Jonathan Paulo Agnes
Avaliação pré-clínica do tratamento com antioxidantes na neuropatia periférica e eficácia antitumoral de
quimioterápicos
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do grau de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Alfeu Zanotto Filho.
Florianópolis-SC 2019
Por
Jonathan Paulo Agnes
Florianópolis 2019
Este trabalho é motivado pelo anseio de usar a ciência como uma ferramenta de desenvolvimento e bem-estar social.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, e de forma especial, agradeço aos meus pais, Darci (em memória) e Soely, os melhores exemplos do que é ser humano que eu poderia ter; agradeço por todos os valores pessoais ensinados, por sempre me incentivar e conduzir a realização dos meus sonhos; por todo amor dedicado a mim, muito obrigado.
A minha irmã Daniani, que foi tão importante nas minhas conquistas; sou grato por todo carinho e cuidado dado a mim desde bebê, por todo apoio aos meus anseios de vida, pela força dada nos mais difíceis momentos que passamos, assim como por todos momentos de alegria plena que passamos juntos.
Ao professor Alfeu, muito obrigado por aceitar minha orientação, por todo conhecimento passado, pela paciência ao ensinar, pela disponibilidade sempre que preciso; por saber conduzir o dia a dia do laboratório compreendendo a individualidade de cada membro da equipe, tornando assim o ambiente de trabalho harmonioso e produtivo;
As colegas de laboratório Rosângela, Marina, Vitória e Marcelo por toda ajuda durante os experimentos, por todas as palavras de força nas tensões de apresentações, pela descontração dentro e fora do laboratório, que tornaram mais leves até os dias mais difíceis.
Ao André por todos os bons momentos vividos desde a chegada aqui em Florianópolis, por toda ajuda dada no dia a dia que facilitaram muito meu desempenho durante esse período, pelo apoio e paciência nos momentos de dificuldade não me deixando desanimar; obrigado pelo carinho e por me sempre me estimular a evoluir.
Ao laboratório do professor Juliano Ferreira por gentilmente ceder alguns materiais para realização da minha pesquisa; aos seus alunos Débora, Marcela e especialmente ao Sérgio pela paciência e dedicação ao ensinar os experimentos de comportamento e pelas dicas dadas para condução dos experimentos.
Minha gratidão a todos os professores do Departamento de Farmacologia da UFSC pelo conhecimento passado nas aulas, laboratório ou conversas de corredor, que muito contribuíram para minha formação nessa etapa.
A todos os colegas da farmacologia, em especial aos colegas do cursão 2017, por toda parceria durante as atividades de aula e pelos momentos de festa e descontração.
Grato a professora Alexandra Acco por ter me acolhido em seu laboratório durante a iniciação cientifica, por todo conhecimento passado, por todo incentivo e apoio em minhas escolhas profissionais.
A todos os funcionários do Departamento de Farmacologia, do biotério, da secretaria de pós-graduação, que foram de grande importância em muitas situações.
Grato aos governantes que acreditaram que ciência e educação são o caminho para o desenvolvimento humano e social, levando universidades públicas para os interiores do país, fazendo dessa forma com que muitos jovens interioranos tivessem acesso ao ensino superior, como foi o meu caso no início da jornada acadêmica.
A CAPES pela bolsa de mestrado que possibilitou a permanência na pós-graduação, e ao CNPq pelo fomento à pesquisa.
RESUMO
A neuropatia periférica induzida por quimioterapia (NPIQ) é um dos efeitos adversos mais comuns causados por quimioterápicos como oxaliplatina (OXA) e paclitaxel (PTX), os quais afetam uma porcentagem significativa de pacientes em quimioterapia. Com poucas terapias eficazes, NPIQ não está relacionada apenas à dor e qualidade de vida em curto prazo, mas também afeta negativamente o andamento dos protocolos quimioterápicos e os desfechos do câncer. Enquanto alguns estudos relatam que antioxidantes podem exercer efeitos neuroprotetores, o equilíbrio redox também é importante na biologia tumoral, podendo proteger células tumorais da toxicidade dos quimioterápicos, tornando controverso o uso de antioxidantes na terapia antineoplásica. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto de três antioxidantes - N-acetilcisteína (NAC), ácido lipóico (LA) e Vitamina E (vit. E) - sobre comportamentos nociceptivos e parâmetros de crescimento tumoral em modelos de NPIQ induzida por OXA e paclitaxel em camundongos. O tratamento com antioxidantes reduziu a nocicepção mecânica e térmica ao frio induzida por OXA e PTX quando iniciado concomitante com os quimioterápicos, ao passo que a administração em dose única de antioxidantes - após indução prévia da NPIQ e estabelecimento das alterações nociceptivas - não atenuou os limiares nociceptivos. Diferente do modelo de dose única, a administração repetida de antioxidantes foi capaz de reverter os comportamentos nociceptivos em testes de Von frey e Placa fria induzidos por OXA. Os antioxidantes não alteraram a nocicepção basal, nem as respostas comportamentais mediadas pela ativação de fibras nociceptoras TRPA1 e TRPV1 positivas por AITC e capsaicina, respectivamente. Os possíveis mecanismos observados para os efeitos antinociceptivos dos antioxidantes incluem a atenuação do estresse oxidativo em medula espinhal reduzindo a produção de oxidantes totais e radicais superóxido, assim como a redução da lipoperoxidação (TBARS) induzida por OXA. Além disso, os antioxidantes reduziram o conteúdo de IL-1β e TNF-α em medula espinhal de animais tratados com OXA. O papel das citocinas inflamatórias foi avaliado em camundongos C57BL/6 com deleção gênica para TLR4 e caspase1/11, os quais apresentaram uma menor resposta inflamatória em nível de medula espinhal quando comparado a animais selvagens tratados com OXA, assim como apresentaram resistência à hipernocicepção induzida por OXA. Com relação ao crescimento tumoral, os antioxidantes não alteraram os efeitos da OXA e PTX sobre a cinética de crescimento tumoral, assim como não preveniram a leucopenia e plaquetopenia induzidas por OXA. Em suma,
nossos dados apontam para uma potencial utilidade farmacológia da NAC, AL e vit. E no tratamento da NPIQ em mecanismo possivelmente envolvendo neuroproteção e inibição da inflamação induzida por quimioterápicos. Aprovação CEUA-UFSC n ° 3722260417.
