Licenciatura Plena em Educação Física

 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Dz l dz INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO

Licenciatura Plena em Educação Física

Rio Claro 2010

‘†”‹‰‘‡‰Ž‹•’‘•–‹

INFLUÊNCIA DOS POLIMORFISMOS PARA

O GENE DA SINTASE DO ÓXIDO NITRICO

ENDOTELIAL (eNOS) NA PRESSÃO

ARTERIAL E PERFIL LIPÍDICO EM

RESPOSTA AO TREINAMENTO FÍSICO EM

MULHERES NO CLIMATÉRIO

 

RODRIGO DEGLI ESPOSTI

INFLUÊNCIA DOS POLIMORFISMOS PARA O GENE DA SINTASE DO ÓXIDO NITRICO ENDOTELIAL (eNOS) NA PRESSÃO ARTERIAL E PERFIL LIPÍDICO EM RESPOSTA AO TREINAMENTO FÍSICO EM MULHERES NO CLIMATÉRIO

ORIENTADORA: Profa. Dra. ANGELINA ZANESCO

CO-ORIENTADOR: Ms. CARLOS HENRIQUE GROSSI SPONTON

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Licenciatura em Educação Física.

Rio Claro 2010

 

796 Esposti, Rodrigo Degli

E77i Influência dos polimorfismos para o gene da sintase do óxido nitrico endotelial (eNOS) na pressão arterial em resposta ao treinamento físico em

mulheres / Rodrigo Degli Esposti. - Rio Claro : [s.n.], 2010 94 f. : il., figs., gráfs., tabs., quadros

Trabalho de conclusão de curso (licenciatura - Educação Física) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Angelina Zanesco

Co-Orientador: Carlos Henrique Grossi Sponton

1. Educação física. 2. Menopausa. 3. Hipertensão. 4. Dislipidemia. 5. Íntron 4. 6. Glu298Asp. I. Título.

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP

 

Dedico este trabalho a todas as pessoas que em algum momento, passaram em minha vida e a marcaram deixando lembranças.

 

"Há duas coisas a buscar na vida: primeiro, conseguir o que se quer; depois, saborear o conseguido. Só os mais sábios conseguem a segunda."

 

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a todos os familiares que acreditaram e me apoiaram para que eu seguisse em frente e conseguisse atingir meu objetivo. Em especial, faço um agradecimento ao meu pai e minha mãe os quais bancaram meus estudos desde antes da Universidade e me deram a oportunidade de cursar uma das melhores Universidades do País, e dessa maneira propiciaram minha conclusão no ensino superior.

Gostaria de agradecer em especial a Pamella Araújo Malagrino, que colaborou desde o início para que este projeto pudesse ser realizado; dividindo comigo às dificuldades, sendo compreensiva e atenciosa nos momentos críticos. Mas acima de tudo me apoiando e dando força para que eu não desistisse. Sem sua ajuda isso não seria possível. Agradeço também aos colegas e grandes amigos do laboratório: Carlos, Rômulo, Andréia, Fernanda Priviero, Emeline, Fernanda, Guilherme e Iane. Os quais de alguma maneira contribuíram tanto no andamento quanto na conclusão deste projeto. Em especial ao Carlos, por ter sido meu co-orientador e ter encaminhado o projeto da melhor maneira possível.

Agradeço também à equipe da Unicamp, por ter aberto às portas do Hemocentro: Dr. Fernando Costa, Dra. Carla Franco-Penteado e a técnica Dra. Dulcinéia.

Agradeço em especial ao prof. Dr. Maurício Bacci Júnior, o qual abriu as portas do CEIS, para que eu pudesse realizar as análises genéticas. Gostaria de agradecer também a prof. Ms. Cynara, a qual além de uma grande companheira de laboratório é hoje acima de tudo uma grande amiga. Sendo a responsável na parte laboratorial por ensinar grande parte daquilo que eu sei.

E por última, mas não menos importante faço aqui um agradecimento especial a minha orientadora Dra. Angelina Zanesco pela oportunidade de trabalhar ao seu lado e vivenciar experiências que me ajudaram e continuam me ajudando a crescer profissionalmente.

Agradeço também à PROEX e a CNPq pelas bolsas concedidas durante o período da realização do projeto.

 

RESUMO

A incidência de doenças cardiovasculares tem se constituído na maior causa de morbi-mortalidade em todo mundo, especialmente após os 50 anos de idade, e têm sido associadas à presença de polimorfismos em alguns genes, especialmente o gene da eNOS. Apesar das mulheres compartilharem com os homens os diversos fatores de risco para o desenvolvimento das doenças cardiovasculares, entre elas hipertensão arterial e dislipidemia, estudos epidemiológicos mostram que as mesmas, antes da menopausa, apresentam menor risco cardiovascular quando comparadas aos homens. Entretanto, após o período da menopausa há um aumento significativo na incidência de hipertensão arterial e suas complicações. Este fato parece estar relacionado a uma possível ação protetora exercida pelos hormônios sexuais femininos, sobretudo os estrogênios que apresentam queda abrupta no período da menopausa. O óxido nítrico (NO), produzido pelas células endoteliais através da enzima eNOS, desempenha importante papel no sistema cardiovascular, participando na regulação do fluxo sanguíneo, do remodelamento vascular e na atividade plaquetária. Assim, estudos envolvendo o gene responsável pela síntese da enzima eNOS, tem sido foco de várias pesquisas na tentativa de avaliar se a presença dos polimorfismos poderia predispor os indivíduos a maior incidência de doenças cardiovasculares. O polimorfismo do gene da eNOS na posição G894T/Glu298Asp localizado no éxon 7, implica na alteração da sequência protéica, tornando a proteína mais suscetível à clivagem, tendo consequências funcionais como a redução do NO demonstrando assim sua provável contribuição para a disfunção endotelial e consequente aumento da pressão arterial. Com relação ao Íntron 4 caracterizado por um Número Variável de Repetições em Tandem, no qual o alelo 4a foi relacionado a baixos níveis de nitrito/nitrato

(NOx-). Os indivíduos 4a/a exibiram 20% menos NOx- que os indivíduos com genótipos 4b/b,

assim como diminuições na expressão protéica da eNOS. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a influência dos polimorfismos do gene da eNOS nas duas posições (G894T/Glu298Asp e Íntron 4), associados ou não sobre os valores de pressão arterial, perfil

lipídico e níveis plasmáticos de nitrito/nitrato (NOx-) em resposta ao treinamento físico

aeróbio de 8 semanas em mulheres na menopausa. Para a análise genética foram feitas análises de reação em cadeia da polimerase seguida de restrição dos fragmentos polimórficos (PCR-RFLP), a análise do perfil lipídico foi feita através de kits comerciais e a pressão arterial foi realizada por método auscultatório. Nosso estudo demonstrou que a presença de polimorfismo do gene da eNOS tanto para as posições G894T/Glu298Asp e Íntron 4 não alteram os efeitos benéficos do treinamento físico aeróbio sobre os parâmetros cardiovasculares e níveis plasmáticos de nitrito/nitrato em mulheres no climatério. Porém a associação desses polimorfismos prejudica a resposta benéfica dos parâmetros cardiorrespiratórios e do perfil lipídico frente ao treinamento físico aeróbio de 8 semanas.

 

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 10

2. MENOPAUSA E DOENÇAS CARDIOVASCULARES ... 12

2.1. Hipertensão Arterial Sistêmica ... 13

2.2. Dislipidemias ... 15

2.3. Disfunção Endotelial e Aterosclerose ... 16

3. GENE DA eNOS ... 17

3.1. Gene da Sintase do Óxido Nítrico Endotelial (eNOS) ... 17

3.2. Polimorfismos do Gene da eNOS e Doenças Cardiovasculares... 17

3.2.1. Polimorfismo Glu298Asp ... 20

3.2.2. Polimorfismo do Intron 4 ... 20

4. EXERCÍCIO FÍSICO E RISCO DE DOENÇAS CARDIOVASCULARES ... 22

4.1. Exercício Físico e Hipertensão Arterial ... 22

4.2.Exercício Físico e Dislipidemia ... 23

4.3. Polimorfismos da eNOS e Atividade Física ... 24

5. OBJETIVOS ... 26

6. MÉTODOS ... 27

6.1. Participantes ... 27

6.2. Critérios de Inclusão:... 27

6.3. Antropometria ... 27

6.4. Medida da Pressão Arterial ... 28

6.5. Consumo Máximo de Oxigênio (VO2 Máximo) ... 28

6.6. Treinamento Físico Aeróbio ... 29

6.7. Coleta Sanguínea ... 30

6.8. Análise Bioquímica: ... 31

6.8.1 Glicemia e Perfil Lipídico ... 31

6.8.2. Nitrito/Nitrato (NOx-) ... 31

6.9.1. Extração do DNA genômico ... 31

6.9.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ... 33

6.9.3. Determinação do polimorfismo para a posição Glu298Asp do gene da eNOS: ... 34

6.9.5 Grupos Experimentais ... 37

6.9.6. Análise Estatística ... 38

7. RESULTADOS... 39

7.1. Resultados Gerais ... 39

7.2. Resultados com Avaliação Gênica para o polimorfismo Glu298Asp: Geral, Normotensas e Hipertensas ... 46

 

