• Nenhum resultado encontrado

Estudo comparativo dos efeitos de heparinas de diferentes pesos moleculares no reparo de lesões na pele

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Estudo comparativo dos efeitos de heparinas de diferentes pesos moleculares no reparo de lesões na pele"

Copied!
103
0
0

Texto

(1)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

NATÁLIA LOPES VIANA

ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS DE HEPARINAS

DE DIFERENTES PESOS MOLECULARES NO REPARO DE

LESÕES NA PELE

CAMPINAS 2020

(2)

NATÁLIA LOPES VIANA

ESTUDO COMPARATIVO DOS EFEITOS DE HEPARINAS DE

DIFERENTES PESOS MOLECULARES NO REPARO DE LESÕES NA

PELE

Tese de doutorado apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Biologia Celular e Estrutural na área de Biologia Celular.

Orientadora: Dra. Tatiana Carla Tomiosso

CAMPINAS 2020

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA NATÁLIA LOPES VIANA E ORIENTADA PELA TATIANA CARLA TOMIOSSO.

(3)
(4)

Campinas, 03/08/2020.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Tatiana Carla Tomiosso

Profa. Dra. Silvia Borges Pimentel de Oliveira

Profa. Dra. Juliana Aparecida Preto de Godoy

Profa. Dra. Taize Machado Augusto

Profa. Dra. Catarina Raposo Dias Carneiro

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia.

(5)

Dedico este trabalho às minhas irmãs e melhores amigas: Nataly e Priscila.

(6)

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.

À Profa. Dra. Tatiana Carla Tomiosso, pela orientação deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Edson Rosa Pimentel pelos conselhos e orientações.

Ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da UNICAMP.

Ao Instituto de Biomedicina da UFU, laboratórios, técnicos e Professores.

Ao Prof. Dr. Mauro Sérgio Gonçalves Pavão da UFRJ por ceder as heparinas, elemento chave para realização deste trabalho.

Aos colegas de laboratório: Bruno, Elusca, Francyelle e Zé, que contribuíram com o desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço a minha mãe e minhas irmãs (Nataly e Priscila) pelo incentivo, apoio e pela torcida para que tudo desse certo.

Às minhas sobrinhas, Alice, Mel e Bella, que extraem de mim o maior sentimento de amor e o melhor que posso oferecer.

(7)

RESUMO

Desde a descoberta da heparina, muitos estudos têm sido feitos quanto à sua estrutura química e farmacológica, despertando interesse clínico pelo seu papel na cicatrização da pele por meio de sua aplicação tópica. Sua capacidade de interagir com proteínas e diversas moléculas da matriz extracelular determina sua contribuição para o reparo tecidual, apresentando propriedades anti-inflamatória, pró-angiogênica e cicatrizante. A grande diversidade química da cadeia da heparina torna esta droga comercialmente distinguida em heparina de baixo peso molecular e heparina não fracionada, originada de diferentes tecidos animais. Estas heparinas de diferentes fontes e diferentes pesos moleculares compreendem fármacos distintos e, portanto, podem apresentar diferentes respostas no processo de cicatrização, fazendo-se necessário um estudo comparativo dos seus efeitos no reparo tecidual da pele. Neste trabalho foi realizada a comparação dos efeitos da heparina não fracionada de fontes bovina e suína e heparina de baixo peso molecular no tratamento de lesões na pele. A eficácia destas drogas foi avaliada a partir da realização de 4 lesões no dorso de 64 camundongos Swiss machos com 9 semanas de vida. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos com 8 animais em cada. O primeiro grupo foi o controle (CO), que recebeu tratamento apenas com o gel de vaselina 30% / lanolina 70%; o segundo foi o grupo heparina bovina (HPbov), por ter sido tratado com heparina bovina adicionada ao gel de lanolina/vaselina; o terceiro foi denominado grupo heparina suína (HPsui), por ter sido tratado com heparina suína adicionada ao gel e o quarto foi o grupo heparina de baixo peso molecular (HBPM), que foi tratado com heparina de baixo peso molecular adicionada ao gel. O procedimento cirúrgico envolveu anestesia prévia para a realização das lesões com o auxílio de punch dermatológico de 5 mm de diâmetro. As lesões foram tratadas topicamente por 3 e 7 dias, uma vez ao dia. Após a eutanásia, as lesões foram dissecadas para realização das seguintes análises: quantificação de mastócitos (azul de Toluidina), análise do diâmetro dos vasos sanguíneos (Tricrômico de Gômori), organização do colágeno (Picrosirius red), atividade das enzimas mieloperoxidase e N-acetil-β-D-glicosaminidase, dosagem de hemoglobina e atividade das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9. Os resultados evidenciaram que o grupo HPbov obteve contração da lesão semelhante ao grupo CO e significante resposta inflamatória. O grupo HPbov demonstrou efeito pró-angiogênico e apresentou melhor organização do colágeno em relação aos demais grupos. Já o grupo HPsui apresentou organização do colágeno semelhante ao CO, porém, elevou a atividade de MPO e de NAG e apresentou vasos sanguíneos com menor calibre. Além disso, a contração da lesão foi menor em relação a todos os grupos. Assim, o grupo HPsui não obteve bons efeitos no reparo de lesões na pele. Por sua vez, o grupo HBPM apresentou propriedades anti-inflamatórias e angiogênicas semelhantes ao grupo CO. O grupo HBPM obteve melhor contração da lesão em relação aos demais grupos. Entretanto, a organização do colágeno foi inferior para este grupo. Dentre as heparinas, a HPbov e a HBPM mostraram-se mais promissoras no reparo de lesões na pele.

(8)

ABSTRACT

Since the heparin discovery, many studies have been carried out regarding its chemical and pharmacological structure, and have attracted clinical interest for its role on skin wound healing through topical application. Its ability to interact with proteins and various extracellular matrix molecules determines its contribution to tissue repair, presenting anti-inflammatory and proangiogenic properties. Different heparin's sources from animal tissues and its chemical diversity of the heparin molecule, commercially discern this drug into unfractionated heparin (UFH) and low molecular weight heparin (LMWH), thus, comprise different drugs and, hence, can present different wound healing responses. Therefore, a comparative study of their effects on skin repair becomes necessary. In this work, a comparison was made among the effects of unfractionated heparin from bovine and swine sources as well LMWH on skin lesions treatment. The effectiveness of these drugs were assessed by creating four wounds on the back of 64 Swiss mice, 9 weeks old. The animals were randomly assigned into 4 groups with 8 animals each. The first group was the control group (CO) which received treatment with only 30% vaseline / 70% lanolin gel formulation; the second one was treated with bovine heparin (HPbov) added to the 30% vaseline / 70% lanolin gel; the third one was treated with swine heparin (HPswi) added to the 30% vaseline / 70% lanolin gel, and the fourth group was treated with low molecular weight heparin (LMWH) added to the 30% vaseline / 70% lanolin gel. The surgical procedure involved prior anesthesia to perform the wounds with the aid of a 5 mm diameter dermatological punch. The wounds of 32 mices were topically treated for 3 days, and 32 mice's wound were topically treated for 7 days, once a day. After euthanasia, skin wounds were dissected for the following analyzes: mast cells quantification (Toluidine blue), tipe III and tipe I collagen organization (red Picrosirius), myeloperoxidase (MPO) and N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) activities, angiogenesis by hemoglobin measuring and blood vessels diammeter analysis (Gomori's Trichrome), and metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) by zimography gel. The results have shown that the HPbov group presented inflammatory reponse and the wound contraction similar to the CO group. Besides, the HPbov group has also presented proangiogênic affect, and better collagen organization. The HPswi group has presented similar collagen organization to the CO group, however, it increased MPO and NAG activities. In addition, the HPswi presented smaller blood vessels diammeter and less wound contraction compered to all groups. Thus, HPswi group has not shown good results on skin wound repair. The LMWH has presented anti-inflammatory and angiogenic properties similar to the CO group, better wound contraction, but worse collagen organization compered to the CO group. Among heparins, the HPbov and the LMWH are the most promising drugs for the wound repair.

