Ocorrência de periodontopatógenos em brasileiros portadores de periodontite crônica

Texto

(1)0 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO CLÍNICA INTEGRADA BRUNA DE CARVALHO FARIAS. OCORRÊNCIA DE PERIODONTOPATÓGENOS EM BRASILEIROS PORTADORES DE PERIODONTITE CRÔNICA. Recife – PE 2009.

(2) 1 BRUNA DE CARVALHO FARIAS. OCORRÊNCIA DE PERIODONTOPATÓGENOS EM BRASILEIROS PORTADORES DE PERIODONTITE CRÔNICA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Odontologia com área de concentração em Clínica Integrada.. Orientadora: Profª. Drª. Renata Cimões Jovino Silveira Co-orientadores: Prof. Dr. Paulo Roberto Eleutério de Souza Profª. Drª. Estela Santos Gusmão. Recife – PE 2009.

(3) 2. Farias, Bruna de Carvalho. Ocorrência de periodontopatógenos em brasileiros portadores de periodontite crônica/ Bruna de Carvalho Farias. – Recife: O Autor, 2009. 65 folhas: tab., gráf. e quadros. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Odontologia, 2009. Inclui bibliografia, anexos e apêndices. 1. Periodontite. 2. PCR. 3. Patógenos. 4. Tanerella forsythial. 5. Porphyromonas gingivalis. I. Título. 616.31 617.632. CDU (2.ed.) CDD (21.ed.). UFPE CCS2010-086.

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(6) 5 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva PRÓ-REITOR DA PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DIRETOR Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro COORDENADOR DA PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Prof. Dr. Jair Carneiro Leão PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA INTEGRADA COLEGIADO Profa. Dra. Alessandra de Albuquerque T. Carvalho Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva Prof. Dr. Etenildo Dantas Cabral Prof. Dr. Geraldo Bosco Lindoso Couto Prof. Dr. Jair Carneiro Leão Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro Profa. Dra. Liriane Baratella Profa. Dra. Lúcia Carneiro de Souza Beatrice Profa. Dra. Renata Cimões Jovino Silveira Profa. Dra. Silvana Maria Orestes Cardoso SECRETARIA Oziclere de Araújo Sena.

(7) 6. DEDICATÓRIA.

(8) 7. Dedicatória Dedico este trabalho: Aos meus amados pais, Franklin de Castro Correia de Farias e Eliane de Carvalho Farias, por todo amor, trabalho e paciência que tiveram comigo durante essa fase da minha vida, e também pelo incentivo na busca dos meus ideais, pois sem o apoio deles não teria conseguido vencer mais essa etapa. Meus eternos agradecimentos pela oportunidade desse aprendizado que vocês me proporcionaram, pois foi de grande importância para minha formação. Ao meu noivo, André Vajgel Fernandes, por todo amor, confiança, paciência e incentivo para que eu conseguisse concluir mais esta conquista..

(9) 8. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS.

(10) 9. Agradecimentos especiais. À minha professora, orientadora e amiga Renata Cimões por todos os conhecimentos ministrados, pelo incentivo na carreira docente, além de estar sempre disponível nos momentos necessários e por me levar a execução e conclusão dessa dissertação. Pessoa fundamental em todos os momentos da minha formação profissional. Meus sinceros e eternos agradecimentos e admiração..

(11) 10. AGRADECIMENTOS.

(12) 11. Agradecimentos Ao Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins, Reitor da Universidade Federal de Pernambuco, que disponibilizou uma estrutura adequada para a execução deste experimento. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos recursos financeiros disponibilizados, fundamental para a execução deste trabalho. À Deus por ter me iluminado e proporcionado a conclusão de mais esta etapa da minha. Às minhas irmãs, Ana Carolina de Carvalho Farias e Fernanda de Carvalho Farias, e toda minha família, por estarem sempre ao meu lado nos momentos difíceis e por toda confiança depositada. À minha segunda mãe, Josefa Correia dos Santos, por todo carinho, amor e cuidado obtido ao longo de toda minha vida. Ao Prof. Paulo Roberto Eleutério de Souza por toda orientação e paciência na execução desta pesquisa, assim como todo conhecimento passado. Meu eterno agradecimento. A todos os professores do curso de Pós-Graduação da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) que foram tão importantes para nossa formação, transmitindo todo o conhecimento e suas experiências. Meus sinceros agradecimentos. A todos os colegas de turma, Daniela Mendes, Talita Ribeiro, Catarina Brasil, Felipe Bravo, Ana Luísa Mariz, Klécio Alves, Raphaela Silva, Michellini Sedycias, Thaís Chaves, Arnaldo Filho, Cláudia Brainer, Natália Carvalho e Camila Arcoverde pelos maravilhosos momentos vividos e conhecimentos compartilhados. Tenham certeza que as amizades geradas no decorrer do curso ficarão guardadas na minha memória. Muito obrigada..

(13) 12. Às alunas de graduação Rayanne Melo e Betânia Lima, as quais foram fundamentais para a execução desta pesquisa. Agradeço por toda ajuda e atenção prestada, além dos momentos maravilhosos e sacrificantes compartilhados no desenvolver de todo experimento. Meu eterno agradecimento. À secretária Oziclere por todo carinho e serviço prestado a nossa turma. Meus sinceros agradecimentos. A todos os funcionários da UFPE pela colaboração durante o curso. Aos pacientes por proporcionar a realização desta pesquisa e consequentemente elaboração desta dissertação, pois sem a colaboração deles nada disso seria possível. Muito obrigada. E a Todos aqueles que, de alguma maneira, colaboraram para que eu pudesse alcançar mais uma etapa na minha formação, meus sinceros agradecimentos..

(14) 13. RESUMO.

(15) 14. RESUMO O presente trabalho teve por objetivo avaliar a presença dos periodontopatógenos que formam o complexo vermelho (Tannerella forsythia (Tf), Porphyromonas gingivalis (Pg) e Treponema denticola (Td)) e o Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) em pacientes portadores de periodontite crônica. A amostra foi constituída de 29 pacientes com diagnóstico clínico e radiográfico de periodontite crônica de acordo com os critérios da AAP (2000). Todos os dentes foram sondados em seis sítios para registro de profundidade, perda de inserção clínica e sangramento após sondagem. As amostras para análise microbiológica foram coletadas dos 4 sítios com maior profundidade de sondagem para cada paciente, totalizando 116 amostras. Estas amostras foram processadas através da técnica de PCR convencional e foram observados os seguintes resultados: 46,6% apresentaram resultado positivo para a bactéria Pg; 41,4% para Tf; 33,6% para Td e 27,6% para Aa. Não se verificou associação significante entre a presença dos periodontopatógenos e as variáveis faixa etária, sexo e sangramento à sondagem. Para a bactéria Pg verificou-se associação significante (p<0,05) com a variável placa visível, e a presença das bactérias Pg e Tf foi mais prevalente (p < 0,05) em bolsas periodontais ≥ 8 mm. Nos sítios com profundidade. 8 mm foram observadas com maior freqüência as combinações Pg + Tf. (23,2%) e Pg + Tf + Td (20,0%). Foram estatisticamente significantes (p < 0,05) as associações entre a presença simultânea das bactérias Aa + Pg, Aa+ Tf, Pg + Tf e entre Tf + Td. Concluiu-se que as bactérias analisadas, principalmente as do complexo vermelho, estiveram fortemente relacionadas com a periodontite crônica, e que as bactérias Pg e Tf foram mais frequentes em bolsas periodontais profundas. Palavras-Chave: PCR, periodontite, patógenos, Tannerella forsythia, Porphyromonas.

(16) 15. gingivalis, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

(17) 16. ABSTRACT This study aimed to evaluate the presence of periodontal pathogens that form the red complex (Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola) and Aggregatibacter actinomycetemcomitans in patients with chronic periodontitis. The sample consisted of 29 patients with clinical and radiographic diagnosis of chronic periodontitis according to the criteria of the AAP (2000). All teeth were probed at six sites to record probing depth, clinical attachment loss and bleeding on probing. Samples for microbiological analysis were collected from 4 sites with greater probing depth for each patient, totaling 116 samples. These samples were processed by conventional PCR and observed the following results: 46.6% tested positive for the bacteria Pg, 41.4% for Tf, 33.6% for Td and 27.6% for Aa. There was no significant association between the presence of periodontal pathogens and the variables age, sex and bleeding on probing. There was a significant association (p < 0.05) between the presence of bacteria Pg and dental plaque, and the presence of bacteria Pg and Tf was more prevalent (p < 0.05) in periodontal pockets ≥ 8 mm. At sites with probing depth. 8 mm were more frequently observed combinations. Tf + Pg (23.2%) and Tf + Pg + Td (20.0%). Were statistically significant (p <0.05) the associations between the simultaneous presence of bacteria Aa + Pg, Aa + Tf, Pg + Tf, and Tf + Td. It was concluded that the bacteria analyzed, particularly those of the red complex, were strongly related to chronic periodontitis and the bacteria Pg and Tf were more frequent in deep periodontal pockets. Keywords: PCR, periodontitis, pathogens,. Tannerella forsythia, Porphyromonas. gingivalis, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

(18) 17. LISTA DE ILUSTRAÇÕES.

