AVALIAÇÃO DO EFEITO CITOTÓXICO DO CHÁ VERDE (Camellia
sinensis), USANDO TESTE Allium cepa
Maria Gabriela Leme Munhoz, gaby.pbela@gmail.com
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Estado de São Paulo
Mônica Huguenin Araujo Faria, professoraquimica@yahoo.com.br
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Estado de São Paulo Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
Ana Cristina Gobbo César, anacristinagobbo@gmail.com
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Estado de São Paulo
Avenida Francisco Samuel Lucchesi Filho, 770 – Penha CEP 12929-600 - Bragança Paulista - SP
RESUMO. Desde os tempos mais antigos, produtos naturais, particularmente aqueles originários de plantas, tem sido uma importante fonte de tratamento para muitas doenças. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, cerca de 60-80% da população mundial nos países em desenvolvimento, devido à pobreza e falta de acesso à medicina tradicional, dependem essencialmente de plantas para cuidar de sua saúde. Entretanto, mesmo com a alta diversidade vegetal mundial, poucas espécies têm sido cientificamente estudadas para a avaliação do seu potencial citotóxico. Diante disso, este estudo objetivou avaliar o efeito citotóxico de infusões de chá verde (Camellia sinensis), no crescimento radicular de cebolas (Allium cepa). Foram expostos 10 bulbos para uma infusão de chá verde na concentração usual e outras 10 cebolas para infusão de chá verde menos concentrada. Outras 10 cebolas foram colocadas em água (controle negativo) e 10 bulbos em 15µg/L MMS (metil metanossulfonato), utilizado como controle positivo, pois apresenta efeito citotóxico. Os bulbos foram expostos por 72h, 120h e 168h e, posteriormente após cada período, o comprimento das raízes foram mensurados. Para análise estatística foi utilizado o programa GraphPad Prisma 5.1. Concluiu-se que o chá verde, independente da concentração, inibe consideravelmente o crescimento radicular da cebola, demonstrando um efeito citotóxico observado macroscopicamente.
Palavras-chave: Camellia sinensis. Allium cepa. Citotoxidade. Plantas medicinais. 1. INTRODUÇÃO
A Camellia sinensis (L) O. Kuntze é uma planta da família Theaceae, conhecida popularmente por chá verde, chá da Índia ou “green tea”. O chá verde é uma das bebidas mais consumidas em todo o mundo, tem aroma específico e propriedades antioxidantes, antimicrobianas, anticancerígenas e antiinflamatórias (DE MEJIA, RAMIREZ-MARES & PUANGPRAPHANT, 2009; PEKAL, DROZDZ, BIESAGA & PYRZYNSKA, 2012), ajudando a prevenir o câncer em seres humanos.
Há 32 espécies e quatro variações do gênero Camellia. Os chás de Camellia sinensis e Camellia assamica são as variedades mais populares, devido à presença de substâncias bioativas, tais como alcalóides e catequinas (FERNANDEZ et al., 2003). O efeito estimulante do chá é atribuído à cafeína (YANG, CHUNG & YANG, 2000).
Diferentes artigos confirmaram o potencial antioxidante do chá verde, como descrito por Juskiewicz et al. (2008), pesquisadores da Polônia, que observaram um aumento nas atividades das enzimas GSH-Px (glutationa peroxidase) e de SOD (superóxido dismustase) no soro e diminuição na concentração do marcador de lipoperoxidação (TBARS) no rim de ratos diabéticos. Babu et al. (2006), da Índia, trataram ratos diabéticos e comprovaram redução de TBARS e aumento na atividade de GSH no coração. Nos EUA, Mustata et al. (2005) evidenciaram aumento nos níveis de GSH e diminuição de hidroperóxidos no soro de animais diabéticos. Sabu et al. (2002), pesquisadores da Índia, também mostraram que várias doses de Camellia sinensis aumentaram as atividades das enzimas antioxidantes SOD e GSH e redução das concentrações dos marcadores de lipoperoxidação em animais diabéticos.
O oposto do que se espera, muitas plantas medicinais podem apresentar efeitos citotóxicos ou genotóxicos. Estudos de toxicidade têm sido realizados concomitantemente com o avanço do uso terapêutico de plantas medicinais, com o objetivo de comprovar a eficácia de suas aplicações farmacológicas (VARANDA, 2006). A citotoxicidade pode ser testada in vitro usando o meristema radicular da cebola, Allium cepa (EL-SHAHABY et al., 2003), um processo que produziu resultados semelhantes aos de ensaios in vivo em animais (TEIXEIRA et al ., 2003).
O sistema teste vegetal de Allium cepa apresenta-se como um bioindicador ideal para uma avaliação preliminar da citotoxicidade e genotoxicidade de infusões de plantas medicinais, devido ao seu baixo custo, confiabilidade e concordância com outros testes de genotoxicidade, auxiliando os estudos de prevenção de danos à saúde humana.
