Londrina 2014
CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
CINTIA CRISTINA SANTI MARTIGNAGO
ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR E DA EXPRESSÃO
GÊNICA DE CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS DE
CAMUNDONGOS (L929) SUBMETIDAS À TERAPIA LASER
DE BAIXA POTÊNCIA
Londrina 2014
CINTIA CRISTINA SANTI MARTIGNAGO
ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR E DA EXPRESSÃO GÊNICA
DE CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS DE CAMUNDONGOS (L929)
SUBMETIDAS À TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dra. Regina Célia Poli-Frederico
Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU
ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação na publicação
Universidade Norte do Paraná Biblioteca Central
Setor de Tratamento da Informação
Martignago, Cintia Cristina Santi
M333a Análise da proliferação celular e da expressão gênica de células fibroblásticas submetidas à terapia laser de baixa potência / Cintia Cristina Santi Martignago. Londrina: [s.n], 2014.
xii; 75f.
Dissertação (Mestrado). Ciências da Reabilitação. Universidade Norte do Paraná/Universidade Estadual de Londrina.
Orientadora: Profª Drª. Regina Célia Poli-Frederico
1- Ciências da reabilitação - dissertação de mestrado – UNOPAR/UEL 2- Colágeno tipo 1 3- Expressão gênica 4- Proliferação celular 5- Terapia laser de baixa frequência 6- Fator de crescimento endotelial vascular I- Poli-Frederico, Regina Célia; orient. II- Universidade Norte do Paraná. III- Universidade Estadual de Londrina.
CINTIA CRISTINA SANTI MARTIGNAGO
ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR E DA
EXPRESSÃO GÊNICA DE CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS
DE CAMUNDONGOS (L929) SUBMETIDAS À TERAPIA
LASER DE BAIXA POTÊNCIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação. BANCA EXAMINADORA _______________________ _____________
Dra. Regina Célia Poli Frederico Prof. Orientador Universidade Norte do Paraná _______________________ _____________ Dra. Deise Aparecida de
Almeida Pires Oliveira Membro Interno Universidade Norte do
Paraná
_______________________ ____________ Dra. Cristina Pacheco
Soares Membro Externo Universidade do Vale do
Paraíba
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, meu guia e Senhor que conduziu meus passos até aqui. Estando sempre ao meu lado dando força, coragem e animo para não desistir mesmo quando tudo dava errado.
Faltam palavras para agradecer a minha família, principalmente a minha mãe (Janete) e aos avós maternos (Nene e Dino) pelo amor incondicional, carinho, paciência, confianças e é claro “apoio financeiro” em mais essa etapa da minha vida. Por cada palavra de incentivo, motivação e até mesmo o silêncio de vocês quando não entendiam nada do que eu estava falando. Saber que poderia contar com vocês tornou tudo menos difícil. Obrigada por acreditar em mim, mesmo quando eu não acreditava. Amo vocês.
Ao meu Pai Iris Martignago (in memória) que infelizmente não esteve presente fisicamente na minha vida, mas tenho certeza que de onde quer que ele esteja sempre olhou por mim.
Aos meus tios Gilberto, Jussara, Alessandro e Adenilson, saber que posso contar sempre com vocês é muito importante.
As minhas primas Tairini, Sarah, Ellen e Gabriela por agüentarem a minha chatice, que foi ainda maior nesses últimos anos. Sei que as vezes meus abraços e beijos eram muitos, chegavam até a incomodar, mas eles me acalmavam, faziam com que qualquer problema sumisse, por alguns instantes.
A minha orientadora professora Dra. Regina Célia Poli-Frederico não apenas por ter aceite a difícil tarefa de orientar uma fisioterapeuta sem experiência alguma em biologia molecular e celular, mas também por todo conhecimento partilhado, paciência na orientação e incentivo que tornaram possível a conclusão desta dissertação. Serei eternamente grata.
Ao meu coorientador, professor Dr. Rodrigo Franco de Oliveira e a professora Dra. Deise Aparecida de Almeida Pires Oliveira que quando tudo parecia estar perdido não mediram esforços para que esse estudo passasse de um projeto e fosse colocado em prática. Por estarem sempre dispostos a me auxiliar partilhando o conhecimento de vocês.
Aos professores Dra. Cristina Pacheco Soares, Dr. Newton Soares e suas equipe de pesquisa (não nomearei, pois possivelmente esquecerei algum) que além de nos receberem em seus laboratórios para a cultura e irradiação das células, não mediram esforços para auxiliar na realização do experimento, partilhando as experiências e o conhecimento.
Aos professores Dr. Paulo Adona e Paulo Monzani e sua equipe do laboratório (Tobias e Samuel) que além de nos receber em seus laboratórios, auxiliaram na realização das análises, partilharam todo o conhecimento e ainda fizeram a nossa estadia em Tamara mais agradável com os momentos de conversa e descontração.
A Priscila de Oliveira, pelo auxílio e companhia durante a realização desse projeto.
A Emily Ruzzon, não tenho palavras para agradecer tudo que me ensinou durante nossas horas e horas de laboratório além da paciência que teve comigo, principalmente às vezes meu humor não era dos melhores (e olha que não foram poucas).
Ao meu ex supervisor de estágio e hoje querido amigo Alisson Gustavo Bráz que muito me ensinou e incentivou para seguir na carreira acadêmica. As amigas, Simone, Morgana, Aline e Manu. Tenho certeza que muitas vezes vocês pensaram que eu utilizei os estudos como um álibi para meu isolamento, mas mesmo assim sempre insistiram em manter contato.
A Susi e Paula, que foram e são muito mais que amigas. Além de todos os conselhos, palavras de carinho, conforto e estímulo me acolheram em sua família, tornando o distanciamento da minha família mais fácil.
Agradeço aos meus colegas de mestrado, em especial a Myrian, Simone e Larissa. Obrigada por todo o apoio, auxílio, conversas e caronas.
“
As grandes obras são executadas,
não
pela
força,
mas
pela
perseverança.”
MARTIGNAGO, Cintia Cristina Santi. “Análise da proliferação celular e da
expressão gênica de células fibroblásticas de camundongo (L929) submetidas à terapia lesar de baixa potência”.2014. Número total de Folhas: 71. Trabalho de
Conclusão de Curso do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
RESUMO
A Terapia Laser de Baixa Potência é utilizada frequentemente nas clínicas de reabilitação por exercer importantes efeitos nos processos da cicatrização. O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da irradiação laser de baixa potência 904 nm Arseneto de Gali (AsGa) nas doses de 2 e 3 J/cm2 na proliferação celular e na expressão dos genes colágeno 1alfa 1 (COL1α1) e do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em cultura de células fibroblásticas de camundongo. As células fibroblásticas foram divididas em 3 grupos; G1- Grupo controle (que não recebeu irradiação), G2- irradiado a 2 J/cm2 e G3- irradiado a 3 J/cm2 em placas de 24 poços com laser de AsGa (904 nm). Os grupos de células que foram submetidas à avaliação da proliferação celular receberam irradiação em três momentos distintos (24, 48 e 72 horas após a semeadura), já para as células submetidas à análise de expressão gênica a irradiação ocorreu em 24 e 48 horas após a semeadura. Ambas as análises foram realizadas em triplicata. Para o estudo da proliferação celular foi realizado o ensaio colorimétrico de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]) 24 horas após cada irradiação, já a análise de expressão gênica foi feita pelo método de RT-PCR em tempo real 48 horas após a primeira irradiação. Na análise da proliferação celular foi observado que a dose de 3 J/cm2 promoveu um aumento estatisticamente significante na proliferação celular 24 h após a primeira irradiação (p=0,026) em comparação ao grupo não irradiado. Já para a análise da expressão gênica foi possível detectar diferença estatisticamente significante na expressão dos genes estudados entre os grupos avaliados. As células irradiadas apresentaram um aumento de 1,78 na expressão do RNAm do gene COL1α1 (p=0,036). No G3 não houve diferença estatisticamente significante (p=0,138) na expressão desse gene tanto em relação ao G1 quanto ao G2. Para a expressão do gene VEGF foi observado um aumento em sua expressão nos dois grupos tratados em relação ao grupo controle. No G2 houve um aumento na expressão de 2,054 (p= 0,037) e no G3 o gene VEGF apresentou um aumento nos níveis de mRNA de 2,562. Entretanto, não foram observadas diferenças significativas entre G2 e G3 (p>0,05). Foi concluído que a irradiação com laser de baixa intensidade estimula tanto a proliferação celular quanto a expressão dos genes COL1 α 1 e VEGF em cultura de células fibroblásticas de camundongos.
