Manual de Instruções para Análise por LC-MS/MS MassChrom Amino acids and acylcarnitines from dried blood (non derivatized)

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Manual de Instruções para Análise por LC-MS/MS

MassChrom® Amino acids and

acylcarnitines from dried blood

(non derivatized)

Reagente diagnóstico para determinação

semi-quantitativa in vitro de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco por LC-MS/MS (sem derivatização). Somente para uso em diagnóstico in vitro.

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MassChrom® Amino acids and acylcarnitines from dried blood

(non derivatised) – LC-MS/MS

MS 10350840260

Importado e Distribuído por: BioSys Ltda.

Rua Coronel Gomes Machado, 358, Centro, Niterói, RJ CEP: 24020-112

CNPJ: 02.220.795/0001-79

SAC: (21) 3907 2534 – sac@biosys.com.br

www.biosys.com.br

Fabricado por: Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH Am Haag 12 D-82166 Gräfelfing Munique, Alemanha Fone: +49 89 18930-0 Fax: +49 89 18930-199 www.chromsystems.de

Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH é certificada de acordo com o DIN EN ISO 9001 e DIN EN ISO 13485. Os produtos são produzidos e colocados em circulação seguindo as diretrizes do IVD 98/79/EC.

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Conteúdo...Página

1 Informações para requisição... 3

2 Introdução... 4

3 Sistema LC-MS/MS...6

3.1....Parâmetros do equipamento... 6

3.2....Métodos de medição MS/MS... 7

3.3....Procedimento inicial... 8

3.4....Desligando o equipamento (Shut down)... 8

4 Transições de massa dos analitos e padrões internos... 9

5 Preparação da amostra... 12

5.1....Coleta e armazenamento das amostras de pacientes... 12

5.2....Reconstituição do padrão interno... 13

5.3....Manuseio dos controles... 13

5.4....Procedimento de preparação das amostras... 14

5.4.1 Preparação da amostra sem placa filtrante... 14

5.4.2 Preparação da amostra com placa filtrante... 14

5.5....Estabilidade das amostras... 15

5.6....Materiais requeridos, mas não fornecidos... 15

6 Resultados e avaliação... 15

6.1....Quantificação com padrão interno... 15

6.2....Princípios do cálculo... 17

7 Controle de Qualidade... 17

8 Valores de referência/valores de cut off... 17

9 Fatores de conversão... 18

10 Informações de segurança... 19

11 Armazenamento e validade dos reagentes... 20

12 Descarte de resíduos... 20

12.1 Garantia... 20

13 Exemplos de cromatogramas... 21

13.1....Espectro de controle de aminoácidos no intervalo do cut off...21

13.2....Espectro de uma amostra de paciente com fenilcetonúria (PKU)... 21

13.3....Espectro de controle de acilcarnitinas no intervalo do cut off... 22

13.4....Espectro de uma amostra de paciente com MCAD... 22

13.5....Espectro de uma amostra de paciente com VLCAD... 23

13.6....Espectro de uma amostra de paciente com GA tipo I... 23

14 Validação... 24

15 Interferentes conhecidos... 28

16 Problemas e soluções... 29

17 Literatura... 30

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1 Informações para requisição

Nº da ordem Produto

57000

57000/F

MassChrom® Kit de reagentes para análise por LC-MS/MS de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco para triagem neonatal / não derivatizado

Conteúdo para 960 análises com placa padrão de 96 poços:

Fase móvel 1000 mL Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL Solução de limpeza 1000 mL Solução tampão de extração 100 mL Placa de 96 poços, fundo em V 10 peças Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças Folha de proteção em alumínio para placa de 96 poços 10 peças

MassChrom® Kit de reagentes para análise por LC-MS/MS de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco para triagem neonatal / não derivatizado com placa filtrante

Conteúdo para 960 análises com placa filtrante de 96 poços:

Fase móvel 1000 mL Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL Solução de limpeza 1000 mL Solução tampão de extração 100 mL

Placa filtrante de 96 poços 10 peças Placa de 96 poços, fundo em V 10 peças

Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças Folha de proteção em alumínio para placa de 96 poços 10 peças

Componentes disponíveis separadamente:

57001 Fase móvel 1000 mL 57002 Fase móvel 10 x 1000 mL 57004/T Padrão interno, liofilizado 1 x 25 mL 57004 Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL 57007 Solução de limpeza 1000 mL 57008 Solução tampão de extração 100 mL 57010

55011

Placa de 96 poços, fundo em V 5 peças Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças 55013 Folha de proteção em alumínio para placa de 96 poços 10 peças 55057 Placa filtrante de 96 poços 5 peças

Acessórios

55015 55016

Capilar de restrição 1 peça Colar adaptador para centrifugação 2 peças 57099 Mistura para Tuning, contêm todos os analitos 5 mL 15009 Pré-filtro em PEEK, 5µm 5 peças 15010 Suporte para pré-filtro em PEEK 1 peça

Controles (spots de sangue seco em papel de filtro)

0191 MassCheck® Controle bi-nível (I + II) de aminoácidos e acilcarnitinas, spot 2 x 3 spots

0192 MassCheck® Controle nível I de aminoácidos e acilcarnitinas, spot 1 x 3 spots

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2 Introdução

O objetivo da triagem neonatal é o diagnóstico de doenças metabólicas hereditárias antes que causem prejuízo ao organismo da criança. De acordo com o novo Kinder-Richtlinie de Dezembro de 2004, o exame de 20 patologias alvo foi prescrito pela lei na Alemanha, oito delas podem ser determinadas por espectrometria de massa em tandem. Estas doenças incluem distúrbios no metabolismo dos aminoácidos, como a fenilcetonúria (PKU) e doença da urina do xarope de bordo (MSUD), no metabolismo dos ácidos graxos (p.ex.: deficiência da acil-CoA desidrogenase de cadeia média e muito longa; MCAD e VLCAD) e também as acidemias orgânicas como a isovalérica (IVA).

Essas doenças são causadas por deficiências enzimáticas hereditárias, levando ao decréscimo ou supressão da atividade enzimática. Desta maneira, os substratos não transformados acumulam-se no organismo. Dependendo do grau da doença o produto estará presente em níveis limitados ou completamente ausente no organismo. Isto leva ao acúmulo de metabólitos potencialmente tóxicos, causando defeitos em órgãos e doenças multisistêmicas (amino e organoacidopatias). Não diagnosticados, estes distúrbios metabólicos causam lesões severas e irreversíveis à criança, mesmo em poucos dias. No caso da fenilcetonúria, ocorre retardo físico e mental da criança afetada. Uma vez que esses defeitos são hereditários, tais doenças são incuráveis e as terapias são limitadas à compensação dos sintomas. Entretanto, se a doença é diagnosticada a tempo, isto é, dentro dos primeiros dias de vida, a criança com PKU é capaz de ter uma vida normal com uma dieta livre de fenilalanina.