ABSTRACT
Peripheral neuropathy induced by chemotherapy (PNIQ) is one of the most common adverse effects associated with chemotherapeutics such as oxaliplatin (OXA) and paclitaxel (PTX), which affect a significant percentage of patients on chemotherapy. With few effective therapies, PNIQ is not only related to short-term pain discomfort and poor quality of life, but it also negatively affects the progress of chemotherapeutic protocols and cancer outcomes. While some studies have reported that antioxidants may exert neuroprotective effects, redox balance is also a key component of tumor biology and, in this context, antioxidants could protect tumor cells from the toxicity of chemotherapeutic drugs, making the use of antioxidants in anticancer therapy controversial. The aim of this study was to evaluate the impact of three antioxidants - namely N-acetylcysteine (NAC), lipoic acid (LA) and Vitamin E (alpha-tocopherol) - up nociceptive behaviors and tumor growth parameters in PNIQ model induced by OXA and paclitaxel in mice. Antioxidant treatment decreased mechanical and thermal cold nociception induced by OXA and Paclitaxel when initiated concurrently with the chemotherapeutics, whereas single dose administration of antioxidants - after previous induction of PNIQ – had no effect upon nociceptive thresholds. In contrast to single dose, repeated administration of antioxidants was able to reverse OXA-induced nociception as evaluated by Von frey and Cold plate tests. Antioxidants altered neither basal nociception nor spontaneous nociception induced TRPA1 and TRPV1-positive nociceptive fibers stimulated by AITC and capsaicin. We also showed that some of the mechanisms underlying antinociceptive effects of antioxidants include attenuation of oxidative stress in the spinal cord, which was associated with decreased production of total reactive species and superoxide production, as well as reduction of OXA-induced lipoperoxidation (TBARS). In addition, antioxidants decreased IL-1β and TNF-α upregulation in the spinal cord of OXA-treated mice. The role of inflammatory cytokines in OXA-induced PNIQ was further investigated in TLR4 and caspase1/11 knockout C57BL/6 mice strains, which displayed lessened inflammatory responses in the spinal cord when compared to wild-type mice treated with OXA, as well as showed resistance to OXA-induced mechanical hyperalgesia. Regarding tumor growth parameters, antioxidant treatment did not alter the effects of OXA and PTX on tumor growth kinetics, nor did they prevent OXA-induced leukopenia and thrombocytopenia. In summary, the herein presented data point out to a potential pharmacological usefulness of NAC, LA and Vitamin E in the treatment of NPIQ in a
mechanism possibly involving neuroprotection and inhibition of inflammatory responses induced by cytotoxic chemotherapeutics. Approval CEUA-UFSC n ° 3722260417.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação do padrão típico de “meia e luvas” dos sintomas da NPIQ. ...21 Figura 2. Esquema das vias produtoras de espécies reativas de oxigênio (ERO) e dos principais sistemas enzimáticos celulares antioxidantes que controlam a produção de ERO...28 Figura 3. Participação da NAC nas vias de síntese e utilização de GSH...30 Figura 4. Mecanismos de ação propostos para o ácido lipóico...32 Figura 5. Mecanismo de ação da Vitamina E...33 Figura 6. Avaliação nociceptiva para caracterização da NPIQ em camundongos Swiss tratados com OXA...45 Figura 7. Análise de danos oxidativos e produção de ERO em animais tratados com OXA em presença de antioxidantes...47 Figura 8. Comparação dos limiares nociceptivos no tratamento com diferentes antioxidantes em modelo de NPIQ por OXA em camundongos Swiss...49 Figura 9. Efeitos dos antioxidantes sobre a nocicepção basal e induzida por ativadores de nociceptores periféricos...51 Figura 10. Dosagens de citocinas inflamatórias e comparação do efeito deleção gênica para TLR4 e Caspases-1/11 na nocicepção mecânica em camundongos C57BL/6 tratados com OXA...53 Figura 11. Comparação do efeito antitumoral dos tratamentos com OXA isolada e combinada com NAC, AL e vitamina E...55 Figura 12. Comparação dos efeitos do tratamento com diferentes antioxidantes em modelo de NPIQ por PTX em camundongos Swiss, sobre o desenvolvimento do tumor ortotópico de Ehrlich e na lipoperoxidação em fígado e medula espinhal...57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Escalas de pontuação dos sintomas da NPIQ...17 Tabela 2: Marcadores hematológicos e plásmaticos de toxicidade...56
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AITC: Alil-isoctiocianato
AL: Ácido lipóico
ALT: Alanina-aminotransferase ANOVA: Análise de variância BSA: Soro fetal bovino CAT: catalase
DCF: 2',7'- diclorofluoresceina DHE: Dihidroetidio
DHLA: Ácido dihidrolipóico DNPH: 2,4 – dinitrofenilhidrazina
DRG: Gânglio da raiz dorsal (do inglês dorsal root ganglion) DTNB: ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
ERO: Espécie Reativa de Oxigênio GPx: Glutationa peroxidase GRx: Glutationa redutase GSH: Glutationa reduzida GSSG: Glutationa oxidada GST: Glutationa-S-transferase H2O2: Peróxido de hidrogênio IL: Interleucina MDA: Malonaldeído
NAC: N-acetilcisteína
NF-κβ: fator nuclear kappa β (do inglês nuclear factor kappa β) NMBA: N -nitrosoometilbenzilamina
NPIQ: Neuropatia periférica induzida por quimioterapia O2-: Ânion superóxido
OHº- Radical hidroxila
OXA: oxaliplatina
PBS: Tampão fosfato salino
PMSF: Fluoreto de Fenilmetilsulfonil (do inglês phenylmethylsulfonyl fluoride)
PTX: Paclitaxel
SOD: Superóxido dismutase
TCA: Ácido tricloroacético (do inglês “trichloroacetic acid”) TLR-4: Receptor tipo toll like-4 (do inglês toll-like receptor 4)
TNF-α: Fator alfa de rosetumoral (do inglês Tumor Necrosis Factor alpha)
TRPA1: Receptor de potencial transitório anquirina subtipo 1 TRPV1: Receptor de potencial transitório vanilóide subtipo 1 Vit. E: Vitamina E
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1.1 Câncer...15 1.1.1 Iniciação, promoção progressão...15 1.1.2 Aspectos epidemiológicos e clínicos...15
1.1.3 Efeitos adversos da quimioterapia...16
1.2 Neuropatia Periférica Induzida por Quimioterapia (NPIQ)...17
1.2.1 Aspectos clínicos e epidemiológicos da NPIQ...17
1.2.2 Fisiopatologia da NPIQ por Oxaliplatina e Paclitaxel...19
1.2.3 Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) (no dano neuronal e no microambiente tumoral...23
1.3 Espécies Reativas e Antioxidantes ...26
1.3.1 Nacetilcisteína...29
1.3.2 Ácido lipóico...31
1.3.3 Vitamina E (alfa tocoferol)...33
1.4 Hipótese...34 2. OBJETIVOS...35 2.1 Objetivo geral...35 2.2 Objetivos específicos ...35 3. MATERIAL E MÉTODOS...35 3.1 Animais...35
3.2 Fármacos e outros reagentes...36
3.3 Procedimentos experimentais...37
3.3.1 Caracterização do modelo de NPIQ (Indução e tratamentos)...37
3.3.2 Testes nociceptivoS...,...37
3.3.2.1 Nocicepção mecânica (Teste de Von Frey)...38
3.3.2.2 Nocicepção térmica ao frio (Teste da placa fria)...38
3.3.2.3 Nocicepção térmica ao calor (teste Hargreaves)...38
3.3.2.4 Nocicepção espontânea aguda...39
3.3.3 Tumores mamários ortotópicos de
Ehrlich...39
3.3.4 Homogeneização dos tecidos...40
3.3.5 Dosagem de proteína – Método de Lowry...41 3.3.6 Produtos de lipoperoxidação (TBARS)...42 3.3.7 Carbonilação proteica...42 3.3.8 Hematologia e Toxicologia...42 3.3.9 ELISA...43
3.3.10 Análise ex vivo da produção de ERO (ensaios DCF e DHE)...43
3.3.11 Análises estatísticas...43
4. RESULTADOS... 44
4.1 Curva de tempo e parêmtros nociceptivos da neuropatia induzida por oxaliplatina (OXA) estão associados a doses imunossupressoras e dano oxidativo na medula espinhal...44
4.2 NAC, AL e vitamina E reduzem o dano oxidativo sistêmico e a produção de ERO em medula espinhal induzidos por oxaliplatina...44
4.3 O tratamento com NAC, AL e vitamina E melhora os parâmetros nociceptivos mecânicos e térmicos na NPIQ induzida por OXA...47
4.4 NAC, LA e vitamina E não alteram os limiares nociceptivos basais nem a transmissão da nocicepção induzida por ativação dos receptores TRPA1 e TRPV1...50
4.5 Camundongos C57BL/6 com deleção gênica para os receptores TLR4 e Caspase-1/11 apresentam menor expressão de marcadores inflamatórios na medula espinhal e resistência à neuropatia induzida por OXA...52
4.6 Os antioxidantes NAC, AL e vitamina E não alteram o peso e volume tumoral no tratamento com OXA assim como não alteram a toxicidade hematológica ...54
4.7 Efeitos do tratamento antioxidante no contexto da neuropatia periférica induzida por paclitaxel...56
5 DISCUSSÃO .....58
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS...67
7 PERSPECTIVAS.....68
1. INTRODUÇÃO 1.1 Câncer
1.1.1 Iniciação, promoção e progressão
Denomina-se câncer o grupo de doenças caracterizadas por modificações em genes supressores de tumor, oncogenes, ou ambos, que culminam em proliferação celular acelerada, as quais podem, com a progressão da doença, migrar do sítio primário para outros tecidos no processo de metástase (ACS 2018; NCI 2108; SLATTERY et al., 2017). O processo de iniciação do câncer envolve mutações, deleções, ampliação e inversão de genes como o TP53, BRCA1, PTEN, EGFR entre outros, que ocorrem espontaneamente ou induzidas por agentes carcinogênicos, resultando na desregulação das vias bioquímicas de sinalização associadas à proliferação, sobrevivência e diferenciação celular (SI IDDIQUi et al., 2015; TYSNES e BJERKVIG, 2007). Uma única célula cancerosa geralmente apresenta mais de uma alteração genética, o que confere maior adaptação ao meio e aumenta a proliferação e chance de sobrevivência (BOZIC et al., 2010). No estágio de promoção, células pré-neoplásicas ativamente proliferantes se acumulam, seguindo para o estágio de progressão que é a fase entre uma lesão pré-maligna e o desenvolvimento de câncer invasivo (LOEB et al., 2003). Ao acumular mutações as células cancerosas vão se diferenciando e adquirindo características de malignização chegando ao estágio final da transformação neoplásica (SI IDDIQUI et al., 2015; LOEB et al., 2003). As células migratórias são altamente resistentes, são clones do tumor primário que apresentam capacidade de sobreviver, multiplicar e adquirir novas mutações em outro tecido (FIDLER., 2003).
