorvido previamente para retirar seus anticorpos naturais contra as células de porco. Esta adsorção foi feita incubando 1 parte de soro de coelho com 1 parte de concentrado de sangue total de porco, a frio (4°C), por 2 horas. Resumidamente, 1 µl de soro humano puro ou diluído, foi colocado em cada poço e adicionados 1 µl de linfócitos de porco totais, T ou B, e incubados a 21°C por 30 min. Após este período, foi adicionado 5 µl de comple-mento de coelho adsorvido seguido de incubação a 21°C, por 60 minutos, para linfócitos T e linfócitos totais e, por 75 minutos para linfócitos B. A seguir, foram adicionados 3 µl de solução de eosina amarela a 5% em água. Após 2 minutos à temperatura ambien-te, foram adicionados 5 µl de formalina a 50 % (pH 7,3) e as placas mantidas a 4°C durante a noite antes da leitura. A reação foi considerada positiva quando Figura 1 - Análise por citometria de fluxo de célula B ou T de porco purificadas em coluna de nailon.
havia mais de 20% de células coradas (mortas) evi-denciadas pela microscopia de contraste de fase.
A adsorção de anticorpos naturais do complemen-to de coelho foi feita pela adsorção com sangue complemen-total de porco.
R e s u l t a d o s
Título de xeno-anticorpos em indivíduos normais: Os títulos de anticorpos contra linfócitos totais de porco encontrados em soros de 21 indivíduos normais variaram de 1:40 até 1:2560, com uma média de 1:664, mediana de 1:320 e desvio padrão de 1:785. Para uma média de 1:664 e um intervalo de confiança de 95% foi encontrada uma amplitude de 1:725 (1:302; 1:1027).
Títulos de xeno-anticor pos em pacientes renais crônicos antes e após imunossupressão: Os títulos de anticorpos naturais em soros de pacientes renais per-maneceram estáveis em 80,90% dos casos após 1 ano de imunossupressão pós-transplante com esquema tríplice, se comparados com os títulos iniciais pré-transplante. Os títulos de anticorpos destes pacientes foram equivalentes àqueles observados em indivíduos normais (Tabela 1). Em poucos casos foi observado um aumento do título após um ano de imunossupressão. Xeno-anticorpos em pacientes imunodeficientes primários: Os títulos de anticorpos foram muito redu-zidos nestes pacientes com imunodeficiência comum
variável, embora nunca chegassem a zero (Tabela 2). Xeno-anticorpos naturais em pacientes crônicos renais hipersensibilizados contra antígenos HLA: A barreira de xeno-anticorpos foi eliminada totalmente com a adsorção das amostras de soro dos pacientes hipersensibilizados com eritrócitos lavados de porco, seguida de inativação de anticorpos classe de IgM por tratamento com DTT. A adsorção com eritrócitos por si só não foi suficiente para a remoção total dos xeno-anticorpos, sendo necessário o tratamento quí-mico. Em 400 reações de microlinfocitotoxicidade com células B de porco foi observado que apenas 20,50% dos casos (82/400 reações) ocorreu uma com-pleta adsorção dos xeno-anticorpos. Nos demais casos (316/400 reações, 79%) a barreira não foi completa-mente eliminada. Nestes últimos, a remoção só foi total após o tratamento com DTT. A eficiência do DTT em remover os xeno-anticorpos foi de 99,37% (teste McNemar). Somente em dois casos foi observada a reação positiva na prova cruzada após a adsorção e tratamento químico com DTT.
Com relação às células T foi observada uma adsorção completa dos xeno-anticorpos com eritrócitos de porco em 54,75% dos soros e uma eli-minação de 100% com o tratamento químico.
D i s c u s s ã o
Foi feita uma avaliação quantitativa da barreira de anticorpos naturais aos linfócitos de porco pelo estu-do da titulação destes xeno-anticorpos no soro de indivíduos normais e no soro de pacientes renais crônicos antes e após um ano de transplante alogênico. A diminuição do nível dos xeno-anticorpos por intermédio da imunossupressão é uma das possi-bilidades teóricas de viabilização de transplantes en-tre espécies discordantes. Enen-tretanto, constatamos sérias dificuldades neste ponto, pois além dos títulos serem muito elevados (média de 1:664), estes não são afetados pelo tratamento de imunossupressão utiliza-do em transplantes convencionais. Mesmo em indiví-duos com hipogamaglobulinemia, observamos anticorpos anti-linfócitos de porco, embora em con-centrações muito inferiores ao normal (Tabela 2).
Os indivíduos renais crônicos hipersensibilizados pelos antígenos HLA seriam os primeiros beneficiados com xeno-transplantes devido à impossibilidade de se Tabela 1
Títulos de xeno-anticorpos em pacientes reanis crônicos antes e após a imunossupressão
Indivíduos Testados Antes Após 1 Ano
1 1:640 1:640 2 1:320 1:640 3 1:320 1:1280 4 1:40 1:320 5 1:320 1:640 6 1:320 1:320 7 1:80 1:80 8 1:1280 1:640 9 1:1280 1:640 10 1:320 1:320 11 1:320 1:640 12 1:640 1:1280 13 1:40 1:320 14 1:1280 1:640 15 1:320 1:320 16 1:640 1:320 17 1:320 1:2560 18 1:640 1:1280 19 1:160 1:640 20 1:640 1:2560 21 1:640 1:1280
onal de Pesquisa (CNPq). Agradecemos o Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, em especial ao Dr. José Roberto Goldim e Dra. Lídia do Carmo C. do Nascimento pelas sugestões e análise estatística.
