APRESENTAÇÃOCAMILA 30 07 2010

(1)

Me. Camila Carolina de Menezes

Patrício Santos

Orientador:

Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Alm

eida

Co-orientadora:

Prof

a

_{. Dr}

a

_{. Liana Clébia Soares Lima de Morais}

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA

PROFESSOR DELBY FERNANDES DE MEDEIROS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS

NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS

JULHO DE 2010

(2)

Camila C. M. P. Santos

DANO

TECIDUAL

INTRODUÇÃO

Involvement of the K and Ca channels

Mediadores

endógenos

NOCICEPTORES

(JI; STRICHARTZ, 2004)

Camila C. M. P. Santos

INTRODUÇÃO

Antinociceptive action of myricitrin: Involvement of the K+_{and Ca}2+_channels

NOCICEPTORES

Vias de sinalização:

PKA

PKC

PK Ca

2+

_/calmodulina

NO

MAPKs

Corno dorsal

Fibras aferentes

primárias

(JI; STRICHARTZ, 2004)

(3)

Camila C. M. P. Santos

INTRODUÇÃO

Involvement of the K+_{and Ca}2+_channels

DOR

(BASBAUM; JESSELL, 2000; JULIUS, BASBAUM, 2001)

Camila C. M. P. Santos

INTRODUÇÃO

SUBSTÂNCIAS

Vias de sinalização

Central

Periférica

Promissoras para o controle da

DOR

(4)

Camila C. M. P. Santos

INTRODUÇÃO

MIRICITRINA

A

C

B

Ramnose

Difenilpropano dos

flavonóides.

INTRODUÇÃO

Manilkara zapota

(fruto)

Croton draco

(látex)

Eugenia uniflora

(folhas)

MIRICITRINA

(MA et al., 2004; SCHMEDA-HIRSCHMANNET et al., 1987; TSACHEVA et al., 2004)

(5)

Camila C. M. P. Santos

MATERIAIS

MEMBRANA

Proteína G

i/o

Abre

canais de

K

+

Fosforilação

de kinases

Fosforilação de

receptores/canais

Liberação

de NT

Influxo de

Na

+

_{/ Ca}

+2

Tirosina

kinase

Proteína

G

q/11

PLC

IP

3

DAG

Liberação

de Ca

+2

NOS

NO

PKC

Fosforilação

de kinases

P

Receptores do

Glutamato,

Vanilóide

Canais de Ca

+2

_,TTx

Canais de K

+

NF-κB

Síntese de novos

mediadores

MAPK

?

Camila C. M. P. Santos

OBJETIVOS

Investigar o efeito de Miricitrina em outras vias de

transmissão da Dor:

Vias de sinalização

excitatórias

Vias de sinalização

inibitórias

Ativação de proteína G

_i/o

Abertura de canais de K

+

Vias mediadas por:

Glutamato, Substância P,

Capsaicina e citocinas

pró-inflamatórias

(6)

Camila C. M. P. Santos

ANIMAIS

Camundongos albinos

Swiss

de ambos os

sexos (25 – 35g);

Ratos

Wistar

machos (200 – 250g);

Ciclo claro/escuro de 12h;

Temperatura de 22 ± 2ºC;

Livre acesso à água e comida;

Aclimatização

60 min

antes

dos

experimentos.

Camila C. M. P. Santos

(7)

Camila C. M. P. Santos

TESTE DAS CONTORÇÕES

ABDOMINAIS

INDUZIDAS PELO ÁCIDO

ACÉTICO

FATIAS

CORTICAIS

IN VIVO

IN VITRO

TESTE DO

COMPORTAMENTO DE

MORDIDA

Camila C. M. P. Santos

A MIRICITRINA TEM

EFEITO ANTINOCICEPTIVO

DIRETAMENTE NO SNC

(8)

Camila C. M. P. Santos

ÁCIDO

ACÉTICO

H

+

CAVIDADE

PERITONEAL

PG

BK

SP

TNF-α

IL-1β

IL-8

Glu

Asp

NOCICEPÇÃO

METODOLOGIA

Camila C. M. P. Santos

Alterações Comportamentais

CONTORÇÕES

ABDOMINAIS

EXTENSÃO DOS

MEMBROS POSTERIORES

NÃO-ESPECÍFICO →

ANALGÉSICOS e ANTIINFLAMATÓRIOS

(KOSTER; ANDERSON; DEBBER, 1959; DERAEDT et al., 1980; ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006)

NOCICEPÇÃO

(9)

Camila C. M. P. Santos

METODOLOGIA

MIRICITRINA

(0,1 – 10μg/sítio)

PBS

(controle)

5 μL

VIA

INTRACEREBRO

VENTRICULAR

VIA INTRATECAL

ESPINHAL SUPRAESPINHAL

(L5 – L6)

10 min

Ácido acético

0,6% (i.p.)