(9)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática da composição da pele ... 15

Figura 2 - Fórmula estrutural da heparina ... 21

Figura 3 - Representação das vias de penetração de fármacos na pele ... 27

Figura 4 - Representação gráfica das fases do reparo ... 29

Figura 5 - Mecanismos de migração dos leucócitos para o sítio inflamatório ... 31

Figura 6 - Lesões realizadas do dorso do animal ... 39

Figura 7 - Aplicação de 100 mg de gel em cada lesão ... 41

Figura 8 - Medição diária das lesões ... 41

Figura 9 - Peles dissecadas contendo as 4 lesões ... 42

Figura 10 - Secção das peles para análises histológicas e bioquímicas ... 43

Figura 11 - Análise macroscópica das lesões ... 49

Figura 12 - Porcentagem de contração da lesão. ... 49

Figura 13 - Cortes de pele corados com HE; objetiva 10x ... 51

Figura 14 - Cortes de pele corados com HE, objetiva 40x ... 52

Figura 15 - Efeito do tratamento com as heparinas sobre a atividade de MPO ... 53

Figura 16 - Efeito do tratamento com as heparinas sobre a atividade de NAG ... 53

Figura 17 - Cortes de pele corados com azul de Toluidina ... 54

Figura 18 - Efeito do tratamento com as heparinas sobre infiltrado de mastócitos .... 55

Figura 19 - Cortes de pele corados com Tricrômico de Gômori. ... 56

Figura 20 - Efeito do tratamento com as heparinas sobre o diâmetro de vasos. ... 57

Figura 21 - Efeitos do tratamento com as heparinas a hemoglobina ... 57

Figura 22 - Cortes de pele corados com Picrosirius red e analisados com filtro de polarização ... 59

Figura 23 - Organização do colágeno tipo III ... 60

Figura 24 - Organização do colágeno tipo I ... 60

Figura 25 - Cortes de pele corados com Picrosirius red e analisados sem filtro de polarização ... 61

Figura 26 - Efeito do tratamento com as heparinas sobre a organização do colágeno solúvel total. ... 62

Figura 27 - Gel de zimografia correspondente ao 3° dia após a lesão ... 62

Figura 28 - Análise densitométrica da atividade da MMP-9 e MMP-2 no 3° dia após a lesão ... 63

Figura 29 - Gel de zimografia correspondente ao 7° dia após a lesão ... 63

Figura 30 - Análise densitométrica da atividade da MMP-9 e MMP-2 no 7° dia após a lesão ... 63

(10)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Heparinas comerciais em uso no Brasil. ... 26 Tabela 2: Grupos experimentais (n=8) ... 38

(11)

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AH - Ácido hialurônico dH2O - Água destilada CO - Controle

D - Derme

DR - Derme reticular DS - Dermatan sulfato

ELISA - Ensaio de imunoabsorção enzimática EXS - Exsudato g - Gramas GAG - Glicosaminoglicano HS - Heparan sulfato H2O2 - Peroxido de hidrogênio H2SO4 - Ácido sulfúrico Hb - Hemoglobina HP - Heparina

HPbov - Heparina bovina HPsui - Heparina suína

HBPM - Heparina de baixo peso molecular HTAB - Hexadecil trimetil brometo de amônio IdoA - Ácido L-idurônico

IF - Infiltrado KDa - Kilodalton Kg - Kilograma L - Leucócitos

MEC - Matriz extracelular MMP-2 - Mieloperoxidase-2 MMP-9 - Mieloperoxidase-9 Mili-Q H2O - Água ultrapura mL - Mililitros

mM - Milimolar

MPO - Mieloperoxidase NaCl - Cloreto de sódio Na3PO4 - Fosfato de sódio NAG - N-acetil-β-D-glicosaminidase NO - Óxido Nítrico ng - Nanograma nM - NanoMolar nm - NanoMetro

O.D - Densidade óptica r.p.m - Rotações por minuto QS - Queratan sulfato

Tris - Tris - (hidroximetil) aminometano μg - Micrograma

(12)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 13

2. REFERENCIAL TEÓRICO ... 14

2.1 PELE ... 14

2.2 MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) ... 18

2.3 GLICOSAMINOGLICANOS (GAGs) ... 19

2.4 HEPARINA (HP) ... 20

2.5 USO CLÍNICO DA HEPARINA ... 22

2.6 HEPARINAS COMERCIAIS ... 24

2.7 PERMEABILIDADE DO GEL DE HEPARINA NA PELE ... 26

2.8 LESÃO ... 27 2.9 PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO ... 28 2.9.1 Hemostasia ... 29 2.9.2 Fase inflamatória ... 30 2.9.3 Proliferação ... 32 2.9.4 Remodelamento ... 34

2.9.5 Fatores que interferem no reparo ... 35

3. JUSTIFICATIVA... 36 4. OBJETIVO ... 37 4.1 GERAL ... 37 4.2 ESPECÍFICOS ... 37 5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 38 5.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ... 38 5.2 MODELO EXPERIMENTAL ... 38 5.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO ... 39 5.4 ELABORAÇÃO DO GEL DE HP ... 39 5.5 TRATAMENTO ... 40 5.6 EUTANÁSIA ... 41 5.7 COLETA DO MATERIAL ... 42 5.8 ANÁLISES MORFOLÓGICAS ... 43 5.9 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 44

5.9.1 Determinação do conteúdo de hemoglobina ... 44

5.9.2 Avaliação da atividade da Mieloperoxidase (MPO) ... 44

5.9.3 Avaliação da atividade de N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAG) ... 45

5.9.4 Determinação atividade gelatinolítica da MMP-9 e MMP 2 ... 46

5.9.5 Quantificação de colágeno solúvel total ... 46

5.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 47 6. RESULTADOS... 48 6.1 CONTRAÇÃO DA LESÃO ... 48 6.2 RESPOSTA INFLAMATÓRIA ... 50 6.3 ANÁLISE DA ANGIOGÊNESE ... 55 6.4 ORGANIZAÇÃO DO COLÁGENO ... 58 6.5 ATIVIDADE DE MMP-9 E MMP-2 ... 62 7. DISCUSSÃO ... 64 8. CONCLUSÃO ... 67 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 68

10. ANEXO I: Documento referente a Bioética e/ou Biossegurança ... 83

11. ANEXO II: Declaração de que a tese não infringe os dispositivos da lei. ... 84

(13)

1. INTRODUÇÃO

A estrutura química e farmacológica da heparina tem fomentado o interesse clínico pela sua aplicabilidade no processo de cicatrização de feridas cutâneas através da via tópica. Esta relevância é acentuada pela sua propriedade quimiotática para fibroblastos e células endoteliais, promovendo a vascularização e a síntese de colágeno. Além disso, a heparina pode interagir com moléculas adesivas que promovem a diapedese de células inflamatórias (OLCZYK, MENCNER e KOMOSINSKA-VASSEV, 2015).

Diferentes fontes de extração da heparina, bem como a grande diversidade química de sua cadeia estrutural, tornam esta droga comercialmente diversificada, originando fármacos distintos e, portanto, podem apresentar diferentes respostas no processo de cicatrização de lesões na pele.

O reparo da pele é uma resposta fisiológica do corpo à lesão e consiste numa série de eventos que ocorrem de forma simultânea e coordenada, levando à reconstrução dos tecidos danificados e ao restabelecimento da homeostase celular (KRAFTS, 2010; OLCZYK et al., 2015).

Tendo em vista que a heparina apresenta propriedades anti-inflamatórias, pró-angiogênicas e cicatrizantes, percebeu-se a necessidade de investigar como se dá a atuação de heparinas de diferentes origens e diferentes pesos moleculares no reparo da pele. Sendo assim, nesta pesquisa analisou-se o processo de cicatrização da pele (submetida a uma determinada injúria), comparando os efeitos do tratamento com heparina não fracionada (HNF)1 de origem bovina, heparina não fracionada de origem suína e heparina de baixo peso molecular (HBPM) na sequência de eventos das fases do reparo tecidual.

1 Nesta pesquisa, foram criadas as siglas HPbov para a heparina não fracionada de origem bovina e HPsui para

(14)

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 PELE

A pele é o maior órgão do corpo e, com seus anexos (pelos, unhas, glândulas sebáceas e sudoríparas), constitui o sistema tegumentar. Sua extensão recobre toda superfície do corpo (2500 cm2 em um recém-nascido e 19.000 cm2 em um indivíduo adulto) e seu peso gira em torno de 4,5 Kg, representando em torno de 12% do peso total corporal (RITTIÉ, 2016).

Além de servir como uma roupagem que confere proteção contra agentes externos de naturezas diversas, desempenha outras funções vitais para o nosso corpo, sendo elas: a) base para receptores sensoriais; b) proteção contra exposição a raios ultravioleta; c) regulação da temperatura corporal; d) controle de sal e água por meio da transpiração; e) síntese de vitamina D (MENON, 2002; SRIRAM et al., 2015; RITTIÉ, 2016).

