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FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU Curso de Pós-Graduação em Zootecnia – Nutrição e Produção Animal
MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS NOS
ALIMENTOS
Kátia Sardinha Bisinato e Fabiana Caldara
Zootecnistas
Disciplina: Métodos de Avaliação da Qualidade de Carnes Prof. Roberto de Oliveira Roça
Departamento de Gestão e Tecnologia Agroindustrial Fazenda Experimental Lageado, Caixa Postal, 237 F.C.A. - UNESP - Campus de Botucatu CEP 18.603-970 - BOTUCATU - SP robertoroca@fca.unesp.br
Métodos de Determinação de Aminoácidos nos Alimentos
• Alternativa I :
Oxidação do Ácido Perfórmico com hidrólise ácida : Método Metabisulfito de Sódio
Aplicado para determinação de aminoácidos (incluindo metionina e cistina) nos alimentos. Não aplicado para determinação de tirosina e triptofano.
A. Princípio:
A oxidação do ácido perfórmico é executada antes da hidrólise, para oxidar cistina e metionina em ácido cistéico e sulfato de metionina, respectivamente. Metabisulfato de sódio é adicionado para decompor ácido perfórmico. Aminoácidos são liberados da proteína pela hidrólise com 6N HCl. Amostras hidrolisadas são diluídas com citrato de sódio ou neutralizada, pH é ajustado para 2,2 e os aminoácidos são separados no cromatógrafo de troca de íons.
A Tirosina é destruída pela oxidação. O Triptofano é destruído pela hidrólise, assim estes aminoácidos não podem ser determinados precisamente.
B. Equipamentos:
a. Analisador de aminoácidos
b. Balança analítica – acurácia para aproximadamente 0,1 mg c. Balança para pesos maiores
d. Frascos – 50 ml de polietileno
e. Tubos de digestão - frascos de ebulição são adequados f. Caixas de digestão - ...de aquecimento são adequados g. Unidades de filtro – 0,22 mm
h. Agitador magnético
i. Phmetro – calibrado com solução tampão de pH 2,0; 4,0 e 7,0 j. Condensador de refluxo
k. Evaporador giratório l. Frasco à vácuo – 250 ml
m. Utensílios de vidro – Becker de vidro, 250 e 1000 ml; frascos de Erlenmeyer, 150 ml; frasco para evaporação de fundo redondo; cilindro graduado 100, 500 e 1000 ml; balão volumétrico, 1000ml; pipetas volumétricas, 10 e 20 ml
n. Filtro de vidro – porosidade 10-15µm o. Banho de gelo p. Seringas C. Reagentes: a. Ácido fórmico – 88% b. Peróxido de hidrogênio – 30% c. Metabisulfato de sódio d. Dl-Norleucina – sintético e. HCl - concentrado f. NaOH – solução 30% g. Fenol – sintético h. Tiodiglicol – solução 98% i. Citrato tri sódio di-Hidratado
j. Solução tampão de pH – pH 2,0; 4,0 e 7,0
k. Kit padrão de aminoácidos – para calibrar o analisador de aminoácidos
D. Preparo da Soluções:
a. Solução tampão de citrato de sódio, pH 2,2 – Pesar 19,60 g de citrato tri sódio di-hidratado em um Becker de 1000 ml e dissolver em aproximadamente 800 ml de água. Agitar um tempo, adicionar 10 ml de solução de tiodiglicol 98% e 15 ml de HCl concentrado. Transferir gradativamente a solução para um balão volumétrico de 1000 ml e diluir até a marca com água. Filtrar a solução tampão através de
sintered filtros de vidro, B(n). Ajustar pH para 2,2 com HCl concentrado ou 2N
NaOH.
b. 6N HCl – solução fenol – Pesar 1g de fenol sintético dentro de um Becker de 1000 ml tarado. Dissolver o fenol sintético em 500 ml de água. Agitar um tempo, adicionar lentamente 500 ml de HCl concentrado.