1.1.2 Aspectos epidemiológicos e clínicos
Segundo os dados analisados por Fitzmaurice e colaboradores (2018), em 2016 foram registrados mundialmente 17,2 milhões casos de câncer com mortalidade de 8,9 milhões de indivíduos, sendo os canceres de mama e colorretal os mais incidentes. Para 2018, foram estimados o surgimento de 18,1 milhões de novos casos de câncer, e mortalidade de 9,6 milhões (BRAY et al., 2018); no Brasil para o biênio 2018-2019 estima-se o surgimento de cerca de 600 mil novos casos de câncer (SANTOS, 2017).
O desenvolvimento do câncer acarreta em uma série de sintomas que reduzem a qualidade de vida do indivíduo acometido, variando de acordo com a quantidade e severidade dos sintomas vivenciados, sendo que alguns desses sintomas podem perdurar mesmo após a remissão do tumor, como os psicossociais e dor (HEYDARNEJAD et al., 2011). A dor pode ser resultado dos efeitos colaterais que algumas terapias antitumorais causam, em especial a quimioterapia, que além da sua ação sobre células tumorais, age em células saudáveis de diversos sistemas orgânicos. Isso não só afeta a qualidade de vida, mas também o protocolo de tratamento, pois, dependendo da severidade dos efeitos colaterais, se faz necessária a redução da dose, o que reduz a taxa de sobrevivência do paciente (PEARCE et al., 2017) e até a descontinuação do tratamento (LEMA et al., 2010).
1.1.3 Efeitos adversos da quimioterapia
As terapias instituídas para o câncer contemplam cirurgias de ressecção tumoral, terapias alvo, imunoterapia, uso de vírus oncolíticos, radioterapia e quimioterapia; sendo que dentre essas modalidades terapêuticas, a quimioterapia é a mais antiga e amplamente difundida (PALUMBO et al., 2013). As classes de quimioterápicos incluem: agentes alquilantes/intercalantes (ciclofosfamida, temozolomida, cisplatina, oxaliplatina), anti-metabólitos (metotrexato, citarabina, fluoruracila, capecitabina), antibióticos antitumorais (doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina), inibidores de topoisomerase (etoposídeo, irinotecano) e estabilizadores de microtúbulos (paclitaxel, docetaxel) (PALUMBO et al., 2013). Durante a evolução da terapia anticâncer, o foco dos estudos foi otimizar o efeito citotóxico dos quimioterápicos sobre o tumor (SCHIRMMACHER, 2019). Porém, a falta de especificidade dos quimioterápicos para células tumorais culmina nos diversos efeitos colaterais conhecidos, dado que os mecanismos de ação farmacológica destes agentes afetam também tecidos saudáveis com alta atividade mitótica, gerando os efeitos comumente relatados como alopecia, afecções gastrointestinais, náusea, mielossupressão, anemia e disfunções reprodutivas (NCI, 2016; PALUMBO et al., 2012; SCHIRMMACHER, 2019).
Não apenas os tecidos proliferativos são afetados pela citotoxicidade de quimioterápicos. Por exemplo, fármacos como a doxorubicina causam efeitos colaterais específicos, como a cardiotoxicidade (KIRAN et al., 2018), enquanto outros como o
paclitaxel (PTX), oxaliplatina (OXA) e vimblastina causam neuropatia periférica em uma significante parcela de pacientes (KIM, 2015; QUASTHOFF e HARTUNG, 2002).
1.2 Neuropatia Periférica Induzida por Quimioterapia (NPIQ) 1.2.1 Aspectos clínicos e epidemiológicos da NPIQ
Estímulos nocivos e lesões teciduais, ativam nociceptores que estão presentes nas estruturas periféricas e transmitem informações ao SNC. Do ponto de vista anatômico, a nocicepção se refere ao processo pelo qual as informações sobre estímulos periféricos são transmitidas pelos nociceptores aferentes primários para a medula espinhal, tronco cerebral, tálamo e estruturas subcorticais. A dor é um estado sensorial complexo que reflete a integração de muitos sinais sensoriais, e é produto de um elaborado processamento (HLADNIK et al., 2015) resultante da liberação aumentada de neurotransmissores excitatórios (ex: glutamato, substância P) e/ou eficácia sináptica aumentada, relacionadas a vários mecanismos celulares como alterações pré ou pós-sinápticas (como a potenciação de longa duração), alterações interneuronais, alterações na modulação da via descendente e mecanismos imunitários/microgliais (BASBAUM, 1999; CAMPBELL e MEYER, 2006).
A NPIQ é um dos efeitos citotóxicos provocados por diversos quimioterápicos, relatada como a complicação neurológica mais frequente na quimioterapia (KIM, 2015). A NPIQ é caracterizada por parestesia, disestesia e dormência em mãos e pés, associada à dor neuropática nos casos mais graves (Hershman et al., 2014; KUMAR et al., 2018). O diagnóstico de NPIQ é estabelecido em avaliação clínica, e são utilizadas escalas para classificar a gravidade dos sintomas clínicos, conforme a tabela 1, adaptada de Gutiérrez e colaboradores (2010): Tabela 1. Escalas de pontuação dos sintomas da NPIQ
Fonte: Adaptada de Gutiérrez e colaboradores (2010).
A NPIQ apresenta incidência variável (LEMA et al., 2010), porém é sabido que há variabilidade de acordo com o quimioterápico utilizado, dose e frequência de administração. Em uma meta-análise, Seretny e colaboradores (2014) avaliaram dados de 4179 pacientes e, destes, 1960 (48%) desenvolveram NPIQ ao longo dos protocolos com OXA, cisplatina, bortezomib, PTX ou talidomida; a prevalência de NPIQ foi de 68% no primeiro mês após o término da quimioterapia, 60,0% aos 3 meses e 30,0% aos 6 meses ou mais. Em um estudo comparativo de fase III (GRAMONT et al., 2000), 68% dos pacientes que tiveram adição de OXA ao protocolo terapêutico (comparado ao tratamento somente com fluorouracila e leucovirina) apresentaram sintomas de NPIQ, e desses, 18% relataram neurotoxicidade de grau 3 (perda sensorial grave que interferiu na função). Outro estudo com 795 pacientes comparando os protocolos FOLFOX (ácido folínico, fluorouracil e OXA), IROX (Irinotecano e OXA) e IFL (Irinotecano, fluorouracila e leucovirina) demonstrou que o regime FOLFOX apresentou taxas significativamente mais baixas de náusea grave, vômitos, diarréia, neutropenia febril e desidratação; porém, a neuropatia sensorial foi significativamente associada aos esquemas contendo OXA. Ainda, nos dois protocolos com OXA houve aumento da frequência de abandono do tratamento por consequência de neutropenia ou parestesia (GOLDBERG et al., 2004).
Na pesquisa de Pachma e colaboradores (2015), 89% de 346 pacientes tiveram pelo menos um sintoma de neuropatia aguda já no primeiro ciclo de FOLFOX; esses sintomas incluíram sensibilidade ao toque em itens frios (71%), sensibilidade a engolir itens frios (71%), desconforto na garganta (63%) ou cãibras musculares (42%); esses sintomas foram cerca de duas vezes mais graves a partir do 2º até o 12º ciclo. Para a neurotoxicidade crônica, o formigamento foi o sintoma mais grave, seguido por dormência e dor.
Estudos clínicos mostraram que duloxetina, promove redução da dor associada a NPIQ em 59% dos pacientes comparado a 38% no grupo placebo (SMITH et al., 2013). Apesar disso, é fato que as terapias para a NPIQ ainda são muito limitadas, ineficazes em muitos pacientes, e baseadas em fármacos usados em outras neuropatias, como pregabalina e gabapentina. Nenhuma estratégia foi altamente eficaz para eliminar os sintomas da NPIQ (NITIPIR et al., 2018). O controle farmacológico precoce pode reduzir a probabilidade de cronificação da dor e inibir a retroalimentação inflamatória no corno dorsal da medula espinhal (ZUO et al., 2003; ELLIS e BENNET, 2013). Porém, o manejo de pacientes que apresentam dor crônica é um problema comum na assistência médica (BARON et al., 2010). Dessa forma o desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas acessíveis para paliação dos sintomas ou inibição da NPIQ se fazem necessárias.
