Marcadores Moleculares e Bioquímicos

L')

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÃNDIA CENTRO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

CURSODE _{CIENCIAS BIOLÓGICAS}

Análise

_{da Segregação}

_Genérica

_do

_Cruzamento

_entre

Phaseolus

_vulgar/Zs

_{e Phaseolus}

_acufifo/ius

_por

_meio

_de

Marcadores

_Moleculares

_e

_Bioquímicos

Miriam

_{Gisele Gasparotto}

Monografia

_apresentada

_{à Coordenação} do _{Curso- de Ciências Biológicas, da} Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.

Uberlândia

—MG

là

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA CENTRO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

CURSODE _{CIÉNCIAS BIOLÓGICAS}

Análise da

_{Segregação Genética}

_do

_Cruzamento

entre

Phaseolus vulgaris

_e

_Phaseolus

_acufifa/tbs

_por

_meio

_de

Marcadores

_Moleculares

_e

_Bioquímicos

Miriam

_{Gisele Gasparotto}

Prof. Ph.D Luiz _{Ricardo GoulartFilho}

(Orientador)

Monografia

_apresentada

_{à Coordenação} do _{Curso de Ciências Biológicas, da} Universidade Federal de Uberlândia, para

obtenção

_{do grau de Bacharel em}

Ciências _Biológicas.

Uberlândia

— MG

&

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÁNDIA CENTRO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

CURSO_{DE CIENCIAS BIOLÓGICAS}

Análise

_{da Segregação}

_Genética

_do

_Cruzamento

enfre

Phaseolus

vulgaris

_{e Phaseolus acufifo/ius por}

_meio

_{de Marcadores}

Moleculares e

Bioquímicos

Miriam

_{Gisele Gasparotto}

Aprovada pela banca examinadora em

_{_l_/1998}

_Nota:

7

Prof. Dr. Luiz _{RIcardo GoulartFilho}

o—orientador)

Maraã/Qu

Prof. Dr. _Warwick

_{EstevalrlKerr}

(Co-_-orientador)

)

)

)

)))

))))))

)

))))))

)

)))))))

)

)

Ao meu noivoMarcos,

Que durante todos esses anos, _{apesar da} distância, esteve _{aomeu lado}

compartilhando problemas, respeitando minhas limitaçõeseaceitando minha ausência. A _{quem devograndeparte das}

minhas conquistas e realizações.

))

)

))))))))))

))

"

Necessitamos de biólogos que nos digam o quepodemos edevemos_fazer

_para

_sobrevivere o que não devemosfazer, se esperarmos manter emelhorar

_a

_{qualidade de vida. Odestino do}

mundo dependedaintegração,_{preservaçãoeextensão do conhecimento quepossui}

um

número reduzido dehomens, _{que somenteagoracomeçam}

_a

_{sedarconta do}

poder desproporcionado quepossuem e _{quão enorme}e'

a

_tarefa

a

_realizar. “

)

)

))

))))

)

)

agradecimentos especiais

Ao meuorientador Luiz,

Queme _{sempre incentivou acreditando naminha}

capacidade, dando _{totalliberdade}

_{para a}

_{busca de} novos conhecimentos, que_apesardo_poucotempo

disponivel, _{sempreestevepronto}

_para

_{me atender} e

ajudar.

A _{quem tenhograndeadmiração.}

Aos meuspais,

Quemesmo sem _{conhecer este universoao}

qual

faço

parte hoje, _{orgulharam-se do meu}

trabalho, ajudando-me _{superardificuldades}

com _{suas orações e apoiando—menasminhas}

escolhas. Com _{todo respeitoe carinho.}

vii

agradecimentos

Agradeçoà _Deus,

PelaVida, _{pela coragem, pelas realizaçõesepelas pessoas que até então cruzaram}

omeu caminho,e _quede_{qualquer maneira ajudaram-me subir os degraus rumoà}

conquistados

meus objetivos.

Ao meu_{co—orientadorGismar,}

Pela paciênciae _{atenção dispensada,o que muito contribuiu paraarealização deste trabalho.}

Ao _{meu co-orientador Warwick Estevam Kerr,}

Pelo simples exemplodeVida _{e de trabalho que nos passa, fazendo-nos acreditar}

que o

sucesso pessoale profissional estãonabuscade_{novos conhecimentos.}

Ao meu irmão Júniore_{minha cunhada Kristiane,}

Pelo apoio,e_{reconhecimento da importância dessa conquista.}

A minha irmã Bia,

Pela sinceridade_{de suas atitudes,e o carinhocom quemerecebeua cadavolta.}

As minhas “irmãs” Andréia, Beatriz eCristiane,

Pela amizade, companheirismoe_{presença. Pelos momentos dificeise maravilhosos que}

)

)

)

))

)

viii

Aos meus queridos amigos Gilberto, Isa, eRicardo

Pela confiançaeamizade sincera_{que me dedicaramcom tantocarinho.}

Aos meus amigos WarleieMarcelo,

Que sempre me ajudaram,seja _{pelas discussões científicas,oupela realizaçãodetarefas, a}

quem devo muita admiraçãoe amizade.

Aos amigos do laboratório: Mauricio,Vivian, _{Elizângela, Bárbara, Graciele, Waldesse,}

Rosana, Luciano, Kátia, Wanessa, Leonardo, André, Walter, Juliana, Wânia, Frederico, Ana Cândida, Ana Luiza, Adriana, Sorayae_{Cristiane, pela amizadee momentosfelizes, os quais}

deixarão muitassaudades.

Á

_4lª

_{turma de Ciência Biológicas,}

Cristiane, Lisandra, Adriana, Katiere, Paula, Marta, Renato, Cristiana,Juliana, Évelin, RonaldoeLuciana.

A_{Universidade Federalde Uberlândia,}

SUMÁRIO

1 — _INTRODUÇÃO

... 1

1.1 —A Cultura...

...