A incidência desses distúrbios metabólicos gira em torno de 1:9.000 (PKU) e de 1:200.000 para algumas desordens no metabolismo dos ácidos graxos (VLCAD, CPT I e II). Em média, 1 em cada 3.000 recém-nascidos é afetado por uma dessas doenças.

O diagnóstico laboratorial destas doenças é feito através da medida de substâncias marcadoras de elevação ou degradação, respectivamente, no sangue do recém-nascido. O sangue é coletado do calcanhar, em papel de filtro, seco e enviado ao laboratório para exame.

Com a tecnologia da espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) é possível triar um amplo espectro de doenças metabólicas em uma única corrida analítica. Esse método permite a detecção simultânea e confiável de várias moléculas alvo, assim como a determinação de suas respectivas concentrações. Devido a sua alta seletividade, esta técnica dispensa o uso de uma coluna de HPLC, permitindo corridas analíticas muito curtas (2 min.). Para evitar a interferência de efeitos de supressão iônica e permitir a quantificação precisa dos analitos, o uso de padrões marcados isotopicamente é essencial.

Dependendo do tipo de papel de filtro utilizado e do hematócrito da amostra, o volume de sangue no picote do disco de sangue seco (3 mm diâmetro) varia entre 2,2 e 3,3 µL. Isto permite apenas uma determinação semi-quantitativa dos analitos, e este método de triagem não deve ser utilizado como método laboratorial para diagnóstico. A triagem neonatal por LC-MS/MS deve estar sempre apoiada por diagnósticos confirmatórios baseados em genética molecular, métodos enzimáticos ou analisadores de aminoácidos.

Princípio do kit:

Os seguintes aminoácidos, acilcarnitinas e carnitinas livres podem ser determinados semi-quantitativamente com este kit:

 Aminoácidos: alanina (Ala), arginina (Arg), ácido aspártico (Asp), citrulina (Cit), ácido glutâmico (Glu),

glicina (Gly), leucina (Leu), metionina (Met), ornitina (Orn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), tirosina (Tyr) e valina (Val).

 Carnitina livre e acilcarnitinas: carnitina livre (C0), acetilcarnitina (C2), propionilcarnitina (C3),

butirilcarnitina (C4), isovalerilcarnitina (C5), glutarilcarnitina (C5DC), hexanoilcarnitina (C6), octanoilcarnitina (C8), decanoilcarnitina (C10), dodecanoilcarnitina (C12), tetradecanoilcarnitina (C14), hexadecanoilcarnitina (C16) e octadecanoilcarnitina (C18).

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O procedimento de preparação da amostra, extremamente simples, é baseado numa extração eficiente dos analitos do papel de filtro sem passos adicionais. Para garantir uma quantificação reprodutível, este método utilizado padrão interno estável e marcado isotopicamente (deuterado) para a calibração e quantificação.

Figura 1- Fórmula estrutural dos aminoácidos, acilcarnitinas e carnitina livre.

Este kit é um método de triagem, os resultados podem variar dependendo do sistema MS/MS usado e devem ser analisados em relação a outros dados laboratoriais. A interpretação clinica dos resultados deve ser feita apenas por profissional capacitado e habilitado. Não existem estudos clínicos sistemáticos sobre a freqüência de resultados falso-positivos ou falso-negativos.

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3 Sistema LC-MS/MS

Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no capítulo 10.

3.1 Parâmetros do equipamento

A análise de aminoácidos, acilcarnitinas e carnitina livre requer um sistema composto por uma bomba de HPLC, um injetor e um espectrômetro de massa em tandem com sensibilidade adequada. Para prevenir variações na composição da fase móvel, o frasco que a contém deverá ser mantido fechado, mesmo durante a operação. A solução de limpeza que acompanha o kit (artigo 57007) deverá ser utilizada como solução de limpeza da agulha do injetor. Nenhuma coluna de HPLC ou forno para coluna é necessário. Para conectar o sistema de HPLC ao sistema MS/MS, é necessário um capilar de restrição (artigo 55015) com pré-filtro em PEEK (artigo 15009 e 15010).

Ajustes do instrumento:

Amostrador automático: Volume de injeção 10 µL Tempo de corrida: 1,7 min

Gradiente de fluxo: 20 a 600 µL/min

Perfil do Gradiente:

Devido aos diferentes volumes mortos dos sistemas de HPLC individuais, o perfil do gradiente descrito abaixo pode ter que ser modificado, servindo apenas de base para a otimização do sistema. A janela do tempo de varredura (scan time window) do sistema tandem MS deve ser ajustada para o período de tempo no qual a intensidade do sinal alcança o nível máximo (aproximadamente 0,25 a 1,25 min.).

Tempo (min) 0 0,24 0,25 1,24 1,25 1,50 1,51

Fluxo (µL/min) 200 200 20 20 600 200 200

Caso o sistema HPLC seja incapaz de manter um fluxo constante de 20 µL/min, o método pode ser realizado alternativamente com um fluxo isocrático de 100 a 150 µL/min. Contudo, o método isocrático causa redução da sensibilidade.

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3.2 Métodos de medição MS/MS

Fundamentos do método de medição:

Em um espectrômetro de massa as moléculas são analisadas por sua relação massa e carga (m/z). Para isso, as moléculas devem ser ionizadas. Na tecnologia LC-MS, a ionização por eletronebulização ou electrospray tem demonstrado ser um método brando de geração de íons moleculares.

O espectrômetro de massa em tandem (MS/MS) contém dois espectrômetros de massa conectados em série. No primeiro espectrômetro (MS 1), os íons são separados por sua relação massa e carga. Em seguida, os íons atingem uma célula de colisão, onde são dissociados em fragmentos induzidos pela colisão com um gás inerte (argônio ou nitrogênio). Logo depois, o segundo espectrômetro (MS 2) analisa a fragmentação característica, outra vez pela relação m/z. Na tecnologia MS/MS, vários métodos de medição têm se mostrado confiáveis para diferentes padrões de fragmentação.

Na tecnologia MS/MS a medida de métodos variados tem se mostrado confiável para diferentes padrões: Varredura de Perdas Neutras, Monitoração de Reações Múltiplas (MRM) e Varredura do Íon Precursor.

Varredura de Perdas Neutras (Neutral Loss Scan):

Muitos aminoácidos fragmentam na célula de colisão pela perda do ácido fórmico, com massa de 46 Daltons (ver figura 3). Durante a determinação dos aminoácidos no modo de varredura de Perdas Neutras, o primeiro e o segundo espectrômetros de massa estão varrendo num intervalo de 46 unidades de massa. Isso gera um espectro de massa seletivo para muitos aminoácidos neutros e ácidos.