1.2.2 Fisiopatologia da NPIQ induzida por Oxaliplatina e Paclitaxel
Os principais fármacos relacionados á indução da NPIQ são: agentes derivados da platina (cisplatina, OXA), taxanos (PTX e docetaxel), alcalóides da vinca (vincristina e vimblastina) e inibidores de proteossoma (bortezomib) (KIM, 2015; QUASTHOFF e HARTUNG, 2002). Embora muitos agentes quimioterápicos possam causar neuropatia periférica, essa não é uma característica universal de todos quimioterápicos, sugerindo que, pelo menos, alguns mecanismos adicionais contribuem para esse efeito. Por exemplo, dentro da classe dos alquilantes compostos de platina, a carboplatina afeta o sistema hematopoiético, já a cisplatina e OXA promovem a NPIQ, indicando que a fisiopatologia da NPIQ é provavelmente multifatorial e há contribuição de pelo menos alguns mecanismos específicos (STAROBOVA e VETTER., 2017).
As drogas neurotóxicas podem induzir a neuropatia axonal distal (axonopatia) caracterizada por degeneração axonal. Alternativamente, como pode se observar na Figura 1, essas drogas podem induzir ganglionopatia afetando os corpos celulares, especialmente os dos gânglios da raiz dorsal (DRG), mielopatia com desmielinização segmentar primária, disfunção mitocondrial, disfunção microtubular e alterações de canais iônicos (KIMURA., 2001; ARGYRIOU et al., 2008; PARK et al., 2013). Neste contexto, a apresentação clínica da dor neuropática é variável de acordo com o quimioterápico utilizado, e isso parece ser decorrente da anatomia da lesão neuronal, porém, o padrão clássico da apresentação da sintomatologia é o de “meia e luva” (Fig. 1). A OXA por exemplo, é conhecida por gerar um comportamento de maior desconforto ao frio, e um dos mecanismos causadores dessa alodinia é a desregulação de canais iônicos pelo metabólito oxalato (KALEY e DEANGELIS, 2009; PARK et al., 2013). Por outro lado, o PTX apresenta a neuropatia com parestesias e dormência, e o seu dano neuronal ocorre nos microtúbulos, DRG e terminações nervosas (ARGYRIOU et al., 2008; PARK et al., 2013).
Figura 1. Representação do padrão típico de “meia e luvas” dos sintomas da NPIQ. apresentando os alvos para toxicidade no sistema nervoso periférico,
partindo do Gânglio da Raiz Dorsal (DRG), para componentes axonais (Mielina, microtúbulos, mitocôndrias, canais iônicos e rede vascular) até as terminações nervosas. Adaptado de Park e colaboradores (2013).
A OXA é um composto de platina de terceira geração que tem demonstrado um papel importnate no tratamento do câncer colorretal (COMELLA et al., 2009), que é um dos canceres de maior incidência. Promove sua ação antitumoral formando ligações covalentes interfilamento e intrafilamento de DNA, inibindo a produção e transcrição de DNA/mRNA e/ou levando à saturação da capacidade celular de reparar adutos de platina do DNA, levando à morte celular (TODD e LIPPARD, 2009; STAROBOVA e VETTER., 2017). Além disso, a ativação do sistema imunológico pode estar envolvida nos efeitos anticancerígenos da OXA, com produção de intérferon pelas células T e morte celular imunogênica resultante da via de ativação de TLR4 observada em células de câncer de cólon humano e murino (TESNIERE et al., 2010). Os efeitos neurotóxicos da OXA incluem o desenvolvimento de uma neuropatia transitória aguda que ocorre em quase 90% dos pacientes dentro de horas após a infusão, a qual é caracterizada por disestesias e parestesias das mãos, dos pés e da região perioral, estes sintomas são frequentemente induzidos pela exposição a temperaturas baixas e são uma característica chave da alodinia ao frio induzida por OXA (ARGYRIOU et al., 2013; STAROBOVA e VETTER., 2017)
Uma característica única da OXA é a rápida transformação não enzimática do complexo dicloro 1,2-diaminociclo-hexil-platina e oxalato, que ocorre por substituição do oxalato por íons cloreto no sangue. A geração do metabólito oxalato é uma das poucas características que distinguem a OXA da cisplatina, e foi proposta como um mecanismo responsável pelas diferenças na apresentação clínica, mais notavelmente a presença de alodinia ao frio que inicia poucas horas após o tratamento com OXA, mas não com cisplatina. Dessa forma, é plausível que metabólitos adicionais possam contribuir para o desenvolvimento do dano neuronal (STAROBOVA e VETTER., 2017). Foi proposto que um dos metabólitos da OXA, o oxalato, altera propriedades funcionais dos canais de sódio dependentes de voltagem (NaV), resultando num estado aberto prolongado dos mesmos e hiper-excitabilidade dos neurônios sensoriais (GROLLEAU et al., 2001); porém, a patofisiologia não é completamente compreendida (BINDER et al., 2007).
O PTX pertence a classe dos taxanos, é um agente antimicrotubulina com um mecanismo único de ação e atividade potente contra vários tipos de tumores, incluindo câncer de mama (PEREZ., 1998) que é o mais incidente em mulheres. Atua inibindo a
despolimerização das unidades de tubulina dos microtúbulos, bloqueando a fase final (G2/M) do ciclo celular, e induzindo a morte celular. Embora esses mecanismos pareçam ser específicos para células em proliferação e, de fato, os taxanos, na prática clínica, prolonguem as remissões e melhorem a sobrevida do pacientes, eles também estão associados com a ocorrência significativa de toxicidade em neurônios sensoriais, especialmente no transporte axonal dependente de tubulina, causando a NPIQ (ARGYRIOU et al., 2008). Um estudo em modelo pré-clínico, demonstrou que a administração de PTX resultou no acúmulo de microtúbulos polimerizados nas células de Schwann e nos axônios do nervo isquiático (ROYTTA et al., 1984, CAVALETTI et al., 1997). Além disso, Persohn e colaboradores (2005) examinaram o efeito da administração crônica de PTX e docetaxel em rato Wistar, e demonstraram que ambos os fármacos induzem danos significativos em nervos periféricos, igualmente severos e dose-dependentes.
Os taxanos afetam todos os neurônios sensoriais, com uma preferência por fibras nervosas mielinizadas grossas, que conduzem a sensação de vibração e propriocepção (MONTERO et al., 2005). O mecanismo da neuropatia induzida por PTX não é claro. No entanto, como a sobrevivência e a função dos neurônios exigem que proteínas e outros componentes sejam transportados ao longo de extensos axônios do corpo celular de um neurônio para suas sinapses distais (LEE e SWAIN, 2006), o tratamento com PTX provavelmente interrompe esse transporte ativo. A incubação do nervo ciático de ratos com PTX 200 µmol/L induziu acúmulo de vesículas no nervo, indicando que o tratamento com PTX bloqueia o transporte axonal rápido (NAKATA e YORIFUJI 1999). Um estudo avaliou as alterações iniciais que ocorrem após a administração de PTX em ratos, sugerindo que a neuropatia periférica induzida por PTX é caracterizada pela lesão de neurônios sensoriais e suas células de suporte no sistema nervoso periférico, ativação de macrófagos tanto no DRG quanto no nervo periférico e ativação microglial dentro da medula espinhal (MOURIDSEN et al., 2002).
1.2.3 Espécies Reativas de Oxigênio (ERO no dano neuronal e no microambiente tumoral)
A respiração aeróbica gera energia nas mitocôndrias das células e, como resultado do metabolismo de oxigênio em água, várias moléculas são produzidas e parte dessas podem ser tóxicas para a célula em altas concentrações. Denominadas espécies reativas de oxigênio (ERO), estas
normalmente se encontram em baixa concentração celular, sendo necessárias para eventos celulares como a transdução de sinal, ativação enzimática, expressão gênica, formação de ligações dissulfeto durante o enrolamento de novas proteínas no retículo endoplasmático e, até mesmo, no controle da atividade da caspase que é ativada durante a apoptose (SOSA et al., 2013).