1

1.2— Genética

... 2 1.3—Cruzamentos lnterespecíficos ...

3 1.4—Marcadores _Bioquímicos

_e

Moleculares... 5 2— OBJETÍVOS

... 9 2.1 — Geral

... 9 2.2 —Específico...

9 3—MATERIAL _E MÉTODOS

... 10 3.1 — Material Biológico

... 10 3.2—Análise Bioquímica

... 11

3.2.1 — Extração de Proteínas ...

11

3.2.1.1 — Faseolina ...

11

3.2.1.2 —Proteínas Solúveis em _{NaCl 0,5 M}

...12 3.2.2— Eletroforese _{em Gel de Poliacrilamida}

(SDS—PAGE)_...12 3.3 —AnáliseMolecular

... 13 3.3.1 — Extração de _DNA

... 13 3.3.2 —Dosagem do DNA

em Espectrofotômetro...14 3.3.3 —Amplificação do _{DNA via PCR pela Técnica}

RAPD_...14 3.3.4 —Eletroforese em Gel de Agarose

_e

Visualização...15 3.4 —Estudos de Ligação por Análise

Bioquímica

_e

_{Molecular...15} 4— RESULTADOS

... 16 4.1 — Faseolina ...

16 4.2 —Proteínas Solúveis em _{NaCl 0,5 M}

... 16 4.3 —Marcadores Moleculares _RAPD

... 19 4.4 — Estudos de Ligação...

21

4.5— Distãncia Genéticas ...

5

_{_}

_DISCUSSÓES

... 24 5.1 — Faseolina

... 24 5.2 —Proteínas Solúveis em

NaCl _0,5 M

... 24 5.3—Marcadores Moleculares

... 27 5.4 —Estudos de Ligação

... 28 5.5 —Distância Genéticas

... 29 6 —CONCLUSÃO

... ₃₁

7

-

_{REFERÉNCIAS BIBLIOGRÁFICAS}

... 32 8 —ANEXO

RESUMO

O _{feijão comum,}

_Phaseolus

_vulgaris,

representa

_{importante fonte de proteinas}

para a

maioria _{da população de}

_países

_{subdesenvolvidos}

_e

_{de baixa renda}

. Visando

essa

_{importância na alimentação humana, programas de melhoramento recorrem à}

cruzamentos entre

_espécies

_para

_a

_{obtenção de cultivares mais}

adaptadas

à região de cultivo.

Ofeijão—tepari,

_Phaseolus

_acutifolius,

_é

_{reconhecido como importante fonte de}

resistência a

_{seca, sendo}

_{portanto um excelente genótipo para cruzamentos} interespecificos _{com P. vulgaris.}

O _{monitoramento do}

melhoramento clássico pela genética molecular pode reduzir

_{gastos e ganhar}

_tempo

_até

_{o lançamento de novas cultivares.}

Com

_a

_{intenção de avaliar a recombinação genética do}

cruzamento entre P. vulgaris, cultivar lca Pijão

_e

_{P. acutifo/ius, cultivar GL—O441, seguidos de dois} retrocruzamentos _{com o pai recorrente P. vulgaris, avaliou-se}

as segregações

gênicas

em 39 _{indivíduos da progênie resultante R2C1}

.

Os resultados indicaram que uma

_{autofecundação}

_{em R1C1 pode ter ocorrido,}

e

_{que possíveis falhas de pareamento}

_e

_{complexas interações}

gênicas

ou cromossômicas estejam alterando a proporção

_esperada

3:1 _{de homozigotos} :

heterozigotos.

Dois _{grupos de ligação foram}

construídos a partir dos marcadores bioquímicos e moleculares, por

este

_mapa foi _{identificado ocorrência de}

1. _INTRODUÇÃO

1. 1. A

_Cultura

A _{cultura do feijoeiro,}

_é

de fundamental importância para o _suprimento alimentar de grande parte da população _{mundial, principalmente em}

_países

subdesenvolvidos

_e

_{de baixa renda, da América}

Latina

_e

_{África, onde}

_representa

principal _{fonte protéica.}

O _feijão

_e

_o

_4º

_{produto em}

_área

plantada,

_e

_o

_6º

_{em valor da produção} agrícola no Brasil.

_Sua

_{importância social,}

como alimento substituto de proteínas

de feijão. _{Dentre eles, a quebra de tolerância}

e

ou resistência.

A

criação de novos cultivares, visando potencial produtivo elevado

_e

adaptabilidade _{climática, é um dos principais}

componentes

_{da estrutura de produção}

do feijão. A _tecnologia

gerada através destes processos,

envolvendo

_anos

_de

pesquisa e vastos

_{recursos financeiros, precisa}

_ser

_{levada ao}

agricultor, o _{que só} poderá

_ser

feito _{por meio da}

_semente

_(VIEIRA,

A _{variabilidade genética existente na natureza fornece elementos que}

possibilitam a melhoria e

_{a adaptação}

_{de uma determinada}

_espécie

_{a um} determinado ambiente.

_Sendo

_{amplamente utilizada no melhoramneto genético, ela} é a

base

_{na qual}

_se

_{fundamenta o trabalho de criação de novos cultivares}

(VIEIRA,

1988).

1. 2.

_Genética

Segundo

Burkart _{(1952), o gênero}

_{Phaseolus é}

composto por aproximadamente 180

_espécies,

_{distribuídas}

_{nas zonas quentes}

_{de ambos} hemisférios, mas com predominância

_nas

_Américas,

_{sendo a}

_{maioria diplóides} (2n=22), _{de reprodução autogãmica, havendo raras exceções. Portanto, a}

presença

de diversas

_espécies

_silvestres

_e

_{a ampla distribuição geográfica que possui,}

o torna uma planta modelo para

estudos

_{de transferência genética,}

_expressão

_gênica,

comportamento do genoma, mapeamento genético

e

evolução.

