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54/Cosmetics & Toiletries (Brasil) www.cosmeticsonline.com.br Vol. 19, set-out 2007
Foi analisado o mecanismo de formação de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD) na pele
como fotoproduto induzido por UV, em seguida, foi avaliado o efeito do extrato de algodão
na formação de lesões de CPD com o uso de imunocitologia e dot-blot método em
queratinócitos humanos.
Analizado el mecanismo de formación de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD) en la piel
como fotoproducto inducido por UV. En seguida, evaluado el efecto de el extracto de
almidón en la formación de lesiones de CPD con el uso de imunocitologia y dot-blot método
en queratinócitos humanos.
The cyclobutane-pyrimidine dymers (CPD) formation as photoproduct UV-induced in the skin
is evaluated. Finally, the effect of the cotton extract in the CPD lesions in human keratinocytes
are evaluated by immunocytology and dot-blot method.
radiação solar que incide na super-fície do nosso planeta é indispensá-vel para o desenvolvimento de plantas, animais e seres humanos. Símbolo da vida, pureza e poder, o sol sempre exerceu fascinação sobre a humanidade.
Embora a luz solar seja necessária e benéfica para nós (síntese de vitamina D, efeito antidepressivo), ela pode desenca-dear efeitos biológicos responsáveis por reações químicas que freqüentemente são nocivas à pele (eritema actínico, heli-odermia, fotossensibilização, câncer). Assim, embora o sol seja indispensável para a vida, sua energia potencialmente destrutiva requer cuidados por parte das pessoas, como a fotoproteção.
O espectro solar é composto por am-plo intervalo de radiação, do qual parte, ultravioleta (100-400 nm), atinge a super-fície da Terra após ser difundida pela at-mosfera. A UV é composta por UVC (200-280 nm), UVB ((200-280-320 nm) e UVA (320-400 nm). A radiação que incide sobre a su-perfície da pele não é constante: depende da latitude, da estação do ano, das condi-ções atmosféricas e, principalmente, do período do dia em que o indivíduo se ex-põe. Composta por partículas elementares chamadas de fótons, a radiação UV é ca-racterizada por comprimento de onda que expressa a sua energia: quanto mais cur-to o comprimencur-to, maior a energia da
ra-A
diação e maior são os seus efeitosbioló-gicos sobre a pele. A pele reflete e desvia uma porção da radiação, mais ainda ab-sorve o restante. Esta absorção inclui a UVB, da qual somente 10% atinge a cama-da basal cama-da epiderme após ser parcialmen-te absorvida por queratinócitos e melani-na, e a UVA (aproximadamente 80%) que penetra nas camadas da pele até a derme. Como resultado da absorção pela ca-mada de ozônio, considera-se que a UVC não chegue à superfície terrestre e, con-seqüentemente, não possui efeitos bioló-gicos na pele. No entanto, por conta da poluição crescente, a camada de ozônio está se tornando mais delgada e a prote-ção contra a UVC está se tornando uma preocupação, já que seu comprimento de onda é bastante curto e, portanto, biolo-gicamente ativo.
Danos Oxidantes causados
pela Radiação UVA
A radiação UVA não é absorvida dire-tamente pelo DNA, mas pode prejudicá-lo indiretamente através da liberação de es-pécies reativas de oxigênio. As lesões oxi-dantes do DNA são produzidas pela fo-tossensibilização, tanto por transferência de carga de um cromóforo endógeno ex-citado, ou por reação com espécies reati-vas de oxigênio produzidas nesses
com-primentos de onda (Perdiz et al., 2000). As principais lesões causadas pela UVA são purinas oxidadas, em particular 8-oxo-7,8-di-hidroguanina (8-oxoGua). Também foi relatado na literatura que a exposição das células à radiação UVA in-duz a formação de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD) (Cario-Andre, 2000).
Fotoprodutos e a
Radiação UVB
A radiação UVB foi um dos primeiros agentes identificados com a capacidade de induzir danos ao DNA porque seu es-pectro de emissão é o mesmo eses-pectro de absorção do DNA. Nesses comprimen-tos de onda, fótons UVB podem ser dire-tamente absorvidos pelo DNA das célu-las e causar reações de degradação às ba-ses de pirimidina,timina e citosina (Cario-Andre, 2000).