Palavras-chave: Cicatrização. Expressão Gênica. Proliferação Celular. Terapia
MARTIGNAGO, Cintia Cristina Santi Martignago.” Analysis of cell proliferation
and gene expression in mouse fibroblast cells (L929) subjected to low-level laser therapy”. 2014. Total number of sheet: 71. Completion of course work in the
Graduate Program in Rehabilitation Sciences – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
ABSTRACT
Low Level Laser Therapy is frequently used in rehabilitation clinics as it exerts significant effects on the healing processes. The aim of this study was to analyze the effects, of Gallium Arsenide (Ga-As) low-level laser irradiation at a wavelength of 904 nm and doses of 2 and 3 J/cm2, on cell proliferation and on the expression of 1alfa 1 (COL1α1) collagen genes and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the fibroblast cells of mice. The fibroblast cells were divided into 3 groups; G1 – Control group (which did not receive irradiation), G2 – irradiated at 2 J/cm2 and G3 – irradiated at 3 J/cm2 on 24-well culture plates with a Ga-As laser (904 nm). The groups of cells that had been subjected to the evaluation of cell proliferation received irradiation at three different times (24, 48 and 72 hours after seeding), while for those cells subjected to an analysis of gene expression, the irradiation occurred 24 and 48 hours after seeding. Both analyses were performed in triplicate. For the study of cell proliferation, the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) colorimetric assay was carried out 24 hours after each irradiation while the analysis of gene expression was performed in real time using RT-PCR, 48 hours after the first irradiation. For the analysis of cell proliferation, it was found that the dose of 3 J/cm2 promoted a statistically significant increase in cell proliferation 24 hours after the first irradiation (p=0.026), when compared to the other groups. With the analysis of gene expression, it was possible to detect a statistically significant difference in the expression of the genes being studied between the groups evaluated. The irradiated cells showed a 1.78x increase in the expression of the RNAm of the COL1α1 gene (p=0036). In G3, there was no statistically significant difference (p=0.138) in the expression of this gene in relation to both G1 and G2. As for the VEGF gene, an increase in expression was observed in both the treated groups when compared to the control group. In G2, there was an increase in expression of 2.054 (p= 0.037) and in G3, the VEGF gene exhibited an increase in the levels of mRNA of 2.562. No significant differences, however, were observed between G2 and G3 (p>0.05). It was concluded that irradiation using low-intensity laser has a photobiomodulation effect by stimulating both cell proliferation and the expression of the genes COL1 α 1 and VEGF in a culture of the fibroblast cells of mice.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Comparação da viabilidade celular entre os grupos nos diferentes momentos avaliados. ... 30
Figura 2 – Expressão relativa do gene COL1α1 nos grupos irradiados ... 44 Figura 3 – Expressão relativa do gene VEGF nos grupos irradiados ... 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 01- Análise dos grupos irradiados a 2 e 3 J/cm2 nos diferentes momentos avaliados (24horas após cada irradiação) ... 39
Tabela 02 – Sequências de primers utilizados para análise da expressão gênica das
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AsGa Arseneto de Gálio ATP Trifosfato de adenosina
cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar COL1α1 Colágeno tipo 1 alfa 1
COL1 Colágeno tipo 1 Ct Cycle Threshold
DNA Ácido Desoxirribonucléico DMSO Dimetilsulfóxido
E Eficiência da Reação
MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio] RNAm Ácido Ribonucléico Mensageiro
PCR Reação em Cadeia da Polimerase RNA Ácido Ribonucléico
RT-qPCR Transcriptase Reversa-Reação Cadeia da Polimerase quantitativa TLBP Terapia Laser de Baixa Potência
VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular
λ Comprimento de onda
nm Nanômetro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA - CONTEXTUALIZAÇÃO ... 13
2.1 TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA ... 13
2.1.1 Histórico... ... 13
2.1.2 Características do Laser... ... 14
2.1.3 Efeitos Fisiológicos do Laser... ... 15
2.1.4 Efeitos Terapêuticos do Laser... ... 15
2.2 REPARO TECIDUAL COM UTILIZAÇÃO DO LASER ... 16
2.3 PROLIFERAÇÃO CELULAR ... 17
2.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUANTITATIVA EM TEMPO REAL... ... 18
3 OBJETIVO 3.1 GERAL ...19
3.2 ESPECÍFICO ... 19
4 ARTIGO: 4.1 Efeitos da terapia laser de baixa potencia na proliferação de células fibroblásticas...20
4.2 Efeito da Terapia Laser de Baixa Potência na expressão gênica do colágeno e fator de crescimento endotelial vascular em células fibrobláticas...34
CONCLUSÃO GERAL ... 49
ANEXOS ... 53 ANEXO A – Normas de formatação do periódico da Revista Fisioterapia e Pesquisa
... 54
ANEXO B – Normas de formatação Laser in Medical Science ... 58 ANEXO C – Parecer consubstanciado do CEP ... 70
1 INTRODUÇÃO
A terapia a laser de baixa potência (TLBP) é definida como a aplicação terapêutica de laseres com potência relativamente baixa para o tratamento de doenças e lesões, utilizando dosagens que não provoquem qualquer aquecimento detectável nos tecidos irradiados1. Ela atua fotobiomodulando importantes funções em nível celular, mas os mecanismos biológicos envolvidos após esse tipo de irradiação ainda não foram totalmente esclarecidos2, pois seus efeitos dependem da combinação de alguns fatores tais como: comprimento de onda, dose, potência, tempo e número de irradiações, propriedades ópticas dos tecidos, tipos de células irradiadas, além das características fisiológicas das células no momento da irradiação3,4.
Sabe-se que a TLBP exerce efeitos antiinflamatórios importantes nos processos de cicatrização como: redução de mediadores químicos, de citocinas, do edema, da migração de células inflamatórias e incremento de fatores de crescimento5. Adicionalmente, promove a neovascularização6 e a proliferação de diferentes tipos celulares7-9. Segundo Trainer10 a primeira vez que foi realizada a irradiação a laser de baixa potência foi em 1960 por Maimann, e desde então muitas investigações vêm sendo realizadas não apenas com o intuito de elucidar seu mecanismo de ação, mas também com a perspectiva de identificar a dose adequada para otimizar o efeito dessa terapia.
