USO DE SENSOR DE BAIXO CUSTO PARA MONITORAMENTO DO pH DO MEIO DE CULTIVO PARA PRODUÇÃO DE CELULOSE BACTERIANA
A. L. Tavares, E. C. A. Trindade, D. V. F. Vanin, W. J. A. Trindade, D. O. S. Recouvreux, C. A. Carminatti.
Laboratório de Polímeros e Materiais Compósitos
Centro Tecnológico de Joinville – Universidade Federal de Santa Catarina R. Dona Francisca, 8300 – Bloco U, Zona Industrial Norte
89.219-600 – Joinville/SC – Brasil. E-mail: ana.tavares@grad.ufsc.br
RESUMO
A celulose bacteriana (CB) é um biopolímero que possui uma vasta aplicabilidade por ser inerte, cristalina e porosa, além de possuir elevada capacidade de absorção, o que torna interessante o desenvolvimento de métodos para a sua obtenção. O controle de parâmetros físico-químicos, como o pH, permite otimizar as condições para a produção da CB. O objetivo deste trabalho foi monitorar o pH do meio de cultivo de CB utilizando um sensor de pH de baixo custo conectado a uma placa Arduino Nano. Foi analisada a variação do pH durante a produção de CB utilizando a bactéria Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 em cultura estática utilizando manitol como fonte de carbono a 25 °C e sete dias. Os resultados demonstraram uma diminuição do pH durante o cultivo, ocorrendo uma estabilização do valor após sete dias de ensaio. Observou-se também que não houve adesão do biofilme formado pela bactéria no sensor de pH.
Palavras-chave: biotecnologia, biopolímeros, celulose bacteriana, controle de processos.
INTRODUÇÃO
A celulose bacteriana é um biopolímero com fórmula molecular e estrutura polimérica idêntica à celulose produzida por plantas, porém possui um grau mais alto de cristalinidade e é quimicamente pura, sendo livre de impurezas como lignina e hemicelulose(1). Pode ser obtida de forma mais rápida do que a produzida por plantas
por meio do cultivo de micro-organismos, principalmente bactérias do gênero
Komagataeibacter, em meios contendo açúcares e outros nutrientes(2).
A Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 é uma bactéria Gram-negativa, estritamente aeróbica, conhecida por produzir celulose na forma de uma película na interface líquido-ar do meio de cultivo em cultura estática(3,4,5). Tipicamente é cultivada
em laboratório em meio Hestrin-Schramm (glucose, extrato de levedura, peptona, ácido cítrico e fosfato de sódio) a pH 5 e temperatura de 28 ºC(1). Nos últimos anos
têm-se buscando alternativas para os açúcares utilizados para o cultivo da bactéria com o objetivo de diminuir o custo da produção da CB e encontrar uma maneira de diminuir o impacto ambiental do descarte de restos da agroindústria(2).
Além de diminuir custos e amenizar o impacto ambiental, estudos relacionados à produção de celulose bacteriana investigam as melhores condições para a produção do biopolímero, buscando maiores índices de produtividade e aperfeiçoamento das propriedades mecânicas(2,6). Essas condições incluem temperatura, tempo de cultivo,
pH inicial, fonte de carbono utilizada no cultivo, adição de suplementos, entre outros(2).
O pH é uma grandeza adimensional definida em termos da atividade de íons de hidrogênio em uma solução. Essa grandeza varia em um intervalo de 0 a 14, onde 7 indica uma solução neutra, valores acima de 7 indicam uma solução básica e abaixo, uma solução ácida(7).
O método primário para a determinação do pH é a célula de Harned, mas é comum também o uso de células com junções líquidas por meio de eletrodos de vidro, cujo fator de resposta (dE/dpH) normalmente se desvia do declive de Nernst, fazendo com que as incertezas sejam significativamente maiores do que aquelas associadas ao método primário(8).