De todos os compostos derivados do metabolismo oxidativo, as ERO são as mais abundantemente produzidas nos processos metabólicos da cadeia transportador de elétrons, gerando o ânion superóxido (Oº
2)
como produto inicial, o qual pode ser dismutado via enzima superóxido dismutase mitocondrial (SOD) para a geração do peróxido de hidrogênio (H2O2). Por ser altamente difusível, o peróxido de hidrogênio pode
difundir aos diferentes compartimentos celulares, reagindo diretamente com biomoléculas, ou atuar na propagação de reações radicalares como, por exemplo, a reação de Fenton, gerando o radical hidroxila (OH.), que
é altamente reativo e o mais danoso entre as ERO, outros oxidantes derivados do oxigênio incluem o, oxigênio singleto (1O
2) e ozônio (O3)
(SIMIC et al., 1989; SOSA et al., 2013).
O dano que as ERO podem causar à célula não só depende da sua concentração intracelular, mas também do equilíbrio entre as ERO e as moléculas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas endógenas. Quando o equilíbrio redox (pró-oxidante/antioxidante) é perdido, o estresse oxidativo é gerado, alterando e danificando biomoléculas, incluindo DNA, RNA, lipídios e proteínas (VESKOUKIS et al., 2012). As ERO podem promover oxidação do DNA gerando, por exemplo, o 8-hidroxi-2a-desoxiguanosina derivado de hidroxilas, que é um produto capaz de gerar mutações e tem sido fortemente implicado na carcinogênese (MATSUI et al., 2000). Apesar de sua menor reatividade em comparação com outras ERO, o peróxido de hidrogênio desempenha um papel importante na carcinogênese porque é capaz de se difundir por toda a mitocôndria e através das membranas celulares e produzir lesão celular (REUTER et al., 2010; MATTES e JIMENEZ., 2000; RAY e HUSAIN., 2002)
É sabido que alguns agentes antineoplásicos podem produzir ERO, as quais participam, pelo menos em parte, da toxicidade de alguns antitumorais na indução da apoptose de células cancerígenas (CONKLIN., 2004). No entanto, as ERO geradas durante a quimioterapia também podem afetar células e tecidos normais, e parecem estar
associadas a vários eventos tóxicos, como cardiotoxicidade, nefrotoxicidade e neurotoxicidade (ARETI et al., 2014).
A neurotoxicidade causada por diferentes classes de drogas quimioterápicas difere significativamente, uma vez que a degeneração neuronal periférica ou a neuropatia de pequenas fibras continua sendo o resultado final típico da NPIQ. Suspeita-se que o aumento do estresse oxidativo neuronal é um dos responsáveis pelos danos neuronais em diferentes modelos de neuropatias (NEGI et al., 2011; SAIFI et al., 2003). Essas observações lançaram as bases para investigar o possível envolvimento do estresse oxidativo na NPIQ (ARETI et al., 2014).
A neurodegeneração mediada pelo estresse oxidativo pode ser explicada por falha bioenergética mitocondrial, depleção de defesas antioxidantes, dano biomolecular, ruptura microtubular, ativação de canais iônicos (Na2+), desmielinização, neuroinflamação,
comprometimento da mitofagia e morte neuronal por apoptose (MCDONALD e WINDEBANK., 2002; TA et al., 2013; ARETI et al., 2014). Além disso, a falta de uma barreira vascular eficiente e a ausência de drenagem linfática tornam o tecido nervoso periférico, incluindo os gânglios da raiz dorsal, mais propensos a danos quimiotóxicos. Além disso, os nervos de mamíferos são conhecidos por serem mais susceptíveis ao estresse oxidativo devido ao seu alto conteúdo de fosfolipídios, mitocôndrias e axoplasma; e também devido à baixa expressão de enzimas antioxidantes (LOW et al., 2007).
As maiores evidências da participação das ERO na NIPQ são demonstradas farmacologicamente com a administração de antioxidantes. A administração de acetil-l-carnitina, ácido lipóico ou vitamina C atenuou a nocicepção mecânica induzida pela OXA, sugerindo o papel crítico do estresse oxidativo na dor neuropática induzida pela OXA (JAGGI e SINGH., 2012). A administração de fenil N-terc-butilnitrona, um “sequestrador” de radicais livres, mostrou reduzir a hipersensibilidade mecânica na dor neuropática induzida por PTX em ratos (KIM et al., 2010). Ainda, a administração de vitamina C e N-acetilcisteína demonstrou aliviar a citotoxicidade causada por bortezomib em células de Schwann, sugerindo a neuroproteção (NAKANO et al., 2011).
É sabido o envolvimento das ERO na carcinogênese, essas moléculas são importantes durante a progressão e promoção do tumor, onde é possível observar uma ruptura da homeostase redox com o
aumento da produção de ERO, possivelmente pelo alto metabolismo glicolítico aeróbico. Os efeitos diretos das ERO, são geralmente atribuídos a altas concentrações no local do dano, incluindo quebras da cadeia de DNA, mutações pontuais, reticulação aberrante de DNA e mutações em protooncogenes e genes supressores de tumor, promovendo assim a transformação neoplásica (REUTER et al., 2010). Porém, esse estado torna essas células mais susceptíveis a danos e, quando somada ao aumento da produção as ERO geradas pela quimioterapia, a superprodução é uma alternativa defendida por alguns pesquisadores para eliminar células tumorais através do aumento da peroxidação lipídica, dano ao DNA e oxidação proteica (SCHUMACKER, 2006; TRACHOOTHAM et al., 2009). Por outro lado, outros autores demonstraram que os antioxidantes podem ter efeito antitumoral. Na revisão de Zafarullah e colaboradores (2003), a NAC, por exemplo, apresentou efeito antitumoral em alguns tipos de câncer, inibindo promotores tumorais e induzindo apoptose. Também já foi observada atividade pró-apoptótica e anti-proliferativa em modelos de câncer com uso de AL (UNIT., 2005; BILSKA e ODEK., 2005; NOVOTNY et al., 2005). Assim como com uso de vit. E, em que já foram observadas atividades anticâncer (MIYAZAWA et al., 2009; CONSTANTINOU et al., 2008).
O uso de antioxidantes na terapêutica do câncer ainda é bastante controverso. Jaggi e Singh (2012) citam dois principais questionamentos em torno da conduta de suplementação de antioxidantes na clínica: “Os antioxidantes aumentam ou diminuem a eficácia do agente anticancerígeno? Os antioxidantes protegem o tecido normal e melhoram a toxicidade ou protegem as células cancerígenas do efeito da quimioterapia?”. Esses são dois questionamentos aparentemente simples, mas que até hoje permanecem em aberto devido à ausência de estudos pré-clínicos e clínicos bem desenhados com a finalidade de abordar tanto efeitos adversos e eficácia antitumoral de diferentes quimioterápicos em combinação com diferentes antioxidantes. Isso gera uma aparente dualidade quanto ao uso dos antioxidantes na terapia antitumoral.
1.3 Espécies Reativas e Antioxidantes
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produtos do metabolismo celular e compreendem diversos radicais livres, além das formas não radicalares. As espécies não radicalares, como o nome prediz, não são radicais livres por não possuírem elétrons desemparelhados no
orbital externo, porém são reativas, podendo levar a reações e danos semelhantes às espécies radicalares. Exemplos de oxidantes não radicalares são o peróxido de hidrogênio, oxigênio singleto, ozônio, peróxido orgânico, ácido hipocloroso e ácido hipobromoso (PHANIENDRA et al., 2015; PHAM-HUY et al., 2008). Diferente dos oxidantes não radicalares, um radical livre pode ser definido como um átomo ou molécula contendo um ou mais elétrons não pareados na camada de valência e é capaz de existir independentemente, embora seus tempos de meia-vida sejam baixos devido à alta reatividade e tendência à estabilização para estados energéticos mais baixos. Como exemplos, podem-se citar os radicais superóxido, hidroxila, alquila e peroxila. O número ímpar de elétrons de um radical livre o torna instável, de curta meia vida e altamente reativo, podendo assim atrair os elétrons de outros compostos para atingir a estabilidade; por consequência a molécula atingida perde seu elétron e se torna um radical livre, iniciando uma cascata de reações em cadeia que culminam nos danos celulares em lipídeos (lipoperoxidação), proteínas (como a carbonilação e alterações em resíduos tiólicos) e DNA (como formação de 8-oxo-dGUA) (PHANIENDRA et al., 2015; MUKHERJI e SINGH, 1986)
Os antioxidantes atuam reagindo enzimaticamente ou neutralizando ERO, evitando ou retardando a ação das espécies radicalares e não radicalares de oxigênio, que causam oxidação de proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA (SINDHI et al., 2013). Os antioxidantes endógenos são classificados como enzimáticos e não enzimáticos. Entre os enzimáticos, podemos citar as enzimas que atuam diretamente na neutralização das ERO, como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) (WILLCOX et al., 2004; CARVALHO et al., 2005). SOD, a primeira linha de defesa contra os radicais livres, catalisa a dismutação do radical ânion superóxido, produzindo peróxido de hidrogênio (H2O2).