c. Soluções de HCl – (1) 1N HCl: Despejar aproximadamente 800 ml de água dentro de um balão volumétrico de 1000 ml e adicionar 83,3 ml de HCl usando pipeta. Diluir até completar a marca com água e misturar completamente. (2)
0,1N HCl: despejar aproximadamente 800 ml de água dentro de um balão volumétrico de 1000 ml e adicionar 100 ml de 1N HCl usando pipeta. Diluir até completar o volume com água e misturar completamente.
d. Solução de Na OH – (1) 7,5 N NaOH: Pesar 300g de NaOH em um Becker de 1000 ml tarado. (2) 2 N NaOH: Pesar 80g de NaOH em um Becker de 1000 ml tarado. Dissolver lentamente os pelets em cada Becker em aproximadamente 600 ml de água. Esfriar a solução e transferir gradativamente separados para balões volumétricos de 1000 ml. Diluir até a marca com água e misturar completamente.
e. Solução padrão de Norleucina – pesar precisamente 195-200 mg de Dl-Norleucina sintético em um Erlenmeyer de 150 ml tarado. Dissolver com 100 ml de 1N HCl. Transferir gradativamente a solução para um balão volumétrico de 1000 ml e diluir até a marca com água.
f. Reagente ácido perfórmico – Prepare hood. Pesar 25 mg de fenol sintético em tubo de ensaio de 25 ml; adicionar 0,5 ml de H2O2 30% usando micropipeta, e 4,5 ml de solução de ácido fórmico 88%. Fechar o tubo de ensaio com rolha e deixar a mistura na estante por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 30 minutos colocar os tubos de ensaio em um banho de gelo e misturar por 15 minutos o ácido perfórmico frio. Preparar o reagente imediatamente antes do uso.
E. Oxidação do Ácido Perfórmico:
Moer as amostras para passar em peneira de 0,25 mm. Pesar precisamente porções de 100-1000 mg de amostras moídas para aproximadamente 0,1 mg (equivalente para 10 mg de conteúdo de nitrogênio) dentro de tubos de digestão rotulados.
Cálculo aproximado da quantidade de amostras para uso:
Ws = 1000 / Ns
Onde: Ns = conteúdo de nitrogênio da amostra, %;
Ws = peso da amostra equivalente para o conteúdo de 10 mg de nitrogênio, mg.
Colocar o misturador magnético dentro de cada tubo e colocar os tubos com amostra dentro do banho de gelo (0ºC).
Após ambos, o ácido perfórmico e as amostras terem resfriado por no mínimo 15 minutos, adicionar 5 ml de ácido perfórmico dentro de cada tubo de amostra, cobrir todos os tubos com tampas de vidro e agitar por 15 minutos no prato do agitador magnético.
Retornar os tubos de amostras para o banho de gelo e deixar as amostras oxidarem 16 horas.
Remover as tampas de vidro e adicionar aproximadamente 0,84 g de metabisulfato de sódio para decompor ácido perfórmico. Agitar a solução por 15 minutos para liberar SO2.
F. Hidrólise:
Adicionar 50 ml de solução 6N HCl-fenol, D(b), na amostra e agitar um pouco. Remover ... e enxaguar com pequeno volume de 0.1N HCl dentro do tubo. Adicionar 2-3 pedaços de boiling chips na solução de amostra.
Hidrolizar as amostras sob refluxo por 24 horas à 110-120 o C usando bloco digestor, B(f). (Cuidado: Executar este passo com adequada ventilação devido a produção de gases).
Remover os tubos de amostra... Adicionar 20 ml de solução padrão de Norleucina, D(e), para cada amostra usando pipeta volumétrica. Misturar as soluções agitando os frascos. Proceder como (a) ou (b) abaixo:
Nota: Se baixa concentração de sódio é requerida para cromatografia, evaporar HCl cuidadosamente [execução passo (a)]. Se baixa concentração de sódio não é requerida executar o passo de neutralização (b).
(a) Filtrar as amostras hidrolizadas através de um filtro de vidro dentro de frascos de evaporação de 1000 ml rotulados. Conectar os frascos ao evaporador rotatório e evaporar as amostras sob vácuo à 40 º C até aproximadamente 5 ml. (Nota: Não deixar a solução evaporar até secar). Retirar os frascos do evaporador. Adicionar 50 ml de solução tampão de citrato de sódio, D(a), misturar bem as amostras evaporadas e transferir para frascos de polietileno de 50 ml rotulados., B(d). Proceder a determinação ou aguardar esfriar até a mensuração.