7.3. Resultados após divisão em normotensas e hipertensas para o polimorfismo

Glu298Asp do gene da eNOS. ... 50

7.4. Resultados com Avaliação Gênica para o polimorfismo do Íntron 4: Geral, Normotensas e Hipertensas. ... 56

7.5. Resultados dos Polimorfismos Associados (Glu298Asp/Íntron 4): Geral, Normotensas e Hipertensas ... 66

8. SUMÁRIO DOS RESULTADOS ... 80

8.1. Resposta ao Treinamento físico de 8 semanas (Pós-treino): ... 80

8.2. Resposta ao Treinamento físico de 8 semanas (Pós-treino) segundo o genótipo Glu298Asp do gene da eNOS: ... 80

8.3. Resposta ao Treinamento físico de 8 semanas (Pós-treino) segundo o genótipo do Íntron 4 do gene da eNOS:... 80

8.4. Resposta ao Treinamento físico de 8 semanas (Pós-treino) segundo a associação dos genótipos para Glu298Asp e Íntron 4 do gene da eNOS: ... 81

9. DISCUSSÃO ... 82

10. CONCLUSÃO ... 84

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 85

ANEXO 1. Parecer do Cômite de Ética. ... 97

ϭϬ 

1. INTRODUÇÃO

Estudos têm associado a presença de polimorfismos em alguns genes com a incidência de doenças cardiovasculares e fatores de risco associados. (HOOPER et al., 1999; WANG & WANG, 2000; HOFFMAN et al., 2000). Em especial, os polimorfismos do gene da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), enzima responsável pela formação do óxido nitríco (NO), um importante vasodilatador. Pelo menos três tipos de polimorfismo tem sido evidenciado no gene da eNOS que parecem estar positivamente associados às doenças cardiovasculares: -786T>C, G894T/Glu298Asp e Íntron 4a/b (CASAS et al., 2006; ZINTZARAS et al., 2006). Especificamente, a presença de polimorfismo na posição 894 e no Íntron 4 do gene da eNOS tem sido relacionada a diminuição na expressão protéica da eNOS, bem como baixos níveis plasmáticos de nitrito/nitrato, cerca de 20% de redução na concentração de NO (SAVVIDOU et al., 2001; LEESON et al.; 2002; TSUKADA et al., 1998, WANG et al., 2000), quando comparados aos indivíduos sem polimorfismo, acarretando disfunção endotelial, levando ao aumento na agregação plaquetária, elevação da pressão arterial e espasmo coronariano. Por outro lado, o exercício físico realizado de forma regular é recomendado como terapêutica não farmacológica na prevenção e/ou tratamento das doenças cardiovasculares e na melhora do quadro hipertensivo (ACSM, 2004). É importante salientar que o exercício físico parece ter efeito de proteção na integridade do endotélio, quer seja aumentando a produção de NO em vasos com endotélio íntegro, quer seja restaurando a disfunção endotelial.

A deficiência de estrógenos, alterações do perfil lipídico e o sedentarismo são considerados os principais fatores para a maior prevalência de hipertensão arterial (HA) em mulheres na menopausa. Na tentativa de reduzir a incidência de HA nesta população, diversas abordagens têm sido empregadas, porém a maioria dos trabalhos mostra que, neste momento, a mudança de estilo de vida como a prática regular de atividade física, parece ser a melhor estratégia no controle da HA e seus fatores de risco nesta fase de vida da mulher (SIMKIN-SILVERMAN et al., 1995). O exercício físico contínuo, onde a intensidade é mantida constante (leve/moderada), tem sido empregado na maioria dos trabalhos dentro da área de saúde com evidentes efeitos benéficos sobre as doenças cardiovasculares e endócrino-metabólicas (STAFFILENO et al., 2007). Estudos prévios demonstraram associação positiva entre menor resposta de redução de pressão arterial e exercício físico em sujeitos com polimorfismo para o gene da eNOS, tanto para o Íntron 4 quanto para a para a posição Glu298Asp. Entretanto, estes trabalhos eram compostos apenas por homens e mulheres

ϭϭ 

saudáveis. Além disso, estes trabalhos não analisaram a interação com outras regiões polimórficas para o gene da eNOS e a influência desta interação com as respostas pressóricas e perfil lipídico em indivíduos submetidos a um programa de treinamento físico aeróbio. Assim nossa hipótese é de que mulheres sem a presença dos dois polimorfismos (G894T/Glu298Asp e Íntron 4a/b) ou com apenas um deles responderiam melhor à redução de pressão arterial em resposta ao treinamento físico do que àquelas com a presença de dois polimorfismos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da associação ou não dos polimorfismos do gene da eNOS (G894T/Glu298Asp e íntron 4a/b) na resposta pressórica, perfil lipídico e níveis plasmáticos de nitrito/nitrato em resposta ao treinamento físico aeróbio de 8 semanas em mulheres no climatério.

ϭϮ 

2. MENOPAUSA E DOENÇAS CARDIOVASCULARES

A incidência de doenças cardiovasculares (DCVs) aumenta dramaticamente com o envelhecimento populacional e tem se constituído na maior causa de morbi-mortalidade em todo mundo, especialmente acima dos 50 anos de idade. Há mais mortes por DCV (41,3%) do que as próximas sete causas de morte combinadas (I DIRETRIZ BRASILEIRA SOBRE PREVENÇÃO DE DOENÇAS CARDIOVASCULARES EM MULHERES CLIMATÉRICAS E A INFLUÊNCIA DA TERAPIA DE REPOSIÇÃO HORMONAL (TRH) DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA (SBC) E DA ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DO CLIMATÉRIO (SOBRAC), 2008).

Apesar das mulheres compartilharem com os homens os diversos fatores de risco para o desenvolvimento das DCVs, como obesidade, diabetes, hipertensão arterial, dislipidemia, dentre outros, estudos epidemiológicos mostram que as mesmas, antes da menopausa, apresentam menor risco cardiovascular quando comparadas aos homens de mesma idade (RECKELHOFF, 2001; VAN EICKELS et al., 2005). Entretanto, após o período da menopausa há um aumento significativo na incidência, sendo seus valores similares aos dos homens para este período (AHA, 2010). Este fato parece estar relacionado a uma possível ação protetora exercida pelos hormônios sexuais femininos, sobretudo os estrogênios que apresentam queda abrupta no período da menopausa (GENAZZANI, 2001; NISKANEN et al, 2002).

O estrogênio apresenta importante função no controle cardiovascular através da modulação da função endotelial, ao elevar a produção de óxido nítrico (NO) via ativação da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (WASSERTHEIL-SMOLLER et al., 2000) (FORJAZ et al., 2007) e de prostaciclina (PGI2) (FREITAS et al., 2002) que são importantes substâncias vasodilatadoras via endotélio-dependente. Como também modula a síntese de endotelina que é um potente vasoconstritor (FREITAS et al., 2002). Sendo assim, reduções nas concentrações de estrogênio levam a uma disfunção endotelial que acarreta em elevação da pressão arterial através do aumento da resistência vascular periférica.

Dentre as inúmeras funções o estrogênio reduz os níveis séricos de colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), tem ação vasodilatadora, antioxidante e, portanto apresenta função cardioprotetora (DUBEY et al., 2002).

ϭϯ 

2.1. Hipertensão Arterial Sistêmica

A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma doença crônica e degenerativa de etiologia multicausal, multifatorial e poligênica, caracterizada pela presença de níveis tensionais elevados e normalmente associada a distúrbios metabólicos, hormonais e hipertrofia cardíaca e vascular. Sendo considerada um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento de DCVs (NEGRÃO & BARRETO, 2006; KRIEGER & PEREIRA, 2006).

Estima-se que cerca de 1 bilhão de indivíduos apresentem HAS em todo mundo, sendo esta patologia responsável por aproximadamente 7,1 milhões de óbitos por ano (WHO, 2002; CHOBANIAN et al., 2003). No Brasil, segundo o Ministério da Saúde, 24,4% da população são hipertensos. Sendo esta, responsável por 40% das mortes por acidente vascular cerebral e 25% por doença arterial coronariana (V DIRETRIZES DE HIPERTENSÃO ARTERIAL, 2006).

A prevalência da HAS aumenta progressivamente com a idade, sendo superior a 50% entre os idosos. Até os 44 anos de idade, um maior percentual de homens tem HAS, dos 45 aos 54 anos período em que se encontram na menopausa, as mulheres apresentam valores similares aos dos homens, e após esse período o predomínio de HAS no sexo feminino é significativamente superior (AHA, 2010). Assim, a incidência de HAS aumenta tanto com a idade quanto com o início da fase pós-menopausa (Figura 1).

ϭϰ 

Figura 1. Prevalência da Hipertensão Arterial Sistêmica segundo o American Heart

Association, 2010.