Os altos custos dos tratamentos de reparo tecidual aumentam a importância dos estudos em busca de tratamentos coadjuvantes, capazes de interagir com o tecido lesado acelerando o processo de reabilitação11. Nessa perspectiva cada vez mais se investiga a utilização da TLBP, uma vez que a fotobiomodulação induzida pelo laser é um recurso terapêutico não farmacológico que contribui para acelerar a recuperação dos tecidos biológicos12. Apesar disso, ainda não existem protocolos padronizados para suas diversas aplicações. Diante do exposto, este trabalho teve por objetivo estudar qual dentre as doses estudadas (2 e 3 J/cm2), no comprimento de onda de 904 nm, possui o efeito modulador tanto na proliferação de células fibroblásticas de camundongo quanto na expressão gênica do colágeno 1 alfa 1 e do fator de crescimento endotelial vascular, proteínas estas que estão relacionadas ao processo de reparo tecidual e consequente reabilitação.
2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO
2.1 TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA 2.1.1Histórico
A palavra laser originou-se do acrômio de Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (Luz Amplificada por Emissão Estimulada por Radiação). Suas bases teóricas foram demonstradas e comprovadas ainda em 1917 pelo brilhante Albert Eisten que expôs os princípios físicos da emissão estimulada13. A utilização do laser iniciou-se na década de 60 e atualmente é usado em diversas áreas da saúde (oftalmologia, odontologia, dermatologia e fisioterapia, por exemplo)10.As décadas de 60 e 70 foram marcadas pelo surgimento de vários tipos de laseres, sendo os mais conhecidos: o de Rubi em 1960 (primeiro laser a ser fabricado), ainda no mesmo ano surgiu o laser de Hélio-Neônio, posteriormente o de diodo (1962-1963). Em 1963 foi a vez do laser de Dióxido de Carbono, seguido pelo laser de íons (1964), o laser de corante orgânico (1966) e o laser de Onda Química Contínua (1969). O laser Excimer foi inventado em 1970 e o laser de elétrons livres em 197610.
Os tratamentos experimentais em pacientes iniciaram na década de 1970, após relatos de resultados positivos da irradiação com a Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) em culturas de células e em experimentos animais6. Inicialmente a TLBP recebeu o nome de fotobioestimulação. Atualmente sabe-se que esse termo é inapropriado, pois os laseres também têm o potencial, mesmo em intensidade terapêuticas, de inibir os processos celulares, sendo assim a terminologia mais adequada a ser utilizada é fotobiomodulação.
Atualmente dentro da fisioterapia os laseres mais utilizados para a reabilitação são os de diodo em que a radiação é obtida a partir da estimulação de um diodo semicondutor formado por cristais como: arseneto de gálio (AsGa), de arseneto de gálio e alumínio (AsGaAl) e fosfato de índio-gálio-alumínio (AlGaInP)14.
2.1.2 Características do Laser
As principais características do laser, que o diferencia da luz normal são: monocromaticidade, colimação e coerência.
Resumidamente, Agne15 define a monocromaticidade como sendo um único comprimento de onda, dando a esta a natureza de luz pura; a colimação como a propriedade da luz de ser paralela, praticamente inexistindo qualquer divergência angular ao longo de sua distância percorrida e a coerência o deslocamento ordenado de suas ondas que oscilam uniformemente.
Outra característica importante do laser é o comprimento de onda (λ), que é definido como sendo à distância percorrida pela onda em uma oscilação completa. O λ é um fator muito importante a ser escolhido para a aplicação, pois é ele quem define a profundidade de penetração no tecido alvo. Laseres com propriedade de luz invisível (λ de aproximadamente 750 a 1300 nm) a cada 4 mm de profundidade pode perder 50% de energia. Já o laser com propriedades visíveis (como o laser de Helio - Neônio) perde 50% de energia em 0,5 mm de profundidade, o que o torna aplicável na biomodulação superficial, mas não para uma penetração profunda o suficiente para a terapia ortopédica e reumatológica16.
Os laseres podem ser classificados de acordo com diferentes critérios, dentre eles a potência da emissão de radiação podendo ser laser de alta, média e baixa potência13,17,18:
Alta Potência: radiações emitidas com alta potência, fornecendo à radiação um potencial destrutivo, utilizado para viabilizar as cirurgias realizadas com o uso de raio laser.
Média potência: radiações emitidas com potência medianas, aplicadas com finalidade terapêutica, sem potencial destrutivo.
Baixa potência: radiações emitidas com potência baixa, também com finalidades terapêuticas e sem potencial destrutivo.
2.1.3 Efeitos Fisiológicos do Laser
Os efeitos fisiológicos da TLPB podem ser divididos em: bioquímicos, bioelétricos e bioenergéticos. O laser tem potencial de acelerar reações bioquímicas como: a liberação de substâncias préformadas (histamina, bradicinina e serotonina), e modificar as reações enzimáticas (inibindo-as ou estimulando-as). Estudos realizados por Karu et al19, demonstraram que a irradiação a laser pode estimular a produção de adenosina trifosfato (ATP) no interior das células acelerando a mitose16,19.
Uma vez que a radiação a laser proporciona um aumento na produção do ATP, a eficiência da bomba de sódio e potássio é melhorada, com isso, a diferença de potencial elétrico existente entre o interior e exterior da célula é mantida com maior eficiência. Sendo assim, o efeito bioelétrico da radiação a laser se resume na manutenção do potencial de membrana13.
Demir et al.20 relataram que o laser possui ainda o potencial para acelerar atividades fibroblásticas, síntese do colágeno, neovascularização, aumento de atividade leucocitárias e fagocitárias.
2.1.4 Efeitos Terapêuticos da TLBP
Como consequência aos seus efeitos fisiológicos a irradiação a laser de baixa potência proporciona os seguintes efeitos terapêuticos: antiinflamatório, analgésico, antiedematoso e estimulante do trofismo dos tecidos13 acarretando desta maneira em um reparo tecidual acelerado e ordenado.
Campana et al.21 demonstraram que a TLBP controla a produção de substâncias liberadas nos fenômenos de dor e inflamação, como as prostaglandinas, prostaciclinas e serotoninas. Desta maneira, confirmando as propriedades tanto antiinflamatórias como analgésicas da TLBP.
O efeito circulatório da TLBP foi demonstrado por Miró et al.22 em seu estudo sobre a ação do laser na microcirculação. Estes pesquisadores concluíram que o aumento tanto na microcirculação como na vasodilatação é em resultado da elevação do metabolismo tecidual e da normalização da homeostase, favorecendo assim a diminuição de edemas.
laser, ao irradiar animais com a TLBP após procedimento cirúrgico. O autor constatou que ocorria a ativação do fluxo linfático dos animais pertencentes ao grupo tratado em comparação ao grupo controle devido à regeneração dos vasos linfáticos.
Com o aumento da produção de ATP, a velocidade mitótica é elevada, o que proporciona uma maior velocidade de cicatrização e também melhora do trofismo tecidual13.