S u m m a r y
The presence of natural antibodies against porcine cells (xeno-antibodies) was analysed in sera of normal human subjects, and immunosuppressed, immunodeficient and highly sensitized renal patients. Average title of 1:664 was observed in normal individuals. No title reduction of xeno-antibodies was observed in 80.9% of renal transplanted recipients after one year of immunosuppression. In primary immunodeficient patients a reduced title was observed but never lower than 1:1. It was noticed that IgG anti-HLA antibodies do not react with histocompatibility antigens on porcine cells, after elimination of natural antibodies from sera of highly sensitized renal patients, by adsortion of sera with porcine erytrocytes followed by dithiotreitol (DTT) treatment.
The conclusions of this paper were: the xenoantibodies title are very high in normal individuals; the immunossupression used after kidney transplantation did not reduce the natural antibodies barrier; the immunodeficients patients with low title of natural antibodies could be one of the first individuals receiving a xenotransplant; the in vitro method of natural antibodies elimination is reproducible; the sera from HLA highly sensitized renal patients do not cross react with pig lymphocytes and they also could receive a xenotransplant after the natural antibodies barrier be solved.
R e f e r ê n c i a s
1. Auchincloss H. Xenogeneic transplantation. Transplantation. 1988; 46: 1-20
2. Pozzetto U, Citterio F, Caizzi MP, Serino F, Castagneto M. Humoral immune reactions to pig antigens in humans.Transplant Proc. 1990; 22: 2000-2001
3. Calne RY. Organ transplantation between widely disparate species. Transplant Proc. 1970; 2: 550-554
4. Oriol R, Ye Y, Koren E, Cooper DK. Carbohydrate antigens of pig tissues reacting with human natural antibodies as potential targets for hyperacute vascular rejection in pig-to-man organ xenotransplantation. Transplantation. 1993; 56(6): 1433-1442 5. Bach FH. Revisiting a challange in transplantation discordant
xenografting. Human Immunology. 1991; 30: 262-269 Tabela 2
Títulos de xeno-anticorpos em pacientes imunodeficientes primários Indivíduos Testados Título de Anticorpos Naturais
1 1:320 2 1:40 3 1:10 4 1:1 5 1:80 6 1:1
encontrar doadores. Este trabalho proporcionou a investigação dos xeno-anticorpos humanos anti-linfócitos de porco, especialmente nos estudos de eliminação desta barreira imunológica in vitro por intermédio da adsorção de parte destes anticorpos com eritrócitos de porco seguida de inativação quími-ca das moléculas de IgM com DTT. Inicialmente ten-tamos utilizar somente o DTT obtendo resultados insatisfatórios pelo fato de não ter sido possível elimi-nar a barreira de anticorpos naturais a concentrações não linfocitotóxicas de DTT. A adsorção com eritrócitos de porco não foi igualmente efetiva, pois em apenas 20% dos casos obtivemos sucesso. A combinação das duas técnicas possibilitou a retirada dos xeno-anticorpos com uma eficiência de 97,37% com linfócitos B e 100% com linfócitos T, sem afetar a viabilidade celular. Estes experimentos sugerem que uma parcela importante dos xeno-anticorpos são da classe IgM e possivelmente os anticorpos anti-HLA de classe IgG remanescentes não reagem cruzadamente com os antígenos de histocompatibilidade presentes nas células de porco, não havendo portanto uma segunda barreira ao xeno-transplante. Prova cruzada dos soros destes pacientes com linfócitos humanos demonstraram que os anticorpos anti-HLA permaneciam após a adsorção e tratamento com DTT (resultados não mostrados).
A existência de anticorpos naturais contra linfócitos totais de porco já é conhecida. Entretanto nenhum estudo foi feito com relação às duas popula-ções de linfócitos T e B separadamente. Neste traba-lho, observamos que os soros pós-adsorvidos com eritrócitos e sem tratamento com DTT reagem em maior número com os antígenos presentes em linfócitos B do que com aqueles presentes em linfócitos T. O significado da diferença entre as duas populações linfocitárias não está esclarecido.
A g r a d e c i m e n t o s
Naci-6. Thibaudeau K, Anegon I, Lemauff B, Soulillou JP, Blanchard D. Human natural antibodies to porcine platelets. Transplantation. 1994; 57(7): 1110-1115
7. Platt JL, Fishel R, Matas A, Reif S, Bolman RM, Bach F. Immunopathology of hyperacute xenograft rejection in a suine-to-primate model. Transplantation. 1991; 52: 214-220
8. Geller RL, Bach FH, Turman MA, Casali P, Platt JL. Evidence that polyreactive antibodies are deposited in rejected discordant xenografts. Transplantation. 1993; 55(1): 168-172
9. Galili U, Macher BA, Buehler J, Shohet SB. Human natural anti-α
(1-3)-linked galactose residues. J Exp Med. 1985; 162: 573 10. Galili U, Clark MR, Shohet SB, Buehler J, Macher BA.
Evolutionary relationship between the natural anti-gal antibody and the Gal α 1-3 Gal epitope in primates. Proc Natl Acad Sci. 1987; 84: 1369
11. Galili U, Shohet SB, Kobrin E, Stults CLM, Macher BA. Man, apes, and old world monkeys differ from other mammals in the expression of α-galactosyl epitopes on nucleated cells. J Biol Chem. 1988; 263: 17755
Artigo recebido em 17 de maio de 1995 e aceito para publicação em 13 de fevereiro de 1996.