A

_espécie

_{mais cultivada do gênero}

_Phaseolus,

_é

o feijão _comum

_Phaseolus

vulgaris, _{amplamente distribuído e utilizado, além de}

_sua

_importância

social, possui

características

como ploidia

_e

_{ciclo curto, que o torna, excelente}

_base

_{para o fluxo} gênico com

_{outras espécies.}

O _{P. vulgaris, em geral não}

_{se adapta aos}

trópicos úmidos, _mas

_cresce

_bem em

áreas

_{com chuvas regulares,}

_desde

_{os trópicos}

_{até as zonas temperadas}

. É

muito _{sensível tanto}

_{às geadas}

_quanto

_às

altas temperaturas. Condições de

_seca

durante

_{as épocas}

_{críticas do florescimento ao enchimento da vagem,}

_são

também muito _{prejudiciais.Da mesma maneira, o}

_excesso

_{de chuva}

causa

a

queda

de flores

e aumenta

a _{ocorrência de enfermidades (ZlMMERMANN& TEIXEIRA, 1988).}

O _{feijão-tepari}

_(Phaseolus

_{acutifo/ius), tem distribuição}

limitada,

_{e é}

cultivado com alguma intensidade

_{nas áreas}

_do

_Sudoeste

_{da América do Norte. Verifica-se na} literatura, _que

_{esta espécie}

_{tem uma resistência considerável à}

seca, e

caracteriza-se

por

apresentar

folhas

_{e sementes pequenas e}

_{rendimentos muito baixo,}

mesmo

sob

_{condições favoráveis, quando comparada com o feijoeiro}

comum (P. vulgaris)

DJ

1. 3.

_{Cruzamentos lnterespecíficos}

A _{exploração de}

_espécies

_{afins de plantas cultivadas e'}

uma

das

maneiras de

se

introduzir

_genes

_{adicionais em}

_variedades

_{cultivadas. A}

hibridação

é

um importante instrumento

_para

_{o melhoramento de}

_espécies

_{de plantas cultivadas.}

A

variabilidade pode

ser

_{obtida tanto por} meio _{da hibridação intervarietal (métodos} convencionais), quanto entre diferentes

_gêneros

_{(intergenéricas), ou entre diferentes}

espécies

_{(interespecificas) (PRESTES} & _{GOULART, 1995).}

Os cruzamentos de P. _{vulgariscom P. acutifo/ius,}

_apresentam

_{resultados ricos} em informações

_genéticas

_{para fins agronômicos, morfológicos, bioquímicos e} moleculares. Do _{ponto de vista básico,}

_estas

_{informações têm}

sido utilizadas para

especulações

da origem, _{isolamento geográfico, compatibilidade de cruzamento e} outros,

e são

_{aplicados diretamente na orientação em programas de melhoramento.}

Segundo

Mejía-Jiménez

_et

al. _{(1994), o}

_sucesso

_{nas transferências de}

genes

da maioria

_das

_{caracteristicas de}

_interesse

_{de tepari}

_para

feijão comum, tem sido

poucas vezes

realizadas,

e

entre

_{as causas}

_para

_esse

_limitado

_sucesso

_{inclui: uso} de poucos genótipos de

_{ambas espécies}

_{para hibridação; ocorrência de híbridos F1} letais,

_{associados a}

_{certos genótipos de}

_{ambas espécies;}

_{ocorrência de aborto}

do embrião; esterilidade do híbrido _{e avaliação inadequada da progênie híbrida} interespecifica.

A _{realização de cruzamentos entre}

_espécies

_do

gênero Phaseolus, tem sido

usado

_{como alternativa para incorporar ao feijão comum (P. vulgaris)}

_determinadas

características

_{agronômicas importantes, como resistência a}

_{doenças e pragas e}

resistência a

_seca,

_que

_{estão presentes}

_{nas demais}

_espécies

_{cultivadas do gênero.} Sobre outro

_aspecto

_{a realização de tais cruzamentos,}

_serve

para

estudar

a relação evolutiva entre

_espécies

_{(SMARTT, 1970).}

Crocomo & Cabral (1985)

_{destacaram a espécie}

_P.

acutifo/ius como uma importante fonte de tolerância ao

estresse

hídrico

_e

_térmico,

_e

_{resistente à algumas}

doenças.

Thomas & Waines (1984) relataram a importância da

espécie

em hibridação interespecifica _{com P. vulgaris, como fonte de tolerância ao}

_estresse

hídrico

_e

_{a altas temperaturas.}

dificuldades de

_sucesso

_{na hibridação. As}

tentativas de transferência de caracteristica para o feijão _{comum por hibridação interespecifica, não têm}

sido bem sucedidas, devido

_aos

_{diferentes níveis}

_de

_{incompatibilidade}

(ClAT, _1990).

Guo

_et

al. _{(1989) citam o melhor}

_desempenho

de híbridos

_resultantes

_de retrocruzamentos entre

_Phaseolus

_{coccineus e P. vulgaris,}

quando

este

último foi

usado

_{como pai recorrente. Da mesma forma,}

Mejía-Jiménez

_et

_{al, (1994), relatam}

ser

_{gradativamente dispensável o}

uso de cultura de embriões, para

resgatar

híbridos entre P. _vulgaris

_e

_{P. acutifo/ius, a medida que retrocruzamentos}

com P. _vulgaris recorrente eram realizados.

O _{principal procedimento para}

a

_{transferência direta de}

_{genes e}

_{por meio da}

manipulação sexual. Após a produção de híbridos faz-se o _{retrocruzamento com o} genitores de

_{caracteres desejáveis}

_{(GOULART, 1990).}

O _{método de retrocruzamento, e'}

frequentemente empregado em cruzamentos divergentes, visando elevar

_a

_{frequência de}

_genes

favoráveis na população. Ele pode também

_ser

_{aplicado na}

_adaptação

_{de germoplasma}

exótico, _reduzindo

_sua

contribuição genética na formação de populações

_segregantes.