2.2 REPARO TECIDUAL COM A UTILIZAÇÃO DO LASER
Herdy et al.24 definem a reparação tecidual como substituição das células atingidas por outras do mesmo tipo e a mesma função, provenientes da proliferação de elementos parenquimatosos ainda viáveis do foco de lesão, levando a restituição perfeita da estrutura original25.
O reparo tecidual é um processo complexo que aborda a regeneração e a formação de cicatriz, sendo dividido em fases (inflamatória, proliferativa e de remodelamento) nas quais participam eventos diversos e interligados25, compreendendo uma sequência de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a restauração do tecido lesado11.
A fase inflamatória inicia-se no momento da lesão tecidual, é nela que o tecido lesado é removido e que ocorre a deposição dos componentes da matriz extracelular na área lesionada. A fase proliferativa é marcada pela formação do tecido de granulação, proliferação e migração de células do tecido conjuntivo e repitelização26. Já na fase de remodelamento ocorre a maturação dos elementos e alterações na matriz extracelular, ocorrendo o depósito de proteoglicanos e colágeno11.
A utilização do laser no reparo tecidual vem sendo estudada há muitos anos, os primeiros pesquisadores a estudar sobre a cicatrização de feridas com o auxílio da TLBP foram Mester et al.27 ainda na década de 60. Desde então pesquisas tem sido realizadas com o propósito de identificar os parâmetros mais indicados para a aceleração do reparo tecidual.
Com o intuito de avaliar os efeitos do laser em queimaduras de terceiro grau Mester et al.28 realizaram uma pesquisa onde após induzir a queimadura de terceiro grau em animais, os pesquisadores irradiaram a área lesada
com laser de Rubi com dose de 1,0; 4,0; e 5,0 J/cm2 e constataram que a TLBP pode auxiliar no processo de cicatrização de queimaduras principalmente na dose de 1 J/cm2.
Nos estudos realizados por Pinfild et al.29 determinaram o papel da irradiação com laser de Hélio-Neônio na dose de 3 J/cm2 na viabilidade de retalhos cutâneos em animais. Estes autores detectaram que a irradiação a laser na dose de 3 J/cm2 foi eficiente para aumentar a viabilidade do retalho cutâneo em ratos.
Rocha Jr. et al.6 ao estudarem o comportamento de feridas cutâneas de ratos irradiados com TLBP (λ 870 nm) com dose de 3,8 J/cm2
observaram que nas lesões submetidas ao tratamento, a cicatrização tecidual foi mais rápida e organizada, pois acelerou a proliferação tecidual e aumentou a vascularização local, formando um tecido de granulação mais organizado6.
Com o objetivo de avaliar os efeitos da TLPB (λ 632,8 nm) na cicatrização de feridas cutâneas de ratos Busnardo e Biondo-Simões30 realizaram ferimentos cirúrgicos em animais e os irradiaram com 4 J/cm2 pelo período de 3, 7 e 14 dias. Concluíram que a TLBP não modifica a qualidade da reação inflamatória, mas diminui a intensidade dela, assim como aumenta a deposição do colágeno no início do processo cicatricial e não intere na maturação da cicatriz.
Embora muitas pesquisas relatando o efeito da TLBP tenham sido publicadas nos últimos anos, os resultados dos efeitos dessa terapia no reparo tecidual ainda são conflitantes e merecem uma investigação mais apropriada.
2.3 PROLIFERAÇÃO CELULAR
A proliferação celular pode ser definida como o surgimento de uma nova célula a partir de outra pré-existente, sendo necessária e importante para o processo de reparo tecidual. Uma das técnicas utilizadas atualmente para avaliar a proliferação celular é o ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5 difeniltetrazólio]).
O MTT é um ensaio colorimétrico rápido, que mede a atividade mitocondrial, sendo assim ocorre apenas em células vivas. Baseia-se na absorção do sal MTT pelas células viáveis, que reduzem este composto em suas mitocôndrias pela ação da enzima succinato desidrogenase a um produto chamado formazan, cuja coloração é roxa. Este produto, acumulado dentro da célula, é extraído através
da adição de dimetilsulfóxido (DMSO) e outros solventes apropriados31. A capacidade das células em reduzirem o MTT fornece uma indicação da atividade e da integridade mitocondrial, que são interpretadas como medidas da viabilidade celular. Este ensaio foi descrito inicialmente por Mosman em 1983 e, desde então, tem sido usado para avaliar a citotoxicidade, viabilidade celular e proliferação de células vivas31.
2.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUANTITATIVA EM TEMPO REAL (RT-qPCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real está sendo amplamente utilizada para investigação biológica, sendo extremamente útil na determinação da expressão gênica32. Ela distingue-se dos outros métodos disponíveis para a expressão do gene em termos de precisão, sensibilidade e resultados rápidos, sendo estabelecido como o padrão ouro para a análise de expressão gênica33. A transcriptase reversa- reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) realiza a conversão do RNA em DNA complementar (cDNA) e em seguida amplifica exponencialmente esta molécula32.
A quantificação da expressão gênica pode ser realizada de duas maneiras distintas: absoluta ou relativa. Na quantificação absoluta o número de cópias no mRNA é determinado por comparação a uma curva padrão34. Já a expressão gênica relativa é determinada a partir da comparação da expressão do gene-alvo com um ou mais genes denominados “housekeeping” ou genes endógenos-controle, que são genes que apresentam sua expressão teoricamente constante32.
A análise da expressão relativa pode ser realizada com o auxílio de softwares como o REST 0935, que leva em consideração os valores do Cycle Threshold (Ct) e a Eficiência da reação (E) para realizar os cálculos. O valor do Ct é o ciclo no qual a fluorescência aumenta sensivelmente, sendo então considerada a primeira fluorescência detectada. Este valor serve para calcular a quantidade inicial do cDNA em cada amostra.
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
Avaliar os efeitos da terapia a laser de baixa potência (comprimento de onda de 904 nm), com doses de 2 e 3 J/cm2, na proliferação celular e expressão dos genes COL1α1 e VEGF de células fibroblásticas de camundongos.
2.2 ESPECÍFICOS
Analisar e comparar os efeitos da TLBP nas doses de 2 e 3 J/cm2 na proliferação celular;
Investigar os possíveis efeitos da TLBP na expressão dos genes COL1α1 e VEGF;
Correlacionar os efeitos da TLBP nas doses de 2 e 3 J/cm2 na expressão dos genes COL1α1 e VEGF.
Efeito da Terapia Laser de Baixa Potencia na Proliferação de Células Fibroblásticas de camundongos.
(Para Submissão na Revista Fisioterapia e Pesquisa)
Effect of therapy laser of low intensity on the proliferation of fibroblast cells from mice.
Efeitos da Laserterapia na proliferação Celular
Martignago CCS1,Pires-Oliveira DAA2, Oliveira RF2, Oliveira PD3, Pacheco Soares C4, Poli-Frederico RC2.
Universidade Norte do Paraná, UNOPAR, Laboratório de Biologia Molecular, Londrina Paraná. Universidade Vale do Paraíba, UNIVAP, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Laboratório de
Cultivo Celular, São José dos Campos, SP, Brasil
1
Mestre em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL-UNOPAR, Londrina(PR). 2
Doutor (a), Docente, Mestrado em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL- UNOPAR, Londrina(PR).