(19) 18. LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Quadro 1 - Microorganismos e primers específicos para a PCR.................................... 29. Gráfico 1 – Avaliação da presença das bactérias nos sítios............................................ 47.

(20) 19. LISTA DE TABELAS.

(21) 20. LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Distribuição dos pacientes analisados segundo os dados sóciodemográficos, econômicos, hábito do tabagismo e histórico da doença na família.. 41. Tabela 2 – Avaliação do elemento dentário, placa, sangramento e profundidade de sondagem nos sítios.. 42. Tabela 3 – Avaliação da ocorrência das bactérias nos sítios segundo o sexo e faixa etária dos pacientes pesquisados.. 43. Tabela 4 – Avaliação das bactérias nos sítios segundo a presença de sangramento e placa.. 44. Tabela 5 – Avaliação das bactérias nos sítios segundo a profundidade de sondagem.. 44. Tabela 6 – Avaliação da presença das bactérias isoladas ou associadas nos sítios segundo a profundidade de sondagem.. 45. Tabela 7 - Associações entre os patógenos analisados.. 45. Tabela 8 - Artigos avaliados, população investigada, técnica utilizada e resultadosult. 46. apresentados para os patógenos analisados..

(22) 21. LISTA DE ABREVIATURAS.

(23) 22. LISTA DE ABREVIATURAS. AAP. American Academy of Periodontology. PCR. Reação em Cadeia da Polimerase. HIV. Vírus da Imunodeficiência Humana. PS. Profundidade de Sondagem. PIC. Perda de Inserção Clínica. µl MgCl2 mM. Microlitro Cloreto de Magnésio Milimolar. dNTP. Desorribonuleotídeo Trifosfatado. rDNA. DNA recombinante. PB. Pares de base. F. Foward. R. Reverse. p. Nível de significância estatística. Q-PCR. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real. ELISA. Ensaio de Imunoadsorção Enzimática.

(24) 23. SUMÁRIO. Artigo......................................................................................................................... 23. Introdução......................................................................................................... 25 Materiais e métodos.......................................................................................... 27 Resultados......................................................................................................... 30. Discussão........................................................................................................... 31. Referências........................................................................................................ 35. Apêndices………………………………………………………………………….. 48. Termo de consentimento livre e esclarecido.................................................... 49. Ficha clínica..................................................................................................... 50. Anexos....................................................................................................................... 53 Normas do Journal of Applied Microbiology……………………………….. 54. Parecer do Comitê de Ética.............................................................................. 65.

(25) 24. ARTIGO.

(26) 25. Ocorrência de periodontopatógenos em brasileiros portadores de periodontite crônica e pouca perda dentária B.C. Farias1, P.R.E. Souza2, E.S. Gusmão3 e R. Cimões4 1. Estudante de Pós-graduação em Odontologia, Universidade Federal de Pernambuco,. Recife, Pernambuco, Brasil. 2. Doutor em Biologia, Departamento de Genética, Universidade Federal Rural de. Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil. 3. Doutora em Odontologia, Departamento de Medicina Oral da Universidade de. Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil 4. Doutora em Odontologia, Departamento de Prótese e Cirurgia Buco-Facial, da Faculdade. de Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil. Endereço onde o trabalho foi realizado: Especialização de Periodontia da Universidade Federal de Pernambuco Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Recife – PE, Brasil. CEP: 50670-901 Título resumido: Ocorrência de periodontopatógenos Autor para correspondência: Renata Cimões Endereço: Pós-Graduação em Odontologia Av. Prof. Moraes Rego 1235, Cidade Universitária, Recife-PE, Brasil. 50670-901. Telefone/Fax: + 55 81 33047292. E-mail: renata.cimoes@globo.com..

(27) 26. INTRODUÇÃO A doença periodontal acomete um grande número de indivíduos em todo o mundo (AAP 1996), e é considerado o maior problema oral presente nos países desenvolvidos e em desenvolvimento (Herrera et al. 2007). A periodontite é definida como uma doença inflamatória crônica que afeta os tecidos de suporte dos dentes, tendo como fator de risco primário a placa dentária (Socransky et al. 1998; van Winkelholf et al. 2002; Mineoka et al. 2008). Uma forte associação da doença periodontal com certos microrganismos tem sido relatada na literatura, principalmente com relação à presença de certas bactérias anaeróbicas gram-negativas como Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) (anteriormente denominada de Actinobacillus actinomycetemcomitans), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf) (anteriormente denominada de Bacteroides forsythus) e Treponema denticola (Td) (Sakamoto et al. 2001; Mayanagi et al. 2004; Herrera et al. 2007; Atieh 2008; Mineoka et al. 2008; Morikawa et al. 2008; Torrungruang et al. 2009; Wara-aswapati et al. 2009). Estas três últimas formam o “complexo vermelho” e apresentam um importante papel na patogênese da doença periodontal. A bactéria Td é um espirilo, anaeróbio estrito, pertence ao grupo das espiroquetas e possui motilidade. Além de invadir células e tecidos, pode ainda induzir desgranulação de leucócitos polimorfonucleares e aumentar a produção de colagenase, gelatinase e elastase (Fenno e McBride 1998). Já a Pg é um bastonete curto, não esporulado, imóvel, anaeróbio obrigatório, assacarolítico, o qual apresenta produtos finais do seu metabolismo ativos contra um amplo espectro de proteínas do hospedeiro (Holt et al. 1999), e desenvolve papel.

(28) 27. na destruição do osso alveolar por ativação dos osteoclastos (Sharma et al. 2000). A última bactéria do complexo vermelho, a Tf, é um bastonete pleomórfico, fusiforme, anaeróbico, bastante relacionado à progressão da doença periodontal, periodontite refratária e formas agressivas da doença. No entanto, o papel da Tf na doença periodontal e sua ação no sistema de defesa do hospedeiro ainda não estão totalmente esclarecidos (Tanner e Izard 2006).. A bactéria Aa é um bastonete pequeno, com terminação arredondada, imóvel microaerófilo, anaeróbio facultativo, sacarolítico, capnofílico, catalase negativa (Socransky e Hafajje 1999; Schacher et al. 2007). A leucotoxina produzida por este microorganismo é o seu principal fator de virulência, podendo interferir no mecanismo de defesa do hospedeiro sendo capaz de destruir polimorfonucleares e monócitos (van Dyke et al. 1982). A. literatura. tem. sugerido. que. a. distribuição. e. prevalência. desses. periodontopatógenos variam de acordo com a localização geográfica, assim como de acordo com diferentes grupos raciais (Dogan et al. 2003; Cortelli et al. 2005; Herrera et al. 2007; Kim et al. 2009; Torrungruang et al. 2009; Wara-aswapati et al. 2009). Essas diferenças podem sugerir que algumas populações estejam mais expostas ao risco de desenvolver a doença periodontal do que outras (Cortelli et al. 2005). Tendo em vista a importância do conhecimento dos microrganismos que compõem a microbiota subgengival e a escassez de estudos realizados em populações da América do Sul, particularmente no Brasil (Victor et al. 2008), o presente trabalho teve por objetivo identificar a ocorrência dos patógenos periodontais do complexo vermelho (Tf, Td, Pg) e o Aa, em brasileiros adultos, não fumantes, portadores de periodontite crônica e com pouca perda dentária, em uma população localizada em Recife, estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil..

(29) 28. MATERIAIS E MÉTODOS Participantes e exame clínico O presente estudo quantitativo e experimental foi realizado na clínica odontológica da Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), localizada na cidade do Recife, estado de Pernambuco, situada na região nordeste do Brasil. Uma amostra de conveniência composta por 29 pacientes de ambos os sexos, diagnosticados como portadores de periodontite crônica e que procuraram tratamento odontológico no período de agosto de 2008 a julho de 2009, participaram do presente estudo. Para participar da pesquisa os pacientes tinham que se incluir nos seguintes critérios: ter no mínimo 30 anos; apresentar no mínimo 20 (vinte) dentes naturais; não ser fumante; não apresentar nenhuma condição sistêmica que interferisse no curso da doença periodontal (diabetes, hipertensão, doenças auto-imunes, entre outras); não estar grávida ou lactente; não ter sido submetido a tratamento periodontal nos últimos 6 meses; não ter feito uso de antibióticos nos últimos 6 meses; não fazer uso de anti-inflamatório de forma crônica; não ser portador de HIV e não fazer uso de aparelho ortodôntico. Após explicação sobre os objetivos da pesquisa, foi solicitado que o paciente assinasse o termo de consentimento livre e esclarecido. Para cada paciente foi preenchido um periograma, onde foram registrados dados sobre: profundidade de sondagem, sangramento à sondagem segundo Ainamo e Bay (1975), perda de inserção clínica e presença de placa visível. O exame foi realizado por um único examinador em ambiente de.