Entretanto, nem todos os aminoácidos podem ser detectados por esse modo de varredura. Os aminoácidos citrulina e ornitina, por exemplo, perdem amônia em adição ao ácido fórmico, logo, esses aminoácidos devem ser detectados com uma varredura de Perdas Neutras de 63 (46 + 17). Por outro lado, a arginina deve ser analisada com varredura de Perdas Neutras de 70; ácido aspártico e ácido glutâmico eliminam água.

Nós recomendamos que todos os aminoácidos devem ser quantificados no modo Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM).

Figura 3 - Fragmentação da fenilalanina pela eliminação do ácido fórmico

Monitoração de Reações Múltiplas (MRM):

No modo MRM, os dois espectrômetros de massa estão estaticamente ajustados para um valor de massa específico. O MS 1 seleciona a molécula ionizada de interesse, descartando íons com massas diferentes. Após a fragmentação da molécula na célula de colisão, o MS 2 detecta o fragmento característico gerado. O modo MRM garante tanto maior seletividade quanto alta sensibilidade.

Basicamente, todos os analitos podem ser detectados no modo MRM. Sua desvantagem é o tempo consumido na otimização do sistema MS/MS para cada transição de massa. Nós, portanto, recomendamos que os aminoácidos e acilcarnitinas sejam quantificados no modo Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM).

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Varredura do Íon Precursor (Parent Ion Scan):

As acilcarnitinas formam um fragmento iônico característico de m/z = 85 na célula de colisão (ver figura 4). Durante a determinação de acilcarnitinas e carnitina livre na varredura do Íon Precursor, o MS 2 está estaticamente ajustado para m/z = 85, enquanto o MS 1 realiza varredura das moléculas ionizadas que deram origem ao fragmento. Isto gera um espectro de massa muito seletivo para as acilcarnitinas.

Contudo, devido à melhor sensibilidade e seletividade, nós recomendamos determinar as acilcarnitinas no modo Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM).

Figura 4 - Fragmentação de acilcarnitinas pela perda de fragmento iônico característico m/z = 85 R = cadeia alquílica (p. ex.: R = CH3 para acetilcarnitina).

3.3 Procedimento inicial

Antes de iniciar uma análise:

1. Antes de iniciar uma seqüência analítica, as bombas de vácuo do sistema MS/MS devem estar em operação por no mínimo 8 horas.

2. Limpe o sistema com aproximadamente 10 mL de fase móvel em fluxo de 200 µL/min.

3. Injete repetidamente os controles preparados, até que dois espectros de massa sucessivos apresentem valores de concentração e intensidade de sinal bem próximos.

4. Após cumprir as etapas descritas acima, a corrida analítica pode ser iniciada.

Para a operação correta do sistema LC-MS/MS, leia o manual do equipamento. Se necessário, realize um curso de treinamento no uso do equipamento com seu fabricante.

3.4 Desligando o equipamento (Shut down)

Para períodos em que o equipamento não esteja sendo utilizado, recomenda-se desligar a bomba do HPLC. A fase móvel pode permanecer dentro do sistema, sem o risco de cristalização de sais nos selos da bomba. As bombas de vácuo do sistema LC-MS/MS devem permanecer operando o tempo todo. Para prolongar a vida média da fonte de ionização e da célula multiplicadora, o sistema MS/MS deverá ser colocado no modo de repouso (stand-by).

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4 Transições de massa dos analitos e padrões internos

As tabelas que seguem mostram as transições de massa recomendadas e os métodos de medição para os analitos e padrões internos isotopicamente marcados.

Aminoácidos:

Substância Método de medição Transição de massa

Alanina MRM 90 > 44 Alanina-D4 MRM 94 > 48 Arginina MRM 175 > 70 Arginina-D7 MRM 182 > 77 Ácido Aspártico MRM 134 > 116 Ácido Aspártico-D3 MRM 137 > 119 Citrulina MRM 176 > 113 Citrulina-D2 MRM 178 > 115 Ácido Glutâmico MRM 148 > 130 Ácido Glutâmico-D5 MRM 153 > 135 Glicina MRM 76 > 30 Glicina-¹³C2-¹5_N _MRM _{79 > 32} Leucina MRM 132 > 86 Leucina-D3 MRM 135 > 89 Metionina MRM 150 > 133 Metionina-D3 MRM 153 > 136 Ornitina MRM 133 > 70 Ornitina-D6 MRM 139 > 76 Fenilalanina MRM 166 > 120 Fenilalanina-D5 MRM 171 > 125 Prolina MRM 116 > 70 Prolina-D7 MRM 123 > 77 Tirosina MRM 182 > 136 Tirosina-D4 MRM 186 > 140 Valina MRM 118 > 72 Valina-D8 MRM 126 > 80

As massas apresentadas são um ponto inicial para otimizações. A posição exata do sinal de máxima intensidade pode variar para cada sistema MS e tem que ser determinada pelo tuning (pelo menos uma posição após o ponto decimal), utilizando a Mistura para Tuning (ordem no. 57099), que contém todos os analitos e padrões internos.

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Carnitina livre e acilcarnitinas:

Substância Método de medição Transição de massa

Carnitina MRM 162 > 85 Carnitina-D9 MRM 171 > 85 C2-Carnitina MRM 204 > 85 C2-Carnitina-D3 MRM 207 > 85 C3-Carnitina MRM 218 > 85 C3-Carnitina-D3 MRM 221 > 85 C4-Carnitina MRM 232 > 85 C4-Carnitina-D3 MRM 235 > 85 C5-Carnitina MRM 246 > 85 C5-Carnitina-D9 MRM 255 > 85 C5DC-Carnitina MRM 276 > 85 C5DC-Carnitina-D6 MRM 282 > 85 C6-Carnitina MRM 260 > 85 C6-Carnitina-D3 MRM 263 > 85 C8-Carnitina MRM 288 > 85 C8-Carnitina-D3 MRM 291 > 85 C10-Carnitina MRM 316 > 85 C10-Carnitina-D3 MRM 319 > 85 C12-Carnitina MRM 344 > 85 C12-Carnitina-D3 MRM 347 > 85 C14-Carnitina MRM 372 > 85 C14-Carnitina-D3 MRM 375 > 85 C16-Carnitina MRM 400 > 85 C16-Carnitina-D3 MRM 403 > 85 C18-Carnitina MRM 428 > 85 C18-Carnitina-D3 MRM 431 > 85

A quantificação dos analitos é feita pela comparação da intensidade do sinal com o padrão interno isotopicamente marcado correspondente. Várias acilcarnitinas de interesse diagnóstico, para as quais os padrões internos isotopicamente marcados ainda não estão disponíveis, também podem ser medidas com este kit, através da comparação do sinal com padrões deuterados que apresentem o mesmo comprimento de cadeia. Acilcarnitinas com comprimento de cadeia igual mostram aproximadamente o mesmo fator de resposta. Entretanto, este kit é validado somente para aqueles analitos com padrões internos deuterados disponíveis, descritos na tabela acima.