O excesso do consumo de sódio é um fator muito importante na incidência e prevalência da hipertensão arterial. Mas, assim como em qualquer DCV, ela tem como seus geradores o sedentarismo, o fumo, o consumo elevado de álcool, a obesidade, a dislipidemia, o diabetes mellitus e a genética (BLOCH et al., 2006).

A hipertensão arterial se origina da falta de controle da pressão arterial (PA) pelo organismo, que se dá pela seguinte equação:

PA = Débito cardíaco x Resistência vascular periférica.

Sendo o débito cardíaco o produto da freqüência cardíaca e o volume sistólico.

Dois mecanismos são capazes de regular a PA, o sistema nervoso simpático/parassimpático que age aumentando/diminuindo a freqüência cardíaca, e a resposta humoral gerada por várias substâncias (vasoconstritoras ou vasodilatadoras) que interferem na resistência vascular periférica. Priorizando a regulação humoral, um aumento das substâncias vasodilatadoras como o óxido nítrico (NO) podem contribuir para uma melhora da hipertensão arterial.

ϭϱ 

2.2. Dislipidemias

As dislipidemias são caracterizadas por alterações metabólicas lipídicas decorrentes de distúrbios em qualquer fase do metabolismo lipídico, que ocasionem repercussão nos níveis séricos das lipoproteínas. Ou seja, consiste na elevação dos triglicerídeos e ou alterações do colesterol plasmático (elevação do LDL-C – lipoproteína de baixa densidade e/ou redução do HDL-C – lipoproteína de alta densidade) (MANUAIS DE CARDIOLOGIA, 2009). Essas alterações podem levar a formação da placa aterosclerótica e têm sido significativamente correlacionadas a manifestações de DCVs.

As dislipidemias podem ser dividas em: primárias ou secundárias. Sendo as primárias decorrentes de alterações genéticas específicas e as secundárias decorrentes de hábitos de vida inadequados, como má alimentação e/ou sedentarismo, dentre outros.

É importante ressaltar que a aterosclerose, conseqüência principal das dislipidemias, tem etiologia multifatorial. Seu desenvolvimento provém tanto de fatores genéticos quanto de fatores ambientais (estilo de vida), bem como a interação de ambos.

No Brasil, um estudo conduzido em nove capitais envolvendo 8045 indivíduos, demonstrou que 38% dos homens e 42% das mulheres possuíam níveis de colesterol total acima do desejado (CT > 200 mg/dL). Ainda, os valores de CT foram maiores no sexo feminino e nas faixas etárias mais avançadas (IV DIRETRIZ BRASILEIRA SOBRE DISLIPIDEMIAS E PREVENÇÃO DA ATEROSCLEROSE DEPARTAMENTO DE ATEROSCLEROSE DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007).

Estudos observacionais demonstraram associação positiva entre níveis de colesterol total e pressão arterial na população em geral e em pacientes hipertensos (CASTELLI & ANDERSON, 1986; NEATON & WENTWORTH, 1992). Sabe-se que cerca de 80% dos pacientes hipertensos apresentam algum grau de dislipidemia, sendo que em metade deles a dislipidemia está francamente estabelecida e na outra metade as alterações lipídicas são limítrofes (KOHLMANN Jr., 2004). A relação causal entre esses dois fatores de risco permanece não elucidada, porém sabe-se que os mecanismos fisiopatológicos envolvidos tanto na gênese da hipertensão quanto da dislipidemia compartilham anormalidades metabólicas comuns e, podem agir acelerando o processo de aterogênese (MARTE & SANTOS, 2007).

ϭϲ 

2.3. Disfunção Endotelial e Aterosclerose

A hipercolesterolemia pode ter efeito primário nos vasos e tônus vascular, além de promover a disfunção endotelial, também presente de forma incipiente na hipertensão arterial (SPOSITO, 2004). Ou seja, tanto a hipertensão quanto a aterosclerose, apresentam em sua gênese ou seus mecanismos a disfunção endotelial. Sendo esta caracterizada por uma menor produção ou biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), perdendo o papel protetor exercido por esta molécula (VANHOUTTE et al., 1988).

O NO está envolvido com mecanismos que regulam o fluxo sanguíneo, os quais participam da modulação da pressão arterial tanto em indivíduos normotensos quanto hipertensos (SPOSITO, 2004). Dentre os quais podemos destacar: controle da resistência vascular, a adaptação do fluxo sanguíneo às demandas metabólicas e o remodelamento do diâmetro do vaso ao fluxo de volume circulante.

Na hipercolesterolemia se observa redução da biodisponibilidade de NO. Além disso, ela promove maior produção de radicais livres pela ação da NADPH oxidase, os quais inativarão as moléculas de NO (JOHN & SCHMIEDER, 2003). A inativação do NO se dá

pela reação com superóxido (O2-) formando o ânion peroxinitrito (OONO-) (GRYGLEWSKI

et al., 1986), que por sua vez se liga à LDL-C resultando na formação da LDL-oxidada (LDL-ox). O aumento de LDL-ox interfere com o processo de transcrição nuclear da enzima eNOS e aumenta adesão leucocitária considerada processo-chave no início da aterogênese (ZANESCO & ANTUNES, 2007). Assim, o aumento do LDL plasmático junto com a disfunção endotelial pode levar a aterosclerose e consequentemente morte do indivíduo.

ϭϳ 

3. GENE DA eNOS

3.1. Gene da Sintase do Óxido Nítrico Endotelial (eNOS)

O gene da eNOS está localizado no cromossomo 7 (Gen Bank D26607), mais especificamente no longo braço do cromossomo, na região 7q35-36, apresentando este um comprimento genômico de 4.4kb compreendendo 25 íntrons e 26 éxons, sintetizando um RNA mensageiro (RNAm) de 4052 nucleotídeos. A codificação do gene da eNOS, leva a formação de uma enzima (eNOS) de cadeia polipeptídica contendo 1203 aminoácidos e um peso molecular de 135-kD. (MARSDEN et al., 1993).

A eNOS é capaz de catalisar a oxidação do nitrogênio terminal do grupamento guanidino da L-arginina formando o Óxido Nítrico (NO) e L-citrulina. A eNOS é estimulada

por uma cascata bioquímica que envolve a participação de íons Ca2+ e calmodulina, e liberam

o NO por curtos períodos de tempo. Para exercer esta função catalítica, esta enzima necessita de um doador de elétron, a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH), e co-fatores como a flavina adenina dinucleotídeo (FAD), a flavina mononucleotídeo (FMN) e a tetrahidrobiopterina (BH4) (MOMBOULI & VANHOUTTE, 1999; MONCADA & HIGGS, 1991; VANHOUTTE, 2003). Uma vez formado, o NO difunde-se rapidamente da célula geradora para a célula alvo, onde interage com o grupamento heme da guanilato ciclase solúvel (GCs) estimulando sua atividade catalítica, levando à formação de GMPc, que por sua

vez, diminui os níveis intracelular de cálcio Ca2+, levando ao relaxamento da musculatura lisa

e conseqüente vasodilatação. Os mecanismos pelos quais a via NO/GMPc induz a

vasodilatação incluem inibição da geração do inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), aumento do

sequestro de Ca2+ citosólico, desfosforilação da cadeia leve de miosina, inibição do influxo de

Ca2+, ativação de proteína quinase, estimulação da Ca2+ ATPase de membrana e abertura de

canais de K+ (IGNARRO et al., 1987; IGNARRO, 2002).

3.2. Polimorfismos do Gene da eNOS e Doenças Cardiovasculares.

As variações naturalmente observadas na sequência do DNA podem assumir diversas formas como: substituição de um único nucleotídeo (single nucleotide polymorphism - SNP), inserção ou deleção de únicos ou múltiplos nucleotídeos, mudanças no número de seqüências repetidas (variable number tandem repeats - VNTR) ou grandes mudanças na estrutura dos

ϭϴ 

cromossomos. Quando essas variações alélicas ocorrem em pelo menos 1% da população são

denominadas polimorfismo (BALASUBRAMANIAN et al., 2004; LIMA et al., 2006).

Os polimorfismos localizam-se nas mais diversas regiões do genoma humano, como: regiões regulatórias (controle da atividade e expressão gênica); regiões codificantes (codificadoras de proteínas); regiões intrônicas (separam regiões codificantes ou éxons em um gene); ou mesmo regiões inter-genes. Os alelos são classificados como selvagens (wild type) quando apresentam uma sequência comum ou raro (rare) quando apresentam variância alélica rara. Grande parte dos polimorfismos são funcionalmente neutros (não influenciam na estrutura e funcionalidade das proteínas). Alguns, entretanto, apresentam-se clinicamente relevantes dependendo da sua localização, podendo ocasionar mudanças fenotípicas (características observáveis de um indivíduo), anormalidades no metabolismo e respostas diferenciadas a fatores ambientais, como treinamento físico. (BALASUBRAMANIAN et al., 2004; SPONTON, 2010).

Atualmente tem-se conhecimento de mais de 100 polimorfismos para o gene da eNOS e sua vizinhança (NCBI SNP database, http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), sendo alguns deles associados a doenças cardiovasculares (WANG & WANG, 2000; ICHIHARA et al., 1998; HOFFMAN et al., 2000; HOOPER et al., 1999; STANGL et al., 2000).