(30) 29. consultório com luz artificial e usando como instrumentos espelho bucal e sonda periodontal milimetrada tipo Williams (Trinity®, Brasil). O diagnóstico de periodontite crônica foi feito com base nos critérios determinados pela AAP (2000), onde para ser considerado como portador de periodontite crônica o paciente deve apresentar pelo menos um sítio com profundidade de sondagem (PS) e perda de inserção clínica (PIC) ≥ 4 mm (AAP, 2000). Obtenção das amostras de placa subgengival Os quatro sítios com maior profundidade de sondagem, em cada paciente, foram considerados para obtenção das amostras subgengivais, totalizando 116 amostras. Cones de papel estéreis nº 30 (Dentsply, Brasil) foram inseridos no interior da bolsa e permaneceram no local por 20 segundos, em seguida foram transportados para tubos tipo eppendorf e armanezados a -20ºC para posterior extração de DNA e análise por PCR no laboratório de biologia molecular da pós-graduação em odontologia da UFPE. Extração de DNA Para a extração de DNA foi utilizada a matriz comercial de purificação kit geneclean (Qbiogene, Inc.), seguindo o protocolo determinado pelo fabricante, e modificação sugerida por Leão et al. (1999). Processamento através da técnica de PCR A reação de amplificação foi realizada com um volume total de 25µl contendo 1,3µl de MgCl2 a 50mM (LGC Biotecnologia, Brasil), 2,5µl de dNTP 2mM (LGC Biotecnologia, Brasil), 1µl de cada primer inicializador e finalizador a 10 µM (Invitrogem®, Brasil), 2,5µl de 10x PCR tampão (LGC Biotecnologia, Brasil), 0,2µl da Taq DNA polimerase a 5U/µl.

(31) 30. (LGC Biotecnologia, Brasil), 13,5µl de água de injeção e 3µl de DNA da amostra. Em todas as reações de amplificação, foi utilizada uma reação da amplificação sem amostra de DNA como controle negativo para verificação da possibilidade de contaminação. O termociclador (Biocycler) foi programado da seguinte maneira: 1ª fase - “hot start” (94° C por 5 minutos); 2ª fase – dividida em três etapas e realizada por 30 ciclos – 1) desnaturação do DNA alvo por aquecimento (94°C por 30 segundos), 2) anelamento dos primers (temperatura de anelamento de acordo com cada primer utilizado por 30 segundos), 3) extensão (72° C por 30 segundos); e 3ª fase - extensão final (72° C por 5 minutos). Os primers utilizados durante a PCR neste estudo foram espécie-específicos para a porção 16S rDNA, a seqüência utilizada foi de acordo com Ashimoto et al. (1996), e a temperatura de anelamento foi a mesma adotada por Ávila-Campos e Velásques (2002) (Quadro 1). Microrganismo. Aa Pg Tf Td. Primer. Temperatura de anelamento da PCR. F - GCT AAT ACC GCG TAG AGT CGG R - ATT TCA CAC CTC ACT TAA AGG T F - AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG R - ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT F - GCG TAT GTA ACC TGC CCG CA R - TGC TTC AGT GTC AGT TAT ACC T F - TAA TAC CGA ATG TGC TCA TTT ACA T R- TCA AAG AAG CAT TCC CTC TTC TTC TTA. 50ºC. Extensão do amplicon (pb*) 557. 60º C. 404. 60º C. 641. 60º C. 316. *pb – pares de base.. Quadro 1 - Microorganismos e primers específicos para a PCR. Após essa etapa, 9,5µl dos produtos da PCR foram adicionados a 0,5 µl do corante fluorescente blue green (LGC Biotecnologia, Brasil) e submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Posteriormente, as corridas de eletroforese foram visualizadas em luz ultravioleta e fotografadas para posterior análise. A massa molecular padrão 100 pb ladder.

(32) 31. (LGC Biotecnologia, Brasil) foi incluída na corrida da eletroforese. Todas as amostras negativas para os patógenos pesquisados foram repetidas e confirmadas. Análise estatística Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística descritiva através da distribuição de frequência, média, moda, mediana. As técnicas de estatística inferencial utilizaram o teste Qui-quadrado ou teste Exato de Fisher quando as condições para utilização do teste Qui-quadrado não foram verificadas, adotando-se nível de significância de 5% e intervalo de confiança de 95% para as tomadas das decisões estatísticas. RESULTADOS A faixa etária dos participantes variou de 30 a 59 anos, com média de 41,8 anos. Os dados sócio-demográficos, econômicos, e informações quanto ao hábito de tabagismo e histórico familiar da doença apresentados pelos participantes encontram-se na Tabela 1. Com relação aos sítios avaliados, 74,1% das amostras foi coletada em elementos posteriores, a maioria (76,7%) apresentou sangramento após sondagem, 37,9% tinham profundidade de sondagem de 6-7 mm e apenas 31,9% apresentavam placa dentária visível associada (Tabela 2). Dos 116 sítios coletados, 46,6% apresentaram resultado positivo para a bactéria Porphyromonas gingivalis, 41,4% para Tannerella forsythia, 33,6% para Treponema denticola, e 27,6% para Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Gráfico 1). Não foi observada associação significante (p > 0.05) entre as bactérias analisadas e as variáveis sexo e faixa etária dos participantes, assim como para a presença de sangramento (Tabela 3.

(33) 32. e 4). Entretanto, para a variável presença de placa, apenas a bactéria Pg apresentou resultado estatisticamente significante (p<0,05) (Tabela 4). Em relação à profundidade de sondagem, foi possível observar uma associação significante (p< 0,05) para as bactérias Pg e Tf, onde se constatou que estas bactérias foram mais prevalentes em bolsas periodontais profundas ( 8 mm), seguido dos sítios que tinham 6 a 7 mm de profundidade de sondagem (Tabela 5). Na Tabela 6 pode-se analisar a presença das bactérias isoladas ou associadas de acordo com a profundidade de sondagem. Observa-se que entre os sítios com profundidade de sondagem entre 4 a 5 mm e de 6 a 7 mm as maiores freqüências corresponderam aos sítios com nenhuma bactéria, entretanto os sítios com profundidade. 8 mm as duas. combinações mais frequentes corresponderam a Pg + Tf (23,2%) e Pg + Tf + Td (20,0%). Quando se avaliou a relação destes periodontopatógenos entre si, verificou-se associações entre a presença da bactéria Aa + Pg e Aa + Tf (p < 0,05), obtendo-se valores de OR de 2,95 e 2,31, respectivamente. O percentual de sítios com as bactérias Tf + Td foram percentualmente mais elevados quando a bactéria Pg estava presente do que quando ausente (66,7% x 19,4% e 42,6% x 25,8%, respectivamente), entretanto ao nível de 5% só comprovou-se associação significativa de Pg + Tf (p < 0,05) e valor de OR de 8,33. A associação entre a presença das bactérias Tf + Td também se mostrou significativa (p < 0,05), com OR de 2,54 (Tabela 7). DISCUSSÃO O presente estudo avaliou a ocorrência dos patógenos periodontais que formam o complexo vermelho (Td, Tf, Pg), que são conhecidamente associados à progressão e.

(34) 33. severidade da doença periodontal, como também investigou a presença da bactéria Aa, um patógeno frequentemente relacionado às formas de periodontite agressiva, mas também presente nas periodontites crônicas. Critérios de inclusão semelhantes ao estabelecido para este estudo foram adotados por outros autores (Asai et al. 2002 (n= 37 para grupo periodontite crônica); Dogan et al. 2003 (n= 14 para grupo de periodontite crônica); Klein e Gonçalves 2003 (n= 10 para grupo de periodontite com profundidade >5mm); Herrera et al. 2007 (Colombia n= 41, Chile n= 37, Espanha n= 36); Wara-aswapati et al. 2009 (n=20 para grupo de periodontite crônica)), e estes também obtiveram um reduzido número de participantes. Apesar dessa redução da amostra, o critério de inclusão bastante rigoroso proporcionou uma amostra mais homogênea quando comparada a outros estudos, assim como um menor número de vieses na pesquisa. Grande heterogenia da amostra é observada em diversas pesquisas (van Winkelhoff et al. 2002; Avila-Campos 2003; Torrungruang et al. 2009), as quais apresentaram critérios de inclusão e exclusão bastante flexíveis e em conseqüência elevado número de participantes. Esta condição favorece o surgimento de vieses, pois estes estudos incluem na mesma amostra fumantes, pacientes usando antibiótico e antiinflamatório, com doenças sistêmicas e sem limite da quantidade de dentes. Todos estes fatores já possuem comprovação de sua interferência na microbiota oral, resultando, deste modo, em achados não tão fidedignos para conhecimento da microbiota subgengival da doença periodontal. Estudos epidemiológicos realizados em adultos têm apresentado uma significante variação na prevalência de patógenos periodontais (Pg, Td, Tf e Aa) de acordo com a raça, etnia e localização geográfica (Torrungruang et al. 2009), assim como a técnica empregada. No Brasil, poucos estudos foram realizados para investigar a microbiota periodontal, sendo.