Nº. de

contorções

abdominais.

20 min

TESTE DAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS

INDUZIDAS PELO ÁCIDO ACÉTICO

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

Efeitos da administração sistêmica, espinhal e supraespinhal de

Miricitrina na nocicepção visceral induzida por ácido acético

(10)

Camila C. M. P. Santos

O EFEITO ANTINOCICEPTIVO

DE MIRICITRINA ENVOLVE

VIAS DE SINALIZAÇÃO

INIBITÓRIAS

Camila C. M. P. Santos

AC

Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 PKA

GDP

AMPc

ATP

K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+

INIBE A LIBERAÇÃO DE

NEUROTRANSMISSORES

HIPERPOLARIZAÇÃO

G

i/o

MORFINA

PARTICIPAÇÃO DA

PROTEÍNA G

_i/o

(OCANA et al., 2004)

(11)

Camila C. M. P. Santos

AC

Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 Ca+2 PKA

GDP

AMPc

ATP

G

i/o

Toxina

pertussis

PARTICIPAÇÃO DA

PROTEÍNA G

_i/o

(OCANA et al., 2004)

METODOLOGIA

TOXINA

PERTUSSIS

(0,5 μg/sítio)

PBS

(controle)

VIA INTRATECAL

ESPINHAL

(L5 – L6)

7 dias

Ácido acético

0,6% (i.p.)

Nº. de

contorções

abdominais.

20 min

TESTE DAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS

INDUZIDAS PELO ÁCIDO ACÉTICO

VEÍCULO

(10mL/kg)

MIRICITRINA

(1 mg/kg, i.p.)

MORFINA

(2,5 mg/kg,

s.c.)

30’

(12)

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

Ausência de TP

Presença de TP

Efeito do pré-tratamento com Toxina pertussis no perfil

antinociceptivo de Miricitrina.

*** p < 0,001 comparado ao grupo controle # p < 0,001 comparado ao grupo com MI ou morfina

Camila C. M. P. Santos

METODOLOGIA

PARTICIPAÇÃO DOS

CANAIS DE K

+

CaM ATP

+ - - -

- - -

_Ca+2 Ca+2

Canal de K

+

_dependente

de voltagem

Canal de K

+

_{dependente de}

Ca

2+

_{de baixa condutância}

Canal de K

+

_{dependente de}

Ca

2+

_{de alta condutância}

Canal de K

+

_dependente

de ATP

TETRAETILAMÔNIA

_APAMINA

GLIBENCLAMIDA

CARIBDOTOXINA

(OCANA et al., 2004)

(13)

METODOLOGIA

TETRAETILAMÔNIA

VIA INTRATECAL

ESPINHAL

(L5 – L6)

15 ’

Ácido acético

0,6% (i.p.)

Nº. de

contorções

abdominais.

20 min

TESTE DAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS

INDUZIDAS PELO ÁCIDO ACÉTICO

VEÍCULO

(10mL/kg)

MIRICITRINA

(1 mg/kg, i.p.)

MORFINA

(2,5 mg/kg,

s.c.)

30’

APAMINA

CARIBDOTOXINA

GLIBENCLAMIDA

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

+ - - -

-Canal de K

+

_dependente

de voltagem

TETRAETILAMÔNIA

(T)

Ausência de T

Presença de T

Efeito do pré-tratamento com Tetraetilamônia no perfil

antinociceptivo de Miricitrina.

*** p < 0,001 comparado ao grupo controle

(14)

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

CaMCa+2

Canal de K

+

_{dependente de}

Ca

2+

_{de baixa condutância}

APAMINA

(A)

Ausência de A

Presença de A

Efeito do pré-tratamento com Apamina no perfil

antinociceptivo de Miricitrina.

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

ATP

Canal de K

+

_dependente

de ATP

GLIBENCLAMIDA

(G)

Ausência de G

Presença de G

Efeito do pré-tratamento com Glibenclamida no perfil

(15)

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

Ca+2

Canal de K

+

_{dependente de}

Ca

2+

_{de alta condutância}

CARIBDOTOXINA

(C)

Ausência de C

Presença de C

Sinergismo

Efeito do pré-tratamento com Caribdotoxina no perfil

antinociceptivo de Miricitrina.