O Arduino é uma família de microcontroladores e um ambiente de criação de
software que torna fácil a criação de programas que podem interagir com o mundo
O presente trabalho tem o objetivo de monitorar o pH do meio de cultivo de celulose bacteriana produzida pela Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 utilizando um eletrodo de vidro de pH de baixo custo (pH-4502C) conectado a uma placa Arduino Nano.
MATERIAIS E MÉTODOS
A Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 foi obtida por meio de cultura em laboratório e o inóculo da bactéria correspondeu a 10% da composição final do meio de cultivo.
Produção de celulose bacteriana
O meio para o cultivo da K. hansenii foi preparado com 5 g.L-1 de extrato de
levedura, 3 g.L-1 de peptona e 25 g.L-1 de manitol. Todas as quantidades foram
determinadas utilizando uma balança de precisão semi-analítica, Bel L3102iH. Um volume de 180 mL de meio foi transferido para um frasco de Erlenmeyer com volume de 1000 mL, que foi autoclavado a 120 ºC por 20 minutos. Após resfriado, foi acrescentado ao frasco o eletrodo de vidro, previamente higienizado com álcool 70% e exposto a luz ultravioleta por 30 minutos. Após a montagem do aparato experimental, foram adicionados 20 mL de inóculo ao recipiente em ambiente estéril.
Sistema de monitoramento do pH
O sistema de monitoramento do pH é formado por um eletrodo de vidro, um módulo que contém um potenciômetro controlável, uma placa Arduino Nano ligada a uma protoboard de 830 pontos e um computador com o software Arduino instalado.
O eletrodo de vidro é o único elemento diretamente em contato com o meio de cultivo. Um dos diferenciais do eletrodo em questão, como pode ser observado na Figura 1, é a proteção polimérica que envolve a extremidade da sonda.
O componente mostrado na Figura 1 foi conectado a um módulo que contém um potenciômetro que altera a leitura analógica para enviar para a placa Arduino, ou qualquer outro microcontrolador similar. Ele foi responsável por receber a diferença de potencial elétrico informada pelo eletrodo e enviar a informação para a placa Arduino Nano, que estava instalada em uma protoboard de 830 pontos.
Figura 1. Eletrodo de vidro para leitura do pH do meio de cultivo.
A placa Arduino Nano é de nível de entrada, simples e compacta, similar a Arduino Uno, o produto mais tradicional da marca. Possui um microcontrolador ATmega328, uma tensão de corrente de operação de 5V e 40 mA, respectivamente(10). A placa foi conectada a um computador desktop com o software
Arduino IDE instalado.
O Arduino IDE é um software de uso livre que facilita o envio do código de trabalho para qualquer placa Arduino(9). O código utilizado foi o responsável por
transformar a diferença de potencial elétrico coletado pelo módulo com potenciômetro no valor de pH, auxiliar no ajuste do sistema e exibir os resultados coletados. O sistema foi programado para obter o valor do pH no meio de cultivo da CB a cada minuto.
Condições de monitoramento
Para aumentar a confiabilidade dos dados coletados, foram utilizadas duas soluções tampão para calibrar o sistema, uma neutra, de pH 7,00±0,02, e outra ácida, de pH 4,00±0,02. O eletrodo de vidro foi posicionado na solução neutra e a equação contida no código responsável pela obtenção dos dados na Arduino IDE foi alterada para que o sistema considerasse o valor lido como 7,0. A solução tampão de pH 4,0 foi utilizada para verificar se a leitura do eletrodo continuava coerente uma vez que os valores fossem alterados.