A pele é o mais antigo e sensível de nossos órgãos, além de ser o primeiro meio de comunicação com o ambiente externo. O sentido mais intimamente associado à pele é o tato, o primeiro a desenvolver-se no embrião. Após o nascimento, a pele é intimada a responder e adaptar-se aos novos estímulos em um ambiente muito diferente daquele que, até então, se resumia na cavidade uterina. Tais estímulos são provenientes do meio atmosférico, deslocamento de ar, mudança na pressão, temperatura, radiação, umidade, luz e microrganismos. No entanto, a pele está eficientemente preparada para responder a todos esses estímulos (MONTAGU, 1988).

A pele humana apresenta aspectos anatômicos (pigmentação, derme, tecido adiposo, apêndices da pele) únicos em relação aos outros mamíferos. A singularidade da pele do Homo sapiens é resultado da sua luta pela sobrevivência. O processo de evolução da pele humana envolveu diversas mudanças anatômicas e fisiológicas, que possibilitaram a sua adaptação. No entanto, o principal fator que alavancou essa condição foi a capacidade de dissipar o calor gerado a partir da atividade muscular. Para atingir a termorregulação, a pele sofreu redução de pelos do corpo (que normalmente agem como isolantes térmicos), formação de glândulas sudoríparas (para permitir a perda de calor), inervação adicional (que liga as glândulas sudoríparas ao hipotálamo) e aumento da vascularização (para suprir as glândulas e regular o fluxo

(15)

sanguíneo da pele). Como resultado, um ser humano pode gerar até quatro litros de suor por hora por intermédio de sua pele e, assim, manter constante a temperatura do corpo (RITTIÉ, 2016; TORTORA e DERRICKSON, 2016).

A arquitetura da pele é baseada em duas camadas distintas, epiderme e derme (Figura 1), que contêm principalmente queratinócitos e fibroblastos. Abaixo da derme fica o tecido subcutâneo composto por adipócitos que conecta frouxamente a pele à musculatura subjacente (TORTORA e DERRICKSON, 2016).

Figura 1 - Representação esquemática da composição da pele em camadas. (A) Estratos que compõe a epiderme. (B) Derme e anexos cutâneos. Fonte: Adaptado de Gaur et al. (2017).

(16)

Nesta pesquisa, a análise do reparo tecidual abordou elementos constituintes da matriz extracelular (MEC), tais como: heparina (HP) e seus efeitos na reconstrução das camadas da epiderme e derme.

A epiderme é a camada mais externa da pele e tem como função primordial exercer barreira protetora do organismo contra diversos agentes externos (químicos, físicos e microrganismos) (TORTORA e DERRICKSON, 2016; RITTIÉ, 2016). Tal camada é composta por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado, que reveste toda a pele. Por isso, é imprescindível que tudo que entra ou deixa o corpo deve atravessar o folheto epitelial. Além disso, é constituída por queratinócitos (também chamados de corneócitos), isto é, células epiteliais especializadas responsáveis pela renovação, coesão e barreira da epiderme, que estabelecem conexão umas com as outras por meio de especializações de suas membranas plasmáticas, conferindo ao tecido, adesão intercelular e resistência a fortes trações e pressão (TORTORA e DERRICKSON, 2016).

Os queratinócitos se organizam em 4 estratos: córneo, granuloso, espinhoso e basal (Figura 1) (SILVEIRA, 2014; RITTIÉ, 2016; TIM, 2016; GAUR et al., 2017). Ao tocar a pele, sente-se primeiro o estrato córneo que estabelece o contato direto com o meio ambiente. Esse estrato é composto por 15 - 20 camadas de corneócitos (queratinócitos poligonais mortos desprovidos de núcleo e organelas) com espessura em torno de 10-20 µm. À medida que os queratinócitos amadurecem, vão “empurrando” os corneócitos das camadas mais externas que, por sua vez, desprendem-se do tecido (devido à dificuldade de acesso a nutrientes provenientes da derme), promovendo a descamação da pele. A espessura do estrato córneo pode variar, sendo maior em partes que sofrem mais atrito: a camada epidérmica e dérmica (somadas em conjunto) da pele de humanos tem espessura de aproximadamente 1-3 mm, podendo ser mais espessa em determinadas partes como a palma das mãos e sola dos pés, bem como mais fina nas pálpebras (MADISON, 2003; RITTIÉ, 2016; GAUR et al., 2017). Os espaços entre os corneócitos contêm lamelas ricas em um complexo insolúvel de proteínas e lipídios originados dos grânulos lamelares formados em queratinócitos da camada granulosa. Esses grânulos são segregados e depositam seu material lipídico nos espaços entre os queratinócitos (ODLAND e REED, 1967;

CATANI et al., 2001). Desta forma, o estrato córneo torna-se altamente hidrofóbico, comportando-se como uma barreira impermeável que impede a saída de água e a

(17)

entrada de agentes químicos através da pele (ODLAND e HOLBROOK, 1981; GAUR

et al.;MADISON, 2003; RITTIÉ, 2016).

Abaixo da camada córnea repousa o estrato granuloso formado por 3-5 fileiras de células poligonais achatadas, núcleo central e citoplasma carregado de grânulos lamelares (ODLAND e HOLBROOK, 1981; RITTIÉ, 2016; GAUR et al., 2017).

O estrato espinhoso é composto por queratinócitos poliédricos ou levemente achatados que perderam seu potencial de proliferação e diferenciação. O citoplasma destas células apresenta prolongamentos nos quais estão localizados os desmossomos que se aproximam das células vizinhas e as mantêm unidas dando às células um aspecto espinhoso. Existe também tonofilamentos ou filamentos de queratina que se inserem nos prolongamentos citoplasmáticos dos desmossomos. Tanto o filamento de queratina, quanto os desmossomos desempenham importante papel na manutenção da coesão entre as células da epiderme e na resistência ao atrito (RITTIÉ, 2016).

O estrato basal ou germinativo é a camada mais interna e repousa sobre a lâmina basal, sendo rica em células-tronco da epiderme que originam as células epidermais. Tais células estão em constante atividade mitótica e, à medida que as células se dividem e amadurecem, são empurradas para cima formando as camadas subsequentes promovendo a renovação da epiderme. Essa renovação depende da localização e da idade do indivíduo, podendo acontecer a cada 15 dias (RITTIÉ, 2016). Além dos queratinócitos, a epiderme é constituída por outros tipos celulares como os melanócitos, dentro dos quais é produzida a melanina - pigmento responsável pela cor da pele. Suas projeções longas e finas se estendem por entre os queratinócitos transferindo os grânulos de melanina. Os melanócitos absorvem os raios UV e inibem a formação de radicais livres. As células de Lanjerhans atuam no sistema imune, reconhecendo e exterminando corpos estranhos. As células de Merkel fazem contato com células nervosas sensoriais detectando sensações (TORTORA e DERRICKSON, 2016) (Figura 1). É fundamental explicitar que abaixo da epiderme localiza-se a membrana basal que se liga à epiderme e proporciona um limite físico entre o epitélio e a derme (PAULSSON, 1992).

A derme localiza-se logo abaixo da membrana basal (SILVEIRA, 2014) e figura como a porção mais grossa da pele (Figura 1). É composta por tecido conjuntivo vascularizado e inervado que permite a percepção de sensações, tais como: dor, frio, calor etc. (ISAAC et al., 2010; GAUR et al., 2017). Nela estão presentes folículos

(18)

pilossebáceos, glândulas sudoríparas e glândulas sebáceas (ISAAC et al., 2010; GAUR et al., 2017). O principal tipo celular presente nesta camada são os fibroblastos que sintetizam o colágeno e elastina. Células adiposas e as células infiltrantes (mastócitos e leucócitos) também estão presentes na MEC desta camada (GAUR et

al., 2017).

2.2 MATRIZ EXTRACELULAR (MEC)

Todos os tecidos e órgãos contêm uma mistura de células e componentes não celulares que formam redes bem organizadas chamadas Matrizes Extracelulares (MECs). A MEC, além de fornecer estrutura física ou arcabouço para as células e componentes do tecido, também regula muitos processos celulares, incluindo: crescimento, migração, diferenciação, sobrevivência, homeostase e morfogênese (FRANTZ et al., 2010; THEOCHARIS et al., 2016). Células epiteliais, fibroblastos, células do sistema imune e endoteliais sintetizam e secretam macromoléculas de matriz sob o controle de múltiplos sinais, participando da formação de MECs (LEBLEU

et al., 2017).

As variações na composição e estrutura dos componentes da MEC afetam seu arcabouço, suas propriedades biomecânicas, bem como interferem nos sinais transmitidos às células, modulando suas respostas. A matriz que compõe a derme é rica em colágeno, elastina, proteoglicanos (PGs) e glicosaminoglicanos (GAGs) (RITTIÉ, 2016).