Este, por redução, é transformado em água e oxigênio (O2) pela CAT ou
GPx. A enzima GPx remove H2O2 usando-o para oxidar a glutationa
reduzida (GSH) em glutationa oxidada (GSSG). A glutationa redutase, regenera o GSH a partir de GSSG, usando o NADPH como doador de elétrons. Além do peróxido de hidrogênio, a GPx também detoxifica os hidroperóxidos lipídicos ou não-lipídicos enquanto oxida a glutationa (GSH) (BAHORUN et al., 2006; DROGE., 2002; YOUNG WOODSIDE., 2001; PHAM-HUY et al., 2008). Estas reações estão sumarizadas na figura 2:
Figura 2. Esquema das vias produtoras de espécies reativas de oxigênio (ERO) e dos principais sistemas enzimáticos celulares antioxidantes que controlam a produção de ERO. Radical superóxido(O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO), peroxinitrito (ONOO-), radical hidroxila (OH.), cobre / zinco-superóxido dismutase (SOD1), manganês-SOD (SOD2), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPX), glutationa redutase (GSR), reduzida glutationa (GSH), glutationa oxidada (GSSG), NADPH e NADP+ oxidado. Imagem obtida de (GARREL et al., 2010).
Os antioxidantes não enzimáticos endógenos são produzidos pelo metabolismo no organismo, e incluem o ácido lipóico, glutationa (GSH), coenzima Q10, melatonina, ácido úrico, bilirrubina, proteínas quelantes de metais, transferrina, entre outros (DROGE., 2002, WILLCOX et al., 2004; PHAM-HUY et al., 2008). Antioxidantes exógenos são compostos que não podem ser produzidos no metabolismo, e devem ser fornecidos através de alimentos ou suplementos, como vitamina E, vitamina C, carotenóides, metais (selênio, manganês, zinco), flavonóides, ácidos graxos (ômega-3 e ômega-6), entre outros (PHAM-HUY et al., 2008). De modo geral, um bom antioxidante tem que atuar em baixos níveis,
sequestrando elétrons desemparelhados e acomodando em sua estrutura, de modo à não propagar as reações em cadeia mediadas por radicais livres.
O processo antioxidante pode funcionar de duas maneiras: inibindo a reação em cadeia radicalar ou prevenindo a formação de ERO. Para a quebra da reação em cadeia de radicas livres, quando um radical libera ou sequestra um elétron, um segundo radical é formado e exerce a mesma ação em outra molécula e continua até que o radical livre formado seja estabilizado por um antioxidante que “quebra” a cadeia de reações, ou simplesmente quando o radical formado se converta/estabilize quimicamente em um metabólito inofensivo estável (PHAM-HUY et al., 2008), tal como o malondialdeído (produto final de lipoperoxidação) e resíduos carbonil proteicos. Esse sequestro de elétrons reativos é o mecanismo típico de antioxidantes não enzimáticos. No contexto da prevenção das reações em cadeia, um exemplo clássico é a peroxidação lipídica. Neste contexto, uma enzima antioxidante pode prevenir a oxidação de biomoléculas por reduzir a taxa de iniciação da cadeia, seja pela eliminação de radicais livres ou pela estabilização de radicais de transição (YOUNG e WOODSIDE., 2001).
1.3.1 N-acetilcisteína
N-acetil-L-Cisteína (NAC) é um fármaco cujo potencial clínico foi relatado no início de 1960, quando se demonstrou ser um agente mucolítico eficaz em pacientes com fibrose cística (HURST et al., 1967). Um novo e importante efeito para a NAC foi descoberto devido a estudos que investigaram seu potencial terapêutico no tratamento da intoxicação por acetaminofeno através da restauração dos níveis hepáticos de GSH e diminuição do estresse oxidativo e necrose (PRESCOTT et al., 1979). Desde a década de 1980, tem havido um crescente interesse no potencial terapêutico da NAC em uma variedade de doenças em que o estresse oxidativo é visto como um fator determinante e no qual os efeitos antioxidantes podem trazer benefícios. A premissa original é de que a NAC apresenta capacidade de estimular a síntese de GSH, um potente antioxidante/detoxificador, a partir de desacetilação que gera cisteínas precursoras de GSH, que ajuda a limitar o impacto do estresse oxidativo, protegendo componentes celulares, além de fornecer equivalentes redutores para apoiar a ação antioxidante das peroxidases como a GPx (RUSHWORTH et al., 2014; DODD et al., 2008), assim como a reciclagem de antioxidantes não enzimáticos, como as vitaminas C e E
(figura 3). A síntese de GSH tem a importante participação da enzima glutamato cisteína ligase (GCL) que é inibida quando os níveis de GSH estão altos, porém, a síntese de GSH a partir da NAC parece não sofrer impedimentos na síntese por conta desse “feedback” negativo, somente nos casos em que os níveis de GSH já estão elevados antes da administração de NAC (RUSHWORTH et al., 2014).
Figura 3. Participação da NAC nas vias de síntese e utilização de GSH.
De-ACase - desacetilases; GCL - glutationa cisteína ligase; GS - glutationa sintase; GPx - glutationa peroxidase; GR - glutationa redutase; GST - glutationa-S-transferase; γ-GT - glutamil transpeptidase. Adaptada de Rushworth (2014).
Demonstrou-se que NAC previne malignidade em linhagens celulares endoteliais (EAhy926 e endotélio da veia umbilical humana [HUVEC]) in vitro. Assim como a NAC inibiu a invasão celular de câncer de bexiga humano (KAWAKAMI et al., 2001; ZAFARULLAH et al., 2003), demonstrando assim possível efeito antitumoral. Entretanto a maior parte destes estudos foi realizada in vitro, um sistema em que as células tumorais estão desprovidas do microambiente tumoral, assim como os parâmetros farmacocinéticos não são contemplados.
Relacionado ao papel da NAC como precursor de GSH, foi demonstrado que a glutationa reduzida (GSH) evita o acúmulo inicial de adutos de platina nos gânglios da raiz dorsal, que é um dos mecanismos propostos para o desenvolvimento de NPIQ em pacientes que recebem agentes de platina. Dois estudos sugerem que a GSH é benéfica para a prevenção de neuropatia periférica induzida por OXA e cisplatina, onde aumento de glutationa reduziu a toxicidade e permitiu que mais ciclos de tratamento fossem administrados (CASCINU et al., 1995; CASCINU et al.,2002). Assim, a utilidade da N-acetilcisteína parece promissora, mas precisa de mais validação (SMITH et al., 2007; WOLF et al., 2008), dado que o número de pacientes envolvidos, e com quadro clinico de NPIQ, foi pequeno, assim como existem dúvidas sobre como a GSH pode ser eficaz, dado que muitos estudos mostram que a mesma não é captada pelas células, e sim requer síntese intracelular.
1.3.2 Ácido Lipóico (AL)
O ácido lipóico está presente em todos os tipos de células procarióticas e eucarióticas. Em humanos, em condições fisiológicas, o AL está presente na forma de lipoato com o próton do grupo funcional hidroxila substituído por resíduos de um álcool orgânico ou com um íon inorgânico (NOVOTNY et al., 2008). O AL é coenzima das enzimas da família das 2-oxo ácido desidrogenases, que participam da formação de energia, sendo essencial para processos aeróbicos celulares, especialmente as reações do ciclo de Krebs que envolvem piruvato desidrogenase (NOVOTNY et al., 2008; PERHAM, 2000). O AL liga grupos acil e os transfere de uma parte do complexo enzimático para outro. Neste processo, o ácido lipóico é reduzido a ácido dihidrolipóico (DHLA), que é subsequentemente reoxidado pela lipoamida desidrogenase (Lip-DH) com a formação de NADH. Importante ressaltar que o DHLA possui atividade antioxidante maior do que o AL (AMBROSI et al., 2018). No geral, o ácido lipóico e o DHLA atuam como um par redox, transportando elétrons do substrato da piruvato desidrogenase para o NAD+ (BIEWENGA et al., 1997; MORRIS et al., 1995; FUJIWARA et al., 1995). O AL além de neutralizar as ERO, possui capacidade de quelante de metais como Fe2+, Cu2+ e Cd2+, impedindo que
os mesmos participem de reações radicalares como a Reação de Fenton e de Haber-Weiss. Também foi demonstrado que o DHLA é capaz de regenerar antioxidantes endógenos (glutationa e vit. E, C); assim como foi descrito que o AL pode inibir a liberação de citocinas pró-inflamatórias induzidas pelo LPS (LI et al., 2015), em mecanismo
dependente da inibição da fosforilação de IκBα e a translocação de NF-kβ para o núcleo (YING et al., 2011; AMBROSI et al., 2018). Estes achados estão sumarizados na figura 4.