3
Mestranda em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL-UNOPAR, Londrina(PR). 4
Doutora, Docente do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade Vale do Paraíba UNIVAP, São José dos Campos, SP, Brasil
Regina Célia Poli-Frederico
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR) Av. Paris 675, Jd Piza, CEP 86041-140. Cx. P. 401, Londrina, PR,
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RESUMO
Terapias que possuam potencial de estimular o metabolismo e a proliferação celular podem acelerar o processo de cicatrização, com este intuito, a terapia laser de baixa potência (TLBP) é utilizada frequentemente nas clínicas de reabilitação por exercer importantes efeitos nos processos iniciais da cicatrização. O objetivo deste estudo foi avaliar a proliferação celular das células fibroblásticas de camundongos (L929) após irradiação com laser de baixa potência (904nm) usando as doses de 2 e 3J/cm2. As células fibroblásticas foram irradiadas com laser de baixa potencia de Arseneto de Gálio (904nm) a cada 24hs totalizando três aplicações e foram divididas em 3 grupos: G1- Grupo controle, G2- irradiado a 2 J/cm2 e G3- irradiado a 3 J/cm2. A análise da proliferação celular foi realizada em triplicada pelo método de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]). Foi observado que a dose de 3 J/cm2 promoveu um aumento estatisticamente significante na proliferação celular 24 h após a primeira irradiação (p=0,026) em comparação ao grupo não irradiado. Os resultados do presente estudo demonstram que a TLBP no comprimento de onda de 904nm apresentou efeitos biomodulador estimulando a proliferação de células fibroblásticas de camundongos na dose de 3J/cm2.
Palavras Chave: Proliferação Celular, Reabilitação, Terapia laser de baixa potência.
ABSTRACT
Therapies that have the potential to stimulate the metabolism and cell proliferation can accelerate the healing process and it is with this aim that low-level laser therapy (LLLT) is frequently used in rehabilitation clinics as it exerts significant effects on the initial phases of the tissue repair process. The aim of this study was to evaluate the cell proliferation of the fibroblast cells of mice (L929) following irradiation with low-level laser (904nm), using doses of 2 and 3 J/cm2. The fibroblast cells were irradiated using a Gallium-Arsenide low-level laser (904nm) every 24 hours, in a total of three applications, and they were divided into 3 groups: G1 - Control group, G2 - irradiated at 2 J/cm2 and G3 - irradiated at 3 J/cm2. The cell proliferation analysis was performed in triplicate using the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) method. It was found that the 3 J/cm2 dose promoted a statistically significant increase in cell proliferation 24 hours after the initial irradiation (p=0.026) in contrast to the non-irradiated group. The results of the present study demonstrate that LLLT at a wavelength of 904nm exhibits biomodulation effects, stimulating the proliferation of the fibroblast cells in mice at a dose of 3J/cm2.
Introdução
A terapia laser de baixa potência (TLBP) é um recurso bastante utilizado nas clínicas de reabilitação por exercer importantes efeitos biomoduladores nas células e tecidos1, dentre eles, observa-se a redução de mediadores químicos, citocinas, edema, diminuição da migração de células inflamatórias, e consequente aumento de fatores de crescimento2,3 e da neovascularização4, demonstrando efetividade na proliferação de diferentes tipos celulares1,3,5, contribuindo diretamente para o processo de reabilitação tecidual2. Os tratamentos experimentais com TLBP iniciaram em pacientes na década de 1970 após relatos de resultados positivos da TLBP em culturas de células e em experimentos animais4. A TLBP é baseada no princípio de que os fotorreceptores do citocromo C, componente da cadeia transportadora de elétrons, pode ser fotoestimulada levando à modulação das propriedades celulares6.
Entretanto, os mecanismos biológicos envolvidos após esse tipo de irradiação ainda não foram totalmente esclarecidos7, já que seus efeitos dependem de vários fatores como: comprimento de onda (λ), dose, potência, tempo e número de irradiações, propriedades ópticas dos tecidos e tipo de células irradiadas, além das características fisiológicas das células no momento da irradiação8,9. Esta diversidade de parâmetros dificulta estudos dos mecanismos biológicos envolvidos.
Quando a irradiação laser no espectro invisível interage com as células e tecidos na dose adequada, ocorre ativação de funções como: mastócitos, aumento na produção de ATP mitocondrial e organização do citoesqueleto3, acarretando a ativação de fibroblastos, acelerando reações bioquímicas, síntese e organização das fibras do colágeno e neovascularização10.
Estudo realizado11 com o propósito de avaliar o efeito biomodulador do laser em células osteoblásticas usando a TLBP (λ 830 nm) com dose de 3 J/cm2
, revelou que as células osteoblásticas submetidas a irradiação mostraram alterações na morfologia mitocondrial alterando a sua atividade e consequentemente aumentando a proliferação celular.
Rocha Jr. et al.4 pesquisaram o comportamento de feridas cutâneas provocadas na região dorsal de ratos ao serem ao irradiadas com TLBP (λ 870 nm) com dose de 3,8 J/cm2 após procedimento cirúrgico e detectaram que nas lesões submetidas ao tratamento a cicatrização tecidual foi mais rápida e organizada, pois acelerou a proliferação tecidual, aumentou a vascularização local, formando um
tecido de granulação mais organizado. No entanto, Lev-Tov et al.6 ao irradiarem células fibroblásticas normais com TLBP (λ 830 nm) nas intensidades de 80, 160 e 320 J/cm2 observaram uma diminuição significante no crescimento celular sem alterar sua viabilidade.
Embora a literatura seja escassa sobre os efeitos da TLBP utilizando λ 904 nm, há estudos que avaliaram sua eficácia na sintomatologia dolorosa12, na resposta inflamatória13,14, na atividade da cadeia respiratória mitocondrial15, síntese de pró-colágeno16 e na proliferação celular11,16,17. Tendo em vista a ampla gama de doses que podem ser utilizados na TLBP, o objetivo deste estudo foi avaliar a proliferação das células fibroblásticas de camundongo (L929) após irradiação com laser diodo de AsGa (904 nm) nas doses de 2 e 3 J/cm2.
Materiais e métodos
Para a realização deste estudo experimental utilizou-se células fibroblásticas, derivados de tecido conjuntivo de camundongos, da linhagem L929 (ATCC CCL-1 CTC) fornecida pelo Instituto Adolfo Lutz-SP, Brasil. O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), sob o protocolo nº 462.478.
Cultura Celular
As células foram rotineiramente cultivadas em garrafas de 25 cm2 (TPP, Zollstrasse- Suíça) com meio de cultura MEM (Minimum Essencial Medium, Gibco TM
- Invitrogen Corporation, Grad Island, USA) suplementado com 10 % de Soro Fetal Bovino (Gibco®, by Life Technologies) e 1% de antibiotico-antimicótico (Gibco®, by Life Technologies), mantidos em estufas de 5% de CO2, a 37ºC (Thermo Forma Scientific, Waltham, MA). As células utilizadas neste experimento seguiram as recomendações de utilização para o teste de toxicidade in vitro que constam na ISO 10993-5. Durante a realização do experimento o meio de cultura foi trocado a cada 48 horas.