(35) 34. a maioria destes realizados no Estado de São Paulo (Avila-Campos e Velásquez-Meléndez 2002; Ávila-Campos 2003; Klein e Gonçalves 2003; Cortelli et al. 2005; Kantorski et al. 2006; Imbronito et al. 2008). Os resultados apresentados por estas investigações encontram-se apresentadas na Tabela 8. Quando comparada a presente pesquisa, a maioria dos estudos realizados em populações brasileiras apresentou índices mais elevados para os patógenos em pacientes com doença periodontal (Avila-Campos e Velásquez-Meléndez 2002; Ávila-Campos 2003; Klein e Gonçalves 2003; Cortelli et al. 2005; Imbronito et al. 2008). A literatura também tem demonstrado grande variação na prevalência desses microrganismos em populações de diferente localização geográfica. Os resultados de estudos realizados em países latinoamericanos, europeus, asiáticos e na Oceania encontram-se apresentados na Tabela 8. As discrepâncias apresentada entre os resultados dos estudos avaliados e da presente pesquisa, podem ser explicadas por vários fatores: utilização de diferentes técnicas como meio de diagnóstico dos patógenos; variação dos protocolos adotados; diferenças na localização geográfica e etnia das populações e distintas condições periodontais avaliadas. No entanto, pode-se constatar que a maioria dos estudos observou maior prevalência do complexo vermelho associado à periodontite crônica, fato este que corrobora com estes achados, em que foi possível verificar maior porcentagem das bactérias Pg, Tf e Td quando comparada a bactéria Aa, a qual apresentou a menor prevalência nas amostras avaliadas. Nos sítios com profundidade de sondagem. 8 mm avaliados, foi possível verificar. uma maior freqüência das combinações Pg + Tf e Pg + Tf + Td, confirmando a grande associação da periodontite crônica com as três espécies do complexo vermelho, fato este.

(36) 35. também confirmado por Socransky et al. (1998), que acrescentam ainda a relação destes patógenos com presença de sangramento após sondagem. Estudos in vitro têm observado que a bactéria Td aumenta a formação de biofilme quando incubados com Pg, mas não quando é incubada com Tf (Kuramitsu et al. 2005). Embora não tenha sido possível confirmar se a formação de biofilme com Tf é influenciada pela incubação com Pg, a interação entre Pg e Tf pode favorecer a formação de biofilme, bem como de Td, pois Tf foi detectado mais freqüentemente e em maior número nas bolsas periodontais mais profundas contendo Pg (Yang et al. 2004). Portanto, é bastante provável que Pg, Td e Tf simbioticamente colonizem e formem biofilmes em sítios com periodontite, atuando de forma cooperativa na infecção (Mineoka et al. 2008). Zambon (1996) ainda acrescenta que os periodontopatógenos Tf e Pg estão fortemente associadas à patogênese da periodontite, pela perda de tecido conjuntivo e reabsorção severa do osso alveolar causados por eles, estando, portanto, mais presente em sítios profundos e com maiores sinais de doença. Entretanto, Dahlén et al. (1992) observaram que a bactéria Pg também se encontrava presente em sítios saudáveis e na língua, sugerindo que bolsas periodontais profundas não são pré-requisito para instalação deste patógeno. A bactéria Aa apresentou-se na presente pesquisa, assim como no estudo de Hamlet et al. (2001), um comportamento diferente dos outros patógenos, obtendo uma menor prevalência à medida em que se aumentava a profundidade de sondagem. Torrungruang et al. 2009, no entanto, observaram um aumento deste patógeno à medida que a profundidade de sondagem aumentava. Na população estudada observou-se que o patógeno Pg estava significativamente associado à presença de placa, ou seja, sítios que apresentavam placa supragengival visível.

(37) 36. tiveram maior chance de apresentar esta bactéria. Este dado é concordante do encontrado por Hamlet et al. (2001), que também observaram tal associação, além de pode ser explicado pela grande facilidade de adesão dessa bactéria, fato este relatados por Vesey e Kuramitsu (2004), Kuramitsu et al. (2005) os quais verificaram que bactéria Pg é a única que sozinha consegue formar in vitro biofilme em superfícies inertes. Por fim, ressalta-se a importância do presente estudo diante do reduzido número de pesquisas realizadas em populações brasileiras, especialmente localizadas no Nordeste do Brasil. Observou-se nesta população maior ocorrência do patógeno Pg, seguido do Tf, Td e Aa. Além disso, esta pesquisa visou promover um melhor entendimento das associações destes patógenos, principalmente as do complexo vermelho, pois estas estão fortemente ligadas ao diagnóstico e ao risco de desenvolver formas severas de periodontite (Mineoka et al. 2008), assim como, promover um melhor direcionamento para o desenvolvimento de novas estratégias para controle da doença periodontal (Klein e Gonçalves 2003). REFERÊNCIAS 1. American Academy of Periodontology. (1996). Consensus report on periodontal disease: pathogenesis and microbial factors. Ann Periodontol 67, 926-932. 2. Herrera, D., Contreras, A., Gamonal, J., Oteo, A., Jaramillo, A., Silva, N., Sanz, M., Botero, J.E. e León, R. (2007). Subgingival microbial profiles in chronic periodontitis patients from Chile, Colombia and Spain. J Clin Periodontol 35, 106113. 3. Socransky, S.S., Haffajee, A.D., Cugni, M.A., Smith, C. e Kent Jr., R.L. (1998). Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 25, 134-144..

(38) 37. 4. van Winkelhoff, A.J., Loos, B.G., van der Reijden, W.A. e van der Velden, U. (2002). Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus and other putative periodontal pathogens in subjects with and without periodontal destruction. J Clin Periodontol 29, 1023–1028. 5. Mineoka, T., Awano, S., Rikimaru, T., Kurata, H., Yoshida, A., Ansai, T. e Takehara, T. (2008). Site-specific development of periodontal disease is associated with increased levels of Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia in subgingival plaque. J Periodontol 79, 670-676. 6. Sakamoto, M., Takeuchi, Y., Umeda, M., Ishikawa, I. e Benno, Y. (2001). Rapid detection and quantification of five periodontopathic bacteria by real-time PCR. Microbiol Immunol 45, 39-44. 7. Mayanagi, G., Sato, T., Shimauchi, H. e Takahashi, N. (2004). Detection frequency of periodontitis-associated bacteria by polymerase chain reaction in subgingival and supragingival plaque of periodontitis and healthy subjects. Oral Microbiol Immunol 19, 379-385. 8. Atieh, A. (2008). Accuracy of real-time polymerase chain reaction versus anaerobic culture. in. detection. of. Aggregatibacter. actinomycetemcomitans. and. Porphyromonas gingivalis: a meta-analysis. J Periodontol 79, 1620-1629. 9. Morikawa, M., Chiba, T.,Tomil, N., Sato, S., Takahashi, Y., Konishi, K., Numabe, Y., Iwata, K. e Imai, K. (2008). Comparative analysis of putatite periodontopathic bacteria by multiplex polymerase chain reaction. J Periodont Res 43, 268-274. 10. Torrungruang, K., Bandhaya, P., Likittanasombat, K. e Grittayaphong, C. (2009). Relationship between the presence of certain bacterial pathogens and periodontal status of urban Thai adults. J Periodontol 80, 122-129..