(b) Filtrar as amostras hidrolizadas em um frasco de vácuo de 250 ml, B(l), através de filtros de vidro e então transferir o filtrado para Beckers de 250 ml . Neutralizar as amostras com aproximadamente 40 ml de 0,5 N NaOH
D(d)(1) durante agitamento. (Nota: a temperatura não pode exceder 40 º C).
Ajustar o pH das amostras para 2,2 usando 2 N NaOH, D(d)(2). Proceder a determinação.
G. Determinação:
Diluir alíquotas de hidrólise evaporadas F(a) com solução tampão de citrato de sódio, D(a), e ajustar o pH para 2,2 com 2 N NaOH. Quando hidrólises neutralizadas
F(b) são usadas, diluir alíquota com água. Filtrar através de unidades de filtro, B(g),
dentro de tubos autosampler e introduzir no analisador (Nota: A resposta do analisador depende do volume da alíquota e diluição.)
Calibrar o analisador de aminoácidos com o kit de solução padrão de aminoácidos, C(k), contendo Norleucina. Operar o analisador de aminoácidos de acordo com as especificações do fabricante. Ajustar as condições do analisador para assegurar a separação da linha de base dos picos. A mínima resolução entre os picos deve ser 90 %.
H. Cálculos:
Calcular o fator resposta (RFaa) para cada aminoácido como segue:
RFaa = Pn x Waa / Paa x Wn
Onde: Paa = área do pico do aminoácido; Pn = área do pico da Norleucina; Waa = peso do aminoácido, mg; Wn = peso da Norleucina, mg.
Calcular o fator padrão interno (IS), como segue:
IS = Wn x 2 x 10 –2
Onde: mg de Norleucina = conteúdo de Norleucina em 20 ml de Norleucina padrão, D(e).
Calcular o conteúdo de aminoácidos (AA) das amostras como segue:
% AA = Paa x RFaa x IS x 100 / Pn x Ws
Onde: Paa = área do pico do aminoácido; Pn = área do pico de Norleucina; Ws = peso da amostra, mg;
RFaa = fator resposta de aminoácidos; IS = fator padrão interno.
• Alternativa II :
Oxidação do Ácido Perfórmico com hidrólise ácida : Método Ácido Hidrobrômico
Aplicado para determinação de aminoácidos (incluindo metionina e cistina) nos alimentos. Não aplicado para determinação de tirosina, triptofano, histidina e fenilalanina.
A. Princípio:
A oxidação do ácido perfórmico é executada antes da hidrólise, para oxidar cistina e metionina em ácido cistéico e sulfato de metionina, respectivamente. Ácido hidrobrômico é adicionado para decompor ácido perfórmico. Os aminoácidos são liberados da proteína pela hidrólise com 6N HCl. Amostras hidrolisadas são diluídas com solução tampão de citrato de sódio ou neutralizador, e os aminoácidos são separados no cromatógrafo de troca de íons.
A Tirosina, fenilalanina e histidina são destruídos durante o processo de oxidação e pela reação com bromo. O Triptofano é destruído pela hidrólise, assim estes aminoácidos não podem ser determinados com precisão.