Mejia-Jiménez

_et

al. _{(1994), citam que problemas com esterilidade do}

híbrido F1, _poderiam

_ser

vencidos parcialmente pelo retrocruzamento recorrente _{com feijão} comum, _{mas isso reduz a possibilidde de reter}

genes

de

_interesse

_dotepari.

O _{comportamento citogenético, pode muitas}

vezes estar associado

a viabilidade do híbrido, onde o _{pareamento entre cromossomos}

_{é consequência}

da uma complexa interação entre genes. Este

_{pareamento é essencial}

_{para o}

_sucesso

de cruzamentos interespecificos (PRESTES & _{GOULART, 1995).}

Os efeitos deletérios dos

_genes

_{envolvidos em cruzamentos entre}

indivíduos que não pertençam à mesma

_espécie,

_podem

_ser

_eliminados

_se

os cromossomos forem _{homólogos, pois há recombinação, entretanto}

se

os cromossomos forem homeólogos ou _{não homólogos, tais efeitos tornam-se difíceis}

de serem eliminados (PRESTES & _{GOULART, 1995).}

caracteres

_{importantes de fontes primárias}

_{e secundárias}

de genes,

são

alguns dos desafios que devem

_ser

_{resolvidos (ClAT, 1990). Porém,}

muitas

_das

_limitações

apresentadas

à

_pesquisa

_{não podem}

_ser

_{resolvidas pela}

exigindo assim, a aplicação de técnicas mais

_avançadas

_{da biotecnologia} (GOULART, 1996).

1. 4.

_{Marcadores Bioquímicos e Moleculares}

Os

_marcadores

_{bioquímicos obtidos sejam por uma}

reação

enzimática diferenciada entre _{indivíduos, ou por uma proteína constitutiva}

polimórfica,

_são

caracteres

de

_interesse

_em

_estudo

_{de genética}

e

evolução como:

_{estudos de}

diversidade genética,

_estudos

_{de ligação}

_associadas

_{a características importantes}

e

outros.

_Dessa

_{forma, os}

_marcadores

bioquímicos, juntamente com outros têm contribuído para elucidação de vários

_estudos

_{genéticos (VlElRA, 1997).}

O _{centro de origem do feijoeiro}

comum _{(P. vulgaris)}

_e

_{do feijão-tepari} (Pacutífo/ius) e' _{conhecido como Mesoamericano, compreendendo}

o sul do México,

e

América Central _{(VlElRA, 1967). Os primeiros}

_autores

a estudarem os centros de origem do _feijão,

_basearam-se

_em

_{características}

morfológicas distintas e comuns

observadas nas

plantas. A _{partir da}

_década

_{de 70, o uso}

_{de marcadores}

bioquímicos começa a

ser

utilizado, _{adicionando informações para diferenciar os centros de} origem de cultivares

_{e espécies}

_{do gênero}

_Phaseolus.

A _faseolina

_está

_{diretamente envolvida}

com o centro de _{origem no}

_gênero

Phaseolus.

Dois _{centros conhecidos, denominados mesoamericano}

e

_{andino, para}

os quais há um _{padrão de faseolina conhecido}

_e

_{distinguível.}

A _faseolina

_é

_{um marcador bioquímico}

bastante

utilizado _nos

_estudos

genéticos _{em feijoeiro comum. Ela é a principal}

proteína de

_reseva

_da

_semente

_de feijoeiro comum,

_{e representa}

(BG—46% _{dototal de proteína da}

semente

(MA & _BLlSS,

1978).

Estudos genéticos envolvendo cruzamentos, mostraram que os

_genes

_que codificam _{os diferentes polipeptídeos componentes da faseolina}

estão

intimamente ligados, formando _{um bloco gênioo, que}

_é

_{herdado em}

caráter

de

_herança

_simples (ROMERO

_et

_{al., 1975)}

A _{biologia molecular tem sido uma}

ótima _ferramenta

_{para estudos}

_de diversidade genética. Informações

_sobre

_o

_parentesco

_ou

_a

_{similaridade genética} entre cultivares dentro de _{um banco de germoplasma, tem aplicações importantes}

A _{tecnologia da PCR}

_(Reação

em Cadeia da Polimerase), surgiu na

década

de 80,

_{e sua concepção}

_{causou um verdadeira revolução na}

biologia. A _facilidade,

rapidez, versatilidade e sensibilidade da PCR, _{a torna}

_{poderosa para estudos}

genéticos moleculares envolvendo grande número de indivíduos _{de qualquer} organismo vivo.

A _PCR

_é

_{caracterizada porum ciclo de 3}

etapas: desnaturação,

aneiamento

_e

extensão. A fita _{dupla de} DNA alvo e'

_desnaturada,

_{a seguir ocorre o aneiamento de}

primers,

_e

_por final, _{a enzima DNA polimerase sintetise nova fita,}

pela adição de nucleotídeos. Este ciclo e' _{repetido muitas}

_vezes

_{de forma}

_a

produziro DNA alvo _em

progressão

geométrica.

A _{partir de 1990, um nova técnica PCR-RAPD}

(Random Amplified PolymorphicDNA), foi _{desenvolvida com a idéia de}

_se

_{utilizar primers curtos}

(10 pb), de

_sequência

_{arbitrária (WILLIAMS,}

_et

_{al., 1990). A}

principal _{vantagem da técnica}

PCR—RAPD

_é

_{a de não}

_requerer

_{informações}

genéticas

prévias da

_sequência

_de

DNA _(TlNGEY,

_et

_{al., 1992).}

Além

_dessa

_{importante caracteristica}

, Williams,

et

al., (1990), em

seu

trabalho

_destacam

_como

_{grandes vantagens}

_{a rapidez}

_e

simplicidade da técnica,

e

a utilização de

_quantidades

_{mínimas de DNA}

_{necessárias para}

_{análise genômica de} um indivíduo.