Essa é a razão pela qual a maior parte do potencial oncogênico da luz solar é atribuída à UVB. Reações de dimerização ocorrem em regiões onde há duas bases de pirimidina adjacentes. Diversos tipos de fotoprodutos são formados, na sua maioria dímeros de pirimidina ciclobutano (6-4) e aductos de pirimidona (6-4PP).
Após estresse induzido por UVB, as lesões ocorrem imediatamente e a quanti-dade de fotoprodutos acumulada no DNA depende da dose de UVB aplicada. A quantidade de lesões fotoinduzidas tam-bém influencia a sua taxa de reparo (Ma-eda et al., 2001; Courdavault et al., 2005).
Resposta Celular
Com objetivo de se proteger contra as lesões endógenas ao DNA (aproximada-mente 10.000 lesões por dia) ou da degra-dação fotoinduzida, todas as células são equipadas com um complexo sistema de
Nova abordagem para Proteção do DNA
C. Lenaers, D. Boudier, V. Barruche, B. Closs
R&D Department, Silab, Brive, Françawww.cosmeticsonline.com.br Cosmetics & Toiletries (Brasil)/5555555555 Vol. 19, set-out 2007
defesa para reparo de DNA danificado. A principal via de eliminação dos fotopro-dutos, especialmente CPD e 6-4PPs, é o mecanismo de reparo por excisão de nu-cleotídeos (NER). Este é composto de duas partes: reparo total do genoma, um sistema de vigilância da molécula do DNA por inteiro, e reparo acoplado à transcrição, que elimina especificamente os danos em fitas transcritas de DNA (Wang et al., 2003). No caso de NER aco-plado à transcrição, a RNA polimerase é responsável por detectar o DNA danifica-do, enquanto no NER propriamente dito é a proteína XPC. Esta proteína facultativa é rapidamente mobilizada entre 30 minutos e 2 horas, após um estresse por UV (Adi-moolam et al., 2002; Wang et al., 2003).
A eliminação dos fotoprodutos tam-bém está relacionada à indução de apop-tose que ocorre 24 horas após a radiação, e também com a redução da capacidade de proliferação da célula. Esses dois pro-cessos são acionados para prevenir a di-visão da célula, cujo genoma foi alterado, favorecendo a sua morte ou o reparo do seu DNA, dependendo da extensão do dano induzido. O CPD formado em abun-dância e corrigido apenas em parte, per-siste no genoma da célula, quando recu-pera as suas capacidades de proliferação. Por isso, são considerados os grandes responsáveis pelos efeitos mutagênicos das radiações UV (Courdavault et al., 2005). Se essas mutações estiverem situ-adas em genes-chave para o funciona-mento da célula, podem causar a sua transformação cancerosa ou desencade-ar o processo de morte programada da célula, apoptose.
Para avaliar o efeito de um ingredien-te cosmético na formação de lesões dire-tas ao DNA induzidas por UVB, primeiro se estudou um modelo para visualizar a aparência do CPD, uma das principais le-sões causadas pela radiação UVB, no núcleo de queratinócitos humanos nor-mais. O primeiro objetivo foi determinar o período pós-irradiação no qual o nível de CPD induzido no núcleo do queratinóci-to fosse máximo. Este é também o perío-do no qual o processo celular de reparo de DNA ainda não está no nível ótimo. A eficiência deste processo e, portanto, a proteção da estabilidade do genoma da célula, resulta no balanço entre quanto o organismo é exposto a fatores variados de indução de lesões de DNA, e sua capacida-de capacida-de reparo (Hadshiew et al., 2000).
Fotoprodutos foram determinados em diferentes períodos após a exposição das células a uma única dose de UVB.
Uma vez estabelecido o período, exami-nou-se a influência de doses diferentes de UVB na quantidade de CPD forma-do. Estes experimentos iniciais permi-tem que sejam definidas condições pa-dronizadas (tempo e intensidade da radi-ação UVB) no modelo em estudo para posteriormente determinar o efeito de um ativo cosmético na quantidade de lesões persistentes após a irradiação de UVB.