B. Equipamentos:
a. Analisador de aminoácidos
b. Balança analítica – acurácia para aproximadamente 0,1 mg c. Balança para pesos maiores
e. Tubos de digestão – frascos de ebulição são adequados f. Caixas de digestão - mantle de aquecimento são adequados g. Unidades de filtro – 0,22 mm
h. Agitador magnético
i. Phmetro – calibrado com solução tampão de pH 2,0; 4,0 e 7,0 j. Condensador de refluxo
k. Evaporador giratório
l. Utensílios de vidro – Becker de vidro, 250 e 1000 ml; frascos de Erlenmeyer, 150 ml; frasco para evaporação de fundo redondo; cilindro graduado 100, 500 e 1000 ml; balão volumétrico, 1000ml; pipetas volumétricas, 10 e 20 ml
m. Filtro de vidro – porosidade 10-15µm n. Banho de gelo q. Seringas C. Reagentes: a. Ácido fórmico – 88% b. Peróxido de hidrogênio – 30% c. Ácido hidrobromico – 48% d. Dl-Norleucina – sintético e. HCl - concentrado f. NaOH – solução 30% g. Fenol – sintético h. Tiodiglicol – solução 98% i. Citrato tri sódio di-Hidratado
j. Solução tampão de pH – pH 2,0; 4,0 e 7,0
k. Kit padrão de aminoácidos – para calibrar o analisador de aminoácidos
D. Preparo da Soluções:
a. Solução tampão de citrato de sódio, pH 2,2 – Pesar 19,60 g de citrato tri sódio di-hidratado em um Becker de 1000 ml e dissolver em aproximadamente 800 ml de água. Agitar um tempo, adicionar 10 ml de solução de tiodiglicol 98% e 15 ml de HCl concentrado. Transferir gradativamente a solução para um balão volumétrico de 1000 ml e diluir até a marca com água. Filtrar a solução padrão através de filtro de vidro, B(m). Ajustar pH para 2,2 com HCl concentrado ou 2 N NaOH.
b. 6N HCl – solução fenol – Pesar 1g de fenol sintético dentro de um Becker de 1000 ml tarado. Dissolver o fenol sintético em 500 ml de água. Agitar um tempo, adicionar lentamente 500 ml de HCl concentrado.
c. Soluções de HCl – (1) 1 N HCl: Despejar aproximadamente 800 ml de água dentro de um balão volumétrico de 1000 ml e adicionar 83,3 ml de HCl usando pipeta. Diluir até completar a marca com água e misturar completamente. (2) 0,1 N HCl: despejar aproximadamente 800 ml de água dentro de um balão volumétrico de 1000 ml e adicionar 100 ml de 1 N HCl usando pipeta. Diluir até completar o volume com água e misturar completamente.
d. Solução padrão de Norleucina – pesar precisamente 195-200 mg de Dl-Norleucina sintético em um Erlenmeyer de 150 ml tarado. Dissolver com 100 ml de 1 N HCl. Transferir gradativamente a solução para um balão volumétrico de 1000 ml e diluir até a marca com água.
e. Reagente ácido perfórmico – Prepare hood Pesar 25 mg de fenol sintético em tubo de ensaio de 25 ml; adicionar 0,5 ml de H2O2 30% usando micropipeta, e 4,5 ml de solução de ácido fórmico 88%. Fechar o tubo de ensaio com rolha e deixar a mistura na estante por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 30 minutos colocar os tubos de ensaio em um banho de gelo e misturar o ácido perfórmico frio por 15 minutos. Preparar o reagente imediatamente antes do uso.
E. Oxidação do Ácido Perfórmico:
Moer as amostras para passar em peneira de 0,25 mm. Pesar precisamente porções de 100-1000 mg de amostras moídas para aproximadamente 0,1 mg (equivalente para 10 mg de conteúdo de nitrogênio) dentro de tubos de digestão rotulados.
Cálculo aproximado da quantidade de amostras para uso:
Ws = 1000 / Ns
Onde: Ns = conteúdo de nitrogênio da amostra, %;
Ws = peso da amostra equivalente para o conteúdo de 10 mg de nitrogênio, mg
Colocar o misturador magnético dentro de cada tubo e colocar os tubos com amostra dentro do banho de gelo .
Após ambos, o ácido perfórmico e as amostras terem resfriado por no mínimo 15 minutos, adicionar 5 ml de ácido perfórmico dentro de cada tubo de amostra, cobrir todos os tubos com tampas de vidro e agitar por 15 minutos no prato do agitador magnético.
Retornar os tubos de amostras para o banho de gelo e deixar as amostras oxidarem 16 horas.
Após a oxidação, remover as tampas de vidro e adicionar aproximadamente 0,70 ml de ácido bromico 48%para decompor ácido perfórmico. Agitar a solução por 30 minutos para liberar bromo.
Transferir os tubos de ensaio para o evaporador rotatório e agitar a solução sob vácuo em temperatura ambiente até a mudança de cor de laranja vivo para amarelado. Remover os tubos do evaporador e colocar no suporte de tubos.