Processamento dos dados
Considerando que foi realizada uma leitura por minuto por sete dias, ao fim do experimento, haviam 10800 dados para serem processados. É um número considerável de dados, tornando pouco prático o uso de planilhas eletrônicas para o seu processamento. Assim, foi utilizado o software GNU Octave, que tornou possível o processamento dos 10800 dados rapidamente e permitiu organizá-los de forma conveniente e simples. O GNU Octave é uma ferramenta essencialmente desenvolvida para cálculos numéricos que trabalha em linguagem de alto nível(11). É
também um softwarede uso livre disponibilizado sob a versão 3 da Licença Pública Geral GNU, que garante a liberdade de utilizar, modificar e compartilhar o software para qualquer finalidade(12).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 2 apresenta o sistema montado para medir a evolução do pH durante a formação das películas de CB. É possível observar que a placa de Arduino Nano está conectada com a CPU para transmissão dos dados recebidos do módulo controlador, pH-4502C, que recebe a informação de diferença de potencial elétrico do sensor de vidro contido dentro do frasco de Erlenmeyer.
A Figura 3 apresenta em detalhes o frasco de Erlenmeyer onde ocorreu o cultivo da K. hansenii. Pode-se notar que uma película de celulose foi formada na interface líquido-ar, e que o sensor está posicionado no fundo do recipiente.
Figura 3. Detalhe do sistema de cultivo com o sensor de pH inserido.
A Figura 4 mostra o resultado de dois experimentos que foram realizados para acompanhamento da evolução do pH durante a produção da celulose bacteriana. Ambos foram realizados nas mesmas condições, isto é, sete dias de cultivo a 25 ºC e com a mesma razão meio de cultivo e inóculo.
O gráfico da Figura 4 mostra os dados da leitura de pH coletados a cada três horas. Embora os valores de pH iniciais tenham sido diferentes nas duas corridas, é possível perceber que o comportamento da curva é bastante semelhante nos dois casos, praticamente se igualando a partir do terceiro dia.
Figura 4. Valor de pH do meio de cultivo em função do tempo durante a produção de celulose bacteriana.
É possível observar que há uma queda suave do valor do pH durante as primeiras 36 horas de cultivo, variando o pH em aproximadamente meia unidade, de 7,0 para 6,5 (Ensaio 1) e 6,6 para 6,1 (Ensaio 2). A partir deste tempo, ocorre uma queda significativa do valor do pH durante aproximadamente 4,5 dias, decrescendo o pH para próximo a 4,7, sendo que existe uma tendência a manter este valor constante a partir deste momento.
A diminuição do valor inicial do pH de 7,0/6,5 na primeira e na segunda corrida, respectivamente, para próximo a 6,0 após 36 horas do início do ensaio está de acordo com estudos de Masaoka; Ohe e Sakota (1992), que concluíram que a faixa ótima de pH para produção de celulose bacteriana está entre 4.0 e 6.0(6). Analisando a Figura
4, nota-se que a partir do sexto dia o valor do pH apresenta um comportamento praticamente constante, favorecendo a produção da celulose bacteriana e permanecendo dentro da faixa entre 4,0 e 6,0.
CONCLUSÃO
O sistema de monitoramento de pH do meio de cultivo para produção de celulose bacteriana desenvolvido se mostrou eficiente para o propósito apresentado.
Primeiramente, o resultado do monitoramento se mostrou coerente com a expectativa da literatura de diminuição do pH em função do tempo, que se deve à conversão de carboidratos em ácido acético que a K. hansenii é capaz de realizar ao sintetizar e extrudar as nanofibras de celulose(13).
O sistema foi capaz também de contornar a dificuldade de monitorar o pH por um período de dias ou semanas exposta por Chawla et al. (2008), que apontou que é comum que a película viscosa de CB acabe aderindo ao sensor utilizado para medição, causando leituras imprecisas(14). Provavelmente por conta da proteção
polimérica que envolve o eletrodo utilizado não ocorreu a aderência da película, tornando possível que o monitoramento fosse realizado dentro do período proposto.
Assim, o sistema montado utilizando um sensor de baixo custo e uma placa Arduino Nano pôde ser utilizado com sucesso para o monitoramento do pH durante a produção da celulose bacteriana, permitindo identificar a melhor faixa de cultivo para a bactéria K. hansenii.
