UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LOUYSE VIZOTTO CARVALHO MOURA LEAL
EXPRESSÃO PROTEICA DE HMGA2 E PLAG1 NA PROGRESSÃO DO ADENOMA PLEOMORFICO PARA CARCINOMA EX ADENOMA
PLEOMORFO
CAMPINAS 2019
LOUYSE VIZOTTO CARVALHO MOURA LEAL
EXPRESSÃO PROTEICA DE HMGA2 E PLAG1 NA PROGRESSÃO DO ADENOMA PLEOMORFICO PARA CARCINOMA EX ADENOMA PLEOMORFO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de concentração de Anatomia Patológica.
ORIENTADORA: FERNANDA VIVIANE MARIANO BRUM CORRÊA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNALOUYSE VIZOTTO MOURA, E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. FERNANDA VIVIANE MARIANO BRUM CORRÊA
CAMPINAS 2019
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO LOUYSE VIZOTTO CARVALHO MOURA LEAL
ORIENTADOR: DRA. FERNANDA VIVIANE MARIANO BRUM CORRÊA
MEMBROS:
1. PROF. DR. FERNANDA VIVIANE MARIANO BRUM CORRÊA
2. PROF. DR. ROGERIO DE OLIVEIRA GONDAK
3. PROF. DR. ERIKA SAID ABU EGAL
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, na área de Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
DEDICATÓRIA
À minha filha Anna Clara, ao meu marido e aos meus pais. Família, a razão do meu esforço.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus que me capacitou para chegar até aqui, dando-me recursos, oportunidades e pessoas para dando-me ajudar e contribuir nesta jornada.
Aos meus pais Walter Carvalho e Lucy Vizotto pelo incentivo e amor incondicional. À minha querida filha Anna Clara por entender minha ausência e ainda sim me dar sem reservas esse amor tão puro e inocente que me manteve forte. Ao meu marido Matheus Moura, que apesar das dificuldades continuou ao meu lado sendo meu porto seguro.Eu amo muito vocês!
À diretoria desta Universidade, ao departamento de Anatomia Patológica e à equipe do laboratório de IHQ- (Claudinha e Arethuza).
Ao CNPq processos 2015/07304-0 e 2017/00831-0, pelo auxílio financeiro fornecido durante esse curso.
Aos meus amigos e familiares pelas orações, recursos que muitas vezes foram necessários, e positividade.
A todos, minha gratidão, e meucompromisso de retribuir-lhes trabalhando em prol da construção do conhecimento, fundamental para a dignidade humana.
RESUMO
Adenoma Pleomorfo (AP), neoplasia benigna mais comum das glândulas salivares, além de sofrer recorrências após remoção cirúrgica,pode sofrer transformação maligna parao Carcinoma Ex-Adenoma Pleomorfo(CXAP). O CXAP, por sua vez, apesar de raro,cursa frequentemente com metástases e óbitos. Neste estudo, por meio de reações de imunohistoquímica, analisamos a expressão das proteínas PLAG1 e HMGA2 em 38 casos de AP, 36 casos de AP Recorrentes e 41 casos de CXAP, levando em consideração o subtipo histológico e grau de progressão tumoral dos mesmos. Dos casos de APanalisados, 34 foram positivos para PLAG1 enquanto apenas 9mostraram positividade para HMGA2. Em APRecorrentes, 34 casos foram positivos para PLAG1 enquanto apenas 8 apresentaram positividade para HMGA2. Quanto aos casos de CXAP, 12 foram positivos para PLAG1 e 20 para o HMGA2.Foi encontrada significativa associação de PLAG1 com AP e houve perda da sua expressão à medida que ocorria a transformação e progressão maligna. Além disso, PLAG1 esteve mais expresso em tumores de baixo grau e com diferenciação mioepitelial. O contrário foi observado com o marcador HMGA2, onde observou-se uma maior associação com a neoplasia malignae maior prevalência de sua expressão em tumores de alto grau (Adenocarcinomas NOS e Carcinomas de Ducto Salivar). Diante de tudo isso, sugere-se que estes marcadores são promissores no que diz respeito a agressividade tumoral e possíveis terapias-alvo.
ABSTRACT
Pleomorphic adenoma (AP) is the most common benign neoplasia of the salivary glands that besides recurrence after surgical removal, may undergo malignant transformation to the Pleomorphic Ex-Adenoma Carcinoma (CXPA). CXPA, on the other hand, although rare, frequently develops metastases and death. In this study, the expression of PLAG1 and HMGA2 proteins in 38 cases of AP, 36 cases of AP Recurrent and 41 cases of CXPA, were analyzed. It was taken into consideration the histological subtype and degree of tumor progression. Of the cases of PA analyzed, 34 were positive for PLAG1 while only 9 showed positivity for HMGA2. In Recurrent AP, 34 cases were positive for PLAG1 while only 8 were positive for HMGA2. As for CXPA cases, 12 were PLAG1 positive and 20 were HMGA2 positive. Significant association of PLAG1 with AP was found and its expression was lost as transformation and malignant progression occurred. In addition, PLAG1 was more expressed in low grade tumors with myoepithelial differentiation. The opposite was observed with HMGA2 marker, where a greater association with the malignant neoplasia and a greater prevalence of its expression in high-grade tumors (Adenocarcinomas NOS and Salivary Duct Carcinomas) were observed. Our results suggested that these markers are promising with regard to tumor aggressiveness and possible target therapies.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...11
2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Adenoma Pleomorfo...12
2.2 Adenoma Pleomorfo Recorrente...13
2.3 Carcinoma Ex Adenoma Pleomorfo...13
2.4 Patogênese de AP e CXAP...15
2.5 PLAG1...17
2.6HMGA2...19
3. OBJETIVOS...20
4. METODOLOGIA...21
4.1 Seleção dosgrupos de estudo...21
4.2 Critérios de Inclusão...21
4.3 Avaliação dos prontuários médicos...21
4.4 Estudo e classificação histopatológica dos casos...22
4.5 Reações de PLAG1 e HMGA2...22
4.6 Avaliação das reações de Imunoistoquímica...23
4.6.1 Escala semi-qualitativa...23
4.6.2 Intensidade da marcação...23
4.6.3 Tipo de célula marcada...23
5. RESULTADOS...24
5.1 Adenomas Pleomorfos...24
5.2 Expressão do PLAG1 em Adenomas Pleomorfos...26
5.3 Expressão de HMGA2 em Adenomas Pleomorfos...29
5.4 Adenomas Pleomorfos Recorrentes...31
5.5 Expressão do PLAG1 em Adenomas Pleomorfos Recorrentes...32
5.6 Expressão de HMGA2 em Adenomas Pleomorfos Recorrentes...33
5.7 Carcinomas Ex-Adenomas Pleomorfos...34
5.8 Expressão do PLAG1 em Carcinomas Ex-AdenomasPleomorfos...38
5.9 Expressão de HMGA2 em Carcinomas Ex-AdenomasPleomorfos...41
5.10 Expressão do PLAG1 e HMGA2 durante a progressão tumoral...43
5.11 Expressão de HMGA2 e PLAG1 em CXAP segundo o subtipo histológico...45
5.12 Expressão simultânea do PLAG1 e HMGA2 em AP, AP recorrentes e
CXAP...46
5.13 Tipo celular marcado pelos anticorpos...48
5.14 Expressão de HMGA2 de acordo com a fase de progressão tumoral maligna...50
6. DISCUSSÃO...51
7. CONCLUSÃO...57
REFERÊNCIAS...59
1 – INTRODUÇÃO
O adenoma pleomorfo (AP) é a neoplasia salivar benigna mais comum, correspondendo a cerca de 60% de todas as neoplasias deste sítio anatômico. Embora a maioria dos casos sejam removidos cirurgicamente por meio de ressecção radical, recorrências podem ocorrer mesmo após várias décadas. Além disso,em alguns casos, o AP pode sofrer transformação maligna e originar o Carcinoma Ex Adenoma Pleomorfo (CXAP), que apesar de relativamente raro, apresenta curso clínico agressivo, cursando com metástases e óbito (1).
Ao longo do tempo, estudos para caracterização tumoral têm sido realizados para identificar as alterações citogenéticas envolvendo AP e CXAP. Forte correlação tem sido descrita entre as duas neoplasias e osproto-oncogenesHMGA2(high mobilitygroupprotein gene) 2 e PLAG1(Pleomorphic adenoma gene 1), cuja ativação está relacionada ao controle do ciclo celular por meio da regulação em cadeia de outros genes alvos relacionados ao surgimento destas neoplasias(2,3).