Irradiação a Laser
Foi utilizado um laser diodo de Arseneto de Gálio (AsGa) da marca KLD® (Biosistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda, Brasil), com comprimento de onda 904 nm, taxa de repetição de 10 KHz, potência de saída de 50 mW, largura de pulso de 100 ns, pico de potência de 50 W, feixe de área de 0,01cm2 e ciclo ativo de 0,1%.
A irradiação foi realizada em 24, 48 e 72 horas após a semeadura em placas de 24 poços, com 18 mm de diâmetro, contendo 1 x 106 células/mL. Com o intuito de avaliar a faixa biomoduladora do laser, foram divididos em 3 grupos: G1- Grupo controle (que não recebeu irradiação); G2-irradiado a 2 J/cm2 e G3- irradiado a 3 J/cm2. A irradiação foi realizada ao abrigo de luz em ambiente escuro com a ponteira da caneta de laser em contato direto na placa. Cada poço foi dividido em 2 quadrantes e irradiado por 24 segundos no total, sendo 12 segundos em cada quadrante para o (G2). Para o G3 foi realizada a irradiação por 36 segundos no total, sendo 18 segundos em cada quadrante.
Teste de proliferação celular por MTT
O teste de proliferação foi realizado em triplicada, pelo método de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazólio]). Esse método é utilizado para avaliar a citotoxicidade, proliferação e ativação celular18. O meio foi retirado de cada poço e adicionado 200 μL de MTT a uma concentração final de 0,5 mg/mL, sendo incubado por 1 hora a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2. Em seguida, retirou-se o MTT e adicionou-se a cada poço 200 μL de Dimetil Sulfóxido (DMSO). As placas foram mantidas sob agitação por 30 minutos para a solubilização dos cristais de formazana. A concentração foi quantificada espectroscopicamente por meio de um leitor de microplacas (Leitor ELISA - SpectraCount – Packards Istrument, Offeburg – Alemanha), em um comprimento de onda de 570 nm. Os resultados foram expressos em percentagem de proliferação das células tratadas em relação ao grupo controle, sendo calculada de acordo com a fórmula descrita abaixo segundo Huertas et al.19:
Análise estatística
Os resultados foram expressos com valores de média e desvio padrão. Para comparação e verificação de diferenças estatisticamente significante entre os grupos, utilizaram-se a Análise de Variância (ANOVA) One Way e o teste post hoc de Tukey. Para a comparação entre as avaliações foi realizado o teste de ANOVA de medidas repetidas. Os valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
Resultados
Ao comparar o número de células viáveis dos grupos G1 (controle), G2 (2 J/cm2) e G3 (3 J/cm2), foi observado uma diferença estatisticamente significante entre eles apenas 24 horas após a primeira irradiação (p= 0,029). Nos tempos de 48h e 72h não foi constatado diferença estatisticamente significante entre os grupos (p=0,621 e p=0,084, respectivamente).
Verificou-se uma diferença estatisticamente significante entre o G1 e G3 no tempo de 24 horas após a primeira irradiação. A TLBP na dose de 3 J/cm2 promoveu um aumento na proliferação celular quando comparado ao grupo não irradiado G1 (p=0,026). Não foi observada diferença estatisticamente significante entre as demais comparações: G1 versus G2 e G2 versus G3 (Figura 01).
Ao realizar a análise de medidas repetidas dos grupos nos diferentes tempos avaliados, verificou-se uma diferença estatisticamente significante (p=0,01) apenas nas células irradiadas do G3, onde ocorreu uma diminuição de células viáveis de 24 para 72 horas (p=0,035), como demonstrado na tabela 01.
Discussão
Os efeitos fotoquímicos do laser dependem de uma combinação de alguns parâmetros, como: comprimento de onda, densidade de energia e frequência da irradiação1,19, porém a falta de padronização destes dificulta a escolha dos parâmetros apropriados da TLBP a serem utilizados na prática clínica2, o presente estudo objetivou identificar qual dentre as doses pesquisadas neste estudo resultaria em uma biomodulação na proliferação celular e desta maneira favorecendo o processo de reparo tecidual.
Nossos resultados demonstraram um aumento estatisticamente significante na proliferação celular do grupo irradiado com TLBP (λ 904 nm) na dose de 3 J/cm2 24 horas após a primeira exposição. Esse efeito bioestimulador 24 horas após uma única irradiação também foi encontrado por Chen et al.20, após irradiarem células fibroblásticas derivadas do tendão de Aquiles de porcos com TLBP (λ 820 nm) nas doses de 1, 2, e 3 J/cm2 .
Em relação às taxas de proliferação celular após múltiplas aplicações da TLBP nosso resultado (3 irradiações) corroboraram com o encontrado por Pereira et al.21 (4 exposições) e também por Szymanska et al.22 (irradiou as células 2 vezes).
Pereira et al.21 após irradiarem células odontoblásticas com TLBP (λ 830 nm) nas doses de 0,8 e 4,2 J/cm2 verificaram que após 3 dias de irradiação os grupos apresentaram uma porcentagem de proliferação semelhante ao grupo controle, não havendo diferença estatisticamente significante. Assim como Szymanska et al.22 ao irradiarem células endoteliais com TLBP a 635 nm e 830 nm (doses de 2, 4 e 8 J/cm2) por 2 vez consecutivas como objetivo de avaliar a os efeitos da exposição a laser na luz visível e invisível não observaram diferença estatisticamente significativa nos grupos irradiados com TLBP no espectro invisível. No entanto observaram um aumento significativo na proliferação celular nos grupos irradiados com TLBP no espectro visível em todas as doses avaliadas. Essa divergência pode ser devido à diferença no mecanismo de atuação dos laseres, uma vez que, a TLBP usada no espectro eletromagnético visível fornece uma fotobiomodulação inicial na atividade mitocondrial, ativando uma cadeia de eventos biológicos. No entanto, quando a irradiação ocorre no espectro infravermelho, há estímulo dos canais da membrana plasmática, resultando em mudanças na permeabilidade da membrana, temperatura e gradiente de pressão23.
Nossos resultados discordam dos relatos de Frozanfar et al.24, Basso et al.25 e Pires-Oliveira et al.17, onde Frozanfar et al.24 investigaram a influência da TLBP (λ 810 nm) na proliferação celular após 3 aplicações de laser a 4 J/cm2 (uma a cada 24 horas) em cultura de células de fibroblastos. Os resultados demonstraram que múltiplas aplicações da irradiação a laser proporcionam um efeito biomodulador na proliferação celular. Assim como nos estudos realizados por Basso et al.25 que ao avaliar o efeito da TLBP (λ 780 nm) após 3 aplicações do laser (uma a cada 24 horas) sobre as células fibroblásticas humanas com diferentes doses, observaram um aumento na proliferação celular nos grupos irradiados a 0,5 e 3 J/cm2 (sem apresentar diferença entre esses grupos).
Pires-Oliveira et al.17 ao irradiarem células fibroblásticas L929 com TLBP λ 904 nm com dose de 50 mJ/cm2 e 6 J/cm2 por 3 dias consecutivos, verificaram um efeito biomodulador na proliferação, sendo observado um melhor efeito na dose de 50 mJ/cm2. No presente estudo foi encontrado um efeito fotobiomodulador, estimulando apenas no grupo irradiado a 3 J/cm2 e 24 horas após a primeira irradiação, já o grupo irradiado com 2 J/cm2 manteve-se durante todo o experimento em similaridade ao grupo controle. Levando em consideração a grande diferença entre as doses utilizadas na pesquisa de Pires-Oliveira17 esperava-se que os resultados encontrados em nosso estudo fossem similares já que as doses usadas estão entre 50 mJ/cm2 e 6 J/cm2. Uma explicação para esta discrepância poderia ser a falta de sincronização do ciclo celular, uma vez que o efeito fotobiomodulatório do laser depende do estado fisiológico da célula no momento da irradiação23.
O campo de ação do laser é muito amplo e estudos vêm demonstrando a contribuição desta irradiação no processo de reparo tecidual, particularmente em relação à influência na modulação de diferentes tipos celulares no processo de cicatrização. De modo geral, os processos biológicos evidenciados por estudos se concentram no aumento da atividade mitocondrial11,17, aumento do número de fibroblastos e síntese de colágeno e neovascularização10. Tais achados sugerem que efeitos biológicos favoreçam a maior velocidade no reparo tecidual no grupo de células submetidas a TLBP devido ao aumento na proliferação celular.
Tendo em vista que é importante reduzir a área da ferida de forma tão rápida quanto possível, a fim de aliviar o estresse e reduzir a possibilidade de infecção2 e que a proliferação celular é um dos eventos envolvidos nesse processo, é importante o estudos da utilização da TLBP com doses indicadas para as fases
iniciais do reparo. Desta maneira estudamos em nossa pesquisa doses que são indicadas para essa fase e constata-mos que o efeito da TLBP é dose dependente, sendo que a de 3 J/cm2 promove um efeito biomodulador estimulando a proliferação celular.
Conclusão
O presente estudo concluiu que a TLBP no comprimento de onda de 904 nm possui potencial fotobiomodulador na proliferação celular de acordo com a dose e o número de exposições a irradiações. Na dose de 3 J/cm2 24 horas após a primeira irradiação apresentou efeito bioestimulador na proliferação celular.
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Figura 01- Comparação da proliferação celular entre os grupos nos diferentes
momentos avaliados. * p=0,029 em relação ao grupo controle.
Tabela 01- Análise dos grupos irradiados a 2 e 3 J/cm2 nos diferentes momentos avaliados. DP: desvio padrão. 24 Horas % ± DP 48 Horas % ± DP 72 Horas % ± DP 24Horas vs. 48 24Horas vs. 72 48Horas vs. 72 Controle 100 100 100 --- --- --- 2 J/cm2 131,05 ± 22,9 90,85 ±17,9 117,85 ± 11,4 0,328 0,582 0,443 3 J/cm2 145,64 ± 13,9 93,28 ±8,3 105,58± 8,0 0,157 0,035* 0,842
Effect of Low Level Laser Therapy on the gene expression of collagen and vascular endothelial growth factor in a culture of fibroblast cells in mice
Efeito da Terapia Laser de Baixa Potência na expressão gênica do colágeno e fator de crescimento endotelial vascular em cultura de células fibroblásticas de
camundongo
(Para Submissão na Laser Medical Science)
Martignago CCS1, Oliveira RF2, Pires Oliveira DAA2, Oliveira PD3, Pacheco Soares C4, Monzani PS5, Poli-Frederico RC2.
1
Mestre em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL-UNOPAR, Londrina(PR). 2
Doutor (a), Docente, Mestrado em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL- UNOPAR, Londrina(PR).
3
Mestranda em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL-UNOPAR, Londrina(PR). 4
Doutor(a), Docente do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade Vale do Paraíba UNIVAP, São José dos Campos, SP, Brasil
5
Doutor, Docente da Universidade Norte do Paraná, Londrina (PR)
Regina Célia Poli-Frederico
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR) Av. Paris 675, Jd Piza, CEP 86041-140. Cx. P. 401, Londrina, PR,
Telefone: 43-3371-7820 Fax: 43-3371-7741
Resumo
A terapia a laser de baixa potência (LLLT) é amplamente utilizada nas clínicas de reabilitação com o objetivo de acelerar o processo de cicatrização tecidual, entretanto as bases moleculares do efeito da LLLT não estão completamente estabelecidas. O presente estudo teve por objetivo avaliar a influência da exposição de diferentes doses da LLLT (904 nm) sobre a expressão dos genes colágeno tipo1 alfa 1 (Col1α1) e do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em células fibroblástica de camundongo (L929) cultivadas in vitro. As células fibroblásticas foram irradiadas com laser de Arseneto de Gálio (904 nm) a cada 24 horas por 2 dias consecutivos, mantidas na estufa a 37ºC, com 5% de CO2 e divididas em 3 grupos: G1- Grupo controle, G2- irradiado a 2 J/cm2 e G3- irradiado a 3 J/cm2. Após a irradiação, o RNA total foi extraído e usado na síntese de cDNA. A expressão gênica foi analisada por reação em cadeia da polimerase em tempo real. As células irradiadas do G2 apresentaram aumento estatisticamente significante de 1,78 na expressão do RNAm do gene COL1α1 (p=0,036) em relação ao G1 e G3. Para o gene VEGF foi observado um aumento na expressão nos dois grupos irradiados em relação ao grupo controle. No G2 houve um aumento na expressão de 2,054 e o G3 de 2,562 (p= 0,037) para este gene. A terapia laser de baixa potência (904 nm) influenciou a expressão dos genes COL1α1 (2 J/cm2) e VEGF (2 e 3 J/cm2) em cultura de células fibroblásticas de camundongo.
Palavras chaves: Colágeno tipo I; expressão gênica; terapia a laser de baixa potência; Fatores de Crescimento Endotelial Vascular.
Abstract
Low-level laser therapy treatment (LLLT) is widely used in rehabilitation clinics with the aim of accelerating the process of tissue repair, however the molecular bases of the effect of LLLT have not been fully established. The goal of the present study was to evaluate the influence of the exposure of different doses of LLLT (904 nm) on the expression of collagen genes type I alpha 1 (Col1α1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the fibroblast cells of mice (L929) cultivated in vitro. Fibroblast cells were irradiated with a Gallium-Arsenide laser (904 nm) every 24 hours for 2 consecutive days, stored in an oven at 37ºC, with 5% CO2 and divided into 3 groups: G1 - Control group, G2 – irradiated at 2 J/cm2
and G3 – irradiated at 3 J/cm2. After irradiation, the total RNA was extracted and used in the cDNA synthesis. The gene expression was analyzed by real-time polymerase chain reaction. The cells irradiated in G2 exhibited a statistically significant growth of 1.78 in the expression of the RNAm of the COL1α1 gene (p=0.036) in comparison with G1 and G3. As for the VEGF gene, an increase in expression was observed in the two irradiated groups in comparison with the control group. There was in increase in expression in G2 of 2.054 and G3 of 2.562 (p=0.037) for this gene. Low-level laser therapy (904 nm) had an influence on the expression of the genes COL1α1 (2 J/cm2) and VEGF (2 e 3 J/cm2) in a culture of the fibroblast cells of mice.
Keywords: Type I collagen; gene expression; low-level laser therapy; Vascular Endothelial Growth Factors.