De acordo com Olczyk et al. (2014), a restauração da integridade do tecido é o resultado da interação de plaquetas, neutrófilos, monócitos, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos com os componentes da MEC (fibronectina, GAGs, PGs, trombospondina, tenacina, vitronectina e colágeno). Tais interações são reguladas por inúmeras citocinas e fatores de crescimento envolvidos no processo de cicatrização. Somado a essa gama de componentes, existem também as metaloproteinases (MMPs), proenzimas secretadas por neutrófilos, monócitos, macrófagos e fibroblastos. Dentre elas, destacam-se as gelatinases 9) e (MMP-2), que têm papel fundamental na determinação da estrutura da MEC e na cicatrização. Estas proenzimas realizam a clivagem de proteínas, especialmente o colágeno, principal proteína estrutural da matriz da pele. Seu papel é fundamental durante a agiogênese, cuja entrada de células endoteliais na MEC depende da

(19)

clivagem do colágeno para que estas células penetrem no tecido. Além disso, na etapa de remodelamento, as MMPs exercem importante papel na degradação de componentes da pele recém-sintetizada para que a composição deste novo tecido seja semelhante ao tecido original. No processo inflamatório a presença da MMP-9 é eminente. Ela é armazenada em grânulos de leucócitos e, durante a inflamação, estes grânulos são liberados na MEC. Na fase proliferativa observa-se a proeminência da MMP-2, sintetizada por fibroblastos presentes na pele (KOIVUKANGAS, V. et al., 1994; WANG et al., 2002). A atuação desregulada destas proenzimas pode induzir a formação de uma matriz fibrótica exacerbada, resultando em cicatrizes hipertróficas e queloides (ARAÚJO et al., 2011).

A MEC é fundamental para a homeostase normal, mas também muitas síndromes e condições patológicas resultam de anormalidades ou deficiências de seus componentes que originam moléculas alvo para tratamento farmacológico direcionado (JÄRVELÄINEN et al., 2009). Os GAGs, por exemplo, são afetados nos grupos de distúrbios genéticos conhecidos como mucopolissacaridose classificadas como síndrome de Hurler, Moquio e síndrome de Sanfilippo. Assim, compreende-se o importante papel dos componentes da MEC e os mecanismos pelos quais estes componentes modulam cada etapa do processo de reparo. Dentre esses componentes, o presente trabalho destaca os GAGs, moléculas fundamentais capazes de interagir com os componentes da MEC e proporcionar um ambiente estrutural propício para que ocorra os eventos do reparo.

2.3 GLICOSAMINOGLICANOS (GAGs)

A MEC que compõe a derme conta com moléculas polissacarídicas fundamentais para a composição dessa matriz: os GAGs (SILVEIRA, 2014). Tais moléculas têm a capacidade especial de se ligar a grandes quantidades de água (SANTOS et al., 2014; OLCZYK et al., 2015). Os GAGs hidratados servem como suporte flexível da MEC, interagindo com proteínas estruturais e adesivas. Assim, atuam como peneiras moleculares, influenciando o movimento de substâncias na MEC (OLCZYK et al., 2015). Por serem moléculas muito rígidas e com grande volume tornam-se eficazes no preenchimento da MEC (OLCZYK et al., 2015; PRYDZ, 2015; HARVEY e FERRIER, 2015). Além disso, os GAGs têm a capacidade de se ligar a uma gama de citocinas e quimiocinas atuando como um reservatório de fatores de

(20)

crescimento que podem ser liberados de forma controlada por degradação seletiva de cadeias dos GAGs (OLCZYK et al., 2015). A interação entre os GAGs e proteínas da MEC possibilita sua participação em vários processos biológicos como: morfogênese, angiogênese, adesão, diferenciação e proliferação celular (SANTOS et al., 2014; OLCZYK et al., 2015).

A estrutura dos GAGs se baseia em um composto heterogêneo formado por cadeias longas e não ramificadas de unidades de dissacarídeos que se repetem. Sendo que cada dissacarídeo é formado pelo ácido urônico (D-glicurônico-GlcA/ácido L-idurônico-IdoA) e pela hexosamina (N-acetil glicosamina/N-acetil galactosamina) (HARVEY e FERRIER, 2015).

Existem 6 tipos de GAGs presentes em tecidos animais: ácido hialurônico (AH), queratam sulfato (QS), condroitim sulfato (CS), heparam sulfato (HS), heparina (HP) e dermatam sulfato (DS). O que diferencia essas moléculas é o tipo de ácido urônico e o tipo de hexosamina associados a elas, além da posição e quantidade dos grupos sulfatos e o tipo de ligação glicosídica (α ou β) (SANTOS et al., 2014; OLCZYK et al., 2015). O HS e a HP possuem a mesma unidade dissacarídica, porém estes GAGs se diferem porque o HS (presente na membrana basal) apresenta algumas glicosaminas acetiladas e menos grupos sulfato que a HP (HARVEY e FERRIER, 2012).

2.4 HEPARINA (HP)

Heparina é o GAG de estrutura mais complexa dentre os demais. É um polissacarídeo linear constituído por repetidas unidades dissacarídicas trissulfatadas constituídas por resíduos de ácido glicurônico e N-acetilglicosamina de estrutura esquemática [→ 4GlcA𝛽1→GlcNAc𝛼1 →]. Possui massa molecular em média 15 kDa (SARRAZIN et al., 2001; VOLPI, 2006; TOVAR et al., 2013; SANTOS et al., 2014; OLCZYK et al., 2015; HARVEY e FERRIER, 2015) (Figura 2).

(21)

Figura 2 - Fórmula estrutural da heparina. Fonte: Adaptado de Harvey e Ferrier (2012).

Cada unidade dissacarídica da HP contém 3 grupos sulfato, um número alto comparado com uma unidade dissacarídica do HS, que contém apenas um grupo sulfato. Tal característica atribui a essa molécula a maior densidade de carga negativa entre as macromoléculas biológicas e a torna a macromolécula mais ácida do corpo humano (SANTOS et al., 2014; OLCZYK et al., 2015). A HP é sintetizada nos mastócitos de pulmões, intestinos e fígado (ERLICH e STIVALA, 1973; OLCZYK et

al., 2015), sendo encontrada em vários animais invertebrados e também na maioria

dos vertebrados (MCLEAN, 1959), sob a forma de um PG chamado de serglican (OLCZYK et al., 2015), no qual cadeias de GAGs estão ligadas covalentemente aos resíduos de serina do core proteico (LINDAHL et al., 1994). O serglican é armazenado nos grânulos de mastócitos (o único PG armazenado em compartimentos secretores intracelulares), que contêm numerosas cadeias de HS, uma fonte importante da qual se deriva farmacologicamente a HP (KOLSET e PEJLER, 2011; KORPETINOU et al., 2014; THEOCHARIS et al., 2016). O serglican é secretado por essas células no processo de desgranulação e, a partir da degradação enzimática, há a subsequente liberação da HP (OLCZYK et al., 2015), que é liberada na pele após ativação durante inflamação (KOLSET e PEJLER, 201; THEOCHARIS et al., 2016).

De acordo com Santos et al. (2014), as HPs de grau farmacêutico feitas a partir de tecidos intestinais bovinos e suínos compreendem dois fármacos distintos. A HP de pulmão bovino tem, por exemplo, proporções mais elevadas de glicosaminas N-sulfatadas e menores proporções de resíduos N-acetilados quando comparada com a HP intestinal suína. As diferenças estruturais observadas entre HPs de diferentes origens são susceptíveis a respostas clínicas diferentes.

(22)

2.5 USO CLÍNICO DA HEPARINA

A HP e sua atividade anticoagulante foi descoberta em 1956 pelo pesquisador

McLean. É um dos mais antigos medicamentos naturais, cujo uso clínico ultrapassa 65 anos (SANTOS et al., 2014). Depois da insulina, consiste na droga de origem endógena mais utilizada na medicina. Esses polímeros são comuns na natureza, ocorrendo em ampla variedade de organismos e abundantes em tecidos de vertebrados. Os avanços técnicas na sua extração permitem a obtenção de quantidades suficientes para utilização na clínica médica (CHARLES e SCOTT, 1936; SILBERT et al., 1997;CATANI et al., 2001).

A HP é amplamente utilizada na medicina como um fármaco anticoagulante (HELLSTRÖM e SPANDOW, 1994; TOVAR et al., 2013; SANTOS et al., 2014). Contudo, essa droga vem sendo utilizada clinicamente em cirurgia plástica e no tratamento de queimaduras por meio de aplicação tópica. Além disso, devido ao seu possível efeito anti-inflamatório, também é utilizada para tratamento de cicatrizes patológicas, especialmente aquelas com distúrbios fibroproliferativos, como: os queloides e as cicatrizes hipertróficas.