Diante destas considerações, o objetivo deste estudo foi analisar a expressão das proteínas HMGA2 e PLAG1 em grupos de AP, AP Recorrente e CXAP (divididos quanto ao subtipo histológico e grau de invasão) por meio de reação de imunohistoquímica. A análise da expressão de tais proteínas nestes grupos tumoraisauxiliará acompreensão da patogênese destas neoplasias que constituem um interessante modelo para o estudo da transformação maligna. Além disto, como a detecção morfológica de transformação carcinomatosa precoce no AP pode ser desafiadora, o estudo da expressão de marcadores auxiliares é de fundamental importância para o diagnóstico destes casos, melhorando o tratamento e contribuindo para um melhor prognóstico destes pacientes.
2 – REVISÃO DE LITERATURA 2.1 - Adenoma Pleomorfo
O AP é um tumor benigno de glândulas salivares, caracterizado como neoplasia mista por possuir histogênese relacionada tanto as células epiteliais quanto as mioepiteliais.Representa 45% a 75% de todos os tumores de glândulas salivares e sua incidência anual é de 2 a 3,5 casos a cada 100.000 indivíduos (1). O AP é também o tumor benigno mais comum em crianças e adolescentes (4).
Dados epidemiológicos revelam maior predileção de APpelo sexo feminino (relação de 2:1). O seu surgimentoocorre entre a terceira e quinta década de vida (média de 43 anos de idade) (5).AP desenvolvem-se preferencialmente nas glândulas salivares maiores, tendo como local de maior ocorrência aglândula parótida (84%), seguido pela glândula submandibular (8%)e glândulas salivares menores (mucosa jugal,lábio superior e inferior, e língua) (6,5%) (1)
Clinicamente,o AP cursa com crescimento lento e assintomático, apresentando nódulos discretos que podem se tornar massas grandes caso não sejam tratados(6).Histologicamente, apresentam variação nos padrões morfológicos e arquiteturais, com crescimento de uma dupla população celular que possui diferenciação epitelial e mesenquimal. A proporção entre estes dois grupos celulares é variável, não sendo incomum que outros componentes (tecido ósseo, condroide, adiposo e mixoide) façam parte do espectro da neoplasia(7,8).
O tratamento dos APé cirúrgico,sendo a parotidectomia superficial a abordagem terapêutica mais comum. O prognóstico é favorável, com cerca de 95% dos casos apresentando completa resolução(7,1).
2.2 – Adenoma Pleomorfo Recorrente
AP, apesar de benignos e passíveis de tratamento cirúrgico, podem sofrer recorrências (8). As recorrências ocorrem em 0,4% a 5% dos casos tratados, e segundo a literatura, esta variação depende da técnica cirúrgica utilizada, sendo as intervenções mais conservadores aquelascom maior taxa de recidiva. Além disso, as recorrências dependem da violação da cápsula tumoral (9).
Histologicamente, a maioria dos casos de AP recorrentesapresentam-se como múltiplos nódulos, com estroma mais proeminente eausência de cápsula fibrosa (7,10 ).
Embora benignos e de crescimento lento, estão associados com omaior risco de paralisia do nervo facial e de malignização. O tratamento inclui cirurgias mais abrangentes do que aquelas para o tumor primário e incluem uma porção de tecido adiposo periparotídeo (11). Nestes casos, oacompanhamento do paciente é mandatório (10).
A transformação malignade AP ou AP recorrentes, emborarara, leva ao desenvolvimento do CXAP, tumor agressivo com patogênese obscura e prognóstico sombrio. A probabilidade de malignização aumenta com o tempo de duração da doença, coma existência de recidivas, com o tamanho do tumor e com a ausência de tratamento adequado(12).
2.3 – Carcinoma Ex-Adenoma Pleomorfo
CXAP, com sua variante benigna, apresenta celularidade mista. Embora raro,apresenta prevalência próxima de 5,6 a cada 100.000casos de tumores malignos. Constituem aproximadamente 3,6% de todas as neoplasias salivares e 11,6% de todos tumores salivares malignos (13). Normalmente, CXAPcursam com frequentes metástases e mortes relacionadas à doença (14).
Manifesta-se geralmente na 6ª e 7ª décadas de vida,frequentemente afetando a glândula parótida, mas surgindo também nasglândulas submandibulares, nas glândulas salivares menores, particularmente naquelas localizadas no palato (15), mas tambémnas sublinguais, lacrimais, mamárias, traqueia e cavidade nasal (16).
O curso clínico do CXAP é variável, com uma amplitude de evolução que pode envolver de meses até décadas (média de 9 anos). Clinicamente nota-se um aumento de volume relacionado à área acometida, primeiramente assintomático, mas que logo evolui com sintomatologia e aumento de tamanho.Algesia e ulcerações relacionadas ao tumor são raramente relatadas (17,13).
CXAP pode ser classificado levando em consideração dois critérios: ahistologia tumoral e o grau de invasividade em relação á capsula.O primeiro critério leva em consideração a composição celular e características anatomo-patológicas do tumor (18). Dentre os subtipos histológicos encontrados estão o Carcinoma de Ducto Salivar, Carcinoma Mioepitelial, Adenocarcinoma NOS, entre outros. Além disso, o grau de invasividade em relação à cápsulaclassifica o tumor como Intracapsular, Minimamente Invasivo e Francamente invasivo (19). Os subtipos intracapsular e minimamente invasivo
são ditos de baixo grau, enquanto o francamente invasivoé referido como uma neoplasia de alto grau.Este último frequentemente resulta em metástases, recidivas e morte (15).
O tratamento para CXAP deve ser cirúrgico, utilizando abordagens mais radicais com margens de segurança, principalmente para o subtipo francamente invasivo, pois isso minimiza os riscos de recidiva (20). A necessidade de esvaziamento cervical ocorrerá nos tumores com metástase regional detectada clinicamente. O uso de radioterapia complementar ao procedimento cirúrgico é indicadoem tumores de alto grau ouquando as margens cirúrgicas estiverem comprometidas ou ainda quandohouver invasão de vasos sanguíneos, linfáticos ou nervos (13). A combinação de radioterapia e quimioterapia é indicada para pacientes com a doença disseminada (17).
As recorrências mudam o prognóstico dos pacientes, pois uma vez que ocorrem, resultam em uma média de sobrevida de um ano após o diagnóstico. As recidivas podem ser locais ou regionais e ocorrem em 23% e 18% respectivamente (21).
2.4 Patogênese de AP e CXAP
O mecanismo de patogênese do AP ainda não foi totalmente elucidado, mas grande avanço tem sido alcançado nos últimos anos.Estudos citogenéticos indicam que 70% deles possuem rearranjos recorrentes em seu material genético (22, 23), os quais podem ser agrupadosda seguinte maneira: I. rearranjos envolvendo 8q12 em 50-60% dos casos; II.rearranjos envolvendo 12q13-15 em 10-15% dos casos; III.tumores com alterações esporádicas, não envolvendo 8q12 ou 12q13 em 15-23% dos casos; IV.Tumores com cariótipos anormais apresentando trissomias, cromossomos dicêntricos, cromossomos em anéis ou em pequenos fragmentos de DNA extracromossomal (double minute) em 20-30% dos casos (7,21, 24).
Quando as translocações envolvem a região 8q12, o gene alvo das alterações é o
PLAG1, um proto-oncogene regulado por dedo de zinco. Os rearranjos comumente
resultam em troca ou substituição da região promotora do PLAG1 por um gene parceiro ubiquitinado, levando à suasuper expressão. Os principais parceiros de fusão observados são CTNNB1-PLAG1 e LIFR-PLAG1 (7, 25).
O gene alvo em AP com rearranjos de 12q14-15 é o HMGA2. Dois principais parceiros de fusão deHMGA2encontrados são: HMGA2-NFIBe HMGA2-FHIT (26,27). O evento crítico para a ativação de HMGA2 parece ser a separação dos seus domínios
ligantes ao DNA, levando a desregulação da expressão da oncoproteína HMGA2. Altos níveis de expressão de HMGA2 têm sido sugeridos comoimportantes eventos na tumorigênese de AP e sua malignização(2).
Figura 1. Principais genes relacionados ao PLAG1 e HMGA2. Imagem modificada de: Röijer E et al., 2002.
Quanto à transformação maligna do AP, a patogênese ainda é pobremente entendida e algumas alterações genéticas já foram descritas. A transformação AP-CXAP foi associada a distúrbios relacionados ao cariótipo das células tumorais, rearranjos específicos em seu material genéticoe a perda progressiva de heterozigosidade (LOH) nos braços cromossômicos 8q, 12q e 17p (28).