Até o presente momento, cinco grandes meta análises foram conduzidas buscando verificar a associação entre os polimorfismos do gene da eNOS e as doenças cardiovasculares (CASAS et al., 2004; CASAS et al., 2006; ZINTZARAS et al., 2006; PEREIRA et al., 2007; HONG-MIAO & GUO-ZHONG, 2009). Em uma das meta-análises, onde se avaliou mais de 23 mil sujeitos, foi demonstrado que os indivíduos homozigotos para o polimorfismo da posição Glu298Asp (RC, 1.31; 95% IC, 1.13 para 1.51) e Íntron 4a/b (RC, 1.34; 95% IC, 1.03 para 1.75) apresentavam maior incidência das doenças isquêmicas do coração (CASAS et al., 2004). Entretanto, estes autores comentam que devido à baixa frequência alélica observada para os indivíduos homozigotos polimórficos e também a heterogeneidade alélica encontrada para a posição Glu298Asp, esses resultados deveriam ser interpretados com cautela.

Posteriormente, este mesmo grupo, em uma atualização, demonstrou novamente a associação entre os polimorfismos da eNOS (-786T>C [RC, 1.17; 95% IC, 1.07 para 1.28], Glu298Asp [RC, 1.17; 95% IC, 1.07 para 1.28] e Íntron 4a/b [ RC, 1.12; 95% IC, 1.01 para 1.24]) e as doenças cardiovasculares. Nessa atualização, os autores comentam que a análise isolada dos polimorfismos pode ser um caminho incerto para o entendimento da relação entre o gene da eNOS e as doenças cardiovasculares, sugerindo assim a análise total de um gene “gene based” para os futuros trabalhos. Além disso, estes autores destacam a necessidade de

ϭϵ 

maiores estudos em diferentes grupos étnicos, assim como melhor entendimento das relações gene-gene e gene-ambiente (CASAS et al., 2006).

Outros estudos, apenas com pessoas portadoras de alguma doença cardiovascular ou fumantes, observaram que a presença dos polimorfismos -786T>C, íntron 4, Glu298Asp estavam associadas com a aterosclerose (SPOTO, 2007; RIOS, 2007; ASAKIMORI, 2003; FATINI, 2004; PARK, 2006). Talvez essas associações possam ser explicadas por um elevado nível sérico de triglicerídeos em portadores do polimorfismo -786T>C (NATH et al., 2009) e aumento do LDL com diminuição do HDL em portadores do polimorfismo do Íntron 4 (POPOVA, 2008; THAMEEN, 2008; BENJAFILD & MORRIS, 2000).

Em relação à hipertensão arterial, duas grandes meta-análises foram conduzidas buscando verificar a associação desta patologia com os polimorfismos do gene da eNOS. A primeira meta-análise avaliou 35 estudos, sendo analisados os polimorfismos -786T>C, Glu298Asp, Íntron 4a/b e G23T. Esses autores demonstraram que apenas o polimorfismo do Íntron 4a/b estava associada com a hipertensão arterial, sendo observado para o alelo b um efeito protetor de 15% em relação ao desenvolvimento da hipertensão arterial. Entretanto, quando analisados os subgrupos como asiáticos e negros não se observou qualquer associação. Esses autores acreditam que uma mutação funcional não identificada do gene da eNOS poderia ser a razão para a ausência dessas associações. Além disso, o reduzido número de estudos com maiores grupos contribuem para esses achados. Desse modo, os autores acreditam que a interação entre os polimorfismos do gene da eNOS poderia ser maior determinante no desenvolvimento de doenças cardiovasculares do que a análise isolada dos polimorfismos. Assim, eles sugerem o desenvolvimento de futuras meta-análises relacionando os haplótipos do gene da eNOS e as doenças cardiovasculares (ZINTZARAS et al., 2006). Outra meta-análise, mais recentemente realizada, avaliou mais de 40 mil sujeitos presentes em 53 trabalhos. Este estudo foi conduzido separando três diferentes populações como: Europeus (ou descendentes de Europeus), Asiáticos (Chineses e Japoneses) e outros (Africanos, Brasileiros, Turcos, etc). Esses autores observaram que o polimorfismo para o Íntron 4a/b, estava associado a um aumento (RC, 1.28; 95% IC, 1.11 para 1.47) de 28% do risco para desenvolvimento da hipertensão arterial comparado aos indivíduos não polimórficos para essa posição. Além disso, eles também observaram, apenas para a população Asiática, que os indivíduos polimórficos para a posição Glu298Asp também estavam associados com a hipertensão arterial (RC, 1.28; 95% IC, 1.06 para 1.54), assim como um incremento de 2mmHg tanto para pressão arterial sistólica, quanto para pressão arterial diastólica. Interessantemente, foi verificado que esta associação poderia ser dependente dos níveis de

ϮϬ 

colesterol observados para essa população. Esses autores comentam que a associação entre os polimorfismos do gene da eNOS e a HA está sujeita não só a heterogeneidade dos resultados, mas também ao viés observados nestes estudos. Assim, eles concluem que futuros trabalhos são necessários para avaliar a interação dos polimorfismos da eNOS, assim como as relações entre gene e ambiente (PEREIRA et al., 2007).

3.2.1. Polimorfismo Glu298Asp

O polimorfismo na posição 894 do gene da eNOS está localizado no éxon 7, sendo o único polimorfismo associado à alteração na sequência protéica da eNOS. Ele é caracterizado pela substituição do nucleotídeo Guanina (G) pela Timina (T) resultando em uma modificação na estrutura primária (sequência protéica) da eNOS, com a substituição do aminoácido Glutamato (Glu) pelo Aspartato (Asp) na posição 298 da proteína, conseqüência de grande importância que permite que o polimorfismo na região 894 seja melhor denominado (Glu298Asp) (YOSHIMURA et al., 1998; HIBI et al., 1998; SHIMASAKI et al., 1998, HINGORANI et al., 1999). Essa discreta substituição faz com que a variante Asp torne a proteína mais suscetível à clivagem, tendo consequências funcionais como a redução do NO demonstrando assim sua provável contribuição para a disfunção endotelial e consequente aumento da pressão arterial (TESAURO et al., 2000; PERSU et al., 2002; SAVVIDOU et al., 2001; LEESON et al.; 2002; GARDEMANN, et al., 2002).

3.2.2. Polimorfismo do Intron 4

Na década de 70, foi desenvolvido o conceito de que qualquer sequência incluída no RNAm maduro era caracterizado como um éxon, e que toda sequência genômica excluída do RNAm maduro era classificado como um íntron (GILBERT, 1978). Entretanto, novas descobertas a respeito da regulação da expressão gênica têm sido propostas, expandindo este conceito simplista até então aceito (WARD & COOPER, 2010). Os íntrons são caracterizados como as regiões não-codificantes do DNA, ou seja, não são responsáveis pela formação de proteínas. Novas evidências têm demonstrado que os íntrons atuam como intensificadores/repressores da transcrição de determinados genes, podendo este alterar a sequência e a função dos RNAm através de splicing alternativo (LIU et al., 2004; VIRTS &

Ϯϭ 

RASCHKE, 2001). Além disso, os íntrons são responsáveis pela formação dos micro RNAs os quais regulam a expressão de determinados genes, através da metilação do DNA ou remodelamento da cromatina (AMBROS et al., 2003).

Para o Íntron 4 do gene da eNOS, dois alelos têm sido identificados: o maior alelo 4b consiste em cinco repetições em tandem da sequência AAGTCTAGACCTGCTGCA/GG GGGTGAG, e o menor alelo 4a consiste em apenas quatro repetições em tandem ambos com 27 bp (WANG et al., 1996). Em seres humanos, verificou-se que o alelo 4a estava relacionado a baixos níveis de nitrito/nitrato plasmáticos, no qual os indivíduos homozigotos para esse alelo exibiram redução de aproximadamente 20% na concentração desses metabólitos do NO quando comparados com indivíduos com genótipos 4b/b, estando esta diminuição também relacionada com a redução na expressão protéica da eNOS (TSUKADA et al., 1998, WANG et al., 2000). No entanto, nem todos os trabalhos confirmam estes achados (YOON et al., 2001; JEEROOBURKHAN, 2001).

Em células endoteliais aórticas de humanos, têm sido demonstrados que a repetição de 27 pb do Intron 4 (caracterizada como MicroRNA) é capaz de reduzir a expressão gênica da eNOS (ZHANG et al., 2005). De maneira interessante, estes autores observaram que os MicroRNAs (27 pb) formados através do Íntron 4 estão principalmente localizados no núcleo das células endoteliais, indicando assim seus possíveis “sítios funcionais” na região regulatória do gene da eNOS ou no processo do pré RNAm. Posteriormente, estes autores demonstraram que o MicroRNA do Íntron 4 suprimi a expressão gênica da eNOS por alterar a acetilação das histonas e a metilação do DNA em regiões próximas a região promotora (ZHANG et al., 2008).