Ng et al. (2015) realizaram uma revisão da literatura, entre janeiro de 1990 e janeiro de 2013, para identificar publicações relatando o uso de tratamentos antitrombóticos administrados via aplicação tópica. Seus resultados revelaram que, naquele período, 34 estudos envolveram a administração tópica da HNF (79.1%) e 2 estudos evolveram o uso da HBPM (4.7%). De acordo com os autores, o tratamento tópico com o gel ESSAVEN (0,1 mg/g de gel), que contém HP, pode alterar positivamente a microcirculação na pele. No mesmo estudo, os autores observaram que pacientes com dermatite atópica, tratados com pomada de HP (0,2 mg/g de creme) associada com o levomenol, apresentaram evolução na cicatrização. Pacientes com dermatite perineal severa, tratados com spray de HP (10 000 IU), apresentaram reepitelização avançada no prazo de 9 a 10 dias de tratamento.

Estudos que avaliam os efeitos do uso tópico de HP em queimaduras têm revelado múltiplos mecanismos que explicam seu papel na cicatrização. Seus efeitos costumam mediar - direta ou indiretamente - diversos fatores químicos envolvidos na inflamação, podendo influenciar a atividade de macrófagos e neutrófilos, atividade de fatores de crescimento e agregação de plaquetas. A HP pode restaurar o fluxo

(23)

sanguíneo em um tempo mais curto e revascularizar o tecido isquêmico, a partir do aumento do crescimento vascular (MASOUD et al., 2014).

O potencial cicatrizante da heparina é também demonstrado pelo efeito pró-angiogênico em modelos de desluvamento em ratos (MENON et al., 2017). Além disso, a HP funciona como um reservatório de mediadores químicos no tecido. Muitos fatores de crescimento, tais como: VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular) e EGF (fator de crescimento epidermal), têm afinidade natural pelo HS, um GAG encontrado na MEC da pele.

A HP tem estrutura e funcionalidade semelhantes às do HS, com a capacidade de se ligar a uma gama de fatores de crescimento e apresentá-los aos receptores celulares de maneira biomimética (LONG et al., 2017). Com base em tal conhecimento, um estudo realizado por Long et al. (2017) abordou a deficiência da regulação dos fatores de crescimento em lesões na pele de suíno e utilizou o plasma rico em plaquetas (PRP) e HP como veículo de liberação de fatores de crescimento para aplicação terapêutica em lesões cutâneas. Seus resultados mostraram que esse PRP acelerou a contração da lesão e as lesões exibiram epiderme mais espessa. Além disso, o PRP modulou a densidade vascular no centro da lesão, ou seja, a densidade vascular foi significativamente maior no tecido recuperado do que no tecido saudável, indicando um afluxo de vasos sanguíneos no leito da lesão, resultado de intensa angiogênese necessária para a formação do tecido de granulação. Contudo, nas bordas da lesão tratada com PRP, a densidade dos vasos sanguíneos foi significativamente menor, assemelhando-se ao tecido não lesionado. Uma vez que as lesões cicatrizam mais rápido nas bordas, os dados sugerem que lesões tratadas com PRP contendo heparina estavam em um estágio avançado de cicatrização (LONG et

al., 2017). O estudo mostrou também que houve contração da área da lesão e

acelerou a maturação do tecido de granulação (LONG et al., 2017).

A investigação realizada por Cebesoy et al. (2013) avaliou o uso da HP aplicada via intraperitoneal em modelo de desluvamentos em caudas de ratos. Os resultados demonstraram redução da espessura de necrose da pele com o uso tanto de heparina não fracionada, quanto de heparina de baixo peso molecular, indicando efeitos positivos no reparo de lesões cutâneas.

A HP apresenta potencial anti-inflamatório pela sua interferência no recrutamento de leucócitos para a região injuriada: a HP inibiu a adesão dos leucócitos no processo de rolamento ao longo da parede endotelial pela inibição das P e

(24)

L-selectinas (NELSON et al., 1993; COOMBE et al., 1994; DIAMOND et al., 1995; JONES et al., 2002; WANG et al., 2002). Ademais, a transmigração de leucócitos a partir da parede endotelial é dependente da interação da integrina MAC-1 (COOMBE

et al., 1994; SPRINGER, 1994; DIAMOND et al., 1995) com a glicoproteína ICAM-1

(LAWSON et al., 1999; HUNSCHE e MOLOSSI, 2002). Tal interação estabelece forte adesão entre os neutrófilos e as células endoteliais e, assim, possibilita a diapedese (BEVILACQUA et al., 1994; HUNSCHE e MOLOSSI, 2002). Hunsche e Molossi (2002) realizaram um estudo em pacientes com doença arterial coronária submetidos à cirurgia sob circulação extracorpórea (CEC) com 5 mg/Kg de heparina injetadas via intravenosa para identificar os níveis séricos da ICAM-1. Os resultados revelaram que estes pacientes apresentaram baixos níveis da ICAM-1 após a CEC com heparina.

2.6 HEPARINAS COMERCIAIS

A HP é obtida da mucosa intestinal de suínos ou do tecido pulmonar bovino. As fontes de tecido usadas para a preparação de heparinas de grau farmacêutico mudaram ao longo do tempo. Iniciou-se com fígado de cão, depois com o fígado bovino, com o pulmão bovino e, por último, a mucosa intestinal suína (SANTOS et al., 2014). A fonte inicial da HP, utilizada para preparar os padrões internacionais, foi o pulmão bovino. Esse tecido foi a principal fonte de HP até a década de 80. No entanto, em razão da possibilidade de contrair encefalopatia espongiforme, a produção de heparina de pulmão bovino quase cessou (SANTOS et al., 2014).

Registra-se que, após o período, a mucosa intestinal suína passou a ser uma fonte quase exclusiva de HP nos EUA e na Europa. Contudo, em alguns países latino-americanos e árabes, o intestino bovino ainda é uma fonte alternativa de HP; provavelmente, pelo baixo custo de produção e crenças (JUNQUEIRA et al., 2011; SANTOS et al., 2014).

Um estudo comparativo entre a heparina de origem bovina e suína comprovou que as HPs de grau farmacêutico, feitas a partir dessas fontes, compreendem dois fármacos distintos, embora compostos pela mesma mistura de frações (TOVAR et al., 2013; SANTOS et al., 2014).

A HP suína é extraída da mucosa intestinal suína. Contém uma mistura de cadeias polissacarídicas de peso molecular variado e consiste principalmente no dissacarídeo trissulfatado repetido →4-α- Ido2S-1→4-α-GlcNS6S-1→. A heparina

(25)

bovina é extraída do tecido pulmonar bovino e possui cadeias polissacarídicas de pesos moleculares variados. Tem a composição dissacarídica semelhante à da HP intestinal suína; porém, as preparações de HP a partir do pulmão bovino apresentam padrão mais heterogênio de sulfatação e contêm α-glicosamina com variações significativas de substituição: ~ 60% são N, dissulfatados, e ~ 40% são 6-dessulfatados (ANVISA, 2010; TOVAR et al., 2013). Ademais, HP de pulmão bovino tem proporções mais elevadas de glicosaminas N-sulfatadas e menores proporções de resíduos N-acetilados quando comparada com a HP intestinal suína (SANTOS et

al., 2014).

A HP pode ser comercializada sob as formas: heparina não fracionada (HNF), também conhecida como heparina padrão e a heparina de baixo peso molecular (HBPM) (MASOUD et al., 2014). A HNF é uma mistura de polímeros de sacarídeos com pesos moleculares variando numa média de 15 KDa (CAMPORESE et al., 2009). Conforme Junqueira et al. (2011), fármacos contendo HNF de fontes bovina e suína são utilizados no Brasil. (Tabela 1).

HBPM são fragmentos da HNF e é obtida através da despolimerização química ou enzimática controlada. Seu peso molecular é menor, em torno de 5 KDa (CATANI

et al., 2001). É constituída por um grupo de várias drogas (Tabela 1) e apresenta

propriedades farmacológicas mais previsíveis para aplicações terapêuticas em ralação a HNF: maior biodisponibilidade e pico de ação mais rápido (DEBRIE, 1995).

(26)

Tabela 1: Heparinas comerciais em uso no Brasil.

Nome comercial Tipo Fonte Indicação Administração

ACTPARIN HNF Bovina Trombose Intravenosa

HEMOFOL HNF Suína Trombose Subcutânea

HEPAMX-S HNF Suína Trombose Subcut/Intrav

HEPTAR HNF Bovina Trombose Injeção/infusão

FRAGMIN HBPM Fragmentos da HNF Trombose Subcutânea CLEXANE HBPM Fragmentos da HNF Trombose Subcutânea FRAXIPARINA HBPM Fragmentos da HNF Trombose Intramuscular IMNOTEP HBPM Fragmentos da HNF Trombose Intravenosa

Fonte: adaptado de Junqueira et al. (2011).