CONCLUSÃO PARCIAL

MIRITRICINA

VIA DE SINALIZAÇÃO INIBITÓRIA

PROTEÍNA G

_i/o

CANAIS DE K

+

Dependentes de

voltagem

Dependentes de

Ca

2+

_{de baixa}

condutância

+

(16)

Camila C. M. P. Santos

O EFEITO ANTINOCICEPTIVO

DE MIRICITRINA ENVOLVE

VIAS DE SINALIZAÇÃO

EXCITATÓRIAS

Camila C. M. P. Santos

VIA DE SINALIZAÇÃO

EXCITATÓRIA

Principais mediadores responsáveis pela

transmissão da DOR no corno dorsal

Excitabilidade neuronal no corno dorsal

(JI; STRICHARTZ, 2004; CARUSO et al., 2005)

Glu

Gq/11 PLC

Glu

Cap

Gq/11 PLC

SP

(17)

Camila C. M. P. Santos

VIA DE SINALIZAÇÃO

EXCITATÓRIA

Excitabilidade neuronal no corno dorsal

MECANISMOS

PRODUÇÃO DE NO

ATIVAÇÃO DE PKC

(CHEN et al., 2000; JI; STRICHARTZ, 2004; CARUSO et al., 2005; MEOTTI et al., 2006)

TESTE DO COMPORTAMENTO DE MORDIDA

Substâncias algogênicas

Glu

Gq/11 PLC

Glu

Cap

Gq/11 PLC

SP

IL-β

TNF-α

NOCICEPÇÃO

Camila C. M. P. Santos

(SCHEIDT et al., 2002; SAKURADA 1990; 1996)

(18)

Camila C. M. P. Santos

Alteração Comportamental

MORDIDA

Movimento da cabeça direcionado para o lado ou para a pata posterior

NOCICEPÇÃO

Contato do focinho do animal com o órgão-alvo

METODOLOGIA

Camila C. M. P. Santos

METODOLOGIA

TESTE DO COMPORTAMENTO DE MORDIDA

VIA

INTRATECAL

3 ’

Tempo gasto com o

comportamento de mordida

VEÍCULO

(10mL/kg)

MIRICITRINA

(30 mg/kg, i.p.)

30’

GLUTAMATO

PBS

5 μL

SUBSTÂNCIA P

CAPSAICINA

6 ’

(19)

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

Salina i.p.

Miricitrina i.p.

41%

61%

84%

Efeito de Miricitrina no comportamento nociceptivo

induzido por Glutamato, Capsaicina e Substância P.

Camila C. M. P. Santos

VIA DE SINALIZAÇÃO

EXCITATÓRIA

PKC P-38

CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS

NOCICEPÇÃO

(20)

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

Salina i.p.

Miricitrina i.p.

100%

96%

Efeito de Miricitrina no comportamento nociceptivo

induzido por IL-β e TNF-α.

Camila C. M. P. Santos

PARTICIPAÇÃO DOS

CANAIS DE Ca

+2

↑ [Ca

2+

_]

i

Liberação de

neurotransmissores

Redução do

limiar da dor

Excitabilidade da

membrana

celular

Ativação de

proteínas

intracelulares

(21)

METODOLOGIA

CaCl

2

(200nmol/sítio)

PBS

(controle)

Ácido acético

0,6% (i.p.)

Nº. de

contorções

abdominais.

20 min

TESTE DAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS

INDUZIDAS PELO ÁCIDO ACÉTICO

VEÍCULO

(10mL/kg)

MIRICITRINA

(1 mg/kg, i.p.)

MORFINA

(2,5 mg/kg,

s.c.)

30’

5 μL

VIA

INTRACEREBRO

VENTRICULAR

SUPRAESPINHAL

10’

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

Ausência de CaCl

2

Presença de CaCl

2

Efeito do pré-tratamento com CaCl

2 no perfil

(22)

Camila C. M. P. Santos

PARTICIPAÇÃO DOS

CANAIS DE Ca

+2

INFLUXO DE

45 _Ca

+2

Medida da concentração de

45 _Ca

+2

_intracelular

Movimentação de

45 _Ca

+2

Fatias corticais

de Ratos

Camila C. M. P. Santos

RESULTADOS

Efeito de Miricitrina no influxo de cálcio em fatias do

córtex cerebral de ratos.

46%

48%

42%

Condição despolarizante

Condição não despolarizante

↑ RECAPTAÇÃO

DE CALCIO

(23)

CONCLUSÃO PARCIAL

MIRITRICINA

VIA DE SINALIZAÇÃO EXCITATÓRIA

CANAIS DE Ca

+2

-SUSBTÂNCIAS

ALGOGÊNICAS

-Camila C. M. P. Santos

Gq/11 Gq/11 Gi/o P PLC PLC NOS PKC P-38 PKC IP3 DAG PKA AMPc PKA PLA2 AA PGE2 COX MPO NFκB IκB CITOCINAS COX