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A tabela seguinte mostra algumas acilcarnitinas adicionais, com seus respectivos valores de transição de massa e padrões internos isotopicamente marcados recomendados. Tais informações são apenas uma sugestão, representando a prática corrente de muitos laboratórios de triagem. O kit de reagentes Chromsystems não é validado para esses analitos.

Acilcarnitinas adicionais sem padrão interno explícito:

Substância Transição de massa Padrões internos recomendados

C3DC-Carnitina 248 > 85 C3-Carnitina-D3 C4OH-Carnitina 248 > 85 C4-Carnitina-D3 C4DC-Carnitina 262 > 85 C4-Carnitina-D3 C5:1-Carnitina 244 > 85 C5-Carnitina-D9 C5OH-Carnitina 262 > 85 C5-Carnitina-D9 C8:1-Carnitina 286 > 85 C8-Carnitina-D3 C10:1-Carnitina 314 > 85 C10-Carnitina-D3 C14:2-Carnitina 368 > 85 C14-Carnitina-D3 C14:1-Carnitina 370 > 85 C14-Carnitina-D3 C14OH-Carnitina 388 > 85 C14-Carnitina-D3 C16:1-Carnitina 398 > 85 C16-Carnitina-D3 C16:1OH-Carnitina 414 > 85 C16-Carnitina-D3 C16OH-Carnitina 416 > 85 C16-Carnitina-D3 C18:1-Carnitina 426 > 85 C18-Carnitina-D3 C18:2OH-Carnitina 440 > 85 C18-Carnitina-D3 C18:1OH-Carnitina 442 > 85 C18-Carnitina-D3 C18OH-Carnitina 444 > 85 C18-Carnitina-D3

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5 Preparação da amostra

Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no capítulo 10.

5.1 Coleta e armazenamento das amostras de pacientes

A coleta de sangue para triagem neonatal deve ocorrer entre 48 e 72 horas após o nascimento. O sangue é coletado do calcanhar do recém-nascido por gotejamento em papel de filtro e colocada em repouso até que esteja seca. Recomenda-se que sejam utilizados papéis de filtro aprovados e específicos para o teste. Amostras com EDTA ou heparina não devem ser utilizadas pois podem levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos.

Descrição resumida das etapas da coleta:

1. Limpe a área do calcanhar do recém-nascido destinada à punção com anti-séptico. Seque com cotonete estéril.

2. Perfure o calcanhar com uma lanceta estéril. A ponta da lanceta deve ser menor que 2 mm, pois, perfurações profundas podem ferir crianças pequenas.

3. Descarte a primeira gota de sangue com um cotonete estéril.

4. Colha a próxima grande gota de sangue com o papel de filtro, aguardando até que a amostra seja adsorvida no papel e preencha totalmente o círculo delimitado. Não aplique uma gota de sangue sobre a outra e nem colha em ambos os lados do papel, pois isto altera o volume de sangue coletado por

spot e pode produzir falsos resultados patológicos.

5. Preencha cada um dos círculos remanescentes no papel de filtro, repetindo o mesmo procedimento, com uma única gota de sangue.

6. Cuidados com o local de punção deve estar de acordo com a prática comum do hospital/laboratório

7. Deixe o sangue coletado secar por 4 horas, repousando o papel de filtro em uma superfície horizontal, não-absorvente, em temperatura ambiente.

8. Envie as amostras secas em papel de filtro para o laboratório, dentro de 24 horas.

Para instruções detalhadas da coleta da amostra, consulte o manual do fabricante do papel de filtro ou as orientações padronizadas.

A estabilidade das amostras de sangue seco é de até 21 dias em temperatura ambiente (20 a 25ºC) ou refrigeradas (2 a 8ºC). Para períodos mais longos de armazenamento, proteja as amostras da umidade e congele-as a < –18ºC. Evite temperaturas acima de 37ºC por vários dias, isto pode causar a diminuição de alguns aminoácidos.

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5.2 Reconstituição do padrão interno

O padrão interno (artigo 57004) é utilizado como padrão de calibração para cada amostra e é rastreável a substâncias de referência isotopicamente marcadas adquiridas de fornecedor certificado. Após reconstituição, uma quantidade definida de padrão interno é adicionada a amostra e, então, submetido a todo o procedimento de preparação das amostras. O padrão interno liofilizado é reconstituído com exatamente 25 mL de

solução tampão de extração (artigo 57008). Abra o frasco do padrão interno e dissolva o conteúdo com 5

mL de solução tampão de extração. Deixe o frasco em repouso à temperatura ambiente por cerca de 5 minutos, agite ocasional e suavemente. Transfira o conteúdo do frasco para um balão volumétrico de 25 mL. Enxágüe o frasco do padrão interno duas vezes com 5 mL de solução tampão de extração e transfira o líquido para o balão volumétrico. Complete o volume do balão volumétrico para 25 mL com a solução tampão de extração e homogeneíze. Evite a exposição direta à luz. A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada no folheto de informações que acompanha o padrão.

Estabilidade padrão interno reconstituído:

O padrão interno reconstituído é estável por até três semanas se mantido bem fechado, protegido da luz e refrigerado (2 a 8°C).

5.3 Manuseio dos controles

Os controles nível I (artigo 0192) e nível II (artigo 0193), disponíveis na forma de spots de sangue seco em papel de filtro são submetidos a todo o procedimento de preparação das amostras. Os controles assim preparados são incluídos em cada série analítica para monitorar a exatidão e a precisão do sistema.

A embalagem com fechamento tipo zip contêm o material controle, envelopes com dissecante e um cartão indicador de umidade. O cartão indicador de umidade deve ser verificado sempre que a embalagem do controle for aberta. Se o indicador apresentar uma mudança da cor azul para rosa, em 50%, os envelopes com dissecante devem ser retirados e regenerados mediante aquecimento a 60ºC por 4 horas em forno de secagem. Para evitar condensação, os controles armazenados em temperaturas abaixo de -18ºC devem ser mantidos na embalagem, até que esta atinja a temperatura ambiente, para então ser aberta. Imediatamente após o uso, os controles remanescentes devem ser novamente acondicionados em suas embalagens zip, feche bem e congele abaixo de -18°C.

Uma fita de registro de temperatura está fixada na embalagem dos controles. Uma mudança permanente da cor branca para preta indica que a temperatura correspondente no indicador foi alcançada. Evite temperaturas acima de 37ºC por mais de cinco dias. Decréscimo na concentração dos analitos (aminoácidos) pode ocorrer. Evite exposição direta à luz do solar.

A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada no folheto de informação que acompanha o controle.