Os efeitos das infusões de plantas medicinais sobre o ciclo celular de Allium cepa têm sido relatados por vários autores (VICENTINI et al., 2001; CAMPAROTO et al., 2002; TEIXEIRA et al., 2003; KNOLL et al., 2006; FACHINETTO et al., 2007), os quais mostraram que os principais efeitos que ocorrem são mutagenicidade e anti-mutagenicidade, bem como aumento e diminuição da proliferação celular de pontas de raízes tratadas com diferentes espécies de plantas medicinais.
Desta forma, este estudo objetivou avaliar o efeito citotóxico de infusões de chá verde (Camellia sinensis) no crescimento radicular de cebolas (Allium cepa), usando diferentes concentrações.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Para a preparação das infusões de chá verde (Camellia sinensis) foi utilizado um saquinho para 200 mL de água fervente, como recomendado pelo fabricante, sendo de uma marca nacional e de grande aceitação no Brasil. Para uma das infusões foram usados cinco saquinhos para 1 litro de água e, essa infusão foi denominada “chá verde 100%”, portanto na concentração usual. Na preparação da outra infusão foi usado o mesmo número de saquinhos de chá verde (5), contudo o dobro de água (2 litros); essa preparação foi denominada de “chá verde 50%”, ou seja, menos concentrada que a primeira.
Antes de colocar as cebolas nas infusões foi realizada uma cuidadosa limpeza do anel primordial de cada bulbo, para retirada de eventuais raízes secas e tecido ressecado, pois este é o local de onde emergem as raízes.
Após o resfriamento das infusões, cinco bulbos de cebola (Allium cepa), com aproximadamente 6 cm de diâmetro, procedentes do comércio local, foram expostos em cada tipo de infusão preparada. Cinco bulbos foram colocados em água (sem cloro) usada como controle negativo e, outros cinco foram expostos a solução de 15 g/L MMS (metil metanossulfonato), usado como controle positivo, por ser capaz de promover alterações celulares e inibir o crescimento. Após 72 horas de exposição foram escolhidas aleatoriamente 10 raízes de cada bulbo; estas foram marcadas e as demais foram retiradas. O tamanho de cada uma das 10 raízes de cada bulbo foi mensurado e anotado em planilha. Após a medição, os bulbos foram novamente expostos as soluções. Novas medidas dessas mesmas raízes marcadas foram realizadas após 120 horas e 168 horas do início da exposição. A opção por usar cinco cebolas por solução e medir 10 raízes por bulbo é garantir um número viável para análise estatística, pois eventualmente, pode ocorrer de algum bulbo não apresentar crescimento e de algumas raízes se quebrarem durante o experimento.
Para cada dia de medição do crescimento radicular foi calculado a média e o desvio-padrão entre os bulbos expostos para cada tipo de tratamento. Para comparar a variação dos valores de crescimento radicular entre cada tipo de tratamento foi aplicado o teste ANOVA one-way e o pós-teste de comparação de Tukey para p<0,0001, disponíveis no
software GraphPad Prisma 5.1.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise dos dados permitiu observar variações no comprimento das raízes entre os diferentes tratamentos para todos os períodos de exposição avaliados, como pode ser observado na tabela 1.
Tabela 1 - Valores (cm) obtidos por meio da medição das raízes (média ± desvio-padrão) após a exposição dos bulbos aos tratamentos por 72h, 120h e 168h.
Tratamentos Tempo de exposição (horas)
72h 120h 168h
Água 3,0±0,4 3,9±0,7 5,5±0,9
MMS 3,1±0,4 4,0±0,6 5,7±0,9
Chá verde 100% 0,2±0,0 0,2±0,0 0,2±0,1
Chá verde 50% 0,4±0,1 0,5±0,1 0,6±0,1
A análise dos dados demonstrou que o controle positivo (MMS) não se mostrou eficaz, pois as suas médias de crescimento radicular foram muito próximas aos valores obtidos das raízes expostas a água, usada como controle negativo (Tabela 1 e Figura 1), em todos os dias avaliados.
A comparação do crescimento radicular entre os tratamentos após 72h, 120h e 168h de exposição, demonstrou valores significativamente diferentes por meio do teste ANOVA one-way, apresentando F=272,60 (p<0,0001); F=221,50 (p<0,0001) e F=219,00 (p<0,0001), respectivamente.
A análise da tabela 1 demonstrou que o crescimento radicular dos bulbos expostos ao controle negativo (água) foi maior que o observado nos bulbos submetidos às infusões de Camellia sinensis, independente da concentração desta. Com a aplicação do teste de comparação de Tukey (Quadro 1) observou-se que o crescimento das raízes expostas ao controle negativo foi altamente significativo (p<0,0001), quando comparado com o tamanho das raízes submetidas as infusões, após 72h, 120h e 168h.