ϮϮ 

4. EXERCÍCIO FÍSICO E RISCO DE DOENÇAS CARDIOVASCULARES

4.1. Exercício Físico e Hipertensão Arterial

O exercício físico aeróbio de intensidade moderada realizado de forma regular é recomendado como terapêutica não farmacológica na prevenção e/ou tratamento das doenças cardiovasculares e na melhora do quadro hipertensivo (ACSM, 2004; V DIRETRIZES DE HIPERTENSÃO ARTERIAL, 2006; ZANESCO & ANTUNES, 2007). Sendo, a inatividade física um importante fator de risco para doença cardiovascular. Além disso, indivíduos inativos apresentam um risco de cerca de 30 a 50% maior do que os indivíduos ativos de desenvolver hipertensão arterial (PAFFENBARGER et al., 1991; FAGARD, 2005).

O exercício físico através da força de cisalhamento ou shear stress é um potente estimulador da liberação de NO pelo endotélio (ZANESCO & ANTUNES, 2005). Sabe-se que o exercício físico aumenta o fluxo sanguíneo pulsátil e a pressão que o sangue exerce sobre a parede vascular, sendo a força de cisalhamento sob as células endoteliais considerados estímulos poderosos para a geração de NO no sistema vascular. Assim, um dos efeitos benéficos do exercício físico regular está estreitamente relacionado à sua capacidade de estimular a síntese de NO e o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) pelas células endoteliais, levando a hipotensão arterial (SESSA et al., 1994; KINGWELL, 2000; KURU et al., 2002; ZANESCO & ANTUNES, 2007). É importante salientar que o exercício físico parece ter efeito de proteção na integridade do endotélio, quer seja aumentando produção de NO em vasos com endotélio íntegro, quer seja restaurando a disfunção endotelial (HIGASHI et al., 1999).

Alguns estudos têm associado a melhora da função endotelial em resposta a um programa de exercício físico ao aumento na expressão e atividade da eNOS, assim como na melhora da atividades das enzimas antioxidantes que por sua vez acarreta aumento da biodisponibilidade de NO para a musculatura lisa vascular (KOJDA & HAMBRECHT 2005; RUSH et al., 2005 FUKAI et al., 2000; MORAES et al., 2008).

Dados experimentais demonstraram que a redução da pressão arterial após exercício dinâmico crônico é maior em indivíduos hipertensos, principalmente quando os indivíduos estão classificados nos estágios 1 e 2 de hipertensão arterial, do que em normotensos, tanto em humanos quanto em animais de laboratório. A redução dos valores de pressão arterial

Ϯϯ 

(Δ), respectivamente, em humanos com hipertensão leve ou moderada. Em indivíduos

normotensos, a redução é de 8–10 mmHg (Δ) para a pressão sistólica e de 3–5 mmHg (Δ) para

a pressão diastólica (DUNCAN et al., 1985; KENNEY & SEALS, 1993). Duas grandes meta-análises demonstraram claramente que o exercício físico aeróbio dinâmico é capaz de promover efeitos benéficos sobre a pressão arterial (PA) (SEAMUS et al., 2002; STAFFILENO et al., 2007). A meta-análise de Seamus e colaboradores, envolvendo 54 estudos com populações normotensas, hipertensas, sobrepeso, obesidade, asiáticas, brancas e negras; demonstrou que indivíduos adultos previamente sedentários, diminuíram significativamente a pressão arterial sistólica em 3,8 mmHg (95% CI, 2,7-5,0 mm Hg) e a pressão arterial diastólica em 2,6 mm Hg (CI, 1,8-3,4 mm Hg), com exercícios aeróbicos regulares.

Portanto, o exercício aeróbio é eficaz como terapia alternativa, ou concomitante com terapia farmacológica, no tratamento da hipertensão arterial leve ou moderada. A recomendação dos programas de condicionamento físico para hipertensos preconizam a prática regular de exercícios físicos, cinco vezes por semana, durante pelo menos 30 minutos

por sessão (máximo de 60 minutos), em intensidade moderada (40-60% do VO2máx),

(ACSM, 2004). Os exercícios de baixa e moderada intensidade (40-60% de VO2máx)

apresentam melhores resultados na redução da pressão arterial do que exercícios de maior intensidade (NEGRÃO & RONDON, 2001).

4.2.Exercício Físico e Dislipidemia

Sabe-se que o exercício físico apresenta uma resposta tanto aguda como crônica sobre o perfil lipídico, pressão arterial e metabolismo da glicose, diminuindo o risco para o desenvolvimento de DCVs. Portanto, esse tipo de intervenção tem sido utilizado com sucesso na prevenção e /ou tratamento de doenças, como a dislipidemia.

Algumas das respostas necessitam de quantidades maiores de exercício para se manifestarem, sendo a resposta diretamente proporcional ao tempo e à intensidade do exercício (FOGER et al., 1994).

Visto que o período da menopausa, está associado com aumento do LDL-C (CARR et al., 2000), bem como aumento do TG e baixos níveis de HDL-C (LAROSA, 2002); intervenções terapêuticas tornam-se necessárias. Estudos em participantes não-atletas e que apresentavam hipercolesterolemia, obtiveram sucesso após o treinamento físico aeróbio com

Ϯϰ 

redução significativa de 5 a 8% do LDL-C (CROUSE et al., 1997; GRANDJEAN et al., 2000). Porém, estes trabalhos avaliaram apenas o efeito do exercício aeróbio na população masculina. O estudo realizado em mulheres na pós-menopausa, após um programa de exercício físico aeróbio, observou reduções significativas do CT e LDL-C, 6 e 11% respectivamente (LINDHEIM et al., 1994). Porém, uma meta-análise realizada por Leon et al. (2001), o qual contou com 51 estudos sobre intervenção de 12 semanas ou mais, apresenta dados conflitantes sobre o exercício físico aeróbio de intensidade moderada a alta com relação aos parâmetros lipídicos.

4.3. Polimorfismos da eNOS e Atividade Física

Existem poucos trabalhos que buscaram relacionar estes polimorfismos com a atividade física. Kimura e colaboradores (2003) observaram em uma população japonesa de indivíduos saudáveis que a interação entre o polimorfismo para o Íntron 4 e os baixos níveis de atividade física apresentavam maiores valores da pressão arterial sistólica comparado aos indivíduos não polimórficos para esta posição. De maneira interessante, quando os indivíduos apresentavam médio e alto nível de atividade física, essa diferença desaparecia. Do mesmo modo, outro estudo realizado em pacientes com doença arterial coronariana (DAC) observou que os indivíduos polimórficos tanto para a posição -786T>C quanto para posição Glu298Asp apresentavam vasodilatação dependente do endotélio reduzida em comparação aos seus pares não polimórficos. Quando esses indivíduos foram submetidos a um período de treinamento físico aeróbio por 4 semanas, verificou-se que somente os pacientes polimórficos para a posição Glu298Asp apresentaram melhora na vasodilatação dependente do endotélio e que o polimorfismo da posição -786T>C prejudica a função vascular em pacientes com DAC independente da aptidão física aeróbia (ERBS et al., 2003).

Um estudo realizado pela HERITAGE Family Study demonstrou que indivíduos polimórficos para a posição (Glu298Asp), submetidos a um programa de treinamento físico aeróbio por 20 semanas, apresentavam menores reduções da pressão arterial diastólica e do duplo produto em comparação aos indivíduos não polimórficos durante exercício submáximo (RANKINEN et al., 2000). Além disso, recente trabalho demonstrou que a condutância e relaxamento vasculares eram menores para os indivíduos que apresentavam o polimorfismo homozigoto (298 Asp/Asp) comparado tanto aos indivíduos heterozigotos (298 Glu/Asp) quanto para os não polimórficos (298 Glu/Glu) em um teste isométrico de preensão manual

Ϯϱ 

(DIAS et al., 2009). Entretanto, estes trabalhos eram compostos apenas por homens e mulheres saudáveis. Além disso, nenhuma interação com outras regiões polimórficas para o gene da eNOS foi realizada objetivando verificar a influência destes para o sistema cardiovascular em resposta a um programa de treinamento físico aeróbio.

Ϯϲ 

5. OBJETIVOS

Assim este trabalho tem por objetivos:

1. Avaliar a influência do polimorfismo G894T/Glu298Asp do gene da eNOS na pressão arterial, no perfil lipídico e nos níveis plasmáticos de nitrito/nitrato (NOx-) em resposta ao treinamento físico aeróbio de 8 semanas em mulheres normotensas e hipertensas no climatério.

2. Avaliar a influência do polimorfismo Íntron 4a/b do gene da eNOS na pressão

arterial, no perfil lipídico e nos níveis plasmáticos de nitrito/nitrato (NOx-) em

resposta ao treinamento físico aeróbio de 8 semanas em mulheres normotensas e hipertensas no climatério.

3. Avaliar a influência da associação dos polimorfismos (G894T/Glu298Asp e Íntron 4a/b) do gene da eNOS na pressão arterial, no perfil lipídico e nos níveis

plasmáticos de nitrito/nitrato (NOx-) em resposta ao treinamento físico aeróbio de

Ϯϳ 

6. MÉTODOS

6.1. Participantes

Os participantes desse estudo foram recrutados através de panfletos e anúncios dentro da comunidade universitária e de áreas circunvizinhas à Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP – Campus de Rio Claro (Bela Vista), sendo este estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do Instituto de Biociências desta mesma Universidade (Protocolo n° 4801 - Anexo 1).

6.2. Critérios de Inclusão:

Para serem incluídos no estudo os participantes deveriam ser do sexo feminino, ter idade acima de 40 anos, estar na menopausa constatada por uma anamnese prévia do médico, ser sedentária (tempo < 150 minutos de atividade física semanal de intensidade moderada ou vigorosa nos últimos 3 meses), não fumante, não diabética (nível de glicose em jejum < 110 mg/dl), ter função renal normal (creatinina sérica < 1,4 mg/dL), apresentar pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) inferiores a 159 e 99 mmHg respectivamente, caracterizando indivíduos normotensos e em estágio 1 de hipertensão (SBH, 2006), apresentar Índice de Massa Corpórea (IMC) < 30 kg/m² e não ter nenhuma outra condição médica que possa impedir a prática de exercício físico.

Após a seleção, 69 mulheres foram convidadas a comparecerem novamente ao Laboratório de Atividade Física e Saúde da Mulher (local do estudo) para a explicação completa do estudo pelo pesquisador responsável. Depois de fornecidas todas as explicações e retiradas todas as dúvidas, um termo de consentimento livre e esclarecido, resumindo o estudo e mostrando seus riscos e benefícios, foi entregue as participantes para que lessem e assinassem.

6.3. Antropometria

O peso corporal foi mensurado em balança, marca WELMY, com o indivíduo vestindo o mínimo possível de roupa e descalço. A estatura foi mensurada com estadiômetro da própria balança, isenta de rodapés ou irregularidades. O indivíduo permaneceu ereto, e com os olhos fixos num eixo horizontal paralelo ao chão.

O IMC foi determinado pela razão peso corporal/ altura2. O valor da circunferência

abdominal (CA) foi adotado como indicador de excesso de tecido adiposo abdominal, sendo as medidas tomadas em triplicata na mínima circunferência entre a crista ilíaca e a última

Ϯϴ 

costela, com a utilização de uma fita métrica com precisão em milímetros (mm) (CALLAWAY et al., 1988).

6.4. Medida da Pressão Arterial

Antes das sessões de treinamento físico as voluntárias foram instruídas para não realizarem exercício físico. Ao chegarem ao laboratório elas permaneciam sentadas em repouso por 15 minutos para a aferição da pressão arterial por método auscultatório, utilizando um esfigmomanômetro aneróide (Tycos, Raleigh, NC, USA). Como média da pressão arterial inicial e final (após 8 semanas de treinamento físico aeróbio) foram consideradas as três primeiras e as três últimas medidas respectivamente, a partir delas e dos medicamentos as voluntárias foram classificadas em normotensas e hipertensas (PAS •140 mmHg ou/e PAD • 90 mmHg).

6.5. Consumo Máximo de Oxigênio (VO2 Máximo)

Primeiramente foi obtida a frequência cardíaca (FC) de repouso de cada voluntária após 15 minutos na posição deitada, sem antes terem realizado qualquer tipo de atividade física.

Em seguida, foi aplicado o protocolo submáximo em cicloergômetro (Astrand –

Ryhming, 1954) para a determinação do consumo máximo de oxigênio (VO2 Máx). Este teste

consistiu de um aquecimento de 2 minutos com carga inicial de 25 watts. Posteriormente, foi selecionada uma carga (100 a 150 watts) a qual as voluntárias deveriam pedalar durante 6 minutos (registrando-se a FC no 5° e 6° minutos e calculando-se a média) em um ritmo de pedalada de 160±10 rotações por minuto (RPM) ou 26~28 km/h. A FC durante o teste teve

que permanecer entre 130 e 170 bpm. Para cálculo do VO2 máximo (ml/Kg/min) foi utilizado

o nomograma de Âstrand (Anexo 2), em seguida utilizou-se um fator de correção pela idade, segundo ACSM (2000).

Ϯϵ 

Fator de Correção do resultado final do VO² máx (ACMS, 2000)

Idade Fator de Correção

15 1,10 25 1,00 35 0,87 40 0,83 45 0,78 50 0,75 55 0,71 60 0,68 65 0,65

Figura 3. Fator de correção para a idade (ACSM, 2000)

Sendo assim:

VO2máx = VO2 teste (l/min) x fator de correção x 1000 x Peso (Kg)

Para a realização desse teste foram utilizados um frequencímetro da marca Polar e um cronômetro digital.

Foi calculado também a FC de reserva para aplicação do treinamento segundo a seguinte equação:

FC reserva = FC máx - FC repouso

6.6. Treinamento Físico Aeróbio

O treinamento de exercício aeróbio foi realizado no Departamento de Educação física (UNESP/Rio Claro). Todas as participantes foram submetidas a 3 sessões/semana de treinamento de exercício supervisionado durante 8 semanas. As participantes foram orientadas a usarem monitores de freqüência cardíaca de pulso para controlarem a intensidade do treinamento do exercício. As sessões de exercício começaram e terminaram com aquecimento apropriado e atividades de relaxamento. A periodização do treinamento foi realizada conforme figura 4.

ϯϬ 

Figura 4. Delineamento Experimental.

Os aumentos na intensidade e duração do treinamento ocorreram somente quando as participantes completaram suas prescrições de exercício sem sinais ou sintomas cardiovasculares ou fadiga excessiva. Os períodos de falta (máximo 3 dias) foram repostos. Os módulos de exercício foram realizados em cicloergômetro inspecionando a duração e a FC.

6.7. Coleta Sanguínea

Após jejum noturno de aproximadamente 12 horas, as amostras de sangue foram obtidas de veia antecubital (15 ml), através da técnica asséptica com material de punção venosa, descartável e apropriado para a população estudada. Uma enfermeira especializada foi contratada para a coleta. Após coleta os tubos de soro foram centrifugados por 5 minutos a 3500 rpm.

† ‡ 60% - 70% FCres. 4 semanas Iniciais _{4 semanas Finais}

50% - 60% FCres.

30 min. 4400mmiinn..

† - Parâmetros Antropométricos e coleta sanguínea

‡ - Teste de Astrand-Ryhming e Percepção Subjetiva de Esforço (Borg) § - Avaliação da FC repouso para cálculo da FCreserva (FCres.)

† ‡ §

§

ϯϭ 

6.8. Análise Bioquímica:

6.8.1 Glicemia e Perfil Lipídico

Após coleta sanguínea, a glicemia plasmática foi analisada através do kit enzimático colorimétrico LaborLab, São Paulo, Brasil. Foram considerados elevados os valores maiores ou iguais a 110mg/dL (IDF, 2007).

Para os parâmetros lipídicos a dosagem foi feita através de soro. Para o colesterol total (CT), HDL - Colesterol (HDL-C) e Triglicerídeos (TG) também foram utilizados os kits enzimáticos colorimétricos LaborLab, São Paulo, Brasil. Já para a analise do LDL - Colesterol (LDL-C) foi utilizado o kit enzimático colorimétrico Wienner, Rosário, Argentina, todos os kits seguiram as instruções do fabricante. Os valores foram considerados elevados quando: TG •150 mg/dL; CT •200 mg/dL, HDL-C •40 mg/dL e LDL-C •130 mg/dL.

Da mesma amostra foi dosada também a concentração sérica de creatinina para a análise da função renal que foi tratada como critério de inclusão.

6.8.2. Nitrito/Nitrato (NOx-)

Amostras de plasma foram utilizadas para determinação da produção endógena de NO

por meio da quantificação dos ânions nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), produtos terminais da

oxidação do NO.

O plasma foi centrifugado (12000g) por 80min, e o sobrenadante estocado a -80°C. Após serem descongeladas as amostras foram ultra filtradas por meio de microfiltros (Microcon Centrifugal Filter Units, 10 kDa; Millipore, Bedford, MA, USA). A concentração do nitrito/nitrato plasmático foi determinada por método colorimétrico utilizando kit comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) seguindo as instruções do fabricante. As absorbâncias dos picos foram determinadas a 540 nm.

6.9. Análise genotípica da NO Sintase

6.9.1. Extração do DNA genômico

O DNA dos participantes foi obtido de 4 ml de sangue, mais especificadamente de

leucócitos, a partir do protocolo Clorofórmio-Fenol. O sangue foi centrifugado a 2650 rpm

ϯϮ 

contendo NH4Cl 0,144M e NH4HCO3 0,01M. Após centrifugação a fase aquosa foi

desprezada e este último passo repetido mais duas vezes. A seguir, foi adicionada ao precipitado 1 ml da solução denominada TKM1 (Tris-HCl 10mM; pH 7,6; KCl 10mM;

MgCl2 10mM; EDTA 20mM), juntamente com 1 gota de Triton X-100. As amostras, depois

de homogeneizadas, foram centrifugadas a 2650 rpm por 10 minutos, e posteriormente a fase aquosa foi descartada, obtendo-se o precipitado de leucócitos.

Para lisar os leucócitos, foram adicionados 400 μl da solução TKM2 (Tris-HCl 10

mM pH 7,6; KCl 10mM; MgCl2 10mM; NaCl 0,4M; EDTA 20mM) e 25μl de SDS 10% e

incubado à 55ºC por 30 min. Após esse período, 180μl de NaCl 5M foram adicionados à

solução anterior e mantida em temperatura ambiente por 15 minutos. A amostra foi centrifugada a 12.000 rpm por 5 minutos e a fase aquosa transferida para outro tubo, foram

adicionados 400μl de fenol pH 8,0 e igual volume de uma solução clorofórmio/álcool

isoamílico (proporção 24:1) para precipitação de proteínas, seguido de homogeneização, centrifugação e transferência da fase aquosa para outro tubo. Para a completa remoção de

proteínas da amostra, 900μl da mistura clorofórmio/álcool isoamílico foram adicionados ao

tubo, centrifugado e a fase aquosa transferida para um novo tubo. Para a precipitação do DNA, foram adicionados 10% do volume da fase aquosa de acetato de sódio 3M pH 5,2 e

900μl de etanol absoluto gelado. O tubo foi centrifugado a 12.000 rpm por 5 minutos, a

fase aquosa foi desprezada e o DNA precipitado foi lavado com 1ml de etanol 70% gelado.

Posteriormente o DNA foi solubilizado em 30μl de tampão Tris-EDTA (TE) estéril e

armazenado em geladeira até o dia seguinte. O DNA foi quantificado em equipamento NanoDrop£ ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc, WILMINGTON, DE, USA) e a análise qualitativa realizada em gel de agarose 1,0%.

ϯϯ 

6.9.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de amplificação de DNA in

vitro proposta por Kary Mullis em 1983. A reação, catalisada por uma enzima termoestável

(Taq DNA polimerase), utiliza primers que se hibridizam em fitas opostas de regiões específicas do DNA, delimitando o fragmento. Os reagentes e suas quantidades utilizadas para a reação foram mostrados no quadro 1. A reação é levada ao termociclador e a amplificação desta região, a partir de uma pequena quantidade de DNA, ocorre em decorrência dos repetidos ciclos de temperatura: 94-96ºC - desnaturação do DNA; aproximadamente 55ºC - anelamento dos primers, e 72ºC – extensão, etapa em que há a incorporação dos nucleotídeos, resultando em um acúmulo exponencial do fragmento. Os ciclos e as temperaturas utilizadas para a PCR foram mostrados no quadro 2. Os primers utilizados na PCR para a obtenção do fragmento que pode conter o polimorfismo para a posição 894 foram desenhados no Laboratório de Bioquímica e Genoma na Unicamp utilizando o programa Gene Runner. Já os primers para o Íntron 4 da eNOS foram

sintetizados de acordo com Wang e colaboradores (1996) com modificação (figura 5). A

repetição de 27 pb do Íntron 4 pode ser vista na figura 6.

Quadro 1. Reagentes utilizados na técnica de amplificação (PCR) das regiões do gene da

eNOS (Glu298Asp/Íntron 4). Reagentes Volumes (μμμμl) eNOS Glu298Asp/Íntron 4 Tampão (10X) 3,0 MgCl2 (50mM) 1,2 dNTP’s (10mM) 0,5 Primer Sense (10 μM) 0,5 Primer Antisense (10 μM) 0,5

Taq DNA Polimerase (5U/μl) 0,2

DNA (200 ng) 1,0

dH2O 23,1

ϯϰ 

Quadro 2.: Condições das reações para amplificação dos fragmentos do gene da eNOS para

as posições Glu298Asp e Íntron 4.

Região

Desnaturação inicial

Desnaturação Anelamento Extensão

Extensão Final 35 ciclos

T(ºC) Tempo T(ºC) Tempo T(ºC) Tempo T(ºC) Tempo T(ºC) Tempo

eNOS -Glu298Asp /Íntron 4 96 2’ 96 30’’ 60 30’’ 72 1’ 72 5’ Região eNOS

Tamanho Sense (5’-3’) Antisense (5’-3’)

Glu298Asp 248 pb AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA

Íntron 4 420 pb AGGCCCTATGGTAGTGCCTTG TCTCTTAGTGCTGTGGTCACAG

Figura 5. “Primers” utilizados na PCR para as diferentes regiões do gene da eNOS e tamanho dos

produtos de amplificacão.

AGGCCCTATGGTAGT GCCTTGGCTG GAGGAGGGGA AAGAAGTCTA GACCTGCTGC AGGGGTGAGG AAGTCTAGACC TGCTGCAGGG GTGAGGAAGT CTAGACCTGC TGCAGGGGTG AGGAAGTCTA GACCTGCTGC GGGGGTGAGG AAGTCTAGAC CTGCTGCGGG GGTGAGGACA GCTGAGCGGA GCTTCCCTGG GCGGTGCTGT CAGTAGCAGG AGCAGCCTCC TGGAAAAGCC CTGGCTGCTG CTTCTCCCCC AAGAGAGAAG GCTTCTCCCG CCAGGCCAGT CCAGTGCAGC CCCTCACCCA CACCCACTGC TACCCCAGTT CCCCTGCTTC GGCCCGCACC CTCCCTCACA CCCCAGCCCA CAGACTCGGG GCTGGCCTTA GTTATGGAAC GCCTGTGACC ACAGCACTAAG AGA

Figura 6. Sequência genotípica da amplificação dos primers (em rosa) para o Íntron 4 (em amarelo)

para o gene da eNOS.

6.9.3. Determinação do polimorfismo para a posição Glu298Asp do gene da eNOS:

Após a confirmação da amplificação pela PCR em gel de agarose 1,0% (figura 7) através da eletroforese, foi realizada a técnica de RFLP (Restriction Fragment Lenght

ϯϱ 

Polymorphism) em que os fragmentos polimórficos amplificados foram digeridos pela MboI (posição do corte na figura 8) e analisados por eletroforese.

Figura 7. Gel de agarose 1,0% mostrando as bandas correspondentes à posição Glu298Asp do

gene da eNOS.

Para a análise utilizando endonucleases de restrição quadro 3 , foram utilizados: 5,0 μl do produto amplificado, 1,5 μl do tampão da enzima 10X e 0,5 U da enzima MboI. A enzima utilizada e seu padrão de digestão esperado estão representados no quadro 6. Água

deionizada e estéril foi adicionada para completar o volume de 15,0 μl e a mistura foi

conduzida ao banho-maria a 37ºC durante 16 horas. O produto foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1000 a 2,5% (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) por 3 horas, corado com brometo de etídio, visualizados sob luz ultravioleta e fotografado (figura 9).

300pb Æ

200pb Æ Å 248pb

ϯϲ 

Quadro 3. Padrão de reconhecimento e digestão pela enzima MboI.

Gene Sequência de restrição da

enzima Produto PCR Enzima

Produto Digestão eNOS

(Glu298Asp)

5’...^GATC...3’ 248pb MboI 190pb+58pb

Figura 9. Foto dos fragmentos da posição Glu298Asp digeridos. M: marcador molecular (50

pb).

Após a digestão, são observadas as seguintes características para a região de interesse: ¾ Homozigoto não polimórfico (GG) - 248pb;

¾ Heterozigoto Polimórfico (GT) - 248pb + 190 pb + 58pb ¾ Homozigoto Polimórfico (T/T) - 190pb + 58pb

6.9.4. Determinação do polimorfismo para o Íntron 4 da eNOS:

Após a confirmação da amplificação pela PCR em gel de agarose 1,5%, foi realizada a genotipagem no sequenciador MegaBACE – 1000 e a análise dos fragmentos produzidos foi feita no programa Fragment Profiler versão 1.2. O alelo 4a produziu um pico em 386 pb (referente a 393 pb) e o alelo 4b produziu um pico em 413 pb (referente a 420 pb) demonstrados na figura 10.

ϯϳ 

Figura 10. Espectro da genotipagem para o Íntron 4 do gene da eNOS.

6.9.5 Grupos Experimentais

Após algumas desistências, terminou-se o estudo com 49 voluntárias que foram analisadas primeiramente por seus genótipos para o gene da eNOS para Glu298Asp (não polimórfico – GG e polimórfico – GT, TT) e posteriormente por seus genótipos para outro polimorfismo da eNOS, o Íntron 4 ( não polimórfico – 4b/b e polimórfico – 4b/a e 4a/a). Em seguida estas análises também foram feitas dentro dois grupos:

Grupo Normotenso (NT) - submetido ao Treinamento Físico por oito semanas: Grupo Hipertenso (HT) - submetido ao Treinamento Físico por oito semanas.

Após a avaliação dos genótipos individuais para cada polimorfismo do gene da eNOS, as voluntárias foram divididas pelos seus genótipos associados, sendo estes especificados conforme figura 11.

ϯϴ 

Figura 11. Divisão dos grupos amostrais.

6.9.6. Análise Estatística

Inicialmente, o teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para determinação da normalidade do conjunto de dados analisado, o qual indicou normalidade dos mesmos.

A partir disso, utilizou-se uma análise descritiva (média ± erro-padrão da média) em todos os resultados dos testes (pré e pós-treinamento).

Foram aplicados o teste de ANOVA one-way (teste post hoc de Tukey) para a comparação das médias dentro dos momentos pré e pós entre os diferentes genótipos (posição Glu298Asp, Íntron 4 e a interação de ambos), entre os hipertensos e normotensos e entre os genótipos e a condição de hipertensão.

Já para a avaliação do treinamento físico (Pré-Treino X Pós-Treino) foi aplicado o teste t de Student pareado.

Para todas as análises foi adotado o nível de significância de p<0,05 e o software utilizado foi o SPSS 13.0.

(GT+TT) – 4b/b

GG – 4b/b GG – (4a/b + 4a/a) GT+TT – 4a/b + 4a/a Grupo 2

ϯϵ 

7. RESULTADOS

7.1. Resultados Gerais

Com relação à participação do estudo, das 69 voluntárias selecionadas apenas quarenta e nove completaram todas as etapas do estudo, sendo observada uma perda amostral de 29%.

A tabela 1 mostra as características gerais do grupo, sendo apresentadas a idade, características antropométricas, parâmetros cardiorrespiratórios, glicemia, perfil lipídico e

níveis de nitrito/nitrato plasmáticos (NOx-) no início (Pré-Treino) e após (Pós-Treino)

programa de treinamento físico aeróbio (TF) de 8 semanas. Sendo que o TF foi eficaz em reduzir significativamente os valores de circunferência abdominal (CA), de pressão arterial sistólica (PAS), de pressão arterial diastólica (PAD), de colesterol total (CT) e LDL-C, além

de promover aumento do consumo máximo de oxigênio (VO2MÁX). Dados ilustrados nas

ϰϬ 

Tabela 1. Parâmetros antropométricos, cardiorrespiratórios, glicemia, perfil lipídico e níveis

de nitrato/nitrato plasmático das voluntárias, no início (Pré-Treino) e após (Pós-Treino) Treinamento Aeróbio de 8 semanas.

DADOS GERAIS

PARÂMETROS Pré-Treino Pós-Treino

IDADE (anos) 50,30±0,92 - IMC (kg/m2) 25,46±0,39 25,50±0,39 C A (cm) 85,96±1,11 84,43±1,07* VO2 MÁX (ml/kg/min) 26,06±0,95 32,86±1,26* PAS (mmHg) 113,07±1,59 107,13±1,50* PAD (mmHg) 74,57±1,16 69,20±1,09* GLICEMIA (mg/dL) 85,33±2,03 82,71±1,66 TRIGLICERÍDEOS (mg/dL) 110,26±9,01 105,18±6,30 COLESTEROL TOTAL (mg/dL) 208,27±5,85 183,47±5,18* HDL-C (mg/dL) 54,58±1,87 50,52±1,71* LDL-C (mg/dL) 141,10±6,06 107,80±4,96* CREATININA (mg/dL) 1,08±0,03 0,89±0,03* NOx- (μM) 19,48±2,32 23,14±2,51

Valores expresssos em média±erro-padrão da média.

IMC: Índice de massa corpórea; CA: Circunferência Abdominal; VO2 MÁX: Consumo máximo de

oxigênio; PAS: Pressão Arterial Sistólica; PAD: Pressão Arterial Diastólica; HDL-C: Lipoproteína de

alta densidade; LDL-C: Lipoproteína de baixa densidade; NOx-: Nitrito/Nitrato plasmático.

Dados do VO2 MÁX foram analisados com 41 voluntárias, sendo excluídas dessa análise as voluntárias

que faziam uso de medicamentos beta-bloqueadores. * Diferente estatisticamente dos valores no Pré-Treino.

0 10 20 30 40 Pré-treino Pós-treino

*

Figura 12. Dados do consumo máximo de oxigênio das voluntárias no momento pré e pós-treino. Os

ϰϭ  0 10 20 30 Pré-treino Pós-treino IM C ( K g /m 2) 0 20 40 60 80 100 Pré-treino Pós-treino * CA ( c m ) 50 75 100 125 150 Pré-treino Pós-treino * P A S ( mmH g ) 50 60 70 80 90 100 Pré-treino Pós-treino * PA D ( m mH g ) 0 10 20 30 Pré-treino Pós-treino N ívei s p lasm át ico s d e Ni tr a to/ Ni tr a to ( μ M ) 50 60 70 80 90 100 Pré-treino Pós-treino G lic e m ia ( m g /d L ) 50 75 100 125 150 Pré-treino Pós-treino N íve is P lá m at ic o s d e T rig lic er íd e o sl ( m g /d L ) 50 100 150 200 250 Pré-treino Pós-treino * N ívei s P lám a ti co s d e C ol e s te ro l To ta l ( m g/ dL)

ϰϮ  0 15 30 45 60 Pré-treino Pós-treino * N ívei s p lasm át ic o s d e HD L C o le s te rol ( m g /dL ) 50 100 150 200 Pré-treino Pós-treino * N ívei s p lasm át ic o s d e L D L C ol e s te rol ( m g/ dL )

Figura 13. Dados gerais do grupo de voluntárias no momento pré e pós-treino. Os valores

representam as médias ± erro padrão da média (n=49). *p<0,05.

A tabela 2 mostra as características gerais do grupo, quando divididas em normotensas e hipertensas sendo apresentadas a idade, características antropométricas, parâmetros cardiorrespiratórios, glicemia, perfil lipídico e níveis plasmáticos de nitrito/nitratos (NOx-) no início (Pré-Treino) e após (Pós-Treino) programa de treinamento físico aeróbio (TF) de 8 semanas. Podemos observar que o TF foi eficaz em reduzir os valores de circunferência abdominal apenas do grupo hipertenso. Entretanto, o TF promoveu redução significativa dos valores de pressão arterial sistólica (grupo normotenso: -5%; grupo hipertenso: -7%), de pressão arterial diastólica (grupo normotenso: -7%; grupo hipertenso: -9%), de colesterol total (grupo normotenso: -11%; grupo hipertenso: -14%) e LDL-C (grupo normotenso: - 22%; grupo hipertenso: -27%), em ambos os grupos. Além disso, promoveu aumento significativo do consumo máximo de oxigênio (grupo normotenso: 22%; grupo hipertenso: 38%). Dados ilustrados na figura 14.

ϰϯ 

Tabela 2. Parâmetros antropométricos, cardiorrespiratórios, glicemia, perfil lipídico e níveis

plasmáticos de nitrato/nitrato das voluntárias normotensas e hipertensas, no início (Pré-Treino) e após (Pós-(Pré-Treino) Treinamento Aeróbio de 8 semanas.

GRUPOS

Normotensas (n=35) Hipertensas (n=14)

PARÂMETROS Pré-Treino Pós-Treino Pré-Treino Pós-Treino

IDADE (anos) 49,83±1,13 - 51,50±1,61 - IMC (kg/m2) 25,25±0,45 25,32±0,45 25,97±0,78 25,96±0,81 CA (cm) 84,51±1,14 83,47±1,18 89,37±2,41 86,69±2,22* VO2 MÁX (ml/kg/min) 26,90±1,10 32,84±1,40* 23,97±1,13 33,01±3,20* PAS (mmHg) 110,41±1,82 105,34±1,19* 119,73±2,53 111,61±2,42* PAD (mmHg) 72,46±1,37 67,75±1,32* 79,83±1,46 72,83±1,60* GLICEMIA (mg/dL) 86,65±3,07 82,14±1,95 87,04±3,76 85,09±3,04 TRIGLICERÍDEOS (mg/dL) 104,85±9,04 103,13±8,38 119,13±22,89 104,67±7,23 COLESTEROL TOTAL (mg/dL) 205,90±6,67 182,78±6,04* 214,21±12,09 185,21±10,39* HDL-C (mg/dL) 56,36±2,25 51,27±1,76* 52,10±3,65 48,32±3,93 LDL-C (mg/dL) 139,53±7,04 108,72±6,37* 145,04±12,16 105,50±7,25* NOx- (μM) 21,74±3,43 22,71±2,58 18,90±4,04 24,55±5,88

Valores expressos em média±erro-padrão da média.

IMC: Índice de massa corpórea; CA: Circunferência Abdominal; VO2 MÁX: Consumo máximo de

oxigênio; PAS: Pressão Arterial Sistólica; PAD: Pressão Arterial Diastólica; HDL-C: Lipoproteína de

alta densidade; LDL-C: Lipoproteína de baixa densidade; NOx-: Nitrito/Nitrato plasmáticos.

Dados do VO2 MÁX do grupo hipertenso foram analisados com 06 voluntárias, sendo excluídas dessa

análise as voluntárias que faziam uso de medicamentos beta-bloqueadores. * Diferente estatisticamente dos valores no Pré-Treino.