TÍTULO: PADRÃO DE EXPRESSÃO DE C-FOS NO ENCÉFALO DE RATOS NEFROPATAS APÓS ADMINISTRAÇÃO DO SUCO DE CARAMBOLA.
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): MAYARA DE CASSIA LINS
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): EDUARDO ACHAR, GERSON BALLESTER, RENATO FIGUEIREDO DE SANTANA, SANDRA REGINA MOTA ORTIZ
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): CLAUDIO ANTONIO BARBOSA DE TOLEDO, MARCIA MARIA TSUTURA, RAFAEL PINHEIRO DAMAS GARCIA
1. Resumo do Trabalho: A Carambola (Averrhoa carambola) é amplamente cultivada
em países tropicais como o Brasil. Em 1993 houve o primeiro relato de caso associando esta fruta a processos de intoxicação em pacientes com distúrbios renais. Essa intoxicação possui três níveis: leve, moderada ou grave, que varia de acordo com as manifestações clínicas que o paciente apresenta como soluços, confusão mental, hipotensão, agitação psicomotora, convulsões, coma e podendo até em casos mais severos levar o individuo a óbito. A caramboxina e o ácido oxálico são duas possíveis teorias a respeito da fisiopatologia. O nível de atividade neural pode levar ao aumento na expressão da proteína nuclear c-Fos, relacionada aos chamados genes de ativação imediata. Assim, procuramos identificar, utilizando a técnica de imunoistoquímica, a presença de células c-Fos+ em cortes de tecidos oriundos do encéfalo de ratos nefropatas submetidos à gavagem com suco de carambola. Dentre as áreas imunorreativas, três núcleos tiveram grande aumento de expressão c-Fos+: Supraóptico (SO), Paraventricular (PVH) e Locus Coeruleus (LC). Essas estruturas podem estar envolvidas diretamente ou indiretamente no processo de intoxicação por carambola. Os dados alcançados podem contribuir, em parte, para a elucidação do processo envolvendo os mecanismos fisiopatológicos e as manifestações clínicas da intoxicação.
2. Introdução: Na década de 80 surgiu a primeira publicação sobre uma possível
toxicidade da carambola (Averrhoa carambola) no Sistema Nervoso Central (MUIR e LAM, 1980). MARTIN et al. (1993) apresentou o primeiro relato de pacientes urêmicos que após a ingestão de suco de carambola desenvolveram um sinal clínico comum: soluço intratável. A partir de então alguns relatos de casos foram sendo descritos (MARTIN et al,. 1993; NETO et al,. 1998; CHANG et al,. 2000; NETO et al,. 2003; TSE et al,. 2003; TSAI, et al,. 2005; FANG et al,. 2007). A intoxicação por carambola pode ser leve, moderada ou grave, de acordo com as manifestações clínicas apresentadas pelo paciente, progredindo com vômitos, confusão mental, agitação psicomotora, convulsões, hipotensão, coma e morte, podendo chegar a 75% de mortalidade em quadros com estado epiléptico. (NETO et al,. 1998; NETO et al,. 2003; TSE et al,. 2003; TSAI et al,. 2005; FANG et al,. 2007). Os primeiros estudos publicados a respeito da fisiopatologia incluíram duas possíveis teorias. A primeira sugere a existência de uma toxina específica
da carambola (caramboxina) que seria capaz de agir em receptores GABA inibindo-os, de forma a aumentar a excitabilidade neuronal (CAROLINO, et al,. 2005). A segunda diz respeito ao papel do ácido oxálico (oxalato), presente em grande concentrações na fruta carambola, em induzir neurotoxicidade (FANG et al., 2007).
Muitos estudos experimentais utilizam genes de ativação imediata como marcadores de elevação de atividade neural. Um desses genes codifica a proteína nuclear c-Fos (KACZMAREK, et al., 1990; HUGHES, et al., 1995). O desequilíbrio que a neurotoxina gera entre os neurotransmissores pode resultar no aumento da excitabilidade cerebral e potencialmente ocasionar o aumento na expressão da proteína Fos, permitindo a identificação de possíveis sítios neurais alvo da ação da neurotoxina presente na fruta carambola em pacientes nefropatas.
3. Objetivo: Identificar possíveis áreas com mudanças no nível de atividade celular
decorrente da ação neurotóxica após a ingestão de carambola em ratos nefropatas, utilizando como ferramenta metodológica a expressão da proteína c-Fos.
4. Metodologia: Foram utilizados 27 ratos albinos (Rattus norvegicus, linhagem
Wistar), machos, adultos, divididos em grupos controle e experimental. O projeto foi aprovado pelo protocolo de pesquisa nº 13259324/08 - CEUA/UNICID. Os animais foram mantidos no biotério respeitando-se as normas e preceitos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBREA) a fim de evitar e minimizar ao máximo o sofrimento do animal.