Atenção: Este produto foi fabricado a partir de pool de sangue total humano testado, fornecendo resultados

negativos para anticorpos HIV-1+2, HIV-, HCV- e HBV-DNA (PCR), antígeno HBs, anticorpos HBc, anticorpos HCV e TPHA. Como não existem métodos que dêem segurança absoluta de que produtos contendo materiais de fonte humana serão livres de agentes infecciosos, um possível risco de infecção deve ser levado em conta. Este produto também pode conter agentes desconhecidos e outros patógenos para os quais não existem testes aprovados. Nós assim recomendamos considerar todos os produtos contendo material de fonte humana como potencialmente infeccioso e manipulá-lo com o mesmo cuidado destinado a amostras de pacientes potencialmente infecciosas.

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5.4 Procedimento de preparação das amostras

5.4.1 Preparação da amostra sem placa filtrante

1. Picotagem da amostra:

Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3 mm da amostra de sangue seco e coloque dentro de um poço da placa de 96 poços.

2. Extração:

Adicione 100 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Tampe a placa com a folha de proteção (artigo 55011) e agite por 20 minutos a 600 rpm, em temperatura ambiente.

3. Transferência:

Remova a folha de proteção da placa. Transfira o sobrenadante para uma nova placa de 96 poços. Tampe a placa com a folha de proteção em alumínio (artigo 55013).

4. Injeção:

Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS.

5. Controle de Qualidade:

A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais em cada corrida analítica.

5.4.2 Preparação da amostra com placa filtrante

1. Picotagem da amostra:

Coloque uma placa filtrante em uma placa de 96 poços com fundo em V. Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3 mm da amostra de sangue seco e coloque dentro de um poço da placa filtrante.

2. Extração:

Adicione 100 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Tampe a placa filtrante com a folha de proteção (artigo 55011) e agite ambas as placas por 20 minutos a 600 rpm, em temperatura ambiente.

3. Centrifugação:

Remova a folha de proteção da placa filtrante. Filtre o sobrenadante para a placa de 96 poços com fundo em V, por centrifugação a 4000 rpm por 2 minutos. Descarte a placa filtrante e tampe a placa de 96 poços com a folha de proteção em alumínio (artigo 55012).

4. Injeção:

Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS.

5. Controle de Qualidade:

A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais em cada corrida analítica.

Atenção:

Use somente os reagentes, placas de 96 poços e folhas de proteção fornecidas no kit. Variações na preparação das amostras irão alterar a eficiência do kit.

Os adesivos selantes são usados na injeção do autosampler refrigerado é recomendado para minimizar a evaporação das amostras

(16)

5.5 Estabilidade das amostras

Os eluatos/amostras, depois de preparados, são estáveis em temperatura ambiente (20 a 25°C) ou refrigerados (2 a 8ºC) por 10 dias (em frasco de vidro bem fechado e protegido da luz).

5.6 Materiais requeridos, mas não fornecidos

Esse kit é para determinação semi-quantitativa de aminoácidos e acilcarnitinas em gotas de sangue seco para triagem neonatal, que adicionalmente requer os seguintes equipamentos não inclusos no kit:

 Espectrômetro de massa em tandem com software de avaliação;

 Sistema de HPLC com bomba, injetor e amostrador automático;

 Picotador automático ou manual, para picotar as amostras, 3 mm em diâmetro;

 Agitador de placas de microtitulação para extração das amostras;

 Presilhas de borracha (elástico) para prender as folhas de proteção às placas de 96 poços;

 Pipeta ou pipeta multicanal, 100 µL;

 Ponteiras;

 Balão volumétrico com capacidade para 25 mL;

 Opcional: centrífuga para placas de 96 poços.

6 Resultados e avaliação

6.1 Quantificação com padrão interno

O padrão interno é utilizado como um calibrador individual para cada amostra, reduzindo assim os efeitos de matriz ao mínimo. Para este fim, a amostra (controle, paciente) é misturada com uma quantidade definida de padrão interno. As concentrações dos compostos isotopicamente marcados no padrão interno dependem do lote e serão encontradas nos folhetos informativos que acompanham os padrões.

O volume de sangue utilizado é fundamental para a quantificação bem sucedida das amostras. O volume de sangue obtido através do picote de um disco de sangue seco depende do diâmetro do disco picotado, do hematócrito da amostra e do material do papel de filtro utilizado. Usando um picote com 3 mm de diâmetro, um hematócrito entre 0,35 e 0,45 e um papel de filtro da marca Whatman 903, o volume médio de sangue é de 3,1 µL. Uma vez que o volume de sangue varia de amostra para amostra, este procedimento de triagem é método de determinação semi-quantitativo. Para confirmar resultados de triagem positivos, testes diagnósticos adicionais devem ser realizados.

Antes de iniciar a análise quantitativa de amostras de pacientes, é recomendado realizar vários testes de corrida, injetando os controles preparados repetidamente, até que dois sucessivos espectros de massa apresentem valores de concentração e de intensidade de sinal quase idênticos.

Dependendo do software utilizado, os valores dos componentes do padrão interno e o volume de sangue ou a concentração do padrão interno relacionada à amostra é necessária. Entre com as concentrações (ver folheto informativo) do padrão interno na tabela de análise.

(17)

Aminoácidos:

Substância Concentração (µmol/L) Concentração relacionada à amostra para 100 µL de padrão interno / 3,1 µL de sangue

(µmol/L)

Alanina-D4 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Arginina-D7 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Ácido Aspártico-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Citrulina-D2 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Ácido Glutâmico-D5 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Glicina-13_C₂_-15_N _{Ver folheto informativo} _{Ver folheto informativo}

Leucina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Metionina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Ornitina-D6 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Fenilalanina-D5 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Prolina-D7 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Tirosina-D4 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Valina-D8 Ver folheto informativo Ver folheto informativo

O volume de amostra de sangue seco é proporcional ao tamanho do disco picotado. Se qualquer outro tamanho de picote do disco de sangue seco, diferente de 3 mm de diâmetro, for utilizado, favor ajustar as concentrações do padrão interno de acordo.

Acilcarnitinas e Carnitina livre:

Substância Concentração (µmol/L) Concentração relacionada à amostra para 100 µL de padrão interno / 3,1 µL de sangue

(µmol/L)

C0-Carnitina-D9 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C2-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C3-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C4-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C5-Carnitina-D9 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C5DC-Carnitina-D6 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C6-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C8-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C10-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C12-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C14-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C16-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo C18-Carnitina-D3 Ver folheto informativo Ver folheto informativo Nota: O folheto informativo, que acompanha o padrão interno, contém os valores a serem inseridos.

O volume de amostra de sangue seco é proporcional ao tamanho do disco picotado. Se qualquer outro tamanho de picote do disco de sangue seco, diferente de 3 mm de diâmetro, for utilizado, favor ajustar as concentrações do padrão interno de acordo.

Para assegurar que as condições do LC-MS/MS não sofreram variações durante a corrida analítica, os controles preparados devem ser injetados durante a corrida e novamente ao final. Para o manuseio correto do software, entre em contato com o fabricante, se necessário.