REFERÊNCIAS
(1) PECORARO, Édison et al. Bacterial Cellulose from Glucanacetobacter xylinus: Preparation, Properties and Applications. In: BELGACEM, Mohamed Naceur; GANDINI, Alessandro (Ed.). Monomers, Polymers and Composites from Renewable Resources. Grenoble: Elsevier Science, 2008. p. 369-383.
(2) LIMA, H. L. S. et al. Bacterial cellulose production by Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 using sisal juice: an agroindustry waste. Brazilian Journal Of Chemical Engineering. Fortaleza, p. 671-680, 2016.
(3) DUDMAN, W.F. Cellulose production by Acetobacter strain in submerged culture. J. Gen. Microbiol., v. 22, p. 25-29, 1960.
(4) ROSS, P.; MAYER, R.; BENZIMAN, M. Cellulose Biosynthesis and Function in Bacteria. Microbiol. Rev., v. 55, n. 1, p. 35-58, 1991.
(5) WATANABE, K., TABUCHI, M., MORINAGA, Y.; YOSHINAGA, F. Structural features and properties of bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose, v. 5, p. 187-200, 1998.
(6) MASAOKA, S.; OHE, T.; SAKOTA, N. Production of Cellulose from Glucose by Acetobacter xylinum. Journal of Fermentation And Bioengineering. Osaka, p. 18-22, 1992.
(7) COVINGTON, A.K.; BATES, R.G.; DURST, R.A. (Org.). Definition of pH scales, standard reference values, measurement of pH and related terminology. Pure and Applied Chemistry. Tyne, p. 531-542, 1985.
(8) IUPAC – International Union Of Pure And Applied (Org.). Compendium of Chemical Terminology Gold Book Version 2.3.3. Zurique: Iupac, 2014. Disponível em: <goldbook.iupac.org/pdf/goldbook.pdf>. Acesso em: 17 ago. 2018.
(9) MARGOLIS, M. Arduino Cookbook. Sebastopol: O'reilly, 2011.
(10) ARDUINO. Arduino Nano (V2.3): User Manual. 2012. Disponível em: <www.arduino.cc/en/uploads/Main/ArduinoNanoManual23.pdf>. Acesso em: 19 ago. 2018.
(11) EATON, J.W. et al. GNU Octave version 4.2.1 manual: a high-level interactive language for numerical computations, 2017. Disponível em: <www.gnu.org/software/octave/doc/v4.2.1/>. Acesso em: 19 ago. 2018.
(12) FREE SOFTWARE FOUNDATION. GNU GENERAL PUBLIC LICENSE Version 3. 2007. Disponível em: <www.gnu.org/copyleft/gpl.html>. Acesso em: 19 ago. 2018.
(13) KONGRUANG, S. Bacterial Cellulose Production by Acetobacter xylinum Strains from Agricultural Waste Products. Biotechnology And Applied Biochemistry. Bangkok, p. 245-256. jan. 2008.
(14) CHAWLA, P.R. et al. Microbial Cellulose: Fermentative Production and Applications. Food Technology and Biotechnology. Mumbai, p. 107-124, 2008.
LOW COST SENSOR FOR CULTURE MEDIUM pH MONITORING OF BACTERIAL CELLULOSE PRODUCTION
ABSTRACT
Bacterial cellulose (BC) is a biopolymer which has wide applicability because it is inert, porous and presents high crystallinity, as well as a high absorption capacity, making it interesting to develop methods for its production. By controlling physico-chemical parameters, such as the pH, it allows to optimize the conditions for BC production. The aim of this work was to monitor the pH of BC’s culture medium using a low cost pH sensor connected to an Arduino Nano plate. The pH variation during BC production using the bacteria Komagataeibacter hansenii ATCC 23769, in static culture, was analyzed using mannitol as the carbon source at 25 °C for seven days. The results showed a decrease in pH during cultivation, with magnitude stabilization after seven testing days. Also, it was observed that there was no adhesion between the pH sensor and the biofilm formed by the bacteria.