Introdução
A Terapia laser de baixa potência (TLBP) é amplamente utilizada em tratamentos clínicos que visam reduzir a dor, diminuir processos inflamatórios, como também promover a cicatrização tecidual [1].Estudos [2-5] têm sido conduzidos com a finalidade de compreender o processo de cicatrização de feridas, sua complexidade e diversidade [6]. Pesquisas recentes tem relatado um grande número de proteínas que desempenham funções importantes no processo de proliferação celular induzida por TLBP, [7] dentre elas destacam-se o colágeno tipo 1 (COL1)[1,8,9] e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) [6,10-12] por estarem intimamente ligadas a esse processo.
O colágeno é uma proteína fibrosa insolúvel encontrada na matriz extracelular e nos tecidos conectivos constituindo o arcabouço extracelular para todos os organismos multicelulares [13]. Atualmente são conhecidos 27 tipos diferentes de colágeno [14], sendo o colágeno tipo I o mais abundante encontrado em ossos, tendões, pele, ligamento, córnea, pulmão, sistema vascular, e em muitos outros tecidos intersticiais [15],é uma proteína extremamente importante no processo de reparo tecidual. Ele possui cadeias peptídicas α1 e α2 que são codificados pelo gene do colágeno tipo I α 1 (COL1α1) e colágeno tipo I α 2 (COL1α2), respectivamente [16].
Estudos prévios têm demonstrado que a aplicação da TLBP em culturas celulares de fibroblastos e células epiteliais promove o aumento na proliferação celular e na expressão gênica do COL 1 [17-19].
Um dos processos pelos quais a TLBP exerce efeitos benéficos no reparo tecidual é a indução do processo de angiogênese [10]. O gene VEGF está relacionado com o potencial angiogênico, uma vez que sua ação estimula a proliferação e migração de células endoteliais, e a formação de novos vasos sanguíneos [11].
A compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na angiogênese induzida por TLBP possibilitará o aperfeiçoamento e o surgimento de técnicas clínicas a serem usadas no reparo tecidual. Cury et al.[10] investigaram os efeitos do TLBP a 660 nm e 780 nm em fluências de 30 e 40 J/cm2 na expressão gênica de três importantes mediadores angiogênicos (VEGF, HIF-1 e MMP-2), e constatou que
ambos os comprimentos de onda utilizados foram capazes de alterar a expressão do gene VEGF culminando no aumento da quantidade de novos vasos sanguíneos.
Estudo tem demonstrado que a TLBP 904 nm além de alterar a atividade mitocondrial também atua fotobiomodulando a proliferação celular [20], mas, pouco se sabe sobre o efeito da TLBP na expressão gênica. No presente trabalho foi avaliado o efeito da TLBP (904 nm) sobre a expressão dos genes COL1α1 e do VEGF em células fibroblásticas de camundongo (L929) visando relacionar alterações da expressão gênica com o processo de reparo tecidual.
Materiais e métodos
O experimento foi realizado utilizando células fibroblásticas, derivadas do tecido conjuntivo de camundongos, da linhagem L929 (ATCC CCL-1 CTC), fornecida pelo Instituto Adolfo Lutz-SP, Brasil. O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), sob o protocolo nº462.478.
Cultura Celular
As células foram cultivadas em garrafas de 25cm2 (TPP, Zollstrasse- Suíça) com o meio de cultura MEM (Minimum Essencial Medium, Gibco TM- Invitrogen Corporation, Grad Island, USA) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (Gibco®, by Life Technologies) e 1% de antibiótico-antimicótico (Gibco®, by Life Technologies), mantidos em estufa com atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC (Thermo Forma Scientific, Waltham, MA). O experimento foi realizado de acordo com as recomendações preconizadas pela ISO 10993-5, para utilização de cultura celular em teste de toxicidade in vitro.
Irradiação a Laser
A irradiação celular foi realizada com uso do laser diodo de Arseneto de Gálio (AsGa) da marca KLD® (Biosistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda, Brasil), com comprimento de onda de 904 nm, taxa de repetição de 10 KHz, potência de saída de 50 mW largura de pulso de 100 ns, pico de potência de 50 W, área de feixe de 0,01cm2 e ciclo ativo de 0,1%.
As células foram irradiadas 24 horas após a semeadura, por dois dias consecutivos uma vez a cada 24 horas em placas de 24 poços, com 18 mm de diâmetro. Para a semeadura utililizou-se 1 ml de células na concentração de 1 x 106 células/mL.
A faixa biomoduladora do laser foi avaliada em três grupos experimentais: G1- Grupo controle, que não recebeu irradiação; G2- irradiado a 2 J/cm2 e G3- irradiado a 3 J/cm2. A irradiação foi realizada ao abrigo de luz em ambiente escuro com a ponteira da caneta laser em contato direto na placa. Cada poço foi dividido em dois quadrantes, para o G2 a irradiação se deu por 24 segundos no total, sendo 12 segundos para cada quadrante, já para o G3 foi realizada por 36 segundos, sendo 18 segundos em cada quadrante. O experimento foi realizado em triplicata.
Extração do RNA
O RNA total foi extraído com o uso do kit High Pure RNA Isolation (Roche® Roche Applied Science), de acordo com as instruções do fabricante. Após a sua extração, o RNA foi quantificado com o auxilio do Fluorômetro Qubit 2.0® (Life Technologies). A extração do RNA foi realizada 24 horas após a última irradiação, seguida da reação de RT-PCR.
RT- PCR
A síntese do cDNA foi realizada utilizando 5 μg do RNA total e o kit Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, Life Technologies) utilizado de acordo com as instruções do fabricante.
PCR em Tempo Real
As reações em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real foram realizadas em um termociclador Step One Plus System (Applied Biosystems) nas seguintes condições: 10 minutos a 95ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 60 segundos a 60ºC seguido pela curva de melting nas seguintes condições: 95ºC por 15 segundo, 60ºC por 60 segundos e para finalizar 95ºC por 15 segundos. A reação de 15 μL final continha 7,5 μL do MasterMix SybrGreen PCR (2X) (Applied Biosystems), 0,75
μL de cada primer (100M) (Tabela 1), 3 μL água livre de DNase e RNase e 3 μL do cDNA da amostra previamente diluído 10 vezes. A expressão relativa dos genes foi calculada utilizando o gene de referência β-Actina e normalizada pela expressão dos genes em relação ao grupo controle. A sequência de primers utilizados estão especificados na Tabela 01.
Análise estatística
Os dados foram analisados segundo o método de Pfaffl [21] e calculados com auxílio do Software Reset 2009 [22], considerando valores de desvio padrão e teste estatístico “Pair wise fixed reallocation”, assumindo significância p<0,05.
Resultado
A análise dos resultados mostrou uma diferença estatisticamente significante no G2 (2 J/cm2) em relação aos níveis de expressão do RNAm do COL1α1 após a irradiação com laser a 904 nm quando comparado ao G1 (controle). As células irradiadas apresentaram um aumento de 1,78 vezes na expressão do RNAm do gene COL1α1 (p=0,036). Enquanto no G3 (3 J/cm2) não houve diferença estatisticamente significante (p=0,138) na expressão desse gene em relação ao G1 (Figura 01).
Na expressão do gene VEGF foi observado diferença estatisticamente significante nos dois grupos tratados em relação ao grupo controle. No G2 foi verificado aumento na expressão de 2,054 (p= 0,037) enquanto que no G3 o aumento nos níveis de RNAm foi de 2,562 (Figura 2). Não foi observada diferença significativa entre G2 e G3 (p>0,05).