(39) 38. 11. Wara-aswapati, N., Pitiphat, W., Chanchaimongkon, L., Taweechaisupapong, S., Boch, J.A e Ishikawa, I. (2009). Red bacterial complex is associated with the severity of chronic periodontitis in a Thai population. Oral diseases 15, 354-359. 12. Fenno, J.C., e McBride, B.C. (1998). Virulence factors of oral treponemes. Anaerobe 4, 117. 13. Holt, S.C., Kesavalu, L., Walker, S. e Genco, C.A. (1999). Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontology 2000 20, 168-238. 14. Sharma, A., Novak, E.K., Sojar, H.T., Swank, R.T., Kuramitsu, H.K. e Genco, R J. (2000). Porphyromonas gingivalis platelet aggregation activity: outer membrane vesicles are potent activators of murine platelets. Oral Microbiol Immunol 15, 3936. 15. Tanner, A.C. e Izard, J. (2006). Tannerella forsythia, a periodontal pathogen entering the genomic era. Periodontol 2000 42, 88-113. 16. Socransky, S.S. e Haffajee, A.D. (1999). Microbiologia do periodonto. In Tratado de Periodontia Clínica e Implantologia Oral 3ª ed. Lindhe J. pp. 105-147. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 17. Schacher, B., Baron, F., Roßberg, M., Wohlfeil, M., Arndt, R. e Eickholz, P. (2007). Aggregatibacter actinomycetemcomitans as indicator for aggressive periodontites by two analyzing strategies. J Clin Periodontol 34, 566-573. 18. van Dyke, T.E., Bartholomew, E., Genco, R.J., Slots, J. e Levine, M.J. (1982). Inhibition of neutrophil chemotaxis by soluble bacterial products. J Periodontol 53, 502-508..

(40) 39. 19. Dogan, B., Antinhelmo, J., Cetiner, D., Bodur, A., Emingil, G., Buduneli, E., Uygur, C., Firatli, E., Lakio, L. e Asikainen, S. (2003). Subgingival microflora in Turkish patients with periodontitis. J Periodontol 74, 803-814. 20. Cortelli, J.R., Cortelli, S.C., Jordan, S., Haraszthy, V.I. e Zambon, J.J. (2005). Prevalence of periodontal pathogens in Brazilians with aggressive or chronic periodontitis. J Clin Periodontol 32, 860-866. 21. Kim, T.S., Kang, N.W., Lee, S.B., Eickholz, P., Pretzl, B. e Kim, C.K. (2009). Differences in subgingival microflora of Korean and German periodontal patients. Arch Oral Biol 54, 223-229. 22. Victor, L.V., Cortelli, S.H., Aquino, D.R., Carvalho Filho, J. e Cortelli, J.R. (2008). Periodontal profile and presence of periodontal pathogens in young AfricanAmericans from Salvador, BA, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology 39, 226232. 23. Ainamo, J. e Bay, I. (1975). Problems and proposals for recording gingivitis and plaque. Int Dent J 25, 229-35. 24. American Academy of Periodontology. (2000). Parameter on chronic periodontitis with slight to moderate loss of periodontal support. J Periodontol 71, 853-855. 25. Leão, J.C., Hinrichsen, S.L., de Freitas, B.L. e Porter, S.R. (1999). Human herpes virus 8 and Kaposi's sarcoma. Rev Assoc Med Bras 45, 55-62. 26. Ashimoto, A., Chen, C., Bakker, I. e Slots, J. (1996). Polymerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions. Oral Microbiol Immunol 11, 266-273..

(41) 40. 27. Ávila-Campos, M.J. e Velásquez-Meléndez, G. (2002). Prevalence of putative periodontopathogens from periodontal pacients and healthy subjects in São Paulo, SP, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 44, 1-5. 28. Asai, Y., Jinno, T., Igarashi, H., Ohyama, Y. e Ogawa, T. (2002). Detection and quantification of oral treponemes in subgingival plaque by real-time PCR. J Clin Microbiol 40, 3334-3340. 29. Klein, M.I. e Gonçalves, R.B. (2003). Detection of Tannerella forsythensis (Bacteroides forsythus) and Porphyromonas gingivalis by polimerase chain reaction in subjects with different periodontal status. J Periodontol 74, 798-802. 30. Avila-Campos, M.J. (2003). PCR detection of four periodontopathogens from subgingival clinical samples. Brazilian Journal of Microbiology 34,81-84. 31. Kantorski, K.Z., Rodrigues, A.S., Zimmemann, G.S. e Lotufo, R.F.M. (2006). Ocurrence of Porphyromonas gingivalis in patients with periodontitis in Brazil. Ciênc Odontol Bras 9, 26-31. 32. Imbronito, A.V., Okuda, O.S., Freitas, N.M., Lotufo, R.F.M. e Nunes, F.D. (2008). Detection of herpes viruses and periodontal pathogens in subgingival plaque of patients with chronic periodontitis, generalized aggressive periodontitis, or gingivitis. J Periodontol 79, 2313-2321. 33. Kuramitsu, H.K., Chen, W. e Ikegami, A. (2005). Biofilm formation by the periodontopathic bactéria Treponema denticola and Porphyromonas gingivalis. J Periodontol 76, 2047-2051. 34. Yang, H.W., Huang, Y.F. e Chou, M.Y. (2004). Ocurrence of Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis in periodontally diseased and healthy subjects. J Periodontol 75, 1077-1083..

(42) 41. 35. Zambon, J.J. (1996). Periodontal disease: Microbial factors. Ann Periodontol 1, 879-925. 36. Dahlén, G., Manji,. F.,. Baelum, V. e Fejerskov, O.. (1992). Putatite. periodontopathogens in „diseased‟ and „non-diseased‟ persons exhibiting poor oral hygiene. J Clin Periodontol 19, 35-42. 37. Hamlet, S.M., Cullinan, M.P., Westerman, B., Lindeman, M., Bird, P.S., Palmer, J. e Seymour, G.J. (2001). Distribution of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia in an Australian population. J Clin Periodontol 28, 1163–1171. 38. Vesey, P.M. e Kuramitsu, H.K. (2004). Genetic analysis of Treponema denticola ATCC 35405 biofilm formation. Microbiology 150, 2401-2407. 39. Lafaurie, G.I., Contreras, A., Barón, A., Botero, J., Mayorga-Fayad, I., Jaramillo, A., Giraldo, A., González, F., Mantilla, S., Botero, A., Archila, L.H., Díaz, A., Chacón, T., Castillo, D.M., Betancourt, M., Del Rosario Aya, M. e Arce, R. (2007). Demographic, Clinical, and Microbial Aspects of Chronic and Aggressive Periodontitis in Colombia: A Multicenter Study. J Periodontol 78, 629-39. 40. Boutaga, K., van Winkelhoff, A.J., Vandenbroucke-Grauls, C.M.J.E., e Savelkoul, P.H.M. (2006). The additional value of real-time PCR in the quantitative detection of periodontal pathogens. J Clin Periodontol 33, 427-433. 41. Riggio, M.P., Macfariane, T.W., Mackenzie, D., Lennon, A., Smith, A.J. e Kinane, D. (1996). Comparison of polymerase chain reaction and culture methods for detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in subgingival plaque samples. J Periodont Res 31, 496-501..

(43) 42. TABELAS Tabela 1 – Distribuição dos pacientes analisados segundo os dados sócio-demográficos, econômicos, hábito do tabagismo e histórico da doença na família.. Variável. N. %. Faixa etária 30 a 40 41 a 50 51 ou mais. 13 12 4. 44,8 41,4 13,8. Sexo Masculino Feminino. 12 17. 41,4 58,6. Estado civil Solteiro Casado. 13 16. 44,8 55,2. Escolaridade Fundamental incompleto Fundamental completo/ Médio incompleto Médio completo/ Superior. 2 5 22. 6,9 17,2 75,9. Renda (salários) <1 1 2a3 >3. 5 5 14 5. 17,2 17,2 48,3 17,2. Hábito do tabagismo Nunca fumou Ex-fumante. 19 10. 65,5 34,5. Histórico da doença na família Sim Não Não sabe. 12 15 2. 41,4 51,7 6,9. 29. 100,0. TOTAL.

(44) 43. Tabela 2 – Avaliação do elemento dentário, placa, sangramento e profundidade de sondagem nos sítios.. Variável. N. %. Elemento dentário Anterior Posterior. 30 86. 25,9 74,1. Sangramento Positivo Negativo. 89 27. 76,7 23,3. Placa Positivo Negativo. 37 79. 31,9 68,1. Profundidade de sondagem (mm) 3 4a5 6a7 8. 3 39 44 30. 2,6 33,6 37,9 25,9. 116. 100,0. TOTAL.

(45) 44. Tabela 3 – Avaliação da ocorrência das bactérias nos sítios segundo o sexo e faixa etária dos pacientes pesquisados. Sexo · Aa. Faixa etária. Masculino. Feminino. N. n. %. %. Grupo Total N. Valor de p. % p(*) = 0,601. 30 a 40. 41 a 50. 51 ou mais. Grupo Total. N. %. N. %. N. %. N. %. 14. 26,9. 11. 22,9. 7. 43,8. 32. 27,6. 38. 73,1. 37. 77,1. 9. 56,3. 84. 72,4. 23. 44,2. 26. 54,2. 5. 31,3. 54. 46,6. 29. 55,8. 22. 45,8. 11. 68,8. 62. 53,4. 16. 30,8. 26. 54,2. 6. 37,5. 48. 41,4. 36. 69,2. 22. 45,8. 10. 62,5. 68. 58,6. 20. 38,5. 16. 33,3. 3. 18,8. 39. 33,6. Positivo. 12. 25. 20. 29,4. 32. 27,6. Negativo. 36. 75. 48. 70,6. 84. 72,4. Positivo. 19. 39,6. 35. 51,5. 54. 46,6. Negativo. 29. 60,4. 33. 48,5. 62. 53,4. Positivo. 20. 41,7. 28. 41,2. 48. 41,4. Negativo. 28. 58,3. 40. 58,8. 68. 58,6. Positivo. 16. 33,3. 23. 33,8. 39. 33,6. Negativo. 32. 66,7. 45. 66,2. 77. 66,4. 32. 61,5. 32. 66,7. 13. 81,3. 77. 66,4. TOTAL. 48. 100. 68. 100. 116. 100. 52. 100. 48. 100. 16. 100. 116. 100. Valor de p p(*) = 0,269. · Pg p(*) = 0,206. p(*) = 0,254. · Tf p(*) = 0,958. p(*) = 0,056. · Td. (*): Através do teste Qui-quadrado de Pearson.. p(*) = 0,956. p(*) = 0,344.

(46) 45. Tabela 4 – Avaliação das bactérias nos sítios segundo a presença de sangramento e placa. Sangramento Bactérias. Presente n %. Placa. Ausente N %. Grupo Total n %. Valor de p. Presente n %. Ausente N %. Grupo Total N %. Valor de p. · AA Positivo Negativo. 25 64. 28,1 71,9. 7 20. 26 74. 32 84. p(†) = 0,826. 28 72. 12 25. 32,4 67,6. 20 59. 25 75. 32 84. 28 72. p(†) = 0,424. · Pg Positivo Negativo. 42 47. 47,2 52,8. 12 15. 44 56. 54 62. p(†) = 0,802. 47 53. 24 13. 64,9 35,1. 30 49. 38 62. 54 62. 47 53. p(†) = 0,007*. · Tf Positivo Negativo. 37 52. 41,6 58,4. 11 16. 41 59. 48 68. 41 59. Positivo Negativo. 27 62. 30,3 69,7. 12 15. 44 56. 39 77. 34 66. TOTAL. 27. 100. 89. 100. 116. 100. p(†) = 0,939. 17 20. 45,9 54,1. 31 48. 39 61. 48 68. 41 59. 13 24. 35,1 64,9. 26 53. 33 67. 39 77. 34 66. 37. 100. 79. 100. 116. 100. p(†) = 0,494. · Td p(†) = 0,174. p(†) = 0,813. (*): Diferença significativa a 5,0%. (†): Através do teste Qui-quadrado de Pearson.. Tabela 5 – Avaliação das bactérias nos sítios segundo a profundidade de sondagem. Bactérias. 3. Profundidade de sondagem 4a5 6a7 n % N %. N. %. 8. Grupo Total N %. Valor de p. n. %. Aa Positivo Negativo. 1 2. 33,3 66,7. 8 31. 20,5 79,5. 13 31. 29,5 70,5. 10 20. 33,3 66,7. 32 84. 27,6 72,4. p(†) = 0,591. Pg Positivo Negativo. 1 2. 33,3 66,7. 9 30. 23,1 76,9. 21 23. 47,7 52,3. 23 7. 76,7 23,3. 54 62. 46,6 53,4. p(†) < 0,001*. Tf Positivo Negativo. 3. 100,0. 12 27. 30,8 69,2. 16 28. 36,4 63,6. 20 10. 66,7 33,3. 48 68. 41,4 58,6. p(†) = 0,005*. Td Positivo Negativo. 3. 100,0. 12 27. 30,8 69,2. 15 29. 34,1 65,9. 12 18. 40,0 60,0. 39 77. 33,6 66,4. p(†) = 0,660. 3. 100,0. 39. 100,0. 44. 100,0. 30. 100,0. 116. 100,0. TOTAL. (*): Diferença significativa a 5,0%. (†): Através do teste Exato de Fisher..

(47) 46. Tabela 6 – Avaliação da presença das bactérias isoladas ou associadas nos sítios segundo a profundidade de sondagem.. 3 mm N %. Profundidade de sondagem 4 a 5 mm 6 a 7 mm n % N %. n. Nenhuma Aa Pg Tf Td Aa + Pg Aa + Tf Aa + Td Pg + Tf Pg + Td Tf + Td Aa + Pg + Tf Aa + Pg + Td Aa + Tf + Td Pg + Tf + Td Aa + Pg + Tf + Td. 2 1 -. 66,7 33,3 -. 18 1 1 5 1 1 4 1 1 2 1 2 1 -. 46,2 2,6 2,6 12,8 2,6 2,6 10,3 2,6 2,6 5,1 2,6 5,1 2,6 -. 15 2 2 1 3 2 4 3 1 3 1 1 2 4. 34,1 4,5 4,5 2,3 6,8 4,5 9,1 6,8 2,3 6,8 2,3 2,3 4,5 9,1. 2 1 2 1 3 1 7 1 1 1 1 1 6 2. 6,7 3,3 6,7 3,3 10,0 3,3 23,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 20,0 6,7. 37 4 4 3 8 6 2 1 15 5 3 6 3 4 9 6. 31,9 3,4 3,4 2,6 6,9 5,2 1,7 0,9 12,9 4,3 2,6 5,2 2,6 3,4 7,8 5,2. TOTAL. 3. 100,0. 39. 100,0. 44. 100,0. 30. 100,0. 116. 100,0. Bactérias. 8 mm %. Grupo Total n %. Tabela 7 - Associações entre os patógenos analisados. Porphyromonas gingivalis ‡ § ( ) OR (IC 95%) P-value †. Pg. -. -. Tf Td Aa (*): Associação significativa a 5,0%. (†): Através do teste Qui-quadrado de Pearson. (‡): OR – Odds ratio (§): IC – Intervalo de confiança. Tannerella forsythia ‡. §. Treponema denticola ‡. §. Aggregatibacter actinomycetemcomitans ‡. §. OR (IC 95%). P-value(†). OR (IC 95%). P-value(†). OR (IC 95%). P-value(†). 8,33 (3,57-19,43). < 0,001*. 2,13 (0,97-4,67). 0,056. 2,95 (1,26-6,91). 0,011*. -. -. 2,54 (1,15-5,59). 0,019*. 2,31 (1,01-5,30). 0,045*. -. -. 1,84 (0,79-4,25). 0,154. -. -.

(48) 47. Tabela 8 - Artigos avaliados, população investigada, técnica utilizada e resultados apresentados para os patógenos analisados. Autores. População investigada. Técnica. SP- Brasil. Resultado Pg. Td. Tf. Aa. PCR. 78,0%. 60,0%. 82,0%. 90,0%. SP- Brasil. PCR. 78,0%. 82,0%. 90,0%. Klein e Gonçalves 2003. SP- Brasil. PCR. 40 a 90%. 70 a 100%. Cortelli et al. 2005. SP- Brasil. PCR. 68,0%. 45,5%. 41,6%. Kantorski et al. 2006. SP- Brasil. cultura. 17,8%. Imbronito et al. 2008. SP- Brasil. NESTED-PCR. 73,3%. 33,3%. 23,3%. Victor et al. 2008. BA - Brasil. PCR. 40,9%. Avila-Campos e Velásquez-Meléndez 2002 Ávila-Campos 2003. Chile Herrera et al. 2007. Espanha. cultura. Colômbia Lafaurie et al. 2007 Dogan et al. 2003 Kim et al. 2009. 45,5%. 8380,0%. 16,2%. 19,4%. 77,8%. 36,1%. 16,7%. 65,9%. 39,0%. 17,1%. 58,5%. 16,5%. Colômbia. PCR. 68,2%%. Turquia. PCR. 93,0%. Alemanha. 16sRNA-gene probe test. 81,8%. 95,5%. 95,5%. 47,7%. 81,1%. 81,8%. 88,9%. 26,7%. Coréia. 50,0%. van Winkelhoff et al. 2002. Holanda. cultura. 59,5%. 90,5%. 31,0%. Boutaga et al. 2006. Holanda. Q-PCR. 45,5%. 89,2%. 27,4%. Riggio et al. 1996. Escócia. PCR. 24,0%. Torrungruang et al. 2009;. Tailândia. PCR. 70,9%. Wara-aswapati et al. 2009. Tailândia. PCR. 95,0%. Japão. PCR. 29,1 a 62,8%. Australia. elisa. 27,6%. Japão. Q-PCR. Mineoka et al. 2008 Hamlet et al. 2001 Asai et al. 2002. 24,0% 80,0% 66 a 72,6%. 77,5%. 19,0%. 95,0% 41,6% a 60,8%. 35,0%. 1,3% 68,0%.

(49) 48. ILUSTRAÇÕES. Gráfico 1 – Avaliação da presença das bactérias nos sítios..

(50) 49. APÊNDICES.

(51) 50 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO NOME DA PESQUISA: Perfil microbiológico de pacientes com periodontite crônica. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Bruna de Carvalho Farias (Mestranda em Odontologia da UFPE). Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Recife – PE. CEP: 50670-901. Telefone para contato: 21268817 (Secretaria de Pós-graduação em Odontologia da UFPE). OBJETIVO: Verificar a presença ou não de bactérias consideradas periodontopatogênicas (causadores de doenças da gengiva e piorréia) nos pacientes diagnosticados com periodontite crônica da clínica de pósgraduação da Especialização em Periodontia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). METODOLOGIA: Serão avaliados o sangramento, profundidade de bolsa, perda de inserção através de um exame clínico e coleta de material da bolsa periodontal com pontas de papel, saliva e citologia esfoliativa da mucosa jugal. BENEFÍCIOS: Os participantes receberão orientações para tratar a doença periodontal presente e prevenir sua progressão, assim como serão encaminhados para tratamento na clínica de Especialização em Periodontia da UFPE. RISCOS: Ao paciente submetido à pesquisa, poderá ocorrer o risco de, durante o exame clínico, constrangimento, pequeno sangramento gengival, esses sintomas serão minimizados pela calibração e experiência do examinador. Eu,__________________________________________________,RG.Nº. ________________________ Abaixo assinado, tendo recebido as informações acima, e ciente dos meus direitos abaixo relacionados, concordo participar desta pesquisa, para o trabalho de mestrado em Clínica Integrada da UFPE, bem como autorizo toda a documentação necessária, a divulgação e a publicação da mesma, em periódicos científicos, na área de Odontologia. DIREITOS: 1. A garantia de receber respostas a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida a cerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros relacionados com a pesquisa; 2. A liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar no estudo sem que isso me traga prejuízo; 3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido caráter confidencial da informação relacionada com minha privacidade; 4. A disponibilidade de tratamento médico e a indenização que legalmente teria direito por parte da instrução à saúde, em casos de danos que a justifiquem, diretamente causados pela pesquisa; 5. O compromisso de proporcionar-me informação atualizada durante o estudo, ainda que este possa afetar a minha vontade de continuar participando; 6. Caso existirem gastos adicionais estes serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.. Tendo ciência do exposto acima, desejo participar da pesquisa. Recife, ____ de ________________ de ___________.. _______________________________________________________ Assinatura do paciente __________________________ Assinatura do Pesquisador. __________________________ Assinatura da Testemunha. _________________________ Assinatura da Testemunha.

(52) 51. FICHA CLÍNICA. N0___________. NOME: ____________________________________________________ SEXO: ( ) Masculino ( ) Feminino DATA:__________________ IDADE:______________ PROFISSÃO:_________________________________ ESTADO CIVIL:_______________ FONE: ____________CEL: _____________ RENDA (salários): _________________ HÁBITO DE FUMAR: ( ) Nunca fumou ( ) Ex-fumante: ________________________(anos que parou) ( ) Fumante: ___________________________(quantos por dia) DIAGNÓSTICO PERIODONTAL: a) Quanto à extensão: ( ) Periodontite crônica localizada ( ) Periodontite crônica generalizada b) Quanto à severidade: ( ) Periodontite crônica leve ( ) Periodontite crônica moderada ( ) Periodontite crônica severa ESCOLARIDADE: ( ) Não sabe ler ou escrever ( )1º grau incompleto ( ) 1º grau completo ( ) 2º grau incompleto ( ) 2º grau completo ( )Universidade incompleta ( )Universidade completa ( )Pós-graduação ( ) Não sei Há alguém na sua família que apresenta o mesmo problema que você? R - __________________________________________________________________ Presença das bactérias: Elemento: _________ Profundidade de sondagem: _______ Pg ( Aa ( Tf ( Td (. ) Presente ) Presente ) Presente ) Presente. ( ( ( (. ) Ausente ) Ausente ) Ausente ) Ausente.

(53) 52. Elemento: _________ Profundidade de sondagem: _______ Pg ( Aa ( Tf ( Td (. ) Presente ) Presente ) Presente ) Presente. ( ( ( (. ) Ausente ) Ausente ) Ausente ) Ausente. Elemento: _________ Profundidade de sondagem: _______ Pg ( Aa ( Tf ( Td (. ) Presente ) Presente ) Presente ) Presente. ( ( ( (. ) Ausente ) Ausente ) Ausente ) Ausente. Elemento: _________ Profundidade de sondagem: _______ Pg ( Aa ( Tf ( Td (. ) Presente ) Presente ) Presente ) Presente. ( ( ( (. ) Ausente ) Ausente ) Ausente ) Ausente.

(54) 53. FICHA PERIODONTAL PACIENTE: __________________________________________________________ DATA:_____________ Dente. Sondagem (mm) Vestibular Palatina D C M D C. M. D. Recessão Gengival (mm) Vestibular Palatina C M D C. Furca M. M. D. Mob P. 18 17 16 15 14 13 12 11 21 22 23 24 25 26 27 28 38 37 36 35 34 33 32 31 41 42 43 44 45 46 47 48. SANGRAMENTO: Faces______________________________ %________________________. 18. 17. 16. 15. 14. 13. 12. 11. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 48. 47. 46. 45. 44. 43. 42. 41. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. PLACA: Faces______________________________________%________________________. 18. 17. 16. 15. 14. 13. 12. 11. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 48. 47. 46. 45. 44. 43. 42. 41. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.

(55) 54. ANEXOS.

(56) 55. Journal of Applied Microbiology Including Letters in Applied Microbiology & Annual Symposium The Official Journals of the Society for Applied Microbiology Edited A. Gilmour. by:. Print ISSN: 1364-5072 Online ISSN: 1365-2672 Frequency: 12 issues a year (2 combined) Current Volume: 106 / 2009 ISI Journal Citation Reports® Ranking: 2008: 69/144 Biotechnology & Applied Microbiology; 51/91 Microbiology Impact Factor: 2.028. TopAuthor Guidelines Did you know... Journal of Applied Microbiology has no page charges? Please note that these author guidelines have been updated recently. It is recommended that all authors check the guidelines thoroughly even if they have previously submitted an article to this journal. ...Quick Links... Manuscript submission: http://mc.manuscriptcentral.com/appliedmicrobiology Editorial Office: jam@wiley.com Production Office: jam-proofs@wiley.com Electronic Graphics: http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp Exclusive Licence form: http://www.blackwellpublishing.com/pdf/jam_caf.pdf Colourwork Agreement form: http://www.blackwellpublishing.com/pdf/SN_Sub2000_F_CoW.pdf.

(57) 56. The preparation and presentation of manuscripts Manuscripts should be drafted as concisely as possible. As space in the Journal is at a premium, the Editors always reserve the right to require authors to reduce the length of their manuscripts. Manuscripts will not be reviewed unless the English is of a publishable standard. By submission of a manuscript to the journal, all authors warrant that they have the authority to publish the material and that the paper, or one substantially the same, has neither been published previously, nor is being considered for publication elsewhere. Submissions may be subject to testing for textual similarity via plagiarism detection software or related applications. Format of papers Manuscripts should be prepared using a word-processor. Text must be double-spaced, and the right hand margin justification should be switched off. Similarly, artificial word breaks at the end of lines must be avoided. A margin of at least 2.5 cm should be left around the text. The pages of the manuscript must be numbered consecutively. Do not use the carriage return (enter) at the end of lines within a paragraph. Turn the hyphenation option off. The first page should show: (a) the title; (b) name(s) of author(s) and place(s) where the work was done; (c) an abbreviated running headline not exceeding 35 letters and spaces; (d) the name, complete mailing address, email address, telephone and fax numbers of the author to whom all correspondence should be addressed and who will check the proofs. Authors may be advised that short papers not exceeding four published pages would be better placed in Letters in Applied Microbiology. Submissions Authors are invited to suggest at least three reviewers. It is not appropriate for reviewers to be members or former members of the authors' organization(s), or to have been associated with them. Conversely, authors may identify, with appropriate justification, reviewers or institutions that they would prefer were not approached. Authors are advised that Editors reserve the right to select reviewers of their choice. Authors are advised to submit their manuscripts online at http://mc.manuscriptcentral.com/appliedmicrobiology . If you experience difficulties submitting your manuscript online you should first contact the Managing Editor jam@wiley.com. A helpline for technical support is accessible on the online submission site. Save your complete manuscript as a Word document (.doc) or Rich Text Format (.rtf) file. The file will be converted to a PDF when uploaded. All original files that you upload will be available and can be accessed by the Editorial Office if necessary. 1. Full-length papers The paper should have as its aim the development of concepts as well as the recording of facts. The manuscript should be prepared for a wide readership. As far as possible the paper should present the results of a substantial programme of research. Sequential publication of numbered papers will not be permitted. The paper will have the following sections: (a) ABSTRACT: A brief summary of about 150-200 words, should give the major findings of the investigation under the following headings: Aims; Methods and Results; Conclusions; Significance and Impact of Study. A list of between five and eight keywords.