(18)

6.2 Princípios do cálculo

As concentrações dos analitos nas amostras são calculadas de acordo com o seguinte princípio:

Intensidade do sinal da substância A no espectro de massa da amostra = AAmostra

Intensidade do sinal do padrão interno no espectro de massa da amostra =ISAmostra

Concentração C do padrão interno relacionada a amostra (tabelas 4 e 5) =CPadrão

A concentração CAnalito,Amostra na amostra é então calculada como a seguir:

CAnalito,Amostra

(µmol/L)

= ____AAmostra x CPadrão

ISAmostra

7 Controle de Qualidade

Controles adicionais podem ser incluídos em cada corrida analítica para monitorar a exatidão e precisão das análises (Controles Chromsystems, spot de sangue seco, artigo 0192 e 0193).

8 Valores de referência/valores de cut-off

Em um estudo piloto conduzido no Centro de Triagem Neonatal do Hospital Universitário de Dresden (Alemanha), os seguintes valores de cut off dados como percentil 99,9% foram determinados. Os dados estão diferenciados entre as semanas gestacionais (SG) e a coleta de sangue após o nascimento.

Aminoácidos:

Analito Cut off (µmol/L) 32-42 SG, >36 h

Cut off (µmol/L) 38-42 SG, >36 h

Cut off (µmol/L) todas SG, >0 h Alanina 583 564 736 Arginina 52 49 55 Ácido Aspártico 420 402 420 Citrulina 50 51 50 Ácido Glutâmico 1074 1087 1073 Glicina 1003 962 1001 Leucina 277 299 276 Metionina 35 35 37 Ornitina 454 455 453 Fenilalanina 127 124 141

Prolina Ainda não estabelecido Ainda não estabelecido Ainda não estabelecido

Tirosina 248 217 248

(19)

Analito Cut off (µmol/L)

32-42 SG, >36 h

Cut off (µmol/L) 38-42 SG, >36 h

Cut off (µmol/L) todas SG, >0 h C0-Carnitina 55,87 54,96 55,83 C2-Carnitina 71,17 73,40 71,08 C3-Carnitina 6,35 6,41 6,34 C4-Carnitina 1,07 1,18 1,07 C5-Carnitina 0,43 0,37 0,48 C5DC-Carnitina 0,56 0,58 0,56 C6-Carnitina 0,17 0,17 0,17 C8-Carnitina 0,24 0,24 0,24 C10-Carnitina 0,35 0,29 0,35 C12-Carnitina 0,35 0,31 0,35 C14-Carnitina 0,50 0,49 0,50 C16-Carnitina 9,90 10,03 9,89 C18-Carnitina 2,06 2,07 2,06

Esses valores de cut off devem servir apenas como base, uma vez que variam de acordo com o grupo de pacientes estudados e com o sistema MS/MS utilizado. Cada laboratório deve determinar seus próprios valores de cut off em estudos pilotos, sob supervisão e avaliação de especialistas.

9 Fatores de conversão

Aminoácidos:

Analito µmol/L em mg/L mg/L em µmol/L

Alanina x 0,0891 x 11,223 Arginina x 0,1742 x 5,7405 Ácido Aspártico x 0,1331 x 7,5126 Citrulina x 0,1752 x 5,7081 Ácido Glutâmico x 0,1471 x 6,7967 Glicina x 0,0751 x 13,321 Leucina x 0,1312 x 7,6237 Metionina x 0,1492 x 6,7020 Ornitina x 0,1322 x 7,5666 Fenilalanina x 0,1652 x 6,0536 Prolina x 0,1151 x 8,6858 Tirosina x 0,1812 x 5,5191 Valina x 0,1172 x 8,5361

Analito µmol/L em mg/L mg/L em µmol/L

C0-Carnitina x 0,1612 x 6,2019 C2-Carnitina x 0,2032 x 4,9203 C3-Carnitina x 0,2172 x 4,6032 C4-Carnitina x 0,2312 x 4,3245 C5-Carnitina x 0,2452 x 4,0776 C5DC-Carnitina x 0,2753 x 3,6319 C6-Carnitina x 0,2593 x 3,8559 C8-Carnitina x 0,2874 x 3,4789 C10-Carnitina x 0,3154 x 3,1701 C12-Carnitina x 0,3435 x 2,9109

(20)

10 Informações sobre substâncias perigosas

As seguintes informações devem ser observadas e as respectivas medidas de segurança deverão ser adotadas. Maiores informações podem ser obtidas nos respectivos folhetos de segurança dos materiais (www.chromsystems.de) ou mediante solicitação.

Produto/ Símbolos de perigo Risco

Fase móvel (artigo 57001, 57002)

Xn (nocivo)

F (altamente inflamável)

R11-20/21/22-36 Altamente inflamável.

Nocivo por inalação, ingestão e contato com a pele. Irritante aos olhos.

S16-36/37

Manter longe de ignição, não fumar. Utilizar jaleco e luvas.

Solução de limpeza (artigo 57007)

Xn (nocivo)

S16-36/37

Solução tampão de extração (artigo 57008)

T (tóxico)

R11-23/24/25-39/23/24/25 Altamente inflamável.

Tóxico por inalação, ingestão e contato com a pele.

Tóxico: perigo de sérios danos irreversíveis por inalação, ingestão e contato com a pele.

S7-16-36/37-45

Manter o frasco bem fechado. Manter longe de ignição, não fumar. Utilizar jaleco e luvas.

Em caso de acidente ou mal estar, procurar auxílio médico imediatamente, de preferência levar esse manual.

Mistura para tuning (artigo 57099)

Xn (nocivo)

S16-36/37

Esses componentes não são classificados como perigosos de acordo com a legislação da União Européia:

Padrão Interno (artigo 57004)

(21)

11 Armazenamento e validade dos reagentes

Reagentes não abertos podem ser utilizados até a data de validade estabelecida no rótulo, desde que as condições de estocagem indicadas no rótulo sejam obedecidas.

Condições de armazenamento dos reagentes:

Produto Condição

Fase móvel Temperatura ambiente Solução de limpeza Temperatura ambiente Solução tampão de extração Temperatura ambiente Placa de 96 poços Temperatura ambiente Placa filtrante de 96 poços Temperatura ambiente Folhas de proteção para placas de 96 poços Temperatura ambiente Mistura para tuning 2 a 8ºC

Padrão Interno Abaixo de -18ºC Controles nível I e nível II, spot Abaixo de -18ºC

Os reagentes devem ser fechados e armazenados nas condições estabelecidas tão logo sejam utilizados. Se nada tiver sido previamente determinado, a validade de um reagente em uso deverá ser de 1 ano após sua abertura, não excedendo o seu respectivo prazo de validade. Para calibradores e controles, ver os capítulos 5.2 e 5.3 deste manual.