Figura 4. Mecanismos de ação propostos para o ácido lipóico. Adaptado
de Ambrosi e colaboradores (2018)
Como componente de terapia antitumoral, o AL apresenta evidências de atividade anticâncer em alguns tipos de câncer como de cólon (UNIT, 2005) e apoptose em células MCF-7 de câncer de mama humano (DOZIO et al., 2010). Porém, o uso do AL é mais bem avaliado como coadjuvante em quimioterapias. Na terapia experimental contra o câncer, o AL foi testado em combinação com a doxorrubicina pelo seu efeito sobre a leucemia murina L1210; doxorrubicina, que é conhecido pela alta taxa de formação de radicais livres (DOVINOVA et al., 1999). Em baixa concentração (1 μmol/L), o AL atuou como um fator de crescimento, enquanto funcionava como um agente antiproliferativo na concentração de 100 μmol/L (BERKSON et el., 2006); além de aumentar a sobrevida dos animais (NOVOTNY et al., 2008). Em um estudo de fase II, aberto, não randomizado, realizado em pacientes com tumores sólidos avançados que recebiam tratamento de manutenção que incluía interleucina-2 recombinante, acetato de medroxiprogesterona e dois antioxidantes, LA (300 mg/dia) e N-acetilcisteína (NAC; 1800 mg/dia), foi constatado que o protocolo é viável, tem um nível muito baixo de toxicidade, e resulta na melhora dos marcadores biológicos como aumento de linfócitos e redução de IL-6, IL-1β e TNF-α, que são preditivos para o desfecho do paciente (MANTOVANI et al., 2002), reforçando a hipótese de que a inclusão de antioxidantes na terapêutica antitumoral parece não induzir o desenvolvimento tumoral.
1.3.3 Vitamina E (vit. E - alfa tocoferol)
Das principais vitaminas lipossolúveis, a bioquímica da vit. E ainda é a mais incompreendida. Se sabe, há muito tempo, que sua participação no sistema antioxidante de animais é de grande importância na defesa dos tecidos em uma gama de condições e doenças mediadas pela degeneração oxidativa (FRYER, 1992). Sua natureza hidrofóbica, facilita a ação em ambiente lipídico, logo os efeitos antioxidantes da vit. E ocorrem principalmente nos domínios de membranas e lipoproteínas (Figura 5), onde inibe principalmente as reações radicalares que levam à lipoperoxidação, prevenindo desestabilização da membrana e disfunção celular (AZZI, 2007; KRINSKY 1992; ZINGG, 2018). O grupo hidroxila livre no anel aromático é responsável pelas propriedades antioxidantes da vit. E; o hidrogênio deste grupo é doado ao radical livre, resultando em uma forma relativamente estável de radical livre de vit. E (EL-BELTAGI et al., 2013).
Figura 5. Mecanismo de ação da Vitamina E. Adaptado de Liou
Além disso, a vit. E afeta a sinalização em mecanismos moleculares redox-dependentes e redox-independentes, influenciando a atividade de enzimas e receptores envolvidos na modulação de vias específicas de transdução de sinais e expressão gênica, assim como vias de sinalização relevantes para a homeostase lipídica, inflamação, neurodegeneração, apoptose, angiogênese, tumorigênese e senescência (ZINGG, 2018).
No contexto da prevenção e terapia dos processos neoplásicos, demonstrou-se que formas específicas de tocoferóis, incluindo vit. E, inibem o crescimento e induzem a morte de células cancerígenas de uma maneira dependente do tempo, da dose e da condição (JIANG, 2018). Em humanos, vários estudos mostram que um baixo nível nutricional de vit. E está associado ao risco aumentado de certos tipos de câncer como de cólon e próstata (CONSTANTINOU et al., 2008; TAYLOR et al.,2008; DAS GUPTA et al., 2006). No estudo de Yang e colaboradores (2018), foi observado que o tratamento com vit. E foi capaz de inibir a carcinogênese induzida por NMBA, atenuando a ativação de NF-κβ e inflamação mediada por CXCR3 em modelo animal. Em estudo realizado por Heinonen e colaboradores (1998), foram acompanhados inicialmente cerca de 29 mil homens tabagistas, durante uma média de 6 anos, onde realizaram suplementação diária de vitamina E durante todo o período do estudo. Os resultados mostraram que a incidência de câncer de próstata diminuiu significativamente (32%) em indivíduos que receberam 50 mg de vit. E diariamente, a qual foi acompanhada de uma redução semelhante na mortalidade pela doença (41%). Em um estudo em modelo animal, foi demonstrado que o uso de vit. E em conjunto com o tratamento quimioterápico não reduziu a atividade antitumoral da cisplatina, porém, foi eficiente em reduzir danos oxidativos em tecidos saudáveis (LEONETTI et al., 2003). Porém, uma meta-análise envolvendo 353 pacientes, realizada por Huang e colaboradores (2016), demonstrou que a vit. E não reduz significativamente a NPIQ, embora os dados mostraram uma alta heterogeneidade (I2: 77%). Contraditoriamente, a vit. E
consistentemente diminuiu parâmetros de neurotoxicidade associados a cisplatina. Portanto, o potencial da vit. E como agente anti-NPIQ permanece em aberto.
1.4 Hipótese
Parte-se da hipótese de que o tratamento antioxidante frente ao modelo animal de neuropatia periférica induzida por OXA e PTX
apresenta efeito antinociceptivo, o qual é resultante da redução dos danos provocados por ERO no tecido nervoso e, consequentemente, a iniciação ou amplificação do processo neuroinflamatório. No tocante ao desenvolvimento tumoral, é esperado que os antioxidantes não alterem a eficácia antitumoral dos quimioterápicos, dado que o mecanismo primário de ação dos quimioterápicos a serem avaliados (alquilação para OXA, e inibição da tubulina pelo PTX) não parece ser associado ao mecanismo dos antioxidantes.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Investigar os efeitos antinociceptivos do tratamento com diferentes antioxidantes (N-acetilcisteína, ácido lipóico e vitamina E) frente ao modelo de NPIQ em camundongos, com a finalidade de melhor compreender os fenômenos biológicos da modulação do balanço redox o presente trabalho apresentará dados envolvendo o uso dos antioxidantes concomitante ao tratamento quimioterápico no desenvolvimento tumoral assim como nos efeitos colaterais induzidos pelos quimioterápicos.
2.2 Objetivos específicos
I. Padronizar o modelo de neuropatia quimioinduzida por OXA e PTX e caracterizar as alterações da nocicepção mecânica e térmica do modelo.
II. Avaliar os efeitos na nocicepção mecânica e térmica do tratamento com os antioxidantes em animais com NPIQ
III. Avaliar se o tratamento com antioxidantes altera o efeito antitumoral da quimioterapia.
IV. Investigar os possíveis mecanismos para os efeitos anti-NPIQ observados com o tratamento antioxidante.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
O presente estudo seguiu todas as premissas éticas no uso de animais de experimentação presentes nas normativas do CONCEA (Conselho Nacional de Experimentação Animal). Os procedimentos experimentais foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina, sob o protocolo número 3722260417.
Foram utilizados camundongos Swiss machos apenas no primeiro experimento para padronização da NPIQ e fêmeas nos demais experimentos (35-45 g, 4-8 semanas), obtidos do Biotério Central da UFSC; camundongos C67BL/6 machos tipo selvagem (25-30 g, 2-4 semanas), cedidos gentilmente pelo Prof. Juliano Ferreira (Laboratório de Farmacologia Experimental-LABEX, UFSC); e camundongos C57BL/6 machos com deleção gênica de TLR-4-/- ou deleção gênica de
Caspase1/11 -/-, cedidos gentilmente pelo Prof. Fernando Spiller
(Laboratório de Imunobiologia, UFSC).
Os animais foram mantidos no biotério em gaiolas com cama de serragem, com temperatura ambiente de 23±1ºC, em ciclo claro/escuro de 12/12h, com acesso livre a água e ração padrão. No período de adaptação ao biotério foram mantidos 10 animais por gaiola, e durante o período de experimentação, cada grupo experimental foi alocado em uma gaiola. Ao final dos experimentos os animais foram submetidos a eutanásia por meio de anestesia com cetamina/xilazina (90/10 mg/Kg) seguida por exsanguinação por/após punção cardíaca.