Materiais e Métodos
Modelagem da formação
de CPD após UVB
1. Visualização de CPD por
imunocitofluorescência
Queratinócitos humanos normais fo-ram inoculados à densidade de 40.000 células por poço em câmaras de cultura Labtek (Falcon, 354108) em 500µl de meio de cultura KSFM (Invitrogen, 17005-034, CA, Estados Unidos) com 5 ng/ml de EGF (fator de crescimento epidérmico) (Invitrogen, 15290-012). Após dois dias de crescimento a 37ºC numa incubadora com atmosfera úmida contendo 5% de CO2, o meio de cultura foi eliminado após as células terem atingido 70% de conflu-ência. As células foram então enxagua-das em solução tampão de PBS (Invitro-gen, 18912-014).1.1 Em relação ao tempo
- Irradiação de UVB de queratinóci-tos: As células foram irradiadas com UVB (312 nm) à intensidade de 80 mJ/cm2 com um sistema Biosun (Vilber Lourmat, Tor-cy, França) em 500 µl de meio 1:199. Após a irradiação, as células foram introduzidas num meio de cultura KSFM a 37ºC, em at-mosfera úmida com 5% CO2 foram incuba-das por 1, 3, 5 e 16 horas. O controle foi as células não irradiadas.- Marcação imunocitofluorescente
do CPD: Após cada período de incuba-ção, foi conduzido um processo de mar-cação por fluorescência imunocitológica do CPD. As câmaras de cultura foram desmontadas, as lâminas foram enxagua-das por 5 minutos em PBS (Invitrogen, 18912-014), fixadas em solução a 4% (v/v) de para-formaldeído (Sigma, F-1635, Lyon, França) por 15 minutos e depois permea-bilizada em solução a 0,50% (m/v) de sa-ponina por 5 minutos (Sigma, S-4521).
As lâminas foram então incubadas por 45 minutos com anticorpo monoclo-nal anti-CPD de origem murina (diluição 1/250) (Sigma, T1192). Foram enxagua-dos por 5 minutos em PBS-1% Tween (Dako, S3306, Glostrup, Dinamarca),
de-56 5656 56
56/Cosmetics & Toiletries (Brasil) www.cosmeticsonline.com.br Vol. 19, set-out 2007 Figura 3. Efeito do extrato de algodão na quantidade de CPD após 5 h de irradiação com UVB (150 mJ/cm2) em
queratinócitos humanos normais
Controle não-irradiado
CPD formado - Controle UVBQuantidade de CPD +++ UVB + 0,5% de extratode algodão Quantidade de CPD ++ UVB + 1% de extrato de algodão Quantidade de CPD + UVB + 2% de extrato de algodão Quantidade de CPD
-Figura 2. Formação do CPD (5 h) versus intensidade de radiação UVB em queratinócitos humanos normais
Controle não-irradiado
CPD formado - Células irradiadas comUVB 50 mJ/cm2
CPD formado +
Células irradiadas com UVB 80 mJ/cm2
CPD formado ++
Células irradiadas com UVB 150 mJ/cm2
CPD formado +++
Tabela 1. Efeito da intensidade da radiação UVB na formação do CPD em queratinócitos humanos normais
CPD (%)
Células não irradiadas 100 Células irradiadas com UVB a 80 mJ/cm2 200*
Células irradiadas com UVB a 150 mJ/cm2 293* *Resultados significantes de acordo com o teste de Student em comparação com o controle não-irradiado dos queratinócitos (P < 0,05)
Figura 4. Efeito do extrato de algodão na quantidade de CPD 5 horas após a irradiação UVB (150 mJ/cm2),
em queratinócitos humanos normais
NIC UVBC 0,5% 1% 2% 150 mJ/cm2 Extrato de algodão
Figura 1. Cinética de formação de CPD após irradiação com UVB (80 mJ/cm2) em queratinócitos humanos normais
Controle não-irradiação
CPD formado - Células irradiadas comUVB: + 1 h CPD formado +
Células irradiadas com UVB: + 3 h
CPD formado ++
Células irradiadas com UVB: + 5 h
CPD formado +++
Células irradiadas com UVB: + 16 h
CPD formado +
Figura 5. Efeito do extrato de algodão na quantidade de CPD após 5 horas de radiação UVB (150 mJ/cm2)
em queratinócitos humanos normais
Á
re
as
(%
)
Controle Controle irradiado UVB + 0,5% UVB + 1% UVB + 2% não-irradiado com UVB de extrato de extrato de extrato de algodão de algodão de algodão
*Resultados significantes de acordo com o teste de Student em comparação com o controle não-irradiado dos
queratinócitos (P < 0,05)
**Resultados significantes de acordo com o teste de Student
em comparação com o controle irradiado dos queratinócitos (P < 0,05)
www.cosmeticsonline.com.br Cosmetics & Toiletries (Brasil)/5757575757 Vol. 19, set-out 2007
pois duas vezes durante 5 minutos em PBS. As lâminas foram incubadas por 35 minutos a 4°C com anti-murina IgG conjuga-do à FITC (diluição 1/400) (A-11004, AlexaFluor 488, Molecular Probes, Estados Unidos). Depois de dois enxágües de 5 minu-tos em PBS, um meio fluorescente (Dako, S3023) foi usado para preencher o espaço entre a lâmina e a lamínula.
- Leitura da imunomarcação: A imunomarcação foi visua-lizada com um microscópio IX 70 (Olympus, Tokyo, Japão) aco-plado a um sistema de análise de imagem, Visiolab 2000 (Biocom, Les Ulis, França). A quantidade de CPD é proporcional à inten-sidade de fluorescência no núcleo dos queratinócitos. Quanto maior a fluorescência, maior a formação de CPD.
1.2 Em relação à intensidade de UVB
- Radiação UVB de queratinócitos: As células foram irra-diadas com UVB a intensidades de 50, 80 e 150 mJ/cm2 com um sistema Biosun (Vilber-Lourmat, Torcy, França) em 500 µl de meio 1: 199. Depois da irradiação as células foram colocadas em meio de cultura KSFM e incubadas a 37ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2 por 5 horas. O controle foi as células não irradiadas.
- Marcação de CPD com imunocitofluorescência: Depois
de 5 horas de incubação, a marcação do CPD com imunocitoflu-orescência foi realizada. Vide seção 1.1 –”Marcação imunocito-fluorescente do CPD” para o procedimento.
- Leitura da imunomarcação: Vide seção 1.1 – “Leitura da imunomarcação”
2. Semi-quantificação de CPD por dot-blot
- Cultura de células e radiação UVB: Queratinócitos
hu-manos normais foram inoculados em meio KSFM (Invitrogen, 17005-034) em placas de Petri de 100 mm de diâmetro a densida-de densida-de 106 células por placa, seguidas de incubação a 37ºC em atmosfera de 5% CO2 durante 4 dias, renovando o meio de cul-tura a cada dois dias. Após a incubação quando as células atin-giram 70% de confluência, o meio de cultura foi descartado. As células foram enxaguadas em PBS (Invitrogen, 18912-014) e ir-radiadas com UVB nas intensidades de 80 e 150 mJ/cm2 com um sistema Biosun (Vilber-Lourmat, Torcy, França) em 5 ml de meio 1:199. Após a irradiação, as células foram colocadas em meio KSFM e incubadas a 37ºC com atmosfera úmida de 5% de CO2 por 5 horas. Os controles foram as células não-irradiadas.
- Dot-blot: Após a incubação, o DNA foi extraído com um QIAmp DNA Mini Kit (Qiagenm 5104, Courtaboeuf, França). O DNA foi quantificado através da medida de absorbância em 260 e 280 nm com um biofotômetro (Eppendorf Biophotometer). 200 ng de DNA de diferentes amostras foram imobilizados numa membrana Zetaprobe (Bio-Rad, Marne la Coquette, França) usando o aparato de Biodot (Bio-Rad, Marne la Coquette, Fran-ça). O DNA foi então fixado através da incubação da membra-na a 80°C por 30 minutos.
a) Imunomarcação: a membrana foi saturada por uma hora
numa solução de PBS-Tween (Dako-S3306) contendo 5% de leite desnatado e incubada por toda a noite com anticorpo monoclo-nal anti-CPD de origem murina (diluição 1/250) (T1192, Sigma). Após enxágüe, a membrana foi incubada com anti-murina IgG conjugada a peroxidase (HRP, PO447, Dako). O sinal foi obtido com um kit OPTI-4CN (Bio-Rad)
b) Visualização: os spots foram semi-quantificados por densitometria após análise de imagem com o software TotalLab (Perkin Elmer, MA, Estados Unidos). A intensidade da marcação do CPD é proporcional à intensidade da cor do spot. Quanto mais intenso o spot, maior a formação de CPD.
Estudo do efeito do extrato de algodão
na formação de CPD
O efeito do extrato de algodão na formação de CPD foi de-terminado por imunocitologia e semi-quantificado por Dot-blot (procedimentos idênticos aos descritos nas seções 1 e 2). Que-ratinócitos humanos normais foram irradiados com a dose mais alta de UVB estudada (150mJ/cm2) e tratados em seguida com 0,5%, 1% e 2% de extrato de algodão por 5 horas.
Resultados
Modelagem da formação
de CPD após irradiação UVB
1. Detecção de CPD por imunocitofluorescência
Como os resultados de imunocitologia são qualitativos, 4 níveis de intensidade de imunofluorescência foram definidos, correspondendo a 4 quantidades de CPD formadas:58 5858 58
58/Cosmetics & Toiletries (Brasil) www.cosmeticsonline.com.br Vol. 19, set-out 2007 - Não detecção de imunorreatividade
(sem formação de CPD)
-- Leve detecção de imunorreatividade (pouca quantidade de CPD formada)
+
- Moderada detecção de imunorreatividade (quantidade moderada de CPD formada)
+ +
- Forte detecção de imunorreatividade (alta quantidade de CPD formada)
+ + +
1.1 Em função do tempo
Como mostra a Figura 1, o sinal de fluorescência correspon-dente à presença de lesões de CPD foi detectado quando que-ratinócitos foram irradiados com UVB (80 mJ/cm2), enquanto um sinal bastante fraco foi detectado em células não-irradiadas (con-trole).
A quantidade de CPD formada aumentou entre 1 e 5 horas após a irradiação. Após 16 horas a intensidade da imunofluores-cência persistiu, mas foi inferior a das 5 horas, refletindo redu-ção do número de lesões no núcleo de queratinócitos irradia-dos. Baseado nesses resultados, a quantidade máxima de CPD fotoinduzido foi obtida após 5 horas, este ponto foi escolhido para determinar o efeito de diferentes doses de UVB na quanti-dade de CPD fotoinduzido.
1.2 Em função da radiação UVB
Quando os queratinócitos foram expostos a doses progres-sivas de UVB (50, 80 e 150 mJ/cm2), a intensidade de imuno-fluorescência (em 5 horas) aumentou progressivamente (Figu-ra 2). O número de fotoprodutos formados no DNA do que(Figu-rati- querati-nócito foi, portanto, dependente da dose de UVB. Nítido au-mento foi notado entre 50 e 80 mJ/cm2, sendo menor entre 80 e 150 mJ/cm2. Estes níveis de CPD formados pelas duas doses de
UVB foram semi-quantificadas por dot-blot para determinar se a diferença foi significante.
2. Quantificação de CPD por dot-blot
Dot-blot foi utilizado para semi-quantificar o efeito da inten-sidade da radiação UVB na quantidade de CPD formada no nú-cleo de queratinócitos. A quantidade de CPD induzido em célu-las irradiadas com doses de UVB de 80 e 150 mJ/cm2 aumentou de 100% para 193%, respectivamente, em comparação ao controle, de forma significante (Tabela 1). A quantidade de lesões formadas é, portanto, dependente da dose de irradia-ção de UVB.