12 Descarte de resíduos

A fase móvel, a solução de limpeza, a solução tampão de extração, a mistura para tuning e qualquer resíduo das amostras extraídas contêm solventes orgânicos e devem ser descartadas de acordo com as diretrizes locais e legislação vigente.

12.1 Garantia

Estas instruções de uso devem ser lidas atentamente antes da utilização do produto e as instruções nela contidas devem ser rigorosamente cumpridas. A confiabilidade dos recados do ensaio não poderá ser garantida em caso de desvio às instruções.

(22)

13 Exemplos de cromatogramas

13.1 Espectro do controle de aminoácidos no intervalo do cut-off

13.2 Espectro de uma amostra de paciente com fenilcetonúria (PKU)

13.3

(23)

13.3 Espectro do controle de acilcarnitinas no intervalo do cut-off

(24)

13.5 Espectro de uma amostra de paciente com VLCAD

13.6 Espectro de uma amostra de paciente com acidemia

glutárica tipo I (GA I)

(25)

14 Validação

Para verificar a linearidade e para validar o método, foram utilizadas amostras de sangue acrescentadas de quantidades definidas de aminoácidos e acilcarnitinas. Alíquotas múltiplas dessas amostras foram submetidas ao procedimento de preparo descrito neste manual.

Recuperação:

A recuperação analítica foi determinada a partir do coeficiente angular da curva de calibração, obtida com amostras de sangue acrescentadas de quantidades definidas de aminoácidos e acilcarnitinas e soluções padrões diluídas. Aminoácidos: Analito Recuperação (%) Alanina 79 Arginina 80 Ácido Aspártico 88 Citrulina 94 Ácido Glutâmico 81 Glicina 81 Leucina 86 Metionina 90 Ornitina 86 Fenilalanina 94 Prolina* 89 Tirosina 93 Valina 90

* a determinação deste analito foi realizada no AB Sciex API4000

Analito Recuperação (%) C0-Carnitina 85 C2-Carnitina 86 C3-Carnitina 89 C4-Carnitina 88 C5-Carnitina 92 C5DC-Carnitina 91 C6-Carnitina 90 C8-Carnitina 91 C10-Carnitina 92 C12-Carnitina 94 C14-Carnitina 94 C16-Carnitina 94 C18-Carnitina 87

(26)

Linearidade e limite de quantificação

O limite de quantificação e a linearidade foram determinados por diluição de um eluato de amostras de sangue preparada com padrão interno. O método é considerado linear a partir do limite de quantificação até o limite máximo.

Aminoácidos:

Analito Limite de quantificação aproximado (µmol/L)*

Limite máximo de linearidade (µmol/L)

Alanina 15,6 2000 Arginina 7,8 2000 Ácido Aspártico 15,6 2000 Citrulina 7,8 2000 Ácido Glutâmico 15,6 2000 Glicina 15,6 2000 Leucina 15,6 2000 Metionina 7,8 2000 Ornitina 7,8 2000 Fenilalanina 7,8 2000 Prolina* 4,8 2400 Tirosina 15,6 2000 Valina 15,6 2000

Analito Limite de quantificação aproximado (µmol/L)*

Limite máximo de linearidade (µmol/L)

C0-Carnitina 1,6 200 C2-Carnitina 1,6 200 C3-Carnitina 0,2 50 C4-Carnitina 0,2 25 C5-Carnitina 0,2 25 C5DC-Carnitina 0,2 25 C6-Carnitina 0,2 25 C8-Carnitina 0,2 25 C10-Carnitina 0,2 25 C12-Carnitina 0,2 25 C14-Carnitina 0,1 25 C16-Carnitina 0,1 33 C18-Carnitina 0,1 33

(27)

Precisão intra-ensaio:

A determinação da precisão intra-ensaio foi realizada em três diferentes concentrações, a partir da média e coeficiente de variação de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra.

Aminoácidos:

Analito Coeficiente de variação (%), n=10

(concentração em µmol/L) Alanina 5,2 (281) 4,7 (390) 4,6 (745) Arginina 4,2 (7) 10,4 (12) 3,4 (125) Ácido Aspártico 4,7 (96) 5,1 (147) 5,8 (345) Citrulina 6,8 (20) 7,3 (61) 5,0 (256) Ácido Glutâmico 4,9 (218) 3,0 (388) 3,8 (749) Glicina 10,9 (241) 6,0 (336) 5,0 (1085) Leucina 6,4 (181) 2,9 (281) 2,8 (592) Metionina 6,8 (19) 4,0 (62) 2,9 (268) Ornitina 5,6 (95) 7,1 (217) 5,4 (626) Fenilalanina 4,7 (69) 3,4 (129) 3,0 (566) Prolina* 8,8 (231) 6,4 (525) 5,4 (834) Tirosina 4,7 (69) 2,9 (158) 3,5 (488) Valina 4,8 (111) 2,3 (171) 4,3 (365)

(concentração em µmol/L) C0-Carnitina 4,7 (26,4) 3,0 (48,0) 4,1 (105) C2-Carnitina 5,5 (15,2) 2,7 (39,5) 2,6 (81,6) C3-Carnitina 6,1 (1,78) 2,7 (6,54) 2,7 (15,1) C4-Carnitina 6,2 (0,34) 4,9 (1,15) 4,0 (4,42) C5-Carnitina 8,1 (0,14) 4,0 (0,60) 3,9 (2,35) C5DC-Carnitina 12,2 (0,19) 12,2 (0,66) 9,0 (2,38) C6-Carnitina 9,6 (0,06) 3,2 (0,48) 4,1 (2,11) C8-Carnitina 8,5 (0,10) 3,9 (0,57) 4,2 (2,31) C10-Carnitina 8,2 (0,16) 3,7 (0,63) 3,1 (2,44) C12-Carnitina 8,1 (0,07) 3,8 (0,52) 3,5 (2,25) C14-Carnitina 10,3 (0,10) 4,6 (0,50) 3,8 (2,00) C16-Carnitina 5,7 (0,72) 4,9 (4,56) 3,3 (12,2) C18-Carnitina 6,6 (0,54) 4,9 (2,26) 5,2 (7,69)

(28)

Precisão inter-ensaio:

A determinação da precisão inter-ensaio foi realizada em três diferentes concentrações, a partir da média e coeficiente de variação de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra, em 10 diferentes séries de testes.