3.2 Fármacos e outros reagentes
I. Quimioterápicos: Oxaliplatina (Oxalibbs; Libbs Farmacêutica Ltda– São Paulo) e Paclitaxel (Glenmark Farmacêutica Ltda – Argentina) foram mantidas refrigeradas a 4ºC de acordo com as orientações do fabricante, e preparadas no dia da administração, sendo diluídos em água ultrapura esterilizada.
II. Antioxidantes: N-acetilcisteína, ácido lipóico e vitamina E (>99% pureza) foram obtidos da Essentia Pharma – Florianópolis-SC, e mantidos em freezer a -20ºC, e dissolvidos no dia da administração. NAC e AL foram inicialmente dissolvidos em 50 mM PBS (pH=7), seguido da adição de hidróxido de sódio (NaOH 0.1 M) para obter completa solubilização e neutralização do pH. A vit. E foi diluída em óleo de gergelim.
III. Veículo: no grupo de animais tratados com veículo, utilizamos soro glicosado na injeção intraperitoneal dos quimioterápicos (dado que compostos de platina não devem ser dissolvidos em soluções contendo cloreto). Para veículo dos antioxidantes, utilizamos PBS (50 mM, pH=7), por via oral.
IV. Pregabalina: utilizou-se pregabalina (Prefiss, Farmacoquímica – Rio de Janeiro); a droga foi dissolvida em água ultrapura e administrada por gavagem orogástrica.
V. Agonistas TRPA1 e TRPV1: Os agonistas TRPA1, alil isotiocianato (AITC), e TRPV1, capsaicina., foram obtidos da Sigma Aldrich Chemical Co. Soluções estoque de AITC e Capsaicina em DMSO foram mantidos a -20ºC até o momento da diluição em NaCl 0,9% para gerar a solução de uso. A concentração residual de DMSO nas soluções de uso não ultrapassou 0,03% em 20 µl.
3.3 Procedimentos experimentais
O cálculo do tamanho amostral para cada estudo foi realizado de acordo com Callegari-Jacques (2004), e calculada com base nos dados de média e desvio padrão do parâmetro principal da análise obtido de estudos prévios com o mesmo modelo, segundo a fórmula: n1=[( SA2 + SB2)/(A -
B)2]x(t + u)2 ; em que : S= desvio das amostras; µ= média das amostras;
SA (desvio ratos controle); SB (desvio ratos tratados); A (média ratos
controle); B (média ratos tratados); = 0,05; Poder = 1- β = 0,9 e então
β = 0,1; n0 = 10; t = 2,1; u = 1,734. O N amostral calculado para os
experimentos de nocicepção, teve o teste de Von Frey como teste principal, foi de 6 animais/grupo.
3.3.1 Caracterização do modelo de NPIQ (Indução) Para caracterizar o modelo de NPIQ, foram utilizados camundongos Swiss machos de 4 semanas. A dose de 5 mg/kg de OXA foi selecionada a partir do estudo de Joseph e colaboradores (2008). Para o PTX, a dose de 5 mg/kg seguiu o estudo de Kamei e colaboradores (2017). Os quimioterápicos foram administrados a cada 48 h através de injeção I.P, em um total de 15 dias de protocolo (7 doses; com dose cumulativa de 35 mg/Kg. Independente do protocolo (concomitante, agudo, ou pós-indução da NPIQ; abaixo descritos), os antioxidantes foram administrados através de gavagem orogástrica (volume de 500 uL/dose), diariamente no período matutino. Os parâmetros de comportamentos nociceptivos mecânicos e térmicos foram avaliados no dia subsequente à administração do quimioterápico e dos antioxidantes, e imediatamente antes da próxima dose de antioxidantes. Outros protocolos específicos serão detalhados ao longo do texto.
3.3.2 Testes nociceptivos
Uma semana antes de iniciar os protocolos experimentais, os animais foram submetidos à ambientação de 30 min nas plataformas de teste (Câmara de Von Frey, Placa de gelo e aparato de Hargreaves) e, nos dias de realização dos comportamentos nociceptivos, foram pré ambientados por 30 min antes do início dos testes. Valores de nocicepção basal para os testes térmicos e mecânicos foram determinados 2 dias antes do início dos tratamentos.
3.3.2.1 Nocicepção mecânica (Teste de Von Frey) A nocicepção mecânica foi mensurada através do método “up and down” de Von Frey (CHAPLAN et al., 1994). Inicialmente, os animais são dispostos em câmaras de acrílico, individualmente, o assoalho da plataforma é gradeado dando acesso aos pés dos animais. O teste consiste na aplicação de filamentos na região intraplantar do pé direito, sendo considerada uma resposta positiva a retirada, chacoalhar ou lamber da pata estimulada. Em camundongos, inicia-se o teste com o filamento de força de 0,16 g e, em caso de resposta positiva um filamento com força menor (0,07 g) é aplicado e, em caso de resposta negativa, um filamento de força maior é utilizado (0,4 g). São realizadas 6 aplicações, utilizando filamentos de 0,02 a 4,0 g de força. Os resultados são expressos em limiar de respostas positivas de 50%, e calculadas de acordo com a fórmula apresentada por Dixon (1980): limiar 50% (g)= 10(Xf+kδ), onde Xf
representa o valor do último filamento de Von Frey do teste; k representa um valor previamente tabelado (DIXON, 1980) como um padrão de respostas positivas/negativas; e δ representa a diferença média entre os estímulos (0,4498). Para análise estatística (mas não para apresentação gráfica), os dados foram normalizados por transformação logarítimica (log10).
3.3.2.2 Nocicepção térmica ao frio (Teste de Placa Fria)
Para avaliar a nocicepção térmica ao frio adaptou-se o protocolo de Jasmin e colaboradores (1998). O teste consiste em expor individualmente os animais em uma placa de gelo revestida por uma superfície plástica, medindo 22 x 22 cm de superfície e 3 cm de altura, com temperatura de superfície de 3 a 4ºC, durante um minuto. São contabilizados o número de movimentos de retirada, chacoalhar ou
lamber de patas dianteiras e traseiras. Os resultados são expressos em número de respostas nociceptivas por minuto (eventos/min).
3.3.2.3 Nocicepção térmica ao calor (Teste de Hargreaves)
Para avaliar a nocicepção térmica ao calor, inicialmente foi utilizada uma o teste criado por Hargreaves e colaboradores (1988), onde os animais são contidos na fonte radiante de luz infravermelha, e a superfície plantar do pé direito exposta ao ponto de emissão do feixe de luz de calor infravermelho. O tempo de permanência da superfície plantar no ponto de emissão de calor até a retirada é automaticamente gerado pelo aparato de Hargreaves. Para tanto, foi utilizada a Intensidade de Luz Infravermelho de 35 (IR:35), de modo a obter um tempo de retirada médio de 7-9 segundos em animais controle, assim facilitando a visualização de limiares menores e/ou maiores de retirada de pata.
Em experimentos de nocicepção espontânea, a nocicepção ao calor foi mensurada através do teste da placa quente adaptado de Hunskaar e colaboradores (1986), que consiste em expor os animais individualmente em uma plataforma de vidro sobre a placa de aquecimento a 50ºC, onde é contabilizado o tempo até o primeiro reflexo de lambida ou retirada de pata; sendo 30 segundos o tempo limite de duração do teste para evitar lesões neurodérmicas na região palmar e plantar dos membros.
3.3.2.4 Nocicepção espontânea aguda
Para avaliação do impacto dos antioxidantes sobre as vias de transmissão nocipetiva, os animais foram submetidos a injeção intraplantar dos agonistas de TRPA1 (AITC, 10 nmol/sítio) ou TRPV1 (capsaicina, 20 nmol/sítio), dissolvidos em 0.9% NaCl. Como controle negativo, foi utilizada a injeção de 0,9% NaCl (controle salina). O volume de administração intraplantar foi de 20 uL/sítio. Imediatamente após a administração intraplantar do fármaco ou controle salina, o animal é colocado em uma câmara de vidro e os reflexos de lamber/chacoalhar e de elevação do pé, são contabilizados separadamente, durante 5 min, e estratificados a cada 1 min. Os eventos de “lamber/chacoalhar” e o “tempo de elevação de pata” ao longo de 5 min foram contabilizados para expressão dos resultados. De maneira complementar, após 30 min da injeção de AITC ou capsaicina, os mesmos animais foram testados os