Os animais utilizados foram divididos nos seguintes grupos: Controles: 1) Controle Branco (BCO) 3 animais; 2) Gavagem água (GVA) 5 animais; 3) Gavagem carambola (GVC) 5 animais; 4) Nefropata gavagem com água (NFA) 7 animais; Experimental: 5) Nefropata gavagem com carambola (NFC) 7 animais. Cirurgia de obstrução bilateral
ureteral (BUO): A cavidade abdominal foi exposta e a nefropatia induzida através da
obstrução em duas extremidades do ureter de ambos os lados, finalizando com uma secção no ureter entre os dois pontos obstruídos anteriormente. Gavagem: As gavagens foram realizadas com o auxílio de uma cânula orogástrica metálica. Cada animal, administrado 1 mL de líquido (água ou carambola) a cada 3 horas entre 7:00h e 16:00h
por dois dias, mantendo oferta irrestrita de água. O suco da carambola foi processado, filtrado sem adição de água. Perfusão: Em torno de 1,5 hora após a última gavagem ou 1,5 hora após o início da crise convulsiva, os animais foram anestesiados e perfundidos via intracardíaca e 3 mL de sangue foram retirados durante o procedimento para a dosagem de ureia e creatinina. Os encéfalos foram seccionados em criostato.
Experimentos Imunohistoquímicos: os cortes foram processados utilizando-se
anticorpo contra proteína c-Fos e revelados pelo método da peroxidase. Parte dos cortes foram corados pela técnica de GIEMSA. Os tecidos foram observados em microscopia de campo claro. Dosagem de Ureia e Creatinina: As dosagens foram realizadas por espectofotometria - método enzimático, para comprovação da nefropatia (Kit-LABTEST).
5. Desenvolvimento: Todos os animais receberam manipulação diária por duas
semanas com o objetivo de habituação, Em todos os grupos a ingestão hídrica foi irrestrita Os animais do grupo BCO não receberam qualquer tipo de procedimento experimental, apenas habituação por duas semanas. Os animais do grupo GVA receberam dois dias de gavagem com água. Os animais do grupo GVC receberam por dois dias administrações de gavagens com suco de carambola. No grupo NFA, os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico de obstrução bilateral dos ureteres, e além da ingestão hídrica à vontade, receberam administrações de gavagens de água, nos dois dias subsequentes a cirurgia. Os animais do grupo experimental (NFC) foram submetidos ao procedimento cirúrgico de obstrução bilateral dos ureteres, e além da ingestão hídrica à vontade, receberam administrações de gavagens com suco de carambola, nos dois dias subsequentes a cirurgia.
6. Resultados: Os resultados obtidos na dosagem de ureia e creatinina comprovam que
o procedimento cirúrgico foi efetivo em gerar um modelo experimental urêmico. A dosagem média de ureia passou de 43,44 ± 4,07 mg/dL p/ 154,32 ± 22,81 mg/dL. Já a dosagem média de creatinina passou de 1,62 ± 0,19 mg/dL p/ 12,75 ± 2,44 mg/dL. Estes dados confirmam que o procedimento cirúrgico de obstrução dos ureteres foi efetivo em gerar um modelo experimental urêmico (nefropatia) (BRANCO et al. 2011)(Gráfico 5 e 6).
A respeito da intoxicação por carambola, os animais do grupo NFC apresentaram achados clínicos como soluços, agitação motora, sialorréia e convulsões, que estão relacionadas a um grau severo de intoxicação por carambola (NETO, 2003).
A identificação das áreas e núcleos presentes no encéfalo teve como guia histológico cortes contra-corados (Giensa - Fig 1A, 2A, 3A). A análise histológica revelou células imunorreativas à proteína c-Fos (c-Fos+) em diversas regiões do encéfalo, sendo que foram consideradas positivas, marcações de formato arredondado e intensamente marcados, como relatado na literatura. Após análise de todo o encéfalo, três áreas revelaram expressiva diferença entre os grupos controle e grupo nefropata carambola: Núcleo Supraóptico (Fig. 1), Núcleo Paraventricular (Fig. 2) e Locus Coeruleus (Fig. 3). Os cortes que apresentam estes núcleos foram analisados e a contagem do número de células c-Fos+ em cada hemicorte (lado direito ou esquerdo) foi realizada, sendo que os dados foram apresentados na forma de média ± desvio padrão.
O núcleo Supraóptico esta situado no hipotálamo, na região do diencéfalo. Todos os animais que sofreram algum tipo de intervenção (gavagem ou nefropatia) apresentaram marcação c-Fos+ no núcleo Supraóptico (Fig. 1A–F). O grupo controle não apresentou marcação (Fig. 1B). A contagem celular deste núcleo apresentou as seguintes médias de células c-Fos positivas entre os grupos: BCO = 0; GVA = 17,5 ± 6,3; GVC = 17,5 ± 5,70;
NFA = 43,1 ± 27; NFC = 65 ± 23,9 (média ± desvio padrão). (Gráfico 1 e 4).
O núcleo PVH também esta situado no hipotálamo (Fig. 2). Todos os grupos que receberam gavagens apresentaram marcação c-Fos+, porém os grupos nefropatas apresentaram maior expressão desta proteína, destacando o grupo NFC, enquanto no grupo branco, não houve expressão (Fig. 2B-F). A contagem celular confirmou a análise visual. Os dados obtidos foram: BCO = 0; GVA = 13,6 ± 4,5; GVC = 15 ± 1; NFA = 66,8 ± 31,2; NFC = 106,1 ± 29,5 (Gráfico 2 e 4).
Gráfico 6. Valores séricos de Ureia (mg/dL), nos grupos controles e experimental.
Gráfico 5. Valores séricos de Creatinina (mg/dL), nos grupos controles e experimental.
O núcleo LC esta localizado no tronco encefálico (ponte) e pode ser observado na figura 3A. Entre os núcleos observados, o LC foi à única região que apresentou marcação nula em todos os grupos, exceto no grupo experimental (NFC), cuja marcação foi intensa (Fig 3B-F). A contagem celular revelou dados expressos em médias de células C-fos positivas ± desvio padrão: BCO = 0; GVA = 0; GVC = 0; NFA = 0; NFC = 55,6 ± 14,6. (Gráfico 3 e 4). Assim, no grupo branco, a expressão foi virtualmente nula nos núcleos estudados.
A realização das gavagem, apenas, estimulou expressão de C-fos+ no SO e no PVH, mas não no LC. Porém, parece não haver diferença entre gavagens com água ou carambola nos animais não nefropatas. No entanto, o grupo NFA apresentou maior expressividade de c-Fos+ no SO e PVH em relação aos grupos que receberam apenas gavagens. Em todos os núcleos nos quais foi realizada a contagem celular, a expressão de c-Fos apresentou pico no grupo NFC.
Gráfico 1. Média de células c-Fos+ no Núcleo SO, dos grupos controles e experimental.
Gráfico 2. Média de células c-Fos+ no Núcleo PVH, dos grupos controles e experimental.
Gráfico 3. Média de células c-Fos+ no Núcleo LC, dos grupos controles e experimental.
Gráfico 4. Média de células C-fos positivas (C-fos+) presente nos núcleos: SO, PVH e LC dos grupos controles e experimental.
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Figura 2: Fotomicrografias em campo claro, utilizando hemicorte frontal, nível 23. As setas indicam o Núcleo Paraventricular (PVH). Na Fig.2A o corte foi contra-corado segundo a técnica de GIEMSA. Nas Figuras B a F os cortes foram imunorreagidos contra C-Fos e sofreram aumento total de 150x.Barra de escala de 100 μm. Fig.2A: visão aproximada do PVH no corte corado por GIEMSA. Fig. 2B: Grupo BCO. Fig.2C: Grupo GVA. Fig.2D: Grupo GVC. Fig.2E: Grupo NFA. Fig.2F: Grupo NFC.
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Figura 1: Fotomicrografias em campo claro, utilizando hemicorte frontal, nível 24. As setas indicam o Núcleo Supraóptico (SO). Na Fig.1A o corte foi contra-corado segundo a técnica de GIEMSA. Nas Figuras B a F os cortes foram imunorreagidos contra C-Fos e sofreram aumento total de 150x.Barra de escala de 100 μm. Fig.1A: visão aproximada do PVH no corte corado por GIEMSA. Fig. 1B: Grupo BCO. Fig.1C: Grupo GVA. Fig.1D: Grupo GVC. Fig.1E: Grupo NFA. Fig.1F: Grupo NFC.
Ao observar a contagem das marcações c-Fos+ nos grupos NFA e NFC, notamos uma discrepância no número de células sensibilizadas do núcleo PVH, quando comparados com o grupo controle (Gráfico 2 e 4). Esse aumento de células c-Fos+ nas regiões hipotalâmicas podem ser oriundas da perda da filtragem do sangue, que ocasionaram um aumento da osmolaridade sanguínea, consequentemente influenciando o aumento da liberação de ADH.
No LC apenas o grupo NFC apresentou expressão de c-Fos. Trata-se de uma região constituída com o maior conjunto de células noradrenérgicas do sistema nervoso central dos mamíferos, que possui conexões difusas que inervam todos os níveis do SNC (FOOTE et al., 1983). O LC é uma região envolvida no controle de algumas funções homeostáticas (SVENSSON et al., 1979; ASTON-JONES et al., 1981; BHASKARAN et al., 1988; MURASE et al., 1993). A atividade do LC pode limitar a propagação e duração de uma convulsão. Danos ao LC convertem convulsões esporádicas em duradouras (GIORGI et al., 2003, 2006, 2008). Em 2008, GIORGI et al. relataram o aumento na expressão de genes no LC durante crises convulsivas. Mostrando uma possível atuação do núcleo como um mecanismo de modulação na epilepsia. Outro achado relatado em diversos estudos foi à relação do LC com a liberação de NE (norepinefrina), ocasionando na redução modulatória
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Figura 3: Fotomicrografias em campo claro, utilizando hemicorte frontal, nível 52. As setas indicam o Núcleo Locus Coeruleus(LC). Na Fig.3A o corte foi contra-corado segundo a técnica de GIEMSA. Nas Figuras B a F os cortes foram imunorreagidos contra C-Fos e sofreram aumento total de 150x.Barra de escala de 100 μm. Fig.3A: visão aproximada do LC no corte corado por GIEMSA. Fig. 3B: Grupo BCO. Fig.3C: Grupo GVA. Fig.3D: Grupo GVC. Fig.3E: Grupo NFA. Fig.3F: Grupo NFC.
da atividade epilética, o que em estudos antigos era um fenômeno exclusivamente cortical. (DALTON et al.,1985; MCINTYRE et al., 1988; CLOUGH et al., 1998; GIORGI et al., 2003, 2006, 2008.; CHACHUA et al., 2010). O efeito desta molécula parácrina influencia toda a atividade cortical devido a sua difusão generalizada (MASON et al., 1979; PAXINOS et al., 2004). Estas características tornam o LC um núcleo poderoso para controlar direta ou indiretamente a atividade cortical (ASTON-JONES et al., 1991;. FORNAI, 2007).
Considerando: a ação modulatória cortical do LC, e o fato de que, em nossos achados, o LC apresentar marcação c-Fos+ apenas no grupo NFC e, sabendo que este grupo foi o único grupo que apresentou crise convulsiva, este núcleo parece ser um potencial candidato a integrar o circuito envolvido na fisiopatologia da intoxicação por Averrhoa carambola. Desta forma é provável que a toxina presente na carambola possa alcançar níveis séricos suficientemente altos a ponto de agir no SNC e causar uma neurotoxicidade elevada, condizente com os primeiros estudos. Esta intoxicação pode ser oriunda das duas possíveis teorias descritas anteriormente, a primeira onde a caramboxina agiria de forma especifica em receptores GABA inibindo-os, e consequentemente aumentando a excitabilidade neuronal (CAROLINO et al. 2005). E a segunda que se refere a grande quantidade de ácido oxálico (oxalato) presente na fruta, capaz de induzir neurotoxicidade (FANG et al.2007). Nossos dados abrem do ponto de vista neuroquímico, um novo ramo de investigação: a modulação noradrenérgica do LC no córtex. Porém, seria muito insipiente a idéia de que o LC possa ser um núcleo alvo neste mecanismo tóxico, pois ainda devemos considerar que este núcleo possa sofrer modulação glutamatérgica ou gabaérgica como proposto nos mecanismos fisiopatológicos relatados na literatura. Ainda assim, outras regiões que apresentaram diferenças visuais na expressão de c-fos ao longo do encéfalo precisam ser analisadas e os dados interpretados, assim como novos experimentos relacionando as áreas encefálicas com aumento de atividade celular (c-Fos+) e suas características neuroquímicas poderiam elucidar, ao menos em parte, a compreensão dos mecanismos envolvidos no quadro clínico apresentado por pacientes nefropatas que ingeriram a fruta ou suco de carambola.
6. Considerações finais: A ingestão do suco de carambola por de ratos nefropatas
aumentou a expressão de c-Fos em diferentes regiões do encéfalo, sendo até o momento, os núcleos Supraóptico (SO) e Paraventricular (PVH) do hipotálamo e o núcleo
Locus Coeruleus (LC) foram analisados quantitativamente. O aumento na expressão no SO e no PVH pode estar relacionado com secreção de ADH, devido à condição de aumento de osmolaridade nos ratos nefropatas. No entanto, a elevada expressão de c-Fos no LC pode estar relacionada a modulação da atividade cortical. Estes dados podem colaborar para a compreensão dos mecanismos neurofisiopatológico envolvendo a ingestão de carambola em indivíduos nefropatas.
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