Água 72 120 168 0 2 4 6 8 horas C om pr im e nt o ra íz e s ( c m ) MMS 72 120 168 0 2 4 6 8 horas C om pr im e nt o ra íz e s ( c m ) Chá verde 100% 72 120 168 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 horas C om pr im e nt o ra íz e s ( c m ) Chá verde 50% 72 120 168 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 horas C om pr im e nt o ra íz e s ( c m )
Figura 1 - O crescimento médio e valores máximos e mínimos das raízes de Allium cepa após 72h, 120h e 168h de exposição ao controle negativo (água), controle positivo (MMS), chá verde 100% (mais concentrado) e chá verde 50% (menos concentrado).
As raízes dos bulbos expostos a infusão “chá verde 50%” apresentaram um crescimento maior em comparação com o crescimento radicular das cebolas expostas a infusão “chá verde 100%”. Contudo com a aplicação do teste de comparação de Tukey (Quadro 1) pôde-se observar que esta diferença não foi significativa, após 72h, 120h e 168h do início da exposição.
A ação anti-proliferativa sobre o ciclo celular da cebola foi observada com infusões de marcela e essa ação inibitória da divisão celular aumentou conforme o aumento da concentração, bem como após o armazenamento das infusões (FACHINETTO et al., 2007).
A capacidade anti-proliferativa dos extratos aquosos de marcela, já tinham sido demonstrados por estudos realizados
in vitro por Arisawa (1994). Este autor demonstrou que os extratos das flores de marcela inibiram em 67% o
desenvolvimento de células cancerosas. Além de demonstrar que estes extratos apresentaram capacidade citotóxica, mas não mutagênica, apesar de que os flavonóides quercetina, luteolina e 3-O-metilquercetina, os quais são os componentes mais significativos do extrato aquoso de A. satureioides não têm sido reportados como tóxicos e estudos realizados em ratos e camundongos demonstraram que o extrato apresentou baixa toxicidade (DE SOUZA et al., 2002; RIVERA et al., 2004).
A atividade de inibição enzimática atribuída à presença de taninos é provavelmente responsável pela inibição da divisão celular em células meristemáticas de Allium cepa (TEIXEIRA et al., 2003).
É importante salientar que o papel histórico das ervas medicinais no tratamento e prevenção de doenças e seu papel como catalizadoras no desenvolvimento da farmacologia não mantém sua segurança para o uso ilimitado pelo público sem informação (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006).
As plantas que possuem propriedades antioxidantes e farmacológicas estão relacionadas com a presença de compostos fenólicos, especialmente ácidos fenólicos e flavonóides (IGNAT et al., 2011). Os compostos fenólicos são metabólitos secundários de plantas que compreendem uma grande variedade de moléculas que têm polifenol na sua estrutura, além de moléculas com um fenol em anel, tais como os ácidos fenólicos e os álcoois fenólicos (GHAFFARI & MOJAB, 2007). Estes compostos compreendem um grupo muito diversificado de fitoquímicos que são largamente distribuídos nas plantas, tais como frutas, legumes, chá, azeite e tabaco (PRAKASH, GAUTAM, JAIN, 2011). Recentemente, a identificação e desenvolvimento de compostos fenólicos em extratos de diferentes plantas consideradas antioxidantes tornou-se uma importante área de pesquisa médica (IGNAT et al., 2011).
Quadro 1 – Valores das diferenças entre as médias do crescimento radicular e q obtidos a partir do teste de comparação de Tukey para os períodos de 72h, 120h e 168h de exposição aos diferentes tratamentos.
Tratamentos
Diferenças entre as médias; q
Água MMS Chá verde 100% MMS 72h -0,08; 0,82ns 120h -0,20; 1,41ns 168h -0,16; 0,78ns Chá verde 100% 72h 2,84; 29,27*** 2,92; 30,09*** 120h 3,69; 26,00*** 3,89; 27,41*** 168h 5,33; 26,18*** 5,49; 26,97*** Chá verde 50% 72h 2,62; 27,00*** 2,70; 27,83*** -0,22; 2,27ns 120h 3,41; 24,03*** 3,61; 25,44*** -0,28; 1,97ns 168h 4,93; 24,22*** 5,09; 25,00*** -0,40; 1,97ns
q= valor do teste de comparação de Tukey;*p<0,0001; ns = não significativo. 3. CONCLUSÃO
Conclui-se que a infusão de Camellia sinensis, popularmente conhecida como chá verde, independente da concentração testada neste estudo, inibiu significativamente o crescimento das raízes de Allium cepa, demonstrando o efeito citotóxico deste tipo de chá, amplamente usado no mundo.
4. AGRADECIMENTOS
A autora Maria Gabriela Leme Munhoz agradece ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo, pela bolsa de iniciação científica institucional.
5. REFERÊNCIAS
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6. NOTA DE RESPONSABILIDADE