F. Hidrólise:
Adicionar 50 ml de solução 6 N HCl-fenol, D(b), na amostra e agitar um pouco. Remover stirring bar usando a haste do agitador magnético e enxaguar com pequeno volume de 0.1 N HCl dentro do tubo. Adicionar 2-3 pedaços de boiling
chips na solução de amostra.
Hidrolizar as amostras sob refluxo por 24 horas à 110-120 o C usando bloco digestor, B(f). (Cuidado: Executar este passo com adequada ventilação devido a produção de gases).
Remover os tubos de amostra do quente e frio para temperatura ambiente. Adicionar 20 ml de solução padrão de Norleucina, D(d), para cada amostra usando pipeta volumétrica. Misturar as soluções agitando os frascos. Filtrar as amostras hidrolizadas através de filtros de vidro dentro de frascos de evaporação de fundo redondo de 1000 ml rotulados.
Evaporar a solução de amostra à 60 º C para secar usando evaporador rotatório. Lavar as amostras com aproximadamente 20 ml de água e evaporar novamente. Repetir a lavagem e a evaporação por mais 2 vezes.
Retirar os frascos do evaporador. Adicionar 50 ml de solução tampão de citrato de sódio, misturar bem as amostras evaporadas e transferir para frascos de polietileno de 50 ml rotulados., B(d). Proceder a determinação ou aguardar esfriar até a mensuração.
G. Determinação:
Diluir a alíquota da amostra hidrolizada com solução padrão de citrato de sódio,
D(a), filtrar através de filtros unitários de 0,22 µm dentro de tubos autosampler , e
colocar no analisador. (Nota: a resposta do analisador depende do volume da alíquota e diluição).
Calibrar o analisador de aminoácidos com o kit de solução padrão de aminoácidos, C(k), contendo Norleucina. Operar o analisador de aminoácidos de acordo com as especificações do fabricante. Ajustar as condições do analisador para assegurar a separação da linha de base dos picos. A mínima resolução entre os picos deve ser 90 %.
H. Cálculos:
Proceder como na Alternativa I.
• Alternativa III:
Método de hidrólise ácida.
Aplicado para determinação de aminoácidos nos alimentos exceto metionina, cistina e triptofano.
A. Princípio:
Aminoácidos são liberados da proteína pela hidrólise com 6 N HCl. Um padrão interno é adicionado e HCl é evaporado. Amostras são diluídas com solução tampão de citrato de sódio e os aminoácidos individualmente são separados pelo cromatógrafo de troca de íons. Cistina e metionina são parcialmente oxidados e o triptofano é completamente destruído; portanto, eles não podem ser quantificados com precisão.
B. Equipamentos :
a. Analisador de aminoácidos
b. Balança analítica – acurácia para aproximadamente 0,1 mg c. Balança para pesos maiores
d. Frascos – 50 ml de polietileno
f. Caixas de digestão – mantle de aquecimento são adequados g. Unidades de filtro – 0,22 mm
h. Phmetro – calibrado com solução tampão de pH 2,0; 4,0 e 7,0 i. Condensador de refluxo
j. Evaporador giratório
k. Utensílios de vidro – Becker de vidro, 250 e 1000 ml; frascos de Erlenmeyer, 150 ml; frasco para evaporação de fundo redondo; cilindro graduado 100, 500 e 1000 ml; balão volumétrico, 1000ml; pipetas volumétricas, 10 e 20 ml
l. Filtro de vidro – porosidade 10-15µm m. Seringas C. Reagentes: a. Dl-Norleucina – sintético b. HCl - concentrado c. NaOH – solução 30% d. Fenol – sintético e. Tiodiglicol – solução 98% f. Citrato tri sódio di-Hidratado
g. Solução tampão de pH – pH 2,0; 4,0 e 7,0
h. Kit padrão de aminoácidos – para calibrar o analisador de aminoácidos
D. Preparo das soluções:
a. Solução tampão de citrato de sódio, pH 2,2 – Pesar 19,60 g de citrato tri sódio di-hidratado em um Becker de 1000 ml e dissolver em aproximadamente 800 ml de água. Agitar um tempo, adicionar 10 ml de solução de tiodiglicol 98% e 15 ml de HCl concentrado. Transferir gradativamente a solução para um balão volumétrico de 1000 ml e diluir até a marca com água. Filtrar a solução tampão através de filtro de vidro. Ajustar pH para 2,2 com HCl concentrado ou 2 N NaOH.