Um trabalho prévio de Poetsch, em 2005, sugeriu que a LOH associada a 12q teria um potencial de transformação maligna, diferentemente do mesmo processo relacionado a 8q. Por outro lado, quando as alterações envolvem 17p estariam associadas a alterações tardias de CXAP (29). Além disso, recentes análises desenvolvidas por nosso grupo de estudo mostraram importantes alterações envolvendo o cromossomo 8 desde a tumorigênese do AP até sua progressão para CXAP francamente invasivo (2) e alterações no número de cópias envolvendo o cromossomo 12 em casos iniciais de CXAP, que foram mantidas em CXAP francamente invasivos. Este último trabalho demonstrou ainda que alterações do número de cópias dos cromossomos 1, 5 e 6 são adicionadas no estágio mais tardio da carcinogênese (2).
Um estudo de Katabi e colaboradores, em 2015, encontrou positividade para rearranjos ou amplificações do PLAG1 ou HMGA2 em 86% dos casos de CXAP analisados. Resultado parecido foi encontrado por Bahami e colaboradores em 2013, que
ao estudar os mesmos genes em carcinomas de ducto salivar encontrou rearranjos ou amplificações em todos os casos que se tratavam de CXAP(30, 31)
2.5 – PLAG1
O gene PLAG1 é um oncogene localizado em 8q12 e pertence à família de fatores de transcrição PLAG, reconhecida atualmente por sua relação na tumorigênese do AP. O gene PLAG1 foi descoberto em estudos com o próprio AP (32, 33), mas posteriormente foi associado também a outros tipos de neoplasias como lipoblastoma, hepatoblastoma e mielo-leucemia aguda. Este gene está envolvido com a proliferação celular através do controle de vários genes alvo (34).Em tecidos normais, sua atividade é elevada durante o desenvolvimento embrionário e fetal, embora na vida adulta sua participação seja baixa ou ausente. Sua expressão é controlada por mecanismos moleculares complexos, como translocações ou controle translacional mediado por micro-RNA’s. (35, 36).
Uma das causas que levam o PLAG1 a induzir neoplasias são translocações que envolvem sua região promotora. No caso de AP, as trocas ocorrem com CTNNB1, LIFR e o fator SII (33). Estas translocações mantêm preservadas as regiões de codificação das proteínas deste gene. A capacidade tumorigênica doPLAG1 foi confirmada em estudos utilizando ratos, onde a sua superexpressão levou ao desenvolvimento tumoral nestes animais(37).
Como fator de transcrição, o PLAG1 altera a taxa de transcrição de alguns genes alvos, como acontece com o promotor P3, que com a ativação peloPLAG1, aumenta a atividade do fator de crescimento IGF2 (38), que é fundamental para o crescimento embrionário normal. O IGF2, por sua vez, também é fortemente expresso em AP com superexpressão doPLAG1, mas indetectável em glândulas salivares normais ou na ausência de expressão do PLAG1 (39). No entanto, vale ressaltar, que esta capacidade do PLAG1 em estimular o IGF2 ligando-se ao promotor P3 é restrita ao tipo celular.
OPLAG1 é um marcador diagnóstico para AP já consagrado pela literatura. Um estudo de Brito e colaboradores, em 2016, revelou uma alta expressão do PLAG1 em 92,5% das amostras de AP estudadas. Além disso, parece haver uma modulação da expressão doPLAG1 de acordo com o tipo celular: células mioepiteliais tendem a mostrar um alto nível de expressão doPLAG1 (40) e a proteína codificada pelo gene tende a estar super expressa tanto em AP quanto em AP recorrentes (35, 41).
A carcinogênese é um mecanismo biológico complexo que envolve a progressão de alterações em níveis genéticos e celulares. Diversas vias de sinalização biológica são envolvidas, e alterações em muitos genes são requeridas para transformar uma célula normal em uma célula cancerígena. Há perda da expressão do PLAG1 em AP durante a transformação maligna para CXAP. A expressão proteica deste gene está associada a tumores em fase inicial e casos de baixo grau de malignidade (41).
2.5 – HMGA2
HMGA2, previamente chamado de HMGIC, pertence à família dos genes de alta
mobilidade AT-hook 2. É um gene que produz uma proteína com função de fator de transcrição arquitetural, modulando a conformação tridimensional do DNA e consequentemente modulando a expressão de diversos genes (15, 32, 42,43, 44).
A expressão do HMGA2resulta na produção de uma proteína que leva o mesmo nome e é restrita aos tecidos embrionários. Nos tecidos adultos ela é encontrada em baixos níveis nos pulmões, rins, células TCD4 e glândulas salivares (22). Por outro lado, também está relacionado ao AP de glândulas salivares, mas pode ser encontrado em uma variedade de outros tumores mesenquimais benignos, como lipoma, leiomioma uterino, harmatoma de mamas e pulmão, fibroadenoma de mama, angiomixoma, pólipos endometriais e condromas. (21, 22).
As fusões de HMGA2 encontradas em AP são característicase não foram encontradas em nenhum dos tumores acima citados. Sua expressão resulta na síntese de proteínas envolvidas na sinalização de fatores de crescimento, regulação do ciclo celular e manutenção da estabilidade genética (45). Seus parceiros de fusão em APsão principalmente: NFIB, FHIT e WIF1.Tais fusões de maneira geral resultam na perda da região de interação let-7, responsável pela regulação negativa da expressão deste gene, e a consequência é a superexpressão do HMGA2 e dos seus genes alvos, notavelmente os genes reguladores do ciclo celular CCNA1 e CCNB2. (43). Além disso, em uma parcela de APe CXAP, o HMGA2 está amplificado junto com MDM2 e outros genes da região 12q14-15 (46, 47).
Portanto, diante de todos estes desequilíbrios genéticos citados acima e diante da influência que exercem na tumorigênese e transformação maligna do AP, o objetivo deste trabalho foi analisar a expressão imunohistoquímica das proteínas PLAG1 e HMGA2 em
um grupo de AP, AP recorrente e CXAP e também avaliar o papel destas proteínas na transformação maligna do AP e progressão do CXAP.
3 – OBJETIVOS 3.1 – Objetivo primário
O objetivo desse estudo foi analisar a expressão imunoistoquímica da proteína HMGA2 e PLAG1 em AP, AP recorrentes e CXAP. O estudo com a proteína PLAG1 já havia sido realizado em outro trabalho da equipe, portanto, fizemos a análise pelo HMGA2 e correlacionamos os dados. O grupo de CXAP foi composto por tumores em diferentes fases da carcinogênese (intracapsular, minimamente invasivo e francamente invasivo) e subdivididos quanto ao tipo histológicos (carcinoma epitelial,carcinoma mioepitelial, epitelial-mioepitelial, do ducto salivar, de grandes células eadenocarcinoma NOS).
3.2 – Objetivos secundários
• Analisar a expressão do PLAG1 em AP e AP recorrente. • Avaliar a expressão do PLAG1 em CXAP.
• Avaliar a expressão do PLAG1 entre os diferentes subtipos histopatológicos e as diferentes fases de progressão maligna do CXAP.
• Analisar a expressão do HMGA2 em AP e AP recorrente. • Avaliar a expressão do HMGA2 em CXAP.
• Avaliar a expressão do HMGA2 entre os diferentes subtipos histopatológicos e as diferentes fases de progressão maligna do CXAP.
• Comparar a expressão do PLAG1 e HMGA2 em AP e CXAP na tentativa de elucidar o processo de malignização.
4 – METODOLOGIA
4.1 – Seleção dos grupos de estudo
Analisou-se os registros histopatológicos dos anos de 1990 a 2014, do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da UNICAMP, de todos os casos de AP, AP recorrente e CXAP tratados pela mesma instituição. Foram encontrados 79, 37 e 55 casos, respectivamente.Após revisão e análise, foram aplicados critérios de inclusão e exclusão e foi obtida uma amostra final de 38 casos de AP, 36 casos de AP recorrente e 41 casos de CXAP.Além disso, foram acrescentados à casuística casos originários de outros serviços.
4.2 – Critérios de inclusão
Foram incluídos no estudo casos que possuíam tecido emblocado em parafina em boa quantidade e que não apresentavam sinais de degradação.
4.3 – Avaliação dos prontuários médicos
Foram confeccionadas duas fichas padronizadas para o estudo (Anexo I e II)para coleta das informações de todos os casos, sendo uma para o AP e outra para o CXAP.
4.4 – Estudo e classificação histopatológica dos casos
A confirmação do diagnóstico dos APe CXAP foi feita a partir de cortes histopatológicos de fragmentos do tumor incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina (H&E). Todos os casos de CXAP foram analisados para classificação histopatológica de acordo comOrganização Mundial de Saúde (World Health Organization Classificationof Tumors, 2017) e foi realizada uma subclassificação segundo o grau de invasão capsular:
- Intracapsular ou Não invasivo (in situ); - Minimamente invasivo;
- Francamente invasivo.
4.5 – Reações de imunoistoquímicapara PLAG1 e HMGA2
A reação de imunoistoquímicapara detecção da proteína PLAG1 foi feita com o anticorpo primário PLAG1 usando o clone mab (2-99) e marcaAbnova, Walnut, CA,
USA. Para detecção da proteína HMGA2 as reações foram realizadas utilizando o anticorpo primário HMGA2 (Sigma-Aldrich).
Nos blocos selecionados de cada caso foram feitas secções de 3 μm de espessura e o material colocado em lâminas tratadas com solução de organosilano a 4% em acetona (3-aminopropil-trietoxi-silano, SIGMA código A3648). A seguir, as lâminas foram colocadas em estufa a 110 ºC por uma hora, antes do início da reação.
A desparafinização foi feita com três banhos de xilol e hidratação em dois banhos de álcool absoluto. Posteriormente, as lâminas foram banhadas em álcool nas concentrações decrescentes de 80% e 50% e depois lavadas em água corrente seguida de água destilada.
O bloqueio da peroxidase endógena foi feito através de três banhos de imersão (3 minutos cada) em solução de peróxido de hidrogênio (H202) a 10%, à temperatura ambiente, seguidos de lavagem em água corrente e passagem por água destilada. Para PLAG1, a recuperação antigênica foi realizada com citrato e o anticorpo primário foi diluído a 1:50 para uso e para as reações de HMGA2 a diluição foi de 1:500. A solução diluente para os anticorpos foi o DAKO e a reação nos cortes foi deixada overnight.
A detecção do anticorpo primário foi efetuada utilizando-se o Sistema EnVision Plus (Dako). A solução foi gotejada sobre os cortes histológicos que permaneceram, durante uma hora, em câmara úmida a 37 ºC. Após, as lâminas foram submersas em solução salina tampão (PBS), à temperatura ambiente.
A coloração foi realizada utilizando o DAB (3,3-tetra-hidrocloreto de diaminobenzidina, SIGMA, código D5637) por 5 minutos à 37 ºC. A seguir, as lâminas foram submetidas novamente à lavagem em água corrente e passagem por água destilada.
4.6 –Avaliação dos resultados da reação de imunoistoquímica
Foi realizada uma calibração da análise para padronização da coleta de dados.Os resultados foram catalogados em tabelas. A positividade dos marcadores foi evidenciada pela coloração marrom. Foram consideradas como marcação positiva do PLAG1, apenas a coloração nuclear, e para HMGA2 a coloraçãonuclear e citoplasmática. A reação foi analisada segundo três parâmetros:
• Escala semi-quantitativa:
- 0: coloração ausente ou positividade <10% das células examinadas; - 1: positividade ≥ 10% e < 50% das células examinadas – positivo focal; - 2: positividade ≥ 50% das células examinadas – positivo difusa.
• Intensidade da marcação: - +: Fraco/moderado; - ++: Forte.
• Tipo de célula marcada: - Epitelial;
- Mioepitelial;
5 – RESULTADOS 5.1 –Adenoma Pleomorfo
Após revisão de cada caso, respeitando sua ampla variabilidade histológica, foi realizada a descrição clínico-patológica individual dos casos e análise de parâmetros clínicos dos APque estão detalhados na Tabela 01.Outra, com mais detalhes, segue em anexo ao final desta dissertação (Anexo III).Foram utilizados para o estudo 38 pacientes que tiveram AP. A idade variou de 17 a 76 anos, com média de 33,4 anos, sendo 31 (81,6%) com 50 anos ou menos e 4 (10,5%) maior ou igual a 51 anos. Dos casos em que constava a informação de gênero, 21 (55,3%) eram femininos e 14 (36,8%) eram masculinos.
O tempo de queixa foi avaliado em 31 pacientes, variando de 1 a 180 meses, com média de 40.9 meses. O tipo de queixa foi avaliado em todos os pacientes e em 37 (97,3%) relatou-se presença de nódulo e 1 (2,6%) queixou-se de cefaleia e zumbido.
Em relação ao local do tumor, 22 (57,9%) localiza-se em parótida, 5 (13,2%) em glândula submandibular e 8 (21,1%) em glândula salivar menor. Dos casos avaliados, 34 (89,5%) estão vivos sem doença e 4 (10%) foram perdidos de vista. Em todos os casos o tratamento foi cirúrgico, sendo em 21 (51,2%) realizado parotidectomia superficial, 1 (2,6%) parotidectomia subtotal, 6 (15,8%) ressecção, 5 (13,2%) submandibulectomia, 1 (2,6%) exérese de tumor parafaríngeo e 1 (2,6%) maxilectomia parcial.
Tabela 01. Parâmetros clínicos dos casos de AP.
Variável Categoria Total (%)
Gênero Feminino 21 (55,3%)
Masculino
Informação não avaliada
14 (36,8%) 3 (7,9%)
Idade (anos) ≤ 50 31 (81,6%)
≥ 51 4 (10,5%)
Informação não avaliada Média
3 (7,9%) 33,4
Recidiva Sim 0
Não
Informação não avaliada
35 (92,1%) 3 (7,9%)
Local Parótida 22 (57,9%)
Submandibular 5 (13,2%)
Glândula salivar menor 8 (21,1%)
Situação atual
Informação não avaliada
Vivo sem doença Morto pela doença Morto por outras causas Informação não avaliada
3 (7,9%)
34 (89,5%) 0
0 4 (10%)
5.2 – Expressão do PLAG1 em AP
Em relação a reação de imunoistoquímica com PLAG1 nos casos de AP, houve positividade em 34 casos (89,5%), sendo >50% de células positivas em 28 casos (73,7%) e 6 casos (15,8%) entre 10% e 50% de células positivas. De todos, 4 casos (10,5%) foram negativos (Fig.2).O tipo de célula marcada em 32 casos (78%) foram tanto as células epiteliais quanto as mioepiteliais, 1 caso (2.6%) foi positivo apenas nas mioepiteliais e 1 (2.6%) caso marcou somente as epiteliais. Os resultados das reações de imunohistoquímica com PLAG1 estão descritos na Tabela 02.
Fig. 2–A,C-AdenomaPleomorfo mostrando morfologia convencional com estruturas ductais com bicamada celular (H&E x20). B, D-Expressão positiva do PLAG1 na bicamada celular das estruturas ductais (x20).
Tabela 2. Positividade do PLAG1 em AP
5.3 – Expressão de HMGA2 em AP
Em relação a reação de imunohistoquímica com HMGA2 nos casos de AP, houve positividade em 9 casos (23,68%), sendo>50% de células positivas em 6 casos (15,78%) e 3 casos (7,89%) com positividade entre 10% e 50% de células. De todos,29 casos(76,31%) foram negativos. Além disso, a dupla população celular marcada (epitelial e mioepitelial)foi positiva em todos os casos (Fig. 3).Os resultados das reações de imunohistoquímica com HMGA2 estão descritos na Tabela 03.
No.
célulaspositivas (> 50%)
No. célulaspositivas (>10% a 50%)
No. célulasnegativas Total
Fig. 3- Expressão de HMGA2 em AP: A- Intensa expressão em alguns casos de AP (x5). B- AP mixoide com áreas mioepiteliais mostrando expressão de HMGA2 em alguns casos (x10). C- Células epiteliais e mioepiteliais mostrando reatividade em alguns casos (x10). D- A maioria dos casos de AP não reagiram ao anticorpo (x20).
Tabela 3. Positividade de HMGA2 em AP
5.4 – Adenoma PleomorfoRecorrente
A análise dos parâmetros clínicos e resultados das reações de imunohistoquímica dos APrecorrentes estão detalhados naTabela 4.Foram utilizados para o estudo 36 pacientes que tiveram AP recorrentes. A idade variou de 18 a 78 anos, com média de 44,4 anos, sendo 19 (53%) com 50 anos ou menos e 9 (25%) maior ou igual a 51 anos. Dos
No.
célulaspositivas (> 50%)
No. célulaspositivas (>10% a 50%)
No. célulasnegativas Total
casos em que constava a informação de gênero, 14 (39%) eram femininos e 17 (47%) eram masculinos.
O tempo de queixa foi avaliado em 25 pacientes, variando de 4 a 216 meses, com média de 38.6 meses. O tipo de queixa foi avaliado em 27 pacientes e 27 (75%) relataram presença de nódulo, 6 (16,7%) relataram dor e 1 (2,8%) queixou-se de otalgia.Em relação ao local do tumor, 26 (72%) localizavam-se em parótida e 1 (3%) em submandibular. Dos casos avaliados, 27 (75%) estão vivos sem doença. Nos casos que continham informação quanto ao tratamento, em 100% das vezes foi utilizada abordagem cirúrgica, sendo em 3 casos (8,3%) a técnica de ressecção empregada, 18 (50%) parotidectomia superficial, 1 (3%) parotidectomia subtotal e 5 (14%) parotidectomia total.
Tabela 4. Parâmetros clínicos dos 36 casos de AP Recorrente
Variável Categoria Total (%)
Gênero Feminino 14 (39%)
Masculino
Informação não avaliada
17 (47%) 5 (14%)
Idade (anos) ≤ 50 19 (53%)
≥ 51 9 (25%)
Média
Informação não avaliada
44.4 8 (22%)
Local Parótida 26 (72%)
Submandibular 1 (3%)
Informação não avaliada 9 (25%)
Situação atual Vivo sem doença
Informação não avaliada
27 (75%) 9 (25%)
5.5 – Expressão do PLAG1 em AP recorrentes
Em relação aos resultados de imunohistoquímica com PLAG1, houve positividade em 34 casos (94%), sendo a positividade >50% em 28 casos (78%) e 6 casos (17%) com positividade entre 10% e 50%. De todos, 2 casos (6%) foram negativos. Observamos expressão PLAG1 em ambos tipos de células, mioepiteliais e epiteliais(Tabela 5).
Tabela 5. Positividade do PLAG1 em AP Recorrente
5.6 – Expressão de HMGA2 em AP recorrentes
Em relação aos resultados de imunohistoquímica com HMGA2 nos casos de AP recorrentes, houve positividade em 8 casos (22,22%), sendo>50% de células positivas em 7 casos (19,44%) e 1 caso (2,77%) com positividade entre 10% e 50%. De todos, 28 casos (77,77%) foram negativos. Dos casos positivos, 6 (75%) casos tiveram a marcação nas células epiteliais e mioepiteliais e 2 (25%) marcaram apenas as células mioepiteliais(Tabela 6).
Tabela 6. Positividade de HMGA2 em AP Recorrente No.
célulaspositivas (> 50%)
No. célulaspositivas (>10% a 50%)
No. célulasnegativas Total
AP Recorrentes 28 (78%) 6 (17%) 2 (6%) 36 No. célulaspositivas (> 50%) No. célulaspositivas (>10% a 50%)
No. célulasnegativas Total
5.7 – Carcinoma Ex-adenoma Pleomorfo
A descrição clinicopatológica de cada caso, análise de parâmetros clínicos e correlação dos casos com o subtipo histológico dos CXAP estão detalhados nas Tabelas 07 e 08respectivamente.
Foram utilizados para estudo 41 pacientes que tiveram CXAP. A idade variou de 27 a 86 anos, com média de 56,4 anos, sendo 58,5% maior ou igual a 51 anos e 31,7% com idade menor ou igual a 50 anos. Destes pacientes, 18 (43,9%) eram do gênero feminino e 20 (48,8%) eram do gênero masculino.
O tempo de queixa foi avaliado em 29 pacientes, variando de 3 semanas a 360 meses, com média de 103,2 meses. O tipo de queixa foi avaliado em 37 pacientes, e em 35 (85,4%) houve relato de tumor ação, 2 (4,9%) tiveram dor, 2 pacientes (4,9%) com tumor localizado em glândula lacrimal tinham queixa de proptose, 1 (2,4%) relatou perda auditiva, zumbido, tontura, 1 (2,4%) relatou dificuldade para movimentar face, 1 (2,4%) teve alteração salivar e 1 (2,4%) queixou-se de desvio de rima e paralisia facial.
O local do tumor em 28 casos (68,3) era em parótida, 4 (9,8%) em submandibular, 4 (9,8%) em glândula salivar menor e 3 (7,32%) em glândula lacrimal. Segundo o histórico da doença, em 34 casos (82,9%) eram tumor pela primeira vez e 5 (12,2%) eram recidiva de AP primário. Em relação ao tratamento, 10 pacientes (24,3%) foram submetidos a cirurgia e radioterapia e 27 (65,9%) fizeram apenas cirurgia.
Segundo a extensão do tumor, 2 (4,9%) apresentaram tumor com 2 cm ou menos em suas maiores dimensões, 8 (19,5%) apresentaram tumor maior que 2 e menor que 4 cm, 11 (26,8%) apresentaram tumor maior que 4cm e 4 (9,8%) apresentaram tumor invadindo a pele, mandíbula, canal auditivo ou nervo facial. Dos casos avaliados, 16 (39%) pacientes não possuíam essa informação.
Em relação ao estadiamento, 11 (26,8%) foram classificados como III, 4 (9,8%) como IV, 4 (9,8%) como estadiamento II e 2 (4,9%) como I. Vinte casos (48,8%) não possuíam esta informação.
O subtipo histológico mais prevalente foi carcinoma de ducto salivar em13 pacientes (31,7%), seguido do adenocarcinoma NOS em 8 (19,5%), carcinoma epitelial-mioepitelial em 7 (17%), carcinoma epitelial-mioepitelial em 7 (17%), adenocarcinoma de alto grau em 2 (4,8%) e 1 (2,4%) caso de cada um dos seguintes subtipos: carcinoma mioepitelial com metaplasia escamosa e carcinoma indiferenciado de grandes células.
Em nosso estudo, 8 casos (19,5%) foram classificados como intracapsulares, 9 (21,9%) como minimamente invasivos e 24 (58%) como francamente invasivos. Recorrências foram observadas em 8 pacientes (19,5%).
Segundo a situação atual dos pacientes, 13 (31,7%) estão vivos sem doença, 4 (9,8%) morreram pela doença, sendo desses, 1 caso de carcinoma epitelial-mioepitelial, 1 caso de carcinoma mioepitelial, 1 de carcinoma indiferenciado de grandes células e 1 de adenocarcinomaNOS todos classificados como francamente invasivos. Quatro (9,8%) morreram por outras causas, 3 (7,3%) perderam o acompanhamento
Tabela 07. Parâmetros clínicos dos casos de CXAP.
Variável Categoria Total (%)
Gênero Feminino 18 (43.9%)
Masculino
Informação não avaliada
20 (48.8%) 3 (7.3%)
Idade (anos) ≤ 50 13 (31.7%)
≥ 51 24 (58.5%)
Informação não avaliada Média
4 (9.8%) 56.4
Histórico da Doença Primeiro tumor 34 (82.9%)
Recidiva de AP primário Informação não avaliada
5 (12.2%) 2 (4.9%)
Local Parótida 28 (68.3%)
Submandibular 4 (9.8%)
Glândula salivar menor 4 (9.8%)
Glândula lacrimal 3 (7.32%)
Informação não avaliada 2 (4.9%)
Extensão do tumor T1 2 (4.9%)
T2 8 (19.5%)
T3 17 (38.8%)
T4 9 (20%)
Informação não avaliada 5 (9,8%)
Estadiamento I e II 6 (15%)
III 11 (26.8%)
IV 4 (9.8%)
Tabela 08. Correlação dos casos de CXAP com o subtipo histológico.
Variável Categoria
Subtipo Histológico
Total
CDS CEME CM CMME CIGC NOS AA
G CEC Localização Parótida 10 5 4 0 1 6 1 1 28 Submandibular 3 0 1 0 0 0 0 0 4 Gl. Menor 0 1 2 0 0 1 0 0 4 Gl. Lacrimal 0 1 0 1 0 0 1 0 3 Tamanho T1 0 1 0 0 0 1 0 0 2 T2 1 1 3 0 0 2 1 0 8 T3 4 2 2 0 1 2 0 0 11 T4 2 0 1 0 0 1 0 0 4 Estadiamento I 0 1 0 0 0 1 0 0 2 II 0 1 2 0 0 1 0 0 4 III 5 3 1 0 0 2 0 0 11 IV 1 0 2 0 0 1 0 0 4 Não avaliado 7 3 1 1 1 3 2 1 19 Tipo IC 3 1 1 0 0 1 1 0 7 MI 4 2 1 0 0 2 0 0 9 FI 6 4 5 1 1 4 1 1 23 Recorrência Sim 1 2 1 0 1 1 1 1 8 Não 5 3 3 1 0 5 1 0 18
Situação Vivo sem doença 3 1 3 1 0 3 2 0 13
Atual Vivo com doença 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Morto pela doença 0 1 1 0 1 1 0 0 4
Morto outra causa 2 1 0 0 0 1 0 0 4
5.8 – Expressão de PLAG 1 em CXAP’s:
Em relação a reação de IHQ do PLAG1 nos casos de CXAP, houve positividade em 12 casos (29.3%), sendo >50% de células positivas em 7 casos (17%) e entre 10 e 50% de células positivas em 5 casos (12.2%). Vinte e nove casos (70.7%) foram negativos. Quando havia positividade, a célula marcada era mioepitelial em 9 casos (22%), epitelial em 2 (4.9%) e epitelial e mioepitelial em 1 caso (2.4%). Em relação aos AP Residuais, houve positividade em 17 casos (77.3%), sendo >50% de células positivas em 12 casos (54.5%) e entre 10% e 50% de células positivas em 5 casos (22.7%). Cinco casos (22.7%) foram negativos. Nos casos onde houve positividade o tipo celular marcado foi miopitelial em 11 casos (50%), e em 6 (27.3%) as duas populações celulares foram marcadas.As Fig.4 e 5ilustram a expressão do PLAG1 segundo o grau de invasão: intracapsular e minimamente invasivo.
Fig. 4 - CXAP tipo carcinoma mioepitelial intracapsular:A-Adenomapleomorfo residual apresentando proliferação de células mioepiteliais e ductais (H&E x20). B-Expressão positiva do PLAG1 nas duas populações celulares contidas no adenoma pleomorfo residual (x20). C-Proliferação de células mioepiteliais malignas, caracterizando a região carcinomatosa do CXAP (H&E x20). D-Células mioepiteliais malignas mostrando negatividade para PLAG1 (x20).
Fig. 5- CXAP tipo carcinoma mioepitelial minimamente invasivo: A-Invasão das células mioepiteliais à cápsula (H&E x10). B, C-Ninhos de células malignas mioepiteliais envolvidas por estroma hialinizado em menor e maior aumento (H&E x10 x20). D-Marcação positiva das células mioepiteliais para PLAG1 (x20).
5.9 – Expressão de HMGA2 em CXAP
Em relação a reação de IHQ com HMGA2 nos casos de CXAP, houve positividade em 20 casos (48,78%), sendo >50% de células positivas em 14 casos (34,14%) e entre 10% e 50% de células positivas 6 casos (14,63%). De todos, 21 casos (51,21%) foram negativos. Quando havia positividade, a célula marcada era mioepitelial em 7 casos (17,07%), epitelial em 10 (24.39%) e epitelial e mioepitelial em 3 (7,31%). Em relação aos AP residuais, foram encontrados 27 casos com presença residual do tumor primário (65,85%), dos quais 10 casos (37,03%) apresentaram positividade da reação, sendo >50% de células positivas em 6 casos (22,22%) e 4 (9,75%) com positividade entre 10% e 50%. Dezessete casos (62,96%) foram negativos. Quando havia marcação, o tipo celular marcado observado foi o epitelial em 1 (10%) caso, a marcação na célula mioepitelial foi observada em 7 (70%) casos, e marcação na dupla população em 2 (20%) casos (Fig. 6 e 7)
Fig. 6. Expressão de HMGA2 em CXAP: A, B- Adenocarcinoma NOS, francamente invasivo, mostrando expressão apenas no núcleo de células mioepiteliais (x5, x10). C, D- Carcinoma de ducto salivar, francamente invasivo mostrando positividade no citoplasma de células epiteliais (x10, x20).
Fig. 7. Expressão de HMGA2 em CXAP: A, B- CXAP epitelial-mioepitelial, francamente invasivo mostrando positividade apenas no núcleo das células mioepiteliais (x10). C, D- CXAP indiferenciado de grandes células mostrando positividade apenas no núcleo de células mioepiteliais(x10, x20).
5.10 – Expressão do PLAG1 e HMGA2 durante a progressão tumoral.
A positividade na marcação da proteína PLAG1 nas reações de IHQ, teve uma redução percentual simultânea à progressão tumoral. Sendo que em APobservamos uma positividade de 89,47% similar à observada em AP recorrentes(94%). Este percentual sofreu uma redução significativa quando o mesmo marcador foi analisado em uma fase tumoral mais avançada representada pelo CXAP, apresentando 29,26% de positividade apenas. Opondo-se a esta correlação, a proteína HMGA2 apresentou aumento percentual de positividade à reação de IHQ concomitante à progressão tumoral,aumentando de 23,68% em APe 21,05% em AP recorrentes para 48,78% em CXAP (Gráficos 1 e 2).
Gráfico 1.
Porcentagem de positividade de marcação dos genes PLAG1 e HMGA2 segundo progressão tumoral. A cor vermelha corresponde ao PLAG1 enquanto a azul ao HMGA2.
Gráfico 2.
Expressão de HMGA2 em laranja e do PLAG1 em azul conforme o estágio tumoral.
5.11 – Expressão de HMGA2 e PLAG1 em CXAP segundo subtipo histológico.
0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% 100,00% AP APR CXAP
Expressão segundo progressão tumoral
A expressão das proteínas estudadas foi verificada levando em consideração o subtipo histológicodos casos de CXAP. Para a proteína PLAG1 foram positivos 14,28% dos CDs, 100% dos CEC, 66,66% dos CEME, 0% dos CGIC, 55,55% dos CM e 0% dos AdenocarcinomasNOS, enquanto para a proteína HMGA2 50% dos CDs foram positivos, 100% dos CEC, 33,33% dos CEME, 100% dos CIGC, 22,22% dos CMe 70% dos AdenocarcinomasNOS (Gráfico 3).
Gráfico 3.
Porcentagem equivalente a positividade da expressão do PLAG1 em azul e HMGA2 em vermelho, em CXAP, segundo subtipo histológico classificado do tumor. CDS- Carcinoma de Ducto Salivar, CEC- Carcinoma Epitelial, CEME- Carcinoma Epitelial Mioepitelial, CIGC- Carcinoma Indiferenciado de Células Gigantes, CM- Carcinoma Mioepitelial e NOS- Sem outra especificação.
5.12 – Expressão simultânea de HMGA2 e PLAG1 em AP, AP recorrentes e CXAP
A expressão simultânea das proteínas HMGA2 e PLAG1 em CXAPfoi encontrada em 4 casos. Em AP a expressão do PLAG1 e HMGA2 concomitantemente foi encontrada em 8 casos,e em AP recorrentes 7 casos foram positivos para ambos os marcadores imunoistoquímicos.(Gráfico 4, 5 e 6).
Gráfico 4.Correlação entre a expressão do PLAG1 e HMGA2 em CXAP.
Diagrama de Venn correlacionando proporcionalmente os casos positivos para HMGA2 e PLAG1 em CXAP, e a intersecção na qual os casos são positivos para ambos.
Gráfico 5.Correlação entre a expressão do PLAG1 e HMGA2 em AP.
PLAG1
(12 casos)
HMGA2
(20 casos)
4 casos
Diagrama de Venn correlacionando a quantidade de casos positivos apenas para PLAG1 (26), apenas para HMGA2 (1) e a intersecção de ambos (8) em AP.
Gráfico 6.Correlação entre a expressão do PLAG1 e HMGA2 em APR.
Diagrama de Venn correlacionando a quantidade de casos positivos apenas para PLAG1 (27), apenas para HMGA2 (1) e a intersecção de ambos (7) em APR.
O tipo celular marcado pela reação de IHQ também foi avaliado.Dos casos de CXAP, para o marcador PLAG1, as células epiteliais foram as únicas positivas em 8,33% dos casos,em 58,34% dos casos apenas as células mioepiteliais foram marcadas, e em 16,67% dos casos houve positividade na dupla população celular, mioepitelial e epitelial.
Para o anticorpo HMGA2, ainda nos casos de CXAP,25% dos casos positivos tiveram apenas as células epiteliais marcadas, 10% dos casos tiveram tanto as células epiteliais quanto as mioepiteliais marcadas, e 35% dos casos positivos tiveram apenas as células mioepiteliais marcadas (Gráfico 7).
Gráfico 7.
Gráfico demonstrando em azul os casos que expressaram PLAG1 segundo o tipo celular e em laranja os casos que expressaram HMGA2 por tipo celular. Ept/Mioept- Célula epitelial e mioepitelial em CXAP.
Dos casos de AP recorrentes, 100% dos casos positivos para PLAG1, tiveram tanto as células epiteliais quanto as mioepiteliais marcadas, enquanto dos positivos para HMGA2, 75% marcaram as células epiteliais e mioepiteliais enquanto 25% marcaram apenas as Mioepiteliais (Gráfico 8).