Uma _{característica da técnica PCR-RAPD,}

_é

_{o fato de}

se

_{comportarem como}

marcadores

_{genéticos dominantes, isto é, o indivíduo}

heterozigoto não é diferenciado do homozigoto dominante

_para

_{amplificação.} É

_usada

_{em uma}

variedade de aplicações incluindo: _{construção de}

_mapas

_{genéticos, estabelecimento} de relacionamentos filogenéticos, análise de estrutura e diversidade genética em populações, obtenção de _{fingerprints, marcas moleculares}

_associadas

_à

genes

de interesse.

Os

_marcadores

_moleculares

_são

_{aplicados em programas de melhoramento} para: reduzirem o _{número de retrocruzamentos,}

_e

_{ou cruzamentos dialélicos,} ligações a

_genes

_{de resistência, controle de qualidade por fingerprints,}

incorporação de

_genes,

_{e monitoração a introduções de}

genes

de plantas silvestres. A _utilização

de

_marcadores

_moleculares

_apresenta

_várias

vantagens

sobre

_marcadores

morfológicos convencionais, tais como: _{exibem neutralidade fenotípica sem} influência _ambiental;

_{são herdados}

_{em dominância}

exibem interações epistáticas ou _{pleiotrópicas, podendo}

_ser

_{detectado tanto em} tecidos jovens como adultos,

_apresentam

_{resultados positivos quanto ao} melhoramento de

_{características}

_{quantitativas (BECKMAM &}

SOLLER, 1983).

A _{técnica RAPD utiliza um primer,}

_{e este}

tem

_sequência

_{arbitrária de} nucleotídeos. Os marcadores _{comportam—se com dominância, havendo a} possibilidade de

_se

_{comportarem com codominãncia (individuos 2n). Os marcadores} RAPD

_{apresentam-se}

_{de maneira muito eficiente}

no _{mapeamento de polimorfismo} ligados

_a

_{locos de resistência a}

_doenças

_{(FERREIRA &}

GRATTAPAGLIA, 1996). Os

_marcadores

_{moleculares podem maximizar a eficiência dos programas de} retrocruzamentos, aumentando a probabilidade de conversão dos indivíduos

_e

reduzindo o _{tempo requerido para obter uma}

_{recuperação}

_{aceitável do}

progenitor recorrente _{(BORÉM, 1997). Diversas aplicações de marcadores moleculares em} melhoramento genético podem

_ser

_{distribuídas em aplicações cujos resultados}

apresentam

_{expectativas de curto, médio}

_e

_longo

prazo. (FERREIRA &

GRATTAPAGLIA, 1996).

A _{proporção do genoma que pode}

ser

monitorada _com

_marcadores

moleculares

e

em função do

_seu

_número

_e

_da

_sua

_{distribuiçãono genoma.}

_{Para as}

espécies

_{que dispõem de}

_mapas

_com

_marcadores

_{que saturam}

o _{genoma em} intervalos menores que 20 CM _{seria teoricamente possível selecionar}

um individuo praticamente idêntico ao genitor recorrente com _{a avaliação de grande número de} progênies da primeira

_geração

_{de retrocruzamentos (BORÉM, 1997).}

As _{aplicações de curto prazo envolvem basicamente, a identificação}

e

discriminação de genótipos. Nas aplicações de médio-longo prazo, os marcadores permitem quantificar a variabilidade genética ao nivel _de

_sequência

_{de DNA}

_e

correlacioná-la _{com a}

_expressão

_{fenotípica em procedimentos de mapeamento} genético (FERREIRA & _{GRATTAPAGLIA, 1996).}

A

_análise

_{genética ao nivel de DNA}

_{está se}

_tornando

cada

vez mais eficiente. Com _{isso, uma grande quantidade de informações}

sobre

_{genomas de plantas}

cultivadas

_{estão sendo geradas.}

_{As perspectivas}

_são

_{de que}

as

próximas

_décadas

assistirão a uma explosão

deste

_{conhecimento, abrindo inúmeras oportunidades}

para a

_{exploração mais eficiente da variabilidade genética existente tanto}

nas

variedades

_{cultivadas como no germoplasma silvestre. Hoje,}

a identificação

_e

localização de

_genes

_{de importância econômica}

_é

_{um objetivo}

)

)))))

)

)

nas

_{culturas tradicionais mais}

_estudadas

e manipuladas geneticamente, mas também em

_{espécies essencialmente}

_não

_domesticadas

)

)))))

)

2. _OBJETIVOS

2. 1. _Geral

-Ana|isar

da

_segregação

_{gênica resultante do cruzamento entre}

as espécies

Phaseolus

vulgaris

e Phaseolus

acutifolius.

2. 2.

_Específico

-Determinar

_{a divergência genética entre}

_{as espécies Phaseolus}

vulgaris

e

Phaseolus

acutifolius, e caracteriza-Ia _bioquímica

_e

_{molecularmente;}

- Realizar

_estudos

_{de ligação entre os}

_marcadores

10

3. MATERIALE MÉTODOS

O

_presente

_{trabalho foi realizado no Laboratório de Genética}

Molecular,

pertencente

_{ao Departamento de Genética}

_e

_{Bioquímica, da Universidade Federal}

de Uberlândia,no _{periodo de junho de 1997}

_a

_{junho de 1998.}

3. 1. _Material

_Biológico

Para

_{a realização}

_deste

_{trabalho, foram obtidas junto ao CNPAF}

(Centro Nacional de

_Pesquisa

_{de Arroz}

_e

_{Feijão, Goiãnia — GO ),}

_sementes

de

Phaseolus

vulgaris (Feijão comum), cultivar lca _Pijão,

_Phaseolus

_{acutifo/lus (Feljão-tepari),} Série GL-O441,

_e

_{uma progênie de 39 híbridos resultante de dois retrocruzamentos} entre

_{as espécies,}

_onde

_{a espécie}

_{P. vulgaris foi utilizada}

como genitor recorrente,

_e

P. _{acutifolius como genitor doador ( Tabela 1).}

As

_sementes

_{dos genitores}

_e

_{a progênie R2C1 foram divididas em dois lotes} com

duas sementes

_cada,

_sendo

_um

_{deles usado}

para análise eletroforética

_das

frações

protéicas

_e

o _{outro plantado em}

_casa

_{de vegetação, para o desenvolvimento}

11

Tabela1._{Relação das espéciesehíbridos analisados}

Genítores

Phaseolus vulgaris lcaPi_jão

Phaseolus acutlfJ/ius GL-0441

Progênie

chl

3262 _{3312 10867}

10881

3267 10858 _{10868 10882}

3272 _{10859 10869 10883} 3277 _{10860 10871 10884}

3282 _{10861 10872}

10885

3287 _{10862 10874 10886} 3292 _{10863 10875 10888} 3297 _{10864 10877 10889} 3302 10865 _{10878 10890}

3307 _{10866 10880}

3. 2.

_{Análise Bioquímica}

3. 2. 1.

_{Extração de Proteínas}

A _{principio retirou—se o tegumento}

_e

_{o embrião}

das sementes,

os cotilédones foram

_{então macerados}

_{em gral de porcelana}

_até

a formação de _{um pó fino, que foi} transferido e tubos de eppendorrf, para a realização da extração

das

frações protéicas.

_Estas

_foram

_armazenadas

_em

_freezer

_—80ºC

para posterior análise eletroforética.

3. 2. 1. 1.

_Faseolina

O _{procedimento para a extração de faseolina,}

foi

_segundo

_{o protocolo descrito}

por Romero

et

al. _{(1975), com modificações no tempo de extração.}

Foi _{adicionado a}

60 _{mg de macerado, 1,2 ml de solução de extração}

(NaCl 0,5 M, ácido ascórbico

0,25 M, _{pH 2,4). O extrato}

_permaneceu

_em

12

protegido de luminosidade, para a extração da proteína, em

seguida

foi _centrifugado

a 13.000_{rpm por 20 minutos,}

_a

_{4ºC. O}

_sobrenadante

_foi

coletado,

e

a ele adicionado 5x

_seu

_{volume de}

_água

_desionizada

_gelada

_{(padronizou—se}

a retirada de 250 pl do

volumetotal do

_sobrenadante

_{para que}

_a

_extração

_fosse

_{realizada em microtubos de} 1,5 ml). Esta

_etapa

foi _{repetida por}

_{duas vezes para a}

_{eliminação do ácido}

ascórbico,

e

o precipitadofinal obtido foi _{solubilizadoem 250 ul de NaCl 0,5 M.}

3. 2. 1. 2.

_{Proteínas Solúveis em}

_{NaCl 0,5 M} As _{proteínas foram extraídas de acordo com o}

protocolo descrito por Echeverrigaray

et

al. _{(1993). Junto a 20 mg de macerado foi adicionado 200}

ul de

solução NaCl _0,5 M,

e

mantido sob agitação constante,

_a

_{4ºC. O extrato foi}

então centrifugado a 10.000_{rpm por 20 minutos,}

_e

_o

_sobrenadante

_recolhido.

3. 2. 2.

_{Eletroforese em}

_Gel

_{de Poliacrilamida Desnaturante}

(SDS-PAGE)

As

_amostras

_{de proteínas foram}

_{desnaturadas e dissociadas}

em

seus

constituintes peptídeos, por aquecimento a 100ºC por 5 _{minutos em}

_presença

_de tampão da amostra 2X _{SDS buffer (0,125 M Tris—HCl, pH = 6,8, SDS}

4%, glicerol 20%, _{B-mercaptoetanol 10 %), (LAEMMLI, 1970).}

As

_subunidades

_foram

_separadas

_{por eletroforese em}

gel de poliacrilamida

desnaturante

_(SDS-PAGE),

_segundo

_{Laemmli (1970) na concentração de}

10%. As

dimensões

_{dos géis} foram de _{16 cm x 17 cm x 0,75mm.}

Como solução tampão, para a corrida eletroforética, foi _{utilizado Trizma}

_base

0,1M; EDTA_7,8 mM; glicina 0,77 M _{e SDS 0,3% pH 8,3.}

As _{eletroforeses foram conduzidas}

_a

_{20 mA}

por aproximadamente 5 h, tanto para a faseolina como para a fração solúvel em NaCl _0,5M.

Após

esta

etapa, os géis foram

_corados

_{em solução de Coomassie Brilhant} Blue R _{250 (50% metanol; 0,125% Coomassie; 10%}

ácido acético), porum periodo de 12 h,

então

foram _submetidos

_à

_{solução de}

_{descoloração}

_(10%

ácido acético), para retirada do

_excesso

_{de corante, e por fim fixados em solução} fixadora (ácido acético _7%).

Os géis foram

_{secados baseado}

_{no método de}

_Popescu

_(1983),

adaptado para

secagem

_{em bastidores, onde eram envolvidos entre}

_duas

_{folhas de papel celofane}

poroso, e

esticados

no bastidor,

_permanecendo

_{assim por 24 h, aproximadamente.}

3. 3.

_Análise

_Molecular

3. 3. 1.

_{Extração de}

_DNA

O DNA _{genômico, foi extraído de acordo com o}

procedimento descrito por Vilarinhos

_et

al. _{(1994), com algumas}

_adaptações

para microextração em microcentrífuga. Inicialmente _{folhas jovens foram coletadas, logo em}

_seguida

pesados

200 mg, e

maceradas

_em

_presença

_{de nitrogênio líquido. O macerado foi}

transferido para microtubos de 2 ml, onde foi _adicionado 1 ml de tampão de extração

(Tris-HCI 100mM pH 8,0; EDTA 50 mM pH 8,0; NaCl 1 _M; 1,5% de _{CTAB; 1% de}

B-mercaptoetanol),

e

incubadas em banho-maria à _{temperatura de 65ºC por 60 a 90} minutos aproximadamente, fazendo

_{agitações suaves}

_a

_cada

_{15 minutos.}

_Para

_o

processo

de desproteinização, 600 ul de clorofórmio—álcool _{isoamílico (24:1), foi}

adicionado ao tubo, realizando leves

_agitações

_{por inversão, durante 5 minutos. Os} microtubos foram _{centrifugados por 15 minutos a 4000 rpm. O}

_sobrenadante

foi

transferido para um novo tubo,

_e

submetido

à

uma nova

_etapa

_{de desproteinização} com 900 ul de clorofórmio-álcool _{isoamílico(24:1), sob a mesma condição anterior.} Ao

_sobrenadante

_{final, foi adicionado 2/3 de}

_seu

_{volume de isopropanol gelado,}

e

os tubos deixados em

freezer

o _{tempo suficiente para}

_a

_{precipitação do DNA. A seguir,} foram centrifugados a 10000 _{rpm por 10 minutos, onde a}

_{fase aquosa}

_{foi removida,}

e

o _{precipitado incubado com etanol 80% a 37ºC por 20 minutos.}

_{Passada esta}

etapa, o DNA foi

_secado

_{a vácuo e}

_{ressuspendido}

_{em 200 ul de tampão TE}

(Tris—HCI

10mM pH 8,0

e

EDTA1 mM _{pH 8,0) contendo RNAse}

na

_{concentração}

de 10 ug/ml,

14

3. 3. 2.

_{Dosagem do}

_DNAem

_{Espectrofotômetro}

O DNA foi _{quantificado por leitura de}

_absorbância

_{a 260 nm em}

espectrofotõmetro, Sambrook

et

al., (1989), utilizando _{uma alíquota de} 10 D.] de

cada

amostra diluída100 _vezes. A _{qualidade do} DNA foi _avaliada

_{submetendo-se}

_{10 ul da}

amostra a eletroforese em gel de

_{agarose a}

0,8%. Após

a

avaliação

as

amostra foram _{diluídas em}

_água

_{ultrapura, em}

_{concentração}

_{para trabalho de 10ng/ul.}

3. 3. 3.

_{Amplificação do}

_{DNAvia PCR}

_{pela Técnica}

_RAPD

A PCR é

_{caracterizada}

_{por um ciclo de 3}

_{etapas: desnaturação,}

_{anelamento e} extensão. A fita _{dupla de} DNA

é desnaturada à

_{aproximadamente 95ºC, em}

_seguida

a temperatura cai _{em torno de 45ºC, onde ocorre o anelamento de primers,}

_e

_por final, ha' _{um novo aumento de temperatura para 72ºC, permitindo que a enzima DNA}

polimerase sintetiza nova fita, _{pela adição de nucleotídeos. Este ciclo}

_é

_repetido

muitas

_vezes

de forma _{a produziro} DNA alvo _em

_progressão

_geométrica.

A

_reação

_em

_cadeia

_{da polimerase foi realizada de acordo com Williams}

_et

_al.

(1990), com _{algumas modificações. Foram}

_testados

_{4 primers de}

_sequência

arbitrária _{com 10 pb de comprimento, da OPERON Technology (Tabela 2). Cada}

reação

de amplificação continha: 1,5 unidade de Taq DNA _{polimerase, tampão de}

reação

1X ₍₁₀ mM Tris—HCI _{pH 8,0; 50 mM de KCl; 2,0 mM de MgCl2), 100 mM de}

cada

(dCTP, dATP, dGTP

_e

_(FTP), 8 _{pmoles de}

_cada

_{oligonuceotídeo (primers),}

_e

20 _ng de DNA _{genômico, completando com}

_água

_{ultrapura para um volume final de}

25ul.

As

_reações

_{ocorreram em termociclador MJ}

_Research

_{lNC, modelo PTC—100,} programado

_para

3 ciclos iniciais de 94ºC/1 min., 35ºC/2 min.

_e

_{72ºC/2 min., mais 34}

Tabela2._{Sequência dos primers testados para análise de}

divergência genética entreP. vulgaris e P. acutifo/íus

Primer _Sequência(5'

ª

_3')

GPB-10

GPB—11

CPB-18

OPS _]]

CTGCTGGGAC GTAGACCCGT CCACAGCAGT AGTCGGGTGG

3. 3. 4.

_{Eletroforese em}

_Gel

_{de Agarose e Visualização}

dos

Fragmentos

Os produtos amplificados foram

_corados

_{com brometo de etídeo (0,2 ug/ml),} visualizados _{em transluminador de luz ultravioleta,}

_e

fotografados em lmageMaster— VDS. _{Como suporte para}

_{a separação das}

regiões amplificadas foi _{utilizado gel de}

agarose

1,2%

_e

_{tampão de gel de eletroforese de TBE 0,5X (Tris-HCl, EDTA}

e

ácido bórico), (SAMBROOK

_et

_{al., 1989).O tempo}

_{para a}

_{corrida eletroforética,}

foi _de 2 _a 3

h,

até

_que

_{as bandas estivessem}

_nitidamente

separadas

no gel.

3. 4.

_{Estudos de Ligações por Análise Bioquímicae}

Molecular

Por meio do _{padrão de}

_segregação

_{genética da progênie, uma}

matriz de

dados

foi

_analisada

_considerando

_presença

_e

_ausência

de bandas.

_Para

_a

caracterização

_{dos grupos de ligação,}

_e

_{percentual da distância genética dos}

indivíduos, foi _{utilizado o programa Mapmaker}

_e

_{“Análise de}

16

4.

_RESULTADOS

4. 1.

_Faseolina

O _{perfil eletroforético da faseolina para os genitores}

lca Pijão

_e

GL—O441, _não

apresentou

_{diferenças. Duas}

_bandas

_de

_pesos

_moleculares

45.71 kDa

_e

_{40.10 kDa,} foram identificadas em ambos. Os híbridos R2C1, _{da mesma forma, obtiveram}

o mesmo padrão de

_bandas

_{encontrado nos genitores (Figura}

1).