2.7 PERMEABILIDADE DO GEL DE HEPARINA NA PELE

O uso tópico de fármacos oferece vantagens em relação às outras vias de administração por ser indolor e não invasivo e, por isso, tem sido alvo de interesse clínico (CHORILLI et al., 2007; ZHAO et al., 2009; SILVA et al., 2010). No entanto, a pele constitui-se de uma barreira impermeável e, portanto, a penetração de substâncias na pele depende de suas propriedades físico-químicas e de sua interação com o veículo adequado (RICCIATTI-SIBBALD e SIBBALD, 1989; CHORILLI et al., 2007).

O estrato córneo consiste na principal barreira à transferência de drogas através da pele. Existem 3 vias de penetração de fármacos na pele: transcelular (entre os lipídios do estrato córneo), intercelular (pelos e poros) e a partir de glândulas (Figura 3) (CHORILLI et al., 2007).

(27)

Figura 3 - Representação das vias de penetração de fármacos na pele. Fonte: Adaptado de Chorilli et al. (2007).

O efeito terapêutico do uso tópico da HP depende da sua penetração nas camadas cutâneas (BETZ et al., 2001) e da composição do veículo, ao qual esta droga é inserida (SCHAEFER e ZESCH, 1976; BETZ et al., 2001). Em 2002, Sato et al., observaram que o aumento da hidratação possibilita a permeabilidade transdérmica de veículos hidrofílicos e lipofílicos. Desta forma, o alto grau de afinidade da HP com a água (SANTOS et al., 2014; OLCZYK et al., 2015) torna viável a formulação de um veículo à base de gel para promover a penetração deste fármaco na pele (ZESCH e SCHAEFER, 1976; CESARONE et al., 2007).

2.8 LESÃO

Lesões são definidas como ruptura dos tecidos que compõe a pele e consequente interrupção da sua função. Podem ser desencadeadas por irritação mecânica, traumatismos repetidos, queimadura, infecção e doenças autoimunes (TIM, 2016).

Mediante uma injuria na pele, o tipo de cicatrização pode ocorrer de forma primária ou secundária. Na cicatrização primária o fechamento da lesão é imediato e sem tensionamento dos tecidos. Por exemplo, uma lesão feita por incisão cirúrgica, na qual não há grande perda de tecidos, o reparo acontece por aproximação das bordas da lesão. Neste contexto, a cura ocorre em curto tempo e o aspecto da cicatriz apresenta pouca ou nenhuma fibrose macroscópica.

(28)

A cicatrização secundária ocorre quando há extensa perda dos tecidos que compõe a pele, sobretudo acometida de grande dano na derme. Por exemplo, uma lesão com grande área aberta, onde não é possível aproximar as bordas da lesão. Nesse caso, a cura é decorrida pela formação do tecido de granulação, reepitelização e contração da lesão. A cicatrização secundária é mais demorada e o resultado final é uma cicatriz fibrótica (CUDY, 2017).

A escolha do tipo de cicatrização é dependente de diversos fatores: tempo de ocorrência da lesão, a forma como ocorreu, localização, tamanho, grau de contaminação, grau de perda tecidual, quadro clínico do paciente, idade e desnutrição (OLCZYK et al., 2014; CUDY, 2017).

Nesta pesquisa, utilizou-se o modelo experimental, cuja cicatrização é secundária.

2.9 PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO

Em condições normais, o reparo tecidual consiste em perfeita e coordenada cascata de eventos celulares, moleculares e bioquímicos que interagem para que ocorra a reconstituição tecidual. Os mecanismos da cicatrização podem ser didaticamente descritos em 4 fases: fase hemostática, fase inflamatória, fase de proliferação e fase de remodelamento (Figura 4) (GUO e DIPIETRO, 2010; OLCZYK

et al., 2014; SRIRAMA et al., 2015; RITTIÉ, 2016; TIM, 2016). As seções seguintes

fazem a exposição mais detalhada de cada uma dessas etapas, bem como aborda alguns fatores que interferem no reparo.

(29)

Figura 4 - Representação gráfica das fases do reparo. Fonte: Adaptado de Venter (2014).

2.9.1 Hemostasia

Hemostasia é o primeiro estágio do processo de cicatrização, e tem início imediato após a ocorrência da lesão vascular (OLCZYK et al., 2014). Sua finalidade é formar um tampão hemostático e cessar a hemorragia, etapa que pode variar em torno de 4-6 horas (AHMED, 2011).

Assim que ocorre a lesão dos vasos, inicia-se o processo de adesão e agregação de plaquetas, ativadas por consequência do seu contato com componentes da matriz extracelular (ISAAC et al., 2010). As plaquetas liberam glicoproteínas adesivas (fibrinogênio, fibronectina, vitronectina e trombospondina) que reforçam ainda mais a agregação plaquetária (ISAAC et al., 2010). Além disso, nesta etapa as plaquetas liberam seus grânulos que secretam vários fatores de crescimento, incluindo EGF, TGF-β e PDGF. Essas moléculas iniciam a cascata de cicatrização de lesões, atraindo e ativando fibroblastos, células endoteliais e macrófagos para o sítio lesionado (ENOCH e LEAPER, 2005).

A superfície das plaquetas ativadas torna-se o sítio de ativação da protrombina que, por sua vez, ativa a trombina, principal fator do processo de coagulação que catalisa a reação de fibrinogênese (OLCZYK et al., 2014). Nesta reação, a trombina em sua forma ativa, catalisa a reação em que o fibrinogênio sérico (proteína solúvel no plasma sanguíneo) é clivado, formando monômeros de fibrina. Os monômeros de fibrina se polimerizam pela ação do fator XIII, para que, junto com plaquetas, formem um tampão hemostático, impedindo a perda de sangue (ISAAC et al., 2010; OLCZYK

(30)

et al., 2014). Deste processo surgem elementos essenciais para a continuação

fisiológica da cicatrização: um leito provisório rico em ácido hialurônico, fibrina e fibronectina que possibilita a migração das células inflamatórias que chegam posteriormente à etapa hemostática juntamente com os primeiros fatores de crescimento (OLCZYK et al., 2014).

2.9.2 Fase inflamatória

A fase inflamatória inicia-se nas primeiras horas após a lesão e prossegue por volta de 48 horas. É acompanhada pelos sinais cardinais, tais como: calor, inchaço, vermelhidão, dor e perda da função do tecido lesionado (OLCZYK et al., 2014). É uma resposta de defesa benéfica ao organismo, agindo em proteção do corpo contra quaisquer agentes nocivos que possam interromper as atividades normais do tecido (AHMED, 2011).

A reposta inflamatória é composta por eventos vasculares (vasoconstrição e aumento da permeabilidade) e eventos celulares (diapedese de leucócitos) (REINKE e SORG, 2012).

Em primeira instância, ocorre a vasoconstrição. Assim, com a diminuição do calibre dos vasos, o fluxo sanguíneo torna-se intenso seguido da liberação do líquido plasmático ultrafiltrado contendo pouca proteína (transudato). O aumento do fluxo sanguíneo possibilita a chegada rápida de leucócitos ao local e é responsável pela vermelhidão e o calor no sítio inflamado (OLCZYK et al., 2014).

Logo após a vasoconstrição, ocorre a vasodilatação e o aumento da permeabilidade dos vasos, permitindo o extravasamento do plasma sanguíneo rico em proteínas (albumina e fibrinogênio), chamado de exsudato (REINKE e SORG, 2012; OLCZYK et al., 2014). A exsudação altera a pressão osmótica e hidrostática, levando à formação do edema e, consequentemente, o inchaço no local (REINKE e SORG, 2012).

Os eventos celulares do processo inflamatório envolvem o recrutamento de leucócitos para o sítio injuriado. Tais células promovem assepsia e remoção do agente nocivo, além de liberar citocinas e fatores de crescimento que desempenham importante papel na etapa seguinte do processo de cicatrização (OLCZYK et al., 2014).

(31)

Devido ao aumento da permeabilidade dos vasos e ao extravasamento do exsudato, o fluxo sanguíneo torna-se lento, gerando um quadro de estase intravascular (SASAKI et al., 2016). Com isso, os leucócitos se aproximam da parede endotelial (REINKE e SORG, 2012) e passam por um processo de rolamento sobre as células endoteliais, o que faz com que diminua sua velocidade até parar por completo. Em seguida, essas células são ativadas e aderem ao endotélio. Com a aderência estabelecida, os leucócitos sofrem diapedese e migram até o local danificado em resposta à quimiotaxia (ISAAC et al., 2010; REINKE e SORG, 2012). (Figura 5).