0 10 20 30 40 50 60 70
Epitelial Ept/Mioept Mioepitelial
Tipo Celular Marcado em CXAP
Gráfico 8.
Gráfico demonstrando em azul os casos que expressaram PLAG1 segundo o tipo celular e em laranja os casos que expressaram HMGA2 por tipo celular. Ept/Mioept- Célula epitelial e mioepitelial em AP recorrentes.
Dos casos de AP, 100% dos casos positivos para HMGA2 tiveram tanto as células epiteliais quanto mioepiteliais marcadas, enquanto nos positivos para PLAG1, 2,94% dos casos tiveram apenas para as células epiteliais marcadas. Em 91,17% dos casos tanto as epiteliais quanto as mioepiteliais estavam marcadas e 5,88% dos casos positivos apenas as células mioepiteliais foram positivas. (Gráfico 9).
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Epitelial Ept/Mioept Mioepitelial
Tipo celular marcado em APRECs
Gráfico 9.
Gráfico demonstrando em azul os casos que expressaram PLAG1 segundo o tipo celular e em laranja os casos que expressaram HMGA2 por tipo celular. Ept/Mioept- Célula epitelial e mioepitelial em AP.
5.14 Expressão de HMGA2 de acordo com a fase de progressão tumoral maligna.
Em relação ao grau de progressão tumoral, os casos de CXAP foram classificados em Intracapsulares, Minimamente Invasivos e Francamente Invasivo, tendo como referência o nível de invasividade em relação à capsula tumoral.Segundo este critério, 3 casos (37,50%) de CXAP intracapsular apresentaram positividade, aumentando para 7 casos(77,78%) positivos quando o CXAP era classificado como minimamente invasivo, e 10 casos (41,67%) positivos de CXAP francamente invasivo.(Gráfico 10).
Gráfico 10.
Análise em porcentagem da expressividade positiva de HMGA2 de acordo com a progressão tumoral. IC: intracapsular, MI: minimamente invasivo e FI francamente invasivo.
6 – DISCUSSÃO
Em nosso estudo avaliamos 38 casos de AP, 36 casos de AP recorrentes e 41 casos de CXAP. A literatura mostra que 53 a 77% dos APe AP recorrentes ocorremem glândula parótida epara CXAP, a variabilidade está entre 64 a 80% (48), valores próximos aos encontradosem nosso estudo, sendo 57,9% para os tumores benignos estudados e 68,3% para malignos. Outros locais de ocorrência deAP em nossa casuística foram a glândula salivar menor (21,1%) e a glândula submandibular (13,2%). Entretanto, mesmo que discreta, a superioridade da incidência em glândula salivar menor em relação a submandibular não está em consonância com a descrição literária prévia, onde há maior prevalência em submandibular, seguida pela glândula salivar menor. Nos CXAP houve igual prevalência em submandibular e glândula salivar menor (9,8%), em concordância com estudos consagrados na literatura (15).
Descritores prévios destas neoplasias afirmam que há uma leve predileção pelo sexo feminino, tanto em AP como em CXAP (48). Em nosso estudo, encontramos em AP leve predileção pelo sexo feminino (55,3%), enquanto para CXAP houve uma discreta predileção pelo sexo masculino (48,8%).
Em relação àmédia de idade, AP atingem adultos jovens entre 30 a 50 anos e CXAP costumam atingir pacientes entre 60 a 80 anos(48). Encontramos em AP uma média de 33,4 anos, sendo 31 (81,6%) com 50 anos ou menos. Em CXAP encontramos média de 56,4 anos, sendo 24 (58,5%) maior ou igual a 51 anos.
Quanto a queixa do paciente, pacientes com AP geralmente relatam uma massa de crescimento lento e indolor. Por isso, acabam demorando meses e até anos para procurar atendimento especializado e fazer o diagnóstico apropriado. (45). No nosso estudo o tempo de queixa variou de 1 a 180 meses, com média de 40.9 meses e a queixa principalestá em consonância com a literatura, onde houve a presença de um nódulo indolor em 37 casos (97.3%) de APestudados.
Nos CXAP, igualmente, a queixa está relacionada a uma massa indolor com rápido crescimento nos últimos meses que antecedem o diagnóstico. Porém, dor, ulceração da pele e paralisia do nervo facial podem estar presentes (45). Encontramos uma variação de 3 semanas a 360 meses de evolução clínica, com média de 103.2 meses, e semelhantemente ao descrito na literatura, em 35 casos (85.4%), a queixa principal foi a presença de uma massa indolor e apenas em 2 casos (4.9%) houve relato de dor. Outras queixas relatadas foram a perda auditiva, zumbido e tontura em 1caso (2.4%), 1 caso(2.4%) relatou dificuldade para movimentar a face, 1 (2.4%) teve alteração no fluxo
salivar e 1 (2.4%) queixou-se de desvio de rima e paralisia facial. Naqueles localizados em glândula lacrimal, 2 casos (4.9%) apresentavam queixa de proptose.
O tratamento do AP é cirúrgico, o tipo de cirurgia é eleito de acordo com o local e extensão do tumor, sendo o prognóstico excelente se a cirurgia for adequada(48). Em todos casos de AP avaliados em nosso trabalho, o tratamento foi cirúrgico e não houve nenhum caso de morte relacionado à doença.
A maioria dos CXAP possuem crescimento agressivo, com invasão capsular e infiltração nos tecidos adjacentes(48). O prognóstico está diretamente relacionado com sua classificação, sendo mais favorável nos subtipos intracapsulares e minimamente invasivos, com mau prognóstico no subtipo francamente invasivo (45). Em nossa casuística foram mais frequentes tumores extensos, com estadiamento III (27%) e classificados como francamente invasivos (56%). Segundo a extensão do tumor, a maioria dos casos 26.8%, apresentaram tumor maior que 4cm em suas maiores dimensões.
O tratamento do CXAP também é cirúrgico, porém dependo do grau de invasão da doença, pode ser necessário a realização de radioterapia adjuvante (48), sendo a quimioterapia pouco utilizada(49, 50). No nosso grupo, 27 casos (65.9%) foram submetidos apenas a cirurgia e em 10 (24.3%) a radioterapia foi utilizada como terapia adjuvante. Além disso, é importante salientar que quanto ao subtipo histológico, o carcinoma de ducto salivar é o subtipo relatado mais comum, seguido pelo carcinoma mioepitelial (31, 46). Encontramos como mais prevalente em nosso trabalho o carcinoma de ducto salivarem 13 pacientes (31.7%), seguido peloadenocarcinoma NOS em 8 (19.5%).
Entretanto, nas últimas duas décadas, a participação do proto-oncogene PLAG1 no desenvolvimento do AP e do CXAP tem sido evidenciada. Um estudo realizado por Katabi Ne colaboradores, em 2015,analisaram o gene PLAG1 por hibridização fluorescente in-situ (FISH) em 22 CXAP. Seus resultados mostraram rearranjos do PLAG1 em 16 casos (72.7%), concluindo que anormalidades genéticas envolvendo PLAG1 são um dos eventos genéticos mais comuns em CXAP (31). Rotellinie colaboradores, em 2014,adicionalmente, avaliaram a expressão de proteína PLAG1 por imunohistoquímica (IHQ) em 36 deAP e apenas 1 de CXAP. Seus resultados mostram quehouve positividade em 94.4% dos casos benignose na única contraparte maligna analisada.Em conclusão, o estudo sugeriu que PLAG1 é um marcador com boa sensibilidade para AP e CXAP, e poderia ser um complemento no diagnóstico de tumores
de glândula salivar. A hipótese apresentada pelo autor é a de que o gene PLAG1 já estaria ativado no componente benignoe que a alteração seria mantida após a transformação maligna (49)
Em 2012, o estudo de Bahrami Ae colaboradores demonstrou por IHQ, positividade da proteína PLAG1 em todos AP testados e em 77% dos CXAP, de diversos subtipos morfológicos. Quando o gene PLAG1 foi analisado por FISH em CXAP, 63% foram positivos e apresentaram rearranjos gênicos, o que indicava que rearranjos do PLAG1 persistiam em CXAP (36). No estudo realizado por Matsuymae colaboradores, em 2011, PLAG1 foi analisado por IHQ e RT-PCR, e houve positividade em 100% dos casos de AP e 100% dos casos de CXAP. Dentre outros tumores de glândula salivar testados (42), apenas 3 carcinomas foram fracamente positivos para PLAG1 (53).Em 2009, Persson e colaboradores, para identificar desequilíbrios genômicos, analisaram 6 AP e 10 CXAP por meio da hibridização genômica comparativa por microarranjos (aCGH) e FISH. Seus resultados mostraram que em 50% dos CXAP houve ganho do número de cópias do PLAG1 nos tumores com desequilíbrio em 8q12.1 (Persson et al., 2009).
Em nossa amostra, encontramos positividade para PLAG1 em 35 casos (89.7%) de AP, valor muito próximo ao descrito nos últimos estudos, sendo >50% de células positivas em 28 casos (73.7%), com 6 casos (15.8%) apresentando positividade entre 10% e 50% e 4 casos (10.5%) apresentando negatividade para o anticorpo. Tanto a célula epitelial e mioepitelial foi positiva em 32 casos (78%), seguida de um único caso (2.6%) com positividade apenas para célula mioepitelial e outro único caso (2.6%) com positividade somente na célula epitelial. Nos casos de AP recorrente houve positividade ainda maior (94% das amostras) e em AP residuais a positividade também foi elevada (17 casos – 77.3%). Em contrapartida, os valores encontrados em CXAP foram inferiores aos descritos nos últimos estudos. Em nosso estudo, 12 casos (29.3%) foram positivos, sendo 5 (5/7) carcinomas mioepiteliais, 4 (4/7) carcinomas epitelial-mioepitelial, 1 (1/1) carcinoma epidermóide e 1 (1/13) carcinomas de ducto salivar. Dos casos positivos, 7 (17%) tinhammais do que 50% de células positivas, 5 (12.2%) estavam entre 10% e 50% de células positivas e 29 (70.7%) eram negativas. Quando havia positividade, a célula marcada era mioepitelial em 9 casos (22%), epitelial em 2 casos (4.9%) e epitelial e mioepitelial em apenas 1 dos casos (2.4%).
Ogene HMGA2 é relacionado aos AP e a uma variedade de outros tumores mesenquimais benignos, como lipoma, leiomioma uterino, harmatoma de mamas e
pulmão, fibroadenoma de mama, angiomixoma, pólipos endometriais e condromas. Os rearranjos e fusões levam a alteração na expressão de HMGA2 nestas diferentes neoplasias acima citadas, porém a fusão de HMGA2 encontrada em AP é característica e não foi encontrada em nenhum dos outros tumores mencionados anteriormente, o que o torna um marcador potencial bastante útil para diagnóstico, em casos onde a morfologia do tumor se confunda com outra neoplasia como adenocarcinoma, ou outra neoplasia de glândula salivar (52).
HMGA2 codifica um fator transcricional arquitetural que promove ativação de expressão de genes pela modulação da conformação do DNA. Duas fusões com o gene HMGA2 tem sido encontrada em AP: HMGA2-NFIB, ins (9;12) e HMGA2-FHIT, t (3;12). Desde que nenhum domínio funcional comum foi encontrado entre os parceiros de translocação do HMGA2, o evento crítico parece ser a separação dos domínios ligantes ao DNA de seu potencial RNAm, levando a desregulação da expressão da oncoproteína HMGA2 (57).
Um relato de caso clínico publicado por Eva Roijer e colaboradores, em 2009,mostrousuperexpressão de HMGA2 nas células polimórficas grandes do CXAP, sugerindo que este fenômeno contribui para a malignização de AP. Neste estudo, a expressão nuclear da proteína foi encontrada em 25-50% dos casos, e quando presente, a marcação era encontrada em grânulos e estruturas semelhantes aos corpos nucleares. Um estudo de Fehr A e colaboradores, em 2009, associou a agressividade do CXAP, sua malignização precocee seu crescimento, à rearranjos no gene HMGA2, juntamente com MDM2 e uma disfunção de tp53 (58).
Mais recentemente, um trabalho realizado por Lee e colaboradores, em 2011,em ratos, revelou que a sobre expressão do gene HMGA2, decorrente de fusões, levou à perda da região 3’URTque contém let-7.Esta última está associada à regulação negativa do gene HMGA2, que levaà proliferação celular acentuada. Katabi e colaboradores, em 2012, publicaram um estudo mostrando que os genes NFIB, WIF1 ou FHIT, estão envolvidos na fusão com HMGA2 no desenvolvimento de AP. No que diz respeito a CXAP, os genes especificamente associados à fusão, não são claramente conhecidos, mas sabe-se que em células neoplásicas polimórficas grandes, encontradas nas regiões centrais ativas do CXAP, expressam mais HMGA2 (56).
Estudos prévios identificaram uma manutenção da expressão do HMGA2 desde AP e em AP recorrentes (41). Tais resultados foram também observados em nosso
trabalho, sugerindo que além da similaridade morfológica, uma similaridade de HMGA2 pode ter um papel na recorrência da doença (54).
Em nosso estudo, encontramos um claro aumento na expressão de HMGA2 proporcionalmente à progressão tumoral e malignização de AP à CXAP. Encontramos uma negatividade para a marcação desta proteína em 77,77% dos casos, semelhantemente ao resultado que obtivemos em AP, onde 76,31% foram negativos. Esta baixa positividade nas contrapartes benignas do modelo de estudo, leva a suporuma associação de HMGA2 com o processo de malignização em si - hipótese reforçada pelo aumento da expressão de HMGA2 nos casos malignos (48,78% de casos positivos).Apesar danegatividade em cerca de 51% dos casos de CXAP para o marcador HMGA2, houve um aumento de cerca de 50% de sua expressão em relação aos casos de AP e AP recorrentes. Além disso, adicionalmente, quando AP residuais eram encontrados em casos de CXAP, a expressão de HMGA2 era baixa, semelhantemente aos casos de AP iniciais e Recorrentes (70% de negatividade). Tais achados condizem com estudos realizados por Rojer et al., (2005), onde foram relatados altos níveis de expressão de HMGA2 resultante de amplificação gênica em CXAP, sendo sugerido com importância na transformação maligna do AP.
Um trabalho publicado por EL-Naggare colaboradores, em 2005 ponderou que a perda progressiva de heterozigosidade nos braços do cromossomo 12q estaria associada ao potencial de transformação maligna, mas não quando associado ao 8q.Um estudo de Palantee colaboradores, em 2015, mostrou que a expressão de HMGA2 aumenta quando o AP sofre transformação maligna, possivelmente devido à ativação de marcadores relacionados à diferenciação, confirmando a hipótese de Line colaboradores, que em 2007 propuseram que vários desequilíbrios genéticos em CXAP poderiam culminar na superexpressão da proteína oncogênica HMGA2, que é diretamente relacionada com o estágio do câncer e tem uma função chave na transformação neoplásica.
Stenman G e colaboradores, em2013, sugeriram que em 50% dos casos de AP, há um rearranjo cromossômico afetando o locus 8q12 e de 10-15% dos casos, que levama fusões que envolvem PLAG1 e HMGA2 – hipótese já apontada por Persson F. e colaboradores, em 2009.
Finalmente, a expressão de HMGA2 parece estar presente principalmente em carcinomas de alto grau e em casos com fase de invasão avançada devido a regulação de diversos outros oncogenes (33, 58). Em CXAP, a expressão de HMGA2 foi associada com diferenciação epitelial e mioepitelial. Quando em células epiteliais, a marcação
esteve presente no citoplasma indicando RNA não codificante devido à alta expressão de HMGA2, como sugerido por Palantee colaboradores, em 2015.
Em nosso estudo, houve aumento da expressão de HMGA2 comparando Carcinomas Intracapsulares (38% de expressão) com Carcinomas Minimamente Invasivos (78% de positividade). Isto contradiz a literatura, que aponta uma redução para 42% da expressão de HMGA2 em casos francamente invasivos. Em nosso trabalho, não obtivemos o mesmo número de casos para cada um dos graus de invasividade, o que pode explicar a variação de nosso resultado com os previamente relatados.
7 – CONCLUSÕES
Houve alta expressão proteica de PLAG1 em AP e de modo similar, em AP recorrentes.
Houve perda da expressão proteica de PLAG1 nos casos de CXAP.
A expressão do PLAG1 parece estar presente principalmente nos carcinomas de baixo grau e nos casos com fase inicial de invasão e com diferenciação principalmente mioepitelial.
A expressão proteica de HMGA2 em AP e AP recorrentes foi baixa e similar. Ainda que a expressão de HMGA2 em CXAP não tenha sido alta, foi maior que em suas contrapartes benignas (AP e AP recorrentes).
A expressão de HMGA2 parece estar presente principalmente em carcinomas de alto grau e em casos com fase avançada de invasão e associada tanto a diferenciação epitelial quanto mioepitelial.
8 – REFERÊNCIAS
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