Estudo do efeito do extrato de algodão na
quantidade de CPD fotoinduzido
1. Detecção do CPD por imunocitofluorescência
Como descrito anteriormente, a intensidade da imunofluo-rescência de células irradiadas com UVB foi alta, enquanto ne-nhum sinal foi detectado para o controle não-irradiado (Figura 3). Quando as células irradiadas foram tratadas com progressi-vas doses de extrato de algodão (0,5%, 1% e 2%), a intensida-de da imunocitofluorescência caiu progressivamente, chegan-do ao nível de praticamente zero (extrato de algodão 2%). As le-sões de CPD remanescentes no núcleo dos queratinócitos 5 horas após a irradiação foram, portanto, menos numerosas quando as células foram tratadas com o extrato de algodão. Além disso, houve aparente relação inversamente proporcional entre a quantidade de CPD persistente após 5 horas da irradiação e a dose de extrato de algodão usada para o tratamento.www.cosmeticsonline.com.br Cosmetics & Toiletries (Brasil)/5959595959 Vol. 19, set-out 2007
Com o objetivo de aprofundar os es-tudos e provar ou não esta relação, dot-blot foi usado para determinar o efeito do extrato de algodão na quantidade de le-sões de CPD remanescentes no núcleo de queratinócitos 5 horas após a irradiação.
2. Semi-quantificação de CPD
por dot-blot
Os spots obtidos nos estudos com dot-blot são mostrados na Figura 4. A in-tensidade do spot marcado corresponde à quantidade de CPD formado e remanes-cente 5 horas após irradiação dos quera-tinócitos. Os resultados estão de acordo com aqueles obtidos por imunofluores-cência e são descritos abaixo (Figura 3). Após a semi-quantificação dos spots por densitometria, observou-se que a quan-tidade de CPD presente no núcleo de queratinócitos irradiados com UVB foi de 293% (Figura 5) e a diferença foi signifi-cante em comparação ao controle não-ir-radiado. Quando as células irradiadas com UVB foram tratadas por 5 horas com extrato de algodão a 0,5%, 1% e 2%, o CPD foi de, respectivamente, 218%, 185% e 160%. Estas diferenças foram sig-nificativas em relação ao controle irradi-ado. O tratamento dos queratinócitos ir-radiados com extrato de algodão a 0,5%, 1% e 2% reduziram então a quantidade de CPD, 5 horas após a irradiação em 26%, -37% e -45%, respectivamente, todas as diferenças significantes.
Conclusão
A cinética de formação de lesões di-retas no DNA após irradiação de UVB em queratinócitos humanos mostrou que a quantidade de CPD formada atingiu seu nível máximo 5 horas após a irradiação. Esta quantidade diminuiu consideravel-mente 16 horas após o estresse. A maio-ria das lesões de CPD no núcleo dos que-ratinócitos foi, portanto, reparada entre 5 e 16 horas depois de uma única exposição à UVB (80 mJ/ cm2) por mecanismos de reparo do DNA como o NER.
Baseado nesta descoberta, decidiu-se determinar a quantidade de lesões de CPD induzidas por diferentes intensida-des de estresse UVB 5 horas após a irra-diação. Após irradiar queratinócitos com doses progressivas de UVB (50 80 e 150 mJ/cm2), observou-se proporcionalidade entre a dose de UVB irradiado e a quanti-dade de CPD formado. Estes resultados são consistentes com dados publicados (Ma-eda et al., 2001; Courdavault et al., 2005).
Os experimentos iniciais foram
usa-dos para padronizar o modelo de quera-tinócitos humanos irradiados com UVB, posteriormente utilizados no estudo do efeito de um ativo cosmético na quanti-dade de CPD induzido por UVB: querati-nócitos humanos foram irradiados com uma dose de UVB de 150 mJ/cm2, a dose mais alta usada no estudo anterior, e en-tão tratados com o extrato de algodão por 5 horas A imunofluorescência e o dot-blot mostraram que queratinócitos irradiados com UVB e depois tratados com extrato de algodão a 0,5%, 1% e 2% exibiram redução significativa na quanti-dade de lesões de CPD nos seus núcleos 5 horas após a irradiação do que os con-troles irradiados não-tratados. Como as células foram tratadas após a indução do estresse induzido por UV, pode-se supor que o extrato de algodão aumentou a efi-cácia dos mecanismos celulares para o re-paro do DNA danificado e/ou aceleraram a sua mobilização.
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