b. 6 N HCl – solução fenol – Pesar 1g de fenol sintético dentro de um Becker de 1000 ml tarado. Dissolver o fenol sintético em 500 ml de água. Agitar um tempo, adicionar lentamente 500 ml de HCl concentrado.
c. Soluções de HCl – (1) 1 N HCl: Despejar aproximadamente 800 ml de água dentro de um balão volumétrico de 1000 ml e adicionar 83,3 ml de HCl usando pipeta. Diluir até completar a marca com água e misturar completamente. (2) 0,1 N HCl: despejar aproximadamente 800 ml de água dentro de um balão volumétrico de 1000 ml e adicionar 100 ml de 1 N HCl usando pipeta. Diluir até completar o volume com água e misturar completamente.
d. Solução NaOH – 2 N NaOH- Pesar 80g de NaOH em um Becker de 1000 ml tarado. Dissolver lentamente os pelets em cada Becker em aproximadamente 600 ml de água. Esfriar a solução e transferir gradativamente para balões volumétricos de 1000 ml. Diluir até a marca com água e misturar completamente. e. Solução padrão de Norleucina – pesar precisamente 195-200 mg de
Dl-Norleucina sintético em um Erlenmeyer de 150 ml tarado. Dissolver com 100 ml de 1 N HCl. Transferir gradativamente a solução para um balão volumétrico de 1000 ml e diluir até a marca com água.
E. Hidrólise:
Moer as amostras para passar em peneira de 0,25 mm. Pesar precisamente porções de 100-1000 mg de amostras para aproximadamente 0,1 mg (equivalente para 10 mg de conteúdo de nitrogênio) dentro de tubos de digestão rotulados.
Cálculo aproximado da quantidade de amostras para uso:
Ws = 1000 / Ns
Onde: Ns = conteúdo de nitrogênio da amostra, %;
Ws = peso da amostra equivalente para o conteúdo de 10 mg de nitrogênio, mg
Adicionar 50 ml de solução 6 N HCl-fenol, na amostra e agitar um pouco. Adicionar 2-3 pedaços de boiling chips na solução de amostra.
Hidrolizar as amostras sob refluxo por 24 horas à 110-120 o C usando bloco digestor, B(f). (Cuidado: Executar este passo com adequada ventilação devido a produção de gases).
Remover os tubos de amostra do quente e frio para temperatura ambiente. Adicionar 20 ml de solução padrão de Norleucina, D(e), para cada amostra usando pipeta volumétrica. Misturar as soluções agitando os frascos.
Filtrar as amostras hidrolizadas através de um filtro de vidro em frascos de evaporação de fundo redondo. Conectar os frascos no evaporador giratório, e evaporar as amostras à 60º C até secar. Lavar as amostras com aproximadamente 20 ml de água e evaporar novamente. Repetir a lavagem e a evaporação por mais 2 vezes.
Remover os frascos do evaporador. Adicionar 50 ml de solução tampão de citrato de sódio, D(a), nas amostras evaporadas, misturar bem, e transferir para frascos de polietileno de 50 ml rotulados, B(d). Proceder a determinação ou congelar até a leitura das mensurações.
F. Determinação:
Diluir alíquotas da amostra de hidrólise evaporadas com solução tampão de citrato de sódio, D(a), e ajustar o pH para 2,2 com 2 N NaOH. Quando hidrólises neutralizadas são usadas, diluir alíquota com água. Filtrar através de unidades de filtro, B(g), dentro de tubos autosampler e introduzir no analisador (Nota: A resposta do analisador depende do volume da alíquota e diluição.)
Calibrar o analisador de aminoácidos com o kit de solução padrão de aminoácidos, C(h), contendo Norleucina. Operar o analisador de aminoácidos de acordo com as especificações do fabricante. Ajustar as condições do analisador para assegurar a separação da linha de base dos picos. A mínima resolução entre dois picos deve ser 90 %.
G. Cálculos:
