68. CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DE COMPOSTOS COMPLEXADOS A METAIS FRENTE A LEVEDURAS DE SPOROTHRIX SCHENCKII.
Reuel Da Silva Torquato Costa1; Thalita Gagini2; Luana Santos2; Sonia Rozental2 1 Escola Superior de Saúde da Universidade Estadual do Amazonas;
2Laboratório de Biologia Celular dos Fungos da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
RESUMO
A esporotricose é uma micose subcutânea causada por espécies do complexo Sporothrix schenckii, este complexo é constituído por fungos dimórficos que se diferenciam em micélio (comum em regiões de clima quente e úmido) e leveduras (que afetam animais, principalmente gatos e o homem). No homem, a esporotricose está relacionada principalmente com o manejo da terra, agricultura e jardinagem. Esse fungo encontra-se no solo, vegetais, palhas e madeiras; a infecção também pode ocorrer por arranhadura e mordedura de gatos ou também por contado direto da pele lesionada. As manifestações clínicas são variadas, entretanto os sinais mais observados são ulceras profundas na pele, que não cicatrizam e evoluem rapidamente. O tratamento padrão dura em torno de seis meses e é realizado com antifúngicos como iodeto de potássio, itraconazol e anfotericina B (uso tópico), porém estes apresentam muitos efeitos colaterais.Este estudo visa buscar uma nova droga para o tratamento da esporotricose. O clotrimazol ja é utilizado no tratamento das dermatomicoses como micoses interdigitais e micoses da pele. O clotrimazol é um inibidor da síntese de ergosterol, podendo assim ser aplicado em outros tipos de micose. A associação com o zinco através do acetato de zinco e cloreto de zinco, ocorre pela tentativa de potencializar o clotrimazol, aumentando o seu efeito contra o complexo S. chenckii diminuindo o período de tratamento.
ABSTRACT
Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by species of the complex Sporothrix schenckii, this complex consists of dimorphic fungi which differentiate into mycelium (common in hot and humid climates) and yeast (affecting animals, especially cats and man).In humans, sporotrichosis is mainly related to land management, agriculture and gardening. This fungus is in the soil, plants, straw and woods; Infection can also occur by scratch and bite cats or also by direct contact of damaged skin.The clinical manifestations are varied, but the most frequently observed signs are deep ulcers on the skin that do not heal and evolve rapidly.The standard treatment lasts around six months and is done with antifungal as potassium iodide, itraconazole and amphotericin B (topical), but they have many side effects.This study aims to find a new drug for the treatment of sporotrichosis. The clotrimazole is already used to treat dermatomycoses as fungal infections of the skin. Clotrimazole is an inhibitor of ergosterol synthesis and can therefore be applied to other types of ringworm. The combination with zinc by zinc acetate and zinc chloride occurs by trying to maximize clotrimazole, increasing their effect against S. complex chenckii reducing the treatment period.
INTRODUÇÃO
Esporotricose
A esporotricose conhecida também como “doença da roseira” é uma micose crônica causada pelo complexo
Sporothrix schenkii, expressa-se sobre a forma cutâneolinfático-nodular com alguns sinais como: úlceras
profundas na pele que não cicatrizam e evoluem rapidamente, podendo também estender-se para as vísceras, mucosas, ossos e sistema nervoso central.
Forma cutânea localizada
Nessa forma, encontra-se lesão única sem nódulos no trajeto linfático e raramente se vê adenopatia regional. Inúmeros tipos de lesões foram descritas: pápulas que pustulizam e ulceram, placas achatadas, lesões eritemato- escamosas, cujo diagnóstico é dificultado. (SIDRIM 2010)
Forma cutânea disseminada
Essa forma está associada à imunodepressão. Após inoculação, ocorre a disseminação por via hematogênica, com lesões inicialmente subcutâneas, amolecidas, que após semanas, podem ulcerar-se. De modo geral, as lesões são assintomáticas, não afetando a saúde geral do paciente. (SIDRIM 2010)
Formas extracutâneas
Está sempre associada a imunodepressão, ela pode envolver qualquer tecido ou órgão, as lesões são resultados da disseminação hematogênica. Os sintomas são relacionados com o órgão envolvido. Depois da pele o tecido mais frequente é o ósseo, os ossos mais afetados são: tíbia, ossos pequenos das mãos, rádio, ulna e ossos do crânio e da face. As lesões assumem formas variadas, como pequenos granulomas solitários ou
grandes lesões gomosas com intensa destruição óssea, lesões semelhantes à osteomielite e à peristite. (SIDRIM 2010)
O complexo Sporothrix schenkii apresenta-se de duas formas: micélio, encontrados na natureza em regiões de clima quente e úmido a 27°C cuja forma é infectante para o homem e levedura, forma parasitaria do homem a 37°C.
A esporotricose está relacionada principalmente com o manejo dos agricultores com o solo, vegetais e madeiras, entretanto a infecção pode ocorrer por arranhaduras e mordeduras de animais principalmente gatos e até mesmo por contato direto da pele lesionada.
Apesar da esporotricose ser uma micose bastante comum em regiões de clima quente e úmido, ela é negligenciada pelo governo portanto, existem poucas drogas no mercado para o tratamento desta patogenia. Assim torna-se importante o estudo de outras drogas para o tratamento desta doença, aperfeiçoando o tratamento e diminuindo os efeitos colaterais causados pelos medicamentos do tratamento padrão. Objetivo geral: caracterizar, por meio das técnicas de microdiluição em caldo, citometria e microscopia eletrônica; o efeito causado sobre as leveduras de Sporothrix schenckii submetidas ao tratamento com compostos complexados a metais. Objetivos Específicos: determinar o efeito inibitório dos compostos complexados a metais, sobre leveduras de Sporothrix schenckii, comparando a efetividade destes com seus sais de partida e também com o tratamento padrão (itraconazol); identificar as alterações nas proporções de lipídios neutros de membrana e nas mitocôndrias das leveduras por meio de marcação para ensaio de citometria; observar, por meio de microscopia eletrônica de transmissão e varredura, as alterações morfológicas e estruturais que ocorrerem causadas pelos tratamentos com compostos complexados a metais, em comparação com o controle não tratado; correlacionar os resultados obtidos por citometria com os resultados da microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 1. Sporothrix schenkii a esquerda em forma de micélio (encontrados em ambientes quentes, úmidos e ricos em material orgânico) e a direta em forma de levedura (parasitas do homem e animais).
MATERIAIS E MÉTODOS
Cultivo in vitro
O fungo utilizado nessa pesquisa foi coletado de pacientes do hospital universitário do rio de janeiro e armazenado em microtúbo à temperatura de 4°C na forma filamentosa. 10 µL dessa amostra serão colocados em 100 mL de meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI) em elermeyer à temperatura de 36°C sobre agitação no agitador innova 42, durante sete dias (primeira passagem) e quatroze dias (segunda passagem). O meio BHI utilizado é composto por infusão de cérebro de bezerro 200 g/L, protease peptona 10 g/L, cloreto de sódio 5 g/L, infusão de coração bovino 250 g/L, dextrose 2 g/L, fosfato dissódico 2,5 g/L, o pH é ajustado para 7,4 e posteriormente autoclavado. O fungo será filtrado com gazes e armazenado em tubo falcon.
Contagem de células e determinação da concentração
Os fungos filtrados serão diluídos em água destilada na proporção de 1:10 portanto, 100µL de fungo em 900µL de água destilada, essa diluição será pipetada e colocada na câmara de neubauer para contagem de células, a contagem será realizada pela visualização em microscópio ótico das células de leveduras nos quadrados maiores das extremidades superiores e inferiores e no centro dos quadrados, após a contagem será ajustado a concentração para 105 células/mL de acordo com a quantidade de meio Roswell Park
Memorial Institute (RPMI) utilizado nas placas de 96 poços. O meio RPMI é composto por Nitrato de Cálcio 4H2O 100 mg/L, Sulfato de Magnésio (anidro) 48,84 mg/L, Cloreto de Potássio 400 mg/L, Cloreto de Sódio
6000 mg/L, Fosfato de Sódio, dibásico, anidro 800 mg/L, Glicina 10 mg/L, Hidrocloreto de L-Arginina 241 mg/L, L-Asparagina 50 mg/L, Ácido L-Aspártico 20 mg/L, Diidrocloreto de L-Cistina 65,20 mg/L, Acido L-Glutâmico 20 mg/L, L-Glutamina 300 mg/L, Hidrocloreto de L-Histidina H2O 20,96 mg/L,
Metionina 15 mg/L, L-Fenilalanina 15 mg/L, L-Prolina 20 mg/L, L-Serina 30 mg/L, L-Treonina 20 mg/L, L- Triptofano 5 mg/L, L-Tirosina (Sal Sódico) 28,83 mg/L, L-Valina 20,00 mg/L, Cloreto de Colina 3 mg/L, D-Biotina 0,20 mg/L, D-Ca-Pantotenato 0,25 mg/L, Ácido Fólico 1 mg/L, Niacinamida 1 mg/L, Hidrocloreto de Piridoxina 1 mg/L, Riboflavina 0,20 mg/L, Hidrocloreto de Tiamina 1 mg/L, Vitamina B12 0,005 mg/L, i-Inositol 35 mg/L, Acido P-Amino Benzóico (PABA) 1 mg/L, D-Glicose 2000 mg/L, Glutationa reduzida 1 mg/L, Vermelho de fenol 5,30 mg/L, pH a 25°C será ajustado para 7,2 a 7,8. Método de diluição em caldo
As drogas com concentração de 1,6 mg/mL a serem trabalhadas serão utilizadas em duplicata em placa de 96 poços, serão diluídas da seguinte forma: 100 µL de meio RPMI serão adicionados em todos os poços da placa de 96 poços através da pipeta automática eppendorf de 15 - 300 µL, em seguida será adicionado 12 µL das drogas até os poços de número dez, seguidamente será adicionado mais 100 µL de meio RPMI nos poços de número um, as diluições dos poços de número um serão ressuspensos cinco vezes, será pipetado 100 µL dos poços de número um e despejados nos poços de número dois, o procedimento anterior será repetido até os poços de número dez, os 100 µL que sobrarão dos poços de número dez serão descartados, o próximo passo será adicionar o fungo de primeira ou de segunda passagem de modo que a concentração seja de 105 células/mL, até os poços de número onze, estes últimos serão os controles pois estarão livres de
drogas, os poços de número doze serão o branco, pois terão somente meio RPMI. As concentrações de drogas serão de 16 µg/mL - 0,03 µg/mL. A placa será incubada na estufa a 35°C durante 48 horas. Concentração inibitória mínima
A concentração inibitória mínima de 90% será determinada através da leitura das placas de 96 poços em microscópio invertido através da comparação das amostradas tratadas com o controle, será aproveitado a concentração da droga em que houver inibição de 90% do crescimento, as concentrações em que houver redução no crescimento fúngico será denominado fungicida.
Concentração fungicida mínima
A concentração fungicida mínima será determinada pela visualização da inibição total do crescimento das colônias fúngicas através da análise em microscópio invertido, a menor concentração das drogas em que houver inibição total do crescimento fúngico será a concentração fungicida mínima, as concentrações de drogas em que houver inibição total do crescimento será denominada fungistático.
Teste da resazurina
O teste da resazurina será realizado após a determinação da concentração inibitória mínima e da concentração fungicida mínima, 15 µL de resazurina serão pipetados em todos os 96 poços da placa, a placa será incubada na estufa por 6 horas, passando-se o período de incubação, a placa será lida no citômetro BD Accuri C6 e determinado a concentração inibitória mínima de 90% através de cálculos no excell.
Citometria de fluxo
As leveduras do isolado ATCC MYA 4821 tratadas e não tratadas por 48 horas com concentrações sub- inibitórias (CIM/2) dos sais de zinco combinados ao clotrimazol serão lavadas em PBS, e 105 leveduras/mL
serão incubadas com 50 µM de BODIPY 493/503 (Molecular Probes®, lipídios neutros) e com 10 µM de MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes®, atividade mitocondrial), por 30 min à temperatura ambiente, no escuro. Após incubação com os marcadores, as leveduras serão lavadas em PBS, fixadas com 1% de formaldeído por 30 minutos e lavadas novamente. Serão detectados 2000 eventos utilizando o citômetro de fluxo BD AccuriTM C6 e os dados serão analisados pelo BD Accuri C6 Software.
Microscopia eletrônica de varredura
Os fungos tratados e não tratados serão coletados após a centrifugação e serão fixados com paraformaldeído 4%, glutaraldeído 2,5% diluídos em tampão cacodilato 0,1M durante uma hora em temperatura ambiente, após a fixação as amostras serão lavadas três vezes com tampão cacodilato 0,1M e serão aderidas sobre uma lamínula de vidro com Poli-L-lisina durante 20 minutos, em seguida serão pós-fixadas com ósmio 1%, ferrocianeto de potássio 1,25%, cloreto de cálcio 5mM em tampão cacodilato 0,1M por uma hora no escuro e serão lavadas três vezes com tampão cacodilato 0,1M ou água miliq, em seguida será iniciado a desidratação com etanol a 30, 50, 70, 90 e 100% sendo 30 minutos para cada concentração, após a desidratação será usado o ponto crítico da marca Laicon de dióxido de carbono em média por uma hora, após a secagem do material as lamínulas serão aderidas em suporte metálico para serem metalizadas com ouro através do metalizador Balzers Union Fl-9400 e serem visualizadas no microscópio eletrônico de varredura.
RESULTADOS PRELIMINARES
Cultivo in vitro
Os fungos apresentaram poucas células de leveduras na primeira passagem, entretanto mais de 80% de conversão foi adquirida na segunda passagem.
Figura 2. Sporothrix schenckii em tubos falcon, 0 dias (esquerda), 7 dias (meio) e 10 dias (direita), nota-se a turbidez do tubo da direita, indicando assim um crescimento e conversão maior que os outros dois tubos.
Contagem de células e determinação da concentração
As contagens das amostras de primeira e segunda passagem foram 17 e 24 células/mL. Primeira
passagem Segunda passagem
17x5=85 24x5=120
85x104x102=850x105 120x104x102=1200x105
Figura 3. Câmara de neubauer (esquerda), câmara de neubauer vista através do microscópio ótico, as células foram
contadas nos quadrados com a letra L e também no centro. Método de diluição em caldo
Através da fórmula das diluições foi possível determinar a concentração fúngica e de drogas a serem utilizada se no preparo da metodologia da diluição em caldo.
Primeira passagem Segunda passagem Concentração das drogas
C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2
850x105xV
V1=2,8 µL V1=4 µL V1=12µL
Concentração inibitória mínima, teste da resazurina e concentração fungicida mínima.
CIM DE PRIMEIRA PASSAGEM CIM DE SEGUNDA
PASSAGEM Compostos CI 90% Leitura
CI 90% Resazurina CFM CI 90% Leitura CI 90%
CFM
visual visual Resazurina
Clotrimazol 2 0,125 8 1 0,5 4 Clotrimazol + 1 0,125 4 2 1 8 acetato de zinco Clotrimazol + cloreto 1 2 4 2 0,5 8 de zinco Acetato de zinco >16 >16 >16 >16 >16 >16 Cloreto de zinco >16 >16 >16 >16 >16 >16 Itraconazol 1 2 8 2 1 8
Tabela 1. Na concentração inibitória mínima de primeira passagem o teste da resazurina revelou que as amostras tratadas com clotrimazol complexado ao acetado de zinco obtiveram a mesma eficiência que o clotrimazol, comparado também ao itraconazol, o composto complexado apresentou resultados mais satisfatórios, todavia na comparação da concentração fungicida mínima o clotrimazol complexado ao acetado de zinco resultou em maior competência comparada as drogas comerciais. Na concentração inibitória mínima de segunda passagem o teste da resazurina revelou que as amostras tratadas com clotrimazol complexado ao cloreto de zinco apresentaram a mesma capacidade de inibição que o clotrimazol e melhor efetividade comparado ao itraconazol, entretanto na análise da concentração fungicida mínima o composto complexado se mostrou menos eficaz que o clotrimazol e na mesma proporção que o itraconazol.
Citometria
A marcação com BODIPY 493/503 sugere que houve um ligeiro acúmulo de lipídios neutros após exposição a ZnAc e ZnCl.
A marcação com MitoTracker Red CMXRos indica que houve uma ligeira diminuição da atividade mitocondrial após o tratamento com Ctz e Ctz-ZnCl. Por outro lado, a exposição aos sais de Zinco induziu aumento desta marcação, que pode estar refletindo a hiperpolarização da mitocôndria em resposta ao estresse celular ou a presença de mais mitocôndrias nas células.
Devido ao reduzido número de leveduras obtidas após exposição aos compostos, foi possível adquirir apenas 2000 eventos, sem que houvesse possibilidade de fazer duplicatas. É necessário que este experimento seja repetido para que de fato uma conclusão seja formulada. Sendo assim, esses resultados tratam-se apenas de resultados preliminares. Entretanto, já indicam que os compostos promovem alterações na homeostase da célula.
Compostos Intensidade de fluorescência
BODIPY 493/503 a % Células m MitoTracker arcadas Red CMXRos Controle 157.915,19 ± 1,5 31,6 ZnAc 259.749,78 ± 1,3 57,1 ZnCl 261.652,36 ± 1,2 42,6 Ctz 201.109,24 ± 0,8 24,8
Ctz-ZnAc 170.860,06 ± 0,9 29,4 Ctz-ZnCl 149.959,13 ± 1,7 21,2
a Média ± desvio padrão
Tabela 2. Resultados preliminares utilizando marcações para lipídios neutros (BODIPY 493/503) e atividade mitocondrial (MitoTracker Red CMXRos) e análise por citometria, onde 2000 eventos foram adquiridos.
Microscopia eletrônica de varredura
Figura 4: Análise dos diferentes tratamentos por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Células controle apresentando leveduras e hifas bem preservadas (A e B). Tratamento com Acetato de zinco apresenta leveduras bem preservadas, porém com ausência de hifas (C e D). Tratamento com Cloreto de zinco apresenta diminuição de leveduras e presença de poucas hifas (E e F). Tratamento com Clotrimazol + Acetato de zinco (G e H) e Clotrimazol + Cloreto de zinco (I e J) apresentam alterações estruturais nas leveduras e ausência de hifas. Tratamento com Clotrimazol apresenta poucas leveduras e estas com alterações estruturais e ausência de hifas.
CONCLUSÃO
Nossos dados ainda são preliminares e ainda não podemos concluir se os fármacos complexados a metais são mais efetivos do que o fármaco comercial, sendo necessários novos experimentos com um maior número de isolados clínicos. Entretando, um resultado muito interessante, foi a atividade do clotrimazol tão ativo quanto o itraconazol, podendo ser considerado como uma opção para tratamentos de uso tópico.
REFERÊNCIAS
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LACAZ, C. S. PORTO, E, et al. Tratado de micologia médica lacaz. São Paulo: Sarvier. 2002.
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SIDRIM, J. J. Moreira, J. L. B. Fundamentos clínicos e laboratoriais da micologia médica. Rio de Janeiro: Guanabara, 1999.
SIDRIM, J. J. C. ROCHA, M, F, G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos. Rio de Janeiro: Guanabara, 2010