Figura 5 - Mecanismos de migração dos leucócitos para o sítio inflamatório. As selectinas medeiam a fraca adesão entre os leucócitos e células endoteliais e as integrinas promovem a forte adesão.

Fonte: Adaptado de Lowell et al. (2012).

A inflamação pode ser dividida em fases, inicial e tardia, dependendo do tempo e duração da resposta inflamatória e do tipo de célula inflamatória envolvida. A fase inflamatória inicial ocorre entre o 1° e o 2° dia após a injúria levando à infiltração os neutrófilos que são as primeiras células a migrarem para a região lesionada, atraídas por fatores quimiotáticos como a trombina, produto da decomposição da fibrina, bactérias, histaminas, leucotrienes, TGF-𝛽 e PDGF. A principal função dos neutrófilos é realizar a defesa do organismo contra agentes patogênicos eliminando-os por meio do oxigênio e nitrogênio gerados (REINKE e SORG, 2012; PULLI et al., 2013). O processo inflamatório é intensificado pela liberação da citocina IL-1 e o fator de necrose tumoral TNF (OLCZYK et al., 2014). Assim que os neutrófilos realizam suas atividades (em torno de 48h), estas células entram em apoptose.

A fase tardia acontece entre o 2° e 3° dia e é marcada pela chegada de monócitos na região lesionada, atraídos por moléculas quimiotáticas, tais como:

(32)

complemento, componentes oriundos da coagulação, fragmentos de imunoglobulina G, produtos de degradação do colágeno e elastina e citocinas (por exemplo, PDGF e TGF-β). Sob o estímulo de substâncias como o interferon-γ (IFN-γ), os monócitos se diferenciam em macrófagos, no sentido de aumentar sua estrutura (seu tamanho celular, o aparelho de Golgi, o número de lisossomos, microtúbulos e microfilamentos) e capacidade metabólica (síntese proteica). Os macrófagos desempenham um duplo papel no processo de cura: por um lado, eles participam na fagocitose de bactérias e remoção de corpos apoptóticos e tecidos mortos. Por outro lado, figuram como a principal fonte de citocinas e fatores de crescimento (EGF, FGF, PDGF, TGF-β e VEGF) que estimulam a proliferação de fibroblastos e a biossíntese de colágeno (ENOCH e LEAPER, 2005; OLCZYK et al., 2014). A ação antimicrobiana dos macrófagos difere da dos neutrófilos pela síntese aumentada de óxido nítrico (NO) que, ao reagir com peróxidos, resulta em um alto potencial destrutivo (ISAAC et al., 2010).

Os mastócitos constituem outro tipo celular conhecido por estar envolvido em uma variedade de processos de defesa do organismo. São identificados pela presença de grânulos citoplasmáticos proeminentes contendo PGs e histamina que se coram metacromaticamente com o azul de toluidina. Tais células constituem um importante passo na reação de hipersensibilidade imediata que ocorre em doenças alérgicas, tais como: urticária, asma brônquica e rinite alérgica (SASAKI et al., 2016). No processo de reparo, a função dos mastócitos envolve o recrutamento de leucócitos, especialmente macrófagos, para o sítio injuriado (BALBINO et al., 2005).

Os mediadores químicos que participam desta fase (TGF-β, PDGF, TGF-α) controlam o processo inflamatório e também participam do recrutamento, da ativação de fibroblastos e de células epiteliais, criando condições para iniciar a próxima fase do processo de cura: a fase proliferativa (OLCZYK et al., 2014).

2.9.3 Proliferação

A fase proliferativa consiste na etapa em que a reconstrução do tecido danificado é intensificada. Nesta etapa há um acúmulo de células no local da lesão em razão da migração e proliferação de fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos (OLCZYK et al., 2014).

(33)

A migração e proliferação de fibroblastos acontece a partir das margens livres da lesão e de células mesenquimais, estimuladas por fatores quimioatraentes e mitogênicos como EGF e PDGF. Estas células são responsáveis pela síntese do colágeno que formará a nova matriz cicatricial. Fibroblastos diferenciados (miofibroblastos) expressam α−actina e α−miosina, tornando-os capazes de se contrair e expandir e, desta forma, movimentarem-se no leito da lesão. Durante a movimentação dos miofibroblastos, ocorre deposição de fibronectina sobre o leito provisório rico em fibrina, formado na fase hemostática. Então, os miofibroblastos, agora diferenciados em fibroblastos, começam a deposição de colágeno sobre o novo leito de fibronectina. Existem cerca de 20 tipos de colágeno descritos na literatura. Na matriz dérmica, há essencialmente dois: colágeno tipo I e tipo III (ISAAC et al., 2010). A fase proliferativa é constituída por duas etapas fundamentais: epitelização e formação de tecido de granulação (MANDELBAUM et al., 2003; REINKE e SORG, 2012).

A epitelização ocorre precocemente e tem a missão de restaurar os estratos da camada epidérmica que foram perdidos com a ocorrência da lesão e restabelecer a função protetora da pele (MANDELBAUM et al., 2003; REINKE e SORG, 2012; RITTIÉ, 2016). Nas primeiras 24 a 36 horas após a lesão, fatores de crescimento epidérmicos estimulam a proliferação de células do epitélio. As células-tronco da camada basal estão em constante atividade mitótica e são responsáveis por substituir os queratinócitos das camadas mais externas que foram destruídas devido à lesão (REINKE e SORG, 2012; RITTIÉ, 2016).

Já o tecido de granulação sustenta uma recente e frágil rede de aparência vermelha e heterogênea composta por colágeno recém-sintetizado e vasos sanguíneos recém-formados (GONÇALVES e PARIZOTTO, 1998). Consiste em uma densa população de macrófagos, fibroblastos e vasos sanguíneos embebidos em uma matriz frouxa de fibras de colágeno (REINKE e SORG, 2012; RITTIÉ, 2016).

A formação do tecido de granulação é marcada por 2 eventos: fibroplasia e angiogênese (REINKE e SORG, 2012; RITTIÉ, 2016).

A fibroplasia é caracterizada pela migração e proliferação de fibroblastos e intensa síntese de colágeno (BALBINO et al., 2005). Este evento ocorre a partir do 3º dia após a injúria e neste período ocorre a síntese do colágeno tipo III. Por volta de três semanas, a taxa de síntese declina dando início à maturação deste colágeno que

(34)

será substituído pelo colágeno tipo I, responsável pela estrutura e força tênsil da pele (TUAN e NICHTER, 1998; BALBINO et al., 2005; PAWELEC et al., 2016).

Por sua vez, a angiogênese consiste na formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, estimulada por fatores de crescimento (VEGF e TGF-β), baixa tensão de oxigênio, baixo pH e alta concentração de ácido láctico. A importância da angiogênese se deve à sua participação na formação do tecido de granulação e no suprimento de nutrientes e oxigênio para o tecido em crescimento (FOLKMAN e SHING, 1992; LANDÉN et al., 2016).

2.9.4 Remodelamento

Por volta do décimo dia, o leito do sítio injuriado está totalmente preenchido pelo tecido de granulação e, então, inicia-se a fase de remodelamento ou maturação (TUAN e NICHTER, 1998; REINKE e SORG, 2012; OLCZYK et al., 2014). A resolução de uma lesão somente pode ser considerada completa após a conclusão de tal etapa (BALBINO et al., 2005), cujo processo ocorre lentamente e pode durar meses ou anos (LANDÉN et al., 2016). Essa fase visa normalizar a espessura da camada epidérmica e dérmica (o conteúdo celular, a composição da MEC e vasos sanguíneos) (RITTIÉ, 2016). Com isso, é restabelecido o equilíbrio entre a produção e destruição das fibras de colágeno por ação de metaloproteinases da matriz, tais como: MMP-2 e MMP-9 (TUAN e NICHTER, 1998). O conteúdo celular também é equilibrado pela apoptose de fibroblastos e células endoteliais (BALBINO et al., 2005). O colágeno III é remodelado e substituído por colágeno I (TUAN e NICHTER, 1998; BALBINO et al., 2005) e o número de novos vasos sanguíneos diminui (isso explica o clareamento da lesão ao final do processo). O desequilíbrio desta relação favorece o aparecimento de cicatrizes hipertróficas e queloides (TUAN e NICHTER, 1998; REINKE e SORG, 2012; OLCZYK et al., 2014).

Durante a fase de remodelamento ocorre também a contração da lesão ocasionada pelo aumento da resistência tênsil com consequente diminuição da área lesionada. Trata-se de um processo benigno que consiste no movimento centrípeto dos tecidos que compõem a pele a partir das margens da lesão (GRINNELL, 1994; RITTIÉ, 2016). Este evento inicia-se por volta de 3 a 5 dias após a lesão e atinge o ápice de atividade 12 a 15 dias após a injúria (KAMAMOTO, 2007). O processo resulta

(35)

em cicatrização mais rápida, reduz o risco de infecção e perdas metabólicas (GRINNELL, 1994; KAMAMOTO, 2007).

2.9.5 Fatores que interferem no reparo

Lesões que exibem problemas na cicatrização, como lesões crônicas, geralmente não atingem o estágio de cura por vias normais. De acordo com Guo e DiPietro (2010), os fatores que influenciam o reparo são: oxigenação, infecção, idade, estresse, hormônio, diabetes, medicamentos, obesidade, nutrição e consumo de álcool e tabaco.

A oxigenação impede, sobretudo, a infecção na lesão. Além de induzir a angiogênese, aumenta a migração e diferenciação de queratinócitos, melhora a reepitelização, interfere na proliferação de fibroblastos e na síntese de colágeno, bem como promove a contração da lesão.

A infecção, por sua vez, pode prolongar a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e promover o estado crônico da lesão.

Os autores ressaltam a idade como o principal fator de risco para o reparo, uma vez que a cicatrização nos idosos é associada a uma resposta inflamatória alterada com infiltração tardia de células T na área da lesão e redução da atividade fagocitária de macrófagos. Além disso, o fator idade é responsável pelo retardamento da reepitelização e interfere na síntese de colágeno e angiogênese. Outro fator de risco seria o estresse, uma vez que se associa com o desencadeamento de várias patologias e resulta no desequilíbrio do sistema imunológico, comprometendo a cicatrização em pacientes diabéticos e promovendo doenças cardiovasculares e câncer. A obesidade também é citada como fator de risco, já que pode gerar complicações no reparo da lesão como hematomas e formação de seroma e úlceras venosas. Por fim, os hábitos nutricionais, ingestão de bebidas alcoólicas e tabagismo também se associam com o comprometimento da cura da lesão (GUO e DIPIETRO, 2010).

(36)

3. JUSTIFICATIVA

Por muitos anos, as propriedades clínicas da heparina concentraram-se no seu potencial anticoagulante. Entretanto, estudos recentes descrevem sua afinidade por diversos elementos da matriz extracelular. As interações estabelecidas entre a heparina e a MEC potencializam sua importância no processo de cicatrização da pele e, por isso, muitos estudos têm sido realizados quanto à sua estrutura química e farmacológica, despertando interesse clínico por suas propriedades cicatrizantes e sua atuação ativa no reparo tecidual (EHRLICH e STIVALA, 1973; ISAAC et al., 2010; SILVEIRA, 2014; PRYDZ, 2015).Esta droga é extraída de diferentes tecidos animais e, além disso, apresenta extensa diversidade química na sua cadeia estrutural (OLCZYK et al., 2015). Sendo assim, as HPs comerciais representam um grupo de fármacos distintos e, portanto, podem apresentar diferentes respostas no reparo tecidual (SANTOS et al., 2014).

Desta forma, ressaltou-se a necessidade de realizar uma pesquisa que abordasse os efeitos destas diferentes drogas (HPbov, HPsui e HBPM) no contexto da cicatrização da pele, através da via tópica.

(37)

4. OBJETIVO

4.1 GERAL

Comparar os efeitos da heparina não fracionada (HNF) de origem bovina, da heparina não fracionada de origem suína e da heparina de baixo peso molecular (HBPM) em lesões na pele de camundongos para, com isso, avaliar a eficácia de tais drogas na composição e organização dos elementos da MEC da pele mediante o processo de cicatrização analisado no 3° e no 7° dia após injúria.

4.2 ESPECÍFICOS

 Avaliar, macroscopicamente, o grau de contração da lesão através do diâmetro das lesões;

 Analisar a lesão e o infiltrado inflamatório na derme, em cortes corados com HE;

 Analisar o a atividade das enzimas MPO e NAG;

 Analisar a presença de mastócitos na lesão, em cortes histológicos corados com azul de Toluidina;

 Analisar a angiogênese com base na dosagem do conteúdo de hemoglobina nas lesões e através do diâmetro dos vasos sanguíneos em cortes histológicos corados com Tricrômico de Gômori;

 Analisar a organização do colágeno I e III através de cortes histológicos corados com Picrosirius red e capturas de imagens realizadas com filtro de polarização;

 Quantificar o colágeno solúvel na lesão através do ensaio colorimétrico pela reação do Picrosirius red;

(38)

5. MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Uberlândia, sob o protocolo nº 045/17.

Foram utilizados camundongos Swiss machos com idade de 9 semanas. Os animais foram dispostos, individualmente, em caixas de polipropileno (com identificação para cada grupo) e acondicionados/condicionados em gabinetes apropriados com água e ração ad libitium, sob o ciclo de 12h de claro/escuro no depositário de animais da UFU.

O número experimental consistiu em 64 camundongos. O experimento ocorreu em duas etapas, sendo 32 animais em cada etapa, subdivididos em 4 grupos de 8 animais. (Tabela 2).

Tabela 2: Grupos experimentais (n=8).

5.2 MODELO EXPERIMENTAL

Para a realização desta pesquisa, foram criadas 4 lesões de espessura total no dorso do animal, até que a fáscia muscular ficasse exposta. As lesões foram feitas com um punch metálico dermatológico de 5 mm. (Figura 6).

GRUPOS

Grupo CO - animais lesionados e tratados com gel contendo vaselina 30% / lanolina 70%.

Grupo HPbov - animais lesionados e tratados com gel contendo heparina bovina.

Grupo HPsui - animais lesionados e tratados com gel contendo heparina suína.

Grupo HBPM - animais lesionados e tratados com gel contendo heparina de baixo peso molecular.

(39)

Figura 6 - A) Quatro lesões realizadas do dorso do animal expondo a fáscia muscular. B) Punch metálico dermatológico de 5 mm.

5.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO

O procedimento cirúrgico para a realização das lesões envolveu uma anestesia intraperitonial prévia com ketamina (80 mg/kg) e Xilazina (5 mg/kg), seguido de tricotomia e assepsia da região dorsal com álcool 70% v/v. Os animais foram dispostos em mesa cirúrgica para a realização de 4 lesões dorsais com o auxílio de punch metálico dermatológico de 5 mm de diâmetro, com lâmina cortante na borda. A pele e a tela subcutânea foram removidas, de forma que foi exposta a fáscia muscular dorsal. Os animais foram mantidos em observação, sob luz incandescente para mantê-los aquecidos até a recuperação do efeito anestésico. Após a recuperação, os animais foram dispostos, separadamente, em caixas com água, ração e mantidos em estantes apropriadamente condicionadas.

5.4 ELABORAÇÃO DO GEL DE HP

Nesta pesquisa, foi utilizado um veículo contendo vaselina 30% e lanolina 70% para elaboração do gel de HP. As propriedades físico-químicas da lanolina, somadas à sua alta afinidade com compostos polares, tornam viável o uso deste gel como veículo para uso tópico da HP no tratamento de lesões.

Referências

Documentos relacionados

A Biopsia de Vilo Corial pela via transabdominal, devido a sua praticabilidade, inocuida- de e eficácia, deve ser o procedimento de escolha para o estudo citogenético pré-natal..

Confirmando-se através de dados obtidos com a aplicação de questionários com os segmentos de clientes envolvidos, de que o modelo de negócio realmente solucionaria alguns

nio da frequência complexa s para o modelo do Sistema de Potência.. em equaçoes de estado, passam por considerações sôbre o

Metadados cuidadosamente elaborados, seguindo padrões nacionais ou preferencialmente internacionais, permitem o tratamento adequado das informações contidas em um recurso,

The  surface  immunglobulin  that  serves  as  the  BCR  has  two  functions  in  B‐cell  activation.  First,  like  the  antigen  receptor  on  T  cells, 

Entre os dois limiares, pelo menos para certos valores dos parâmetros (isto é, com certas condições adicionais que certamente não são ótimas), foi possível provar a existência de

A presente dissertação objetiva analisar um corpus constituído por textos escritos, especialmente, para serem inseridos em contra-capas, ‘orelhas’ e sinopses de catálogos de

• Grupo de recrutamento em que se encontra provido(a) ou colocado(a) (código dos grupos de recrutamento - Decreto-Lei n.º 27/2006, de 10 de fevereiro e Decreto-Lei n.º 176/2014 de