(58) 57. should be added; (b) INTRODUCTION: A balance must be struck between the pure and applied aspects of the subject; (c) MATERIALS AND METHODS: Ensure that the work can be repeated according to the details provided. By submission of a manuscript, the authors consent that biological material, including plasmids, viruses and microbial strains, unobtainable from national collections will be made available to members of the scientific community for noncommercial purposes subject to national and international regulations governing the supply of biological material. In the case of a new diagnostic PCR, you should consider the need for an internal amplification control (JAM 2004 96(2):221; available at http://www.blackwell-synergy.com/links/doi/10.1046/j.1365-2672.2003.02188.x/full ); (d) RESULTS: Well-prepared tables and figures must be a cardinal feature of the 'Results' section because they convey the major observations to readers who scan a paper. Information provided in tables and figures should not be repeated in the text, but focus attention on the importance of the principal findings of the study. In general, journal papers will contain between one and seven figures and tables; (e) DISCUSSION: This must not recapitulate the results and authors must avoid the temptation of preparing a combined 'Results and Discussion' section; (f) ACKNOWLEDGEMENTS; and (g) REFERENCES: Citation of references having three or more names should be cited in the text as Jones et al. (1992) at the first and subsequent times of quoting the reference unless this causes confusion, e.g. Jones, Brown and Green (1992) and Jones, Green and Smith (1992) would have to be quoted in full. A series of references should be given in ascending date order (Green and Smith 1946; Jones et al. 1956). Different publications having the same author(s) and year will be distinguished by, for example, 1992a, 1992b. This also applies to the Bibliography. Papers or other publications having no obvious author(s) should usually be cited as 'Anon.' with the year in the text and bibliography. References to papers not freely available to the public without charge are not acceptable. Web sites should be quoted in the text with an access date. Layout of references The Harvard system should be used. Names with the prefixes de, do van, von, etc. will be placed in alphabetical order of the first letter of the prefix, e.g. von Braun would appear under 'V'. Where italics are intended, words must either be typed in roman and underlined or printed in italics from a word processor. Abbreviate journal titles according to Index Medicus (http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/terms_cond.html). The following is an example of order and style to be used in the manuscript: Laverick, M.A., Wyn-Jones, A.P. and Carter, M.J. (2004) Quantitative RT-PCR for the enumeration of noroviruses (Norwalk-like viruses) in water and sewage. Lett Appl Microbiol 39, 127-135. Garner, J.S. and Favero, M.S. (1985) Guidelines for Handwashing and Hospital Environment Control. US Public Health Service, Centers for Disease Control HHS No. 99117. Washington DC: Government Printing Office. Fricker, C.R. (1995) Detection of Cryptosporidium and Giardia in water. In Protozoan Parasites in Water ed. Betts, W.B., Casemore, D., Fricker, C.R., Smith, H.V. and Watkins, J. pp.91-96. London: The Royal Society of Chemistry. Personal communications should be cited in the text with initials and family name of all.

(59) 58. individuals. English usage Numbers in text: one to nine in full; 10 and above as numerals. Use 'z' spelling where possible, except analyse, dialyse, hydrolyse, etc.; sulfur, sulfate, etc. Headings The hierarchy of the headings used is: First Order MATERIALS AND METHODS Second Order Sample preparation Third Order The media First paragraph runs on; second and subsequent paragraphs indented. Abbreviations and units The Journal uses SI units: g l-1 not g/l; d, h, min, s (time units) but week and year in full; mol l-1 (not M or N); probability is P; centrifugation conditions relative to gravity (g). Please refer to the Biochemical Journal 'Instructions to Authors' www.biochemj.org/bj/bji2a.htm. Microbial nomenclature The Latin binomial name of micro-organisms, plants and animals (other than farm animals) must be given at first mention in the text; thereafter the generic name will be abbreviated in such a way that confusion is avoided when dealing with several genera all beginning with the same letter, viz. Pseudomonas, Proteus, Pediococcus, etc. (see list of abbreviations below). Subspecies are italized (Corynebacterium diphtheriae subsp. mitis); groups and types are printed in Roman and designated by capital letters or Arabic figures (e.g. Staphylococcus aureus group A). Common names will not have an initial capital letter nor will they be underlined in the manuscript, viz. pseudomonad, salmonellas. The specific name will be given in full in the captions to tables and figures. Major ranks are written in Roman with an initial capital (e.g. Enterobacteriaceae) . Here is a list of abbreviations currently in use for common generic names: Acet., Acetobacter; Ac., Acinetobacter; Act., Actinomyces; Aer., Aeromonas; Ag., Agrobacterium; Alc., Alcaligenes; Alt., Alteromonas; B., Bacillus; Bact., Bacteroides; Bord., Bordetella; Bran., Branhamella; Br., Brucella; Camp., Campylobacter; Cit., Citrobacter; Cl., Clostridium; Coryne., Corynebacterium; Cyt., Cytophaga; Des., Desulfomonas or Desulfovibrio (spell out if both appear in same paper); Edw., Edwardsiella; Ent., Enterobacter or Enterococcus (spell out if both appear in same paper); Erw., Erwinia; E., Escherichia; Eu., Eubacterium; Fl., Flavobacterium; Fus., Fusobacterium; G., Gemella; H., Haemophilus; Kl., Klebsiella; Lact., Lactobacillus; L., Lactococcus; Leg., Legionella; Leuc., Leuconostoc; L., Listeria;.

(60) 59. Meth., Methanobacterium or Methanococcus (spell out if both appear in same paper); Mic., Microbacterium; M., Micrococcus; Mor., Moraxella; Myco., Mycobacterium; Myc., Mycoplasma; N., Neisseria; Nit., Nitrobacter or Nitrosomonas (spell out if both appear in same paper); Noc., Nocardia; Past., Pasteurella; Ped., Pediococcus; Ple., Plesiomonas; Pr., Proteus; Ps., Pseudomonas; Rh., Rhizobium; R., Ruminococcus; Salm., Salmonella; Ser., Serratia; Sh., Shigella; Staph., Staphylococcus; Strep., Streptococcus; S., Streptomyces; T., Thiobacillus; V., Vibrio; X., Xanthomonas; Y., Yersinia. For plant pathogenic bacteria, authors may need to refer to the list of pathovars compiled by the International Society for Plant Pathology: Young, J.M., Bull, C.T., De Boer, S.H., Firrao, G., Gardan, L., Saddler, G.E., Stead, D.E. and Takikawa, Y. Names of Plant Pathogenic Bacteria Published Since 1995. Report of the Taxonomy of Bacterial Plant Pathogens Committee of the International Society of Plant Pathology. Available at http://www.isppweb.org/names_bacterial_new2004.asp In this, many species names not included in the Approved Lists (www-sv.cict.fr/bacterio) are reduced to the rank of pathovar so that the original names are retained in a trinomial form. Where the pathovar name is cited it may subsequently be abbreviated as follows: Pseudomonas syringae pv. phaseolicola becomes P. s. phaseolicola. Reference to the two lists avoids the need for citing past authors who named or renamed pathogens but, for completeness or clarity, synonyms suggested by more recent work may have to be considered.The nomenclature used when describing the species of salmonella should accord with the system proposed by Le Minor and Popoff (http://www.bacterio.cict.fr/). Specifically, at the first citation of a serotype the genus name is given followed by the word "serotype" and then the serotype name. Names of serotypes should be in Roman type with the first letter capitalised (for example Salmonella serotype Typhimurium). Subsequently the name should be written with the genus (abbreviated) followed directly by the serotype name (for example Salm. Typhimurium). Nucleotide sequences (1) Nucleotide sequence data should be deposited in the EMBL/GenBank/DDBJ Nucleotide Sequence Data Libraries and the accession number referenced in the manuscript; (2) Sequence data should only be included if they are new (unpublished), complete (no unidentified nucleotides included) and if the sequence information itself provides important new biological insights of direct relevance to the question addressed in the manuscript. Generally sequences should not be submitted if the same gene has been reported in another species unless a comparison with related sequences contributes important new information; (3) Presentation of nucleotide sequences should include clear indications of nucleotide numbers and points of interest, e.g. promoter sequences, ribosome binding sites, mutations, insertions, probe sequences, etc. In the case of comparisons, nucleotides which differ between the sequences should be readily visible to the reader, e.g. by the use of bold face, shading, boxing or by the use of a dash to represent identical nucleotides. The font size used in the manuscript should facilitate appropriate reduction of the figure..