Aminoácidos:

(concentração em µmol/L) Alanina 6,6 (281) 7,9 (390) 5,6 (745) Arginina 9,3 (7) 17,6 (12) 10,3 (125) Ácido Aspártico 6,4 (96) 6,7 (147) 6,1 (345) Citrulina 11,4 (20) 7,6 (61) 5,7 (256) Ácido Glutâmico 6,1 (218) 7,0 (388) 5,4 (749) Glicina 8,4 (241) 8,3 (336) 6,0 (1085) Leucina 5,8 (181) 6,3 (281) 5,5 (592) Metionina 6,7 (19) 6,3 (62) 5,4 (268) Ornitina 9,4 (95) 8,8 (217) 8,6 (626) Fenilalanina 5,9 (69) 6,6 (129) 5,0 (566) Prolina* 7,7 (241) 8,2 (562) 7,1 (869) Tirosina 5,3 (69) 5,8 (158) 4,9 (488) Valina 7,3 (111) 8,2 (171) 5,7 (365) * a determinação deste analito foi realizada no AB Sciex API4000

(concentração em µmol/L) C0-Carnitina 6,7 (26,4) 7,1 (48,0) 6,1 (105) C2-Carnitina 6,1 (15,2) 6,5 (39,5) 5,1 (81,6) C3-Carnitina 5,8 (1,78) 6,8 (6,54) 5,3 (15,1) C4-Carnitina 7,0 (0,34) 6,8 (1,15) 5,2 (4,42) C5-Carnitina 8,5 (0,14) 7,0 (0,60) 5,8 (2,35) C5DC-Carnitina 14,3 (0,19) 11,7 (0,66) 9,0 (2,38) C6-Carnitina 13,3 (0,06) 7,4 (0,48) 5,6 (2,11) C8-Carnitina 9,3 (0,10) 7,6 (0,57) 5,6 (2,31) C10-Carnitina 7,8 (0,16) 7,0 (0,63) 5,5 (2,44) C12-Carnitina 9,1 (0,07) 6,9 (0,52) 5,7 (2,25) C14-Carnitina 8,8 (0,10) 7,1 (0,50) 6,1 (2,00) C16-Carnitina 6,4 (0,72) 6,6 (4,56) 5,5 (12,2) C18-Carnitina 6,3 (0,54) 6,8 (2,26) 5,5 (7,69)

(29)

15 Interferentes conhecidos

 Isoleucina interfere com leucina. A concentração medida na amostra é um somatório das concentrações dos dois aminoácidos.

 Hidroxiprolina interfere com leucina. O valor padrão da hidroxiprolina é insignificante comparado ao da leucina. Hidroxiprolina não deve causar qualquer falso aumento da concentração de leucina durante a análise de rotina.

 Metionina sulfona interfere com tirosina. Metionina sulfona é um produto de degradação da metionina. A concentração padrão da Metionina em crianças é de aproximadamente 20 µmol/L e as concentrações máximas esperadas de metionina sulfona estão dentro dessa faixa. O valor patológico de tirosina é de aproximadamente 300 µmol/L. Desta forma, metionina sulfona não deve causar acréscimos significativos na concentração de tirosina durante análises de rotina.

 Metionina sulfóxido interfere com metionina, tirosina e fenilalanina. Metionina sulfóxido é um produto da oxidação da metionina. In vivo, metionina sulfóxido é reduzida novamente a metionina pela ação da enzima metionina sulfóxido redutase. Logo, em condições in vivo, não devem existir concentrações patológicas de metionina, tirosina e fenilalanina causadas pelo aumento da concentração de metionina sulfóxido.

 Sarosina interfere com alanina. A concentração de sarosina em relação à alanina, contudo, é negligenciável. Portanto, a sarosina não deve causar falsa elevação dos resultados de alanina.

 A creatina, um suplemento alimentar utilizado para aumentar a massa muscular, interfere com alanina e leucina.

 O metabólito do analgésico Metamizol (ex. Dipirona Sódica) interfere com a C2-carnitina.

 Acilcarnitinas isobáricas com fragmentações idênticas são medidas como somatório. Isto aplica-se aos seguintes pares de acilcarnitinas: C3DC/C4OH; C4DC/C5OH; C5DC/C6OH, etc.

 Asparagina interfere com ornitina. A concentração máxima de asparagina em crianças é de 140 µmol/L. Somente concentrações de asparagina acima de 300 µmol/L podem causar um aumento de 20% na concentração de ornitina. Asparagina não deve causar qualquer falso aumento da concentração de ornitina durante análise de rotina.

 Aditivos em materiais plásticos (placas de microtitulação, folhas de proteção) usados na preparação das amostras, podem interferir consideravelmente com algumas acilcarnitinas, gerando resultados falso-positivos. Logo, este kit de reagentes da Chromsystems contém todos os materiais plásticos necessários para a análise, devidamente testados e classificados como livre de interferentes.

 Em pacientes com dietas parenterais, com substituição de tirosina por acetiltirosina, pode ocorrer decréscimo na concentração de tirosina. A razão elevada entre as concentrações de Fenilalanina e Tirosina (Phe/Tyr) pode indicar falsamente fenilcetonúria, mesmo com a concentração de fenilalanina em valores normais.

 Pacientes em uso de pivalina como antibiótico podem apresentar concentrações elevadas de C5-Carnitina, devido à formação de pivalilcarnitina (isômero da isovalerilcarnitina). Embora nenhuma desordem metabólica exista, uma acidemia isovalérica (IVA) pode ser falsamente indicada.

Para o esclarecimento de quaisquer outras questões envolvendo possíveis interferências, entre em contato com a assessoria científica da Biosys, através de e-mail ou telefone, ou mande um e-mail para

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16 Problemas e Soluções

Problema

Possível causa

Solução

Gradiente de fluxo não está sendo gerado

Bomba do HPLC

Ar no sistema

Fluxo inconstante

Checar bomba de HPLC (vazamentos, bolhas de ar)

Degaseificar o sistema de HPLC (purga)

Checar a bomba do HPLC

Sinais interferentes Sistema de injeção contaminado

Frascos do amostrador automático contaminados

Selos dos frascos

Limpar com metanol ou injetar fase móvel 10 vezes

Usar frascos novos ou limpá-los com metanol

Usar outros selos

Perda de sinal Defeito no injetor

Defeito na bomba

Sistema MS/MS não está pronto

Checar o injetor

Checar a bomba

Checar o sistema MS/MS

Diminuição da sensibilidade

Fonte de íons contaminada

Espectrômetro de massa contaminado

Vazamento na válvula de injeção

Multiplicadora degradada

Limpe a fonte de íons

Limpe o espectrômetro de massa

Checar o injetor

Substitua à multiplicadora

Sinal com pouca intensidade

Massas imprecisas

Amostrador automático sem exatidão

Realize a calibração das massas

Checar a acurácia

Ausência de vácuo

Defeito na bomba de vácuo

Vazamento no sistema de vácuo

Checar todas as bombas de vácuo

Checar tubulações e conexões

Sem suprimento de gás

Defeito no gerador de nitrogênio

Defeito no compressor

Cilindro de gás vazio

Pressão do gás inadequada

Checar o gerador de nitrogênio

Checar compressor

Substituir o cilindro de gás

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