4. 2.

_{Proteínas Solúveis em}

_NaCl

0,5 M

Dez

_bandas

_{protéicas, obtidas pela eletroforese realizada}

em

ambos

genitores

_e

_{híbridos, lca Pijão (pai recorrente),}

GL-O441(pai _doador),

_e

_{R2C1, foram}

analisadas

_{quanto à}

_presença

_e

_ausência

_{de bandas.}

A

_presença

_{de heterozigose foi}

detectada

em

_apenas

2 _bandas,

_as

_{da lecitina, de 27 kDa}

e

23 kDa _{(Figura 2), com} proporção de indivíduos heterozigotos de 7,69% (3

_casos

_{em 39). Em 7}

_bandas,

_os resultados apresentaram, uma proporção

de

3:1,

_sendo

_{75% de caracteristica} homozigótica

_herdada

_{do pai recorrente, lca}

Pijão,

_e

_{25% de caracteristica} homozigótica

_herdada

_{do pai doador (Figura3). Em}

uma

_{das bandas a de}

_{33.4 kDa,} houve

_segregação

_{3:1 com prevalência de}

bandas herdadas

da cultivar GL—O441

)))

)

)

)

)))))))))))))))))))))))))))))))))))

17

M 1 _{2 Híbridos}

RZCI

45.715»

«neki»

—>

A

Fig

L

_{Eletroforese em SDS-PAGE10% dos padrões de}

faseolina encontrados: _{(M) marcador 6H, (1)IcaPijão (P. vuLgarlk);}

(2) GL-0441 (P, acutzfolius) & Híbridos _{R2C1: (10884, 10885,}

10886, 10888, 10889, 10890).

Fig2. _{Perfileletroforéticoem SDS-RAGE 10%.de}

proteínassolúveis

em

N

_aCl

_{0,5M, destacando}

_a

_{lecitina:(M) marcador 6H, (1) [ea} Pijão (P. _{vulgaris); (2) GL-0441 (P, a;:utzfolius),}

e

Híbridos

R2C1: _{(10883, 10884, 10885, 10886, 10888,}

10889, 10890). As

))))))))))))))))))))))')))))))))))))))))))))))))))

Fig

_{& Perfil eletroforético em}SDS—PAGE,10% de _{proteínas solúveis emNaCl} 0,5

M:

(M) marcador 6H, (1) lca Pijão

_{( P.}

vulgairs); ,(2) GL—044J _aº,

awtg'folius)&Híbridos RzCLL _{(10869, 1.0871,,10872, 10874,.,10875,.,1,08,77,,}

10818, 10880,10881, _{10882),Asbandassinalizadas pelaseta—apresentaram.} diefríhnínã'n _'ª']

4. 3.

_{Marcadores Moleculares}

_RAPD

Os quatro primers testados, geraram um _{total de cinco}

_bandas

_{polimórficas} (Tabela 3), _que foram _{avaliadas quanto}

_{a presença e ausência}

de bandas. Entre

essas

cinco, três

_são

_{resultado de amplificação pelo}

GPB—10, _{uma pelo GPB-18}

_e

uma pelo OPS-11. Das três

_bandas

_{polimórficas}

_geradas

_pelo

GPB-10, _{uma (600pb)}

apresentou segregação

de 3:1 ₍₂₉

_{bandas presentes}

_{para 10}

ausentes), as

outras

duas bandas

polimón'icas

_geradas,

_{530 pb}

_e

_{1230 pb,}

apresentaram segregação

de

372

(presentes

_para

_ausentes)

_{e 33:65}

_(ausentes

para presentes), respectivamente (Figura4).

Tabela3. Totaisde _{bandas amplificadase polimórt'lcaspor}

primer Bandas

Primer _{Totais Polimórtícas}

Tamanho pb

OPB-lO _{12 03}

380—1800

OPB-l 1 ₁₂

00 _320—2072

OPB—l8 _{04 01}

400-2000

OPS-11 _{08 01}

300—1400

Outra banda a

_{apresentar segregação}

_{polimórfica, foi}

a de 1000 pb

_gerada

pelo primer OPS-11, com 31

_presentes

_{para 8}

_ausentes.

_O

primer GPB-18, _gerou

banda

polimórfica _{de 800 pb, na proporção de 33:13,}

presentes

_para

_ausentes.

Além

_{das bandas}

_{polimórficas, foi}

constatado

também

_bandas

_que

_estão

presentes

_{em todos os indivíduos R2C1,}

_e

_que

estão presentes apenas

no cultivar lca _Pijão,

_geradas

_{pelos primers GPB-10 e}

11 _{(Figuras 4}

_e

_5),

_e

_{OPS—11. Caso}

semelhante

não foi _{encontrado para a cultivar GL—0441}

, exceto

se

essa

banda

estiver

_presente

_em

_ambos

_genitores.

Bandas

_{aparentemente}

_não

_encontradas

nos genitores foram

_constatadas

_nos híbridos R2C1, _{em amplicação pelo primer GPB-11 (Figura}

20

M

I

2

_{Híbrídestcl}

<—1230_pb

' 600pb.

t

530 pb

Fig-A. _{Eletroforesede DNA, em gel de»}

agarose1,2%. _{primerGPB-10. (M)} marcador molecular 100 pb“; _{(1) Ica Pijâo (P. vulgaris); (2)}

GL-0441(P. acutifolius)

_e

Híbridos RZCI: _{(3262, 3267, 3272, 3277, 3282,}

3287, 3292, _{3297, 3302, 3307, 3312,}

10858, 10859, 10860, 10861, 10862, 10863).

Fig. S;._{Eletroferesede DNA em gel}

deagarose

1,2%. Pn'mer OPB-l—l.

(M) Marcador MolecuIaf _{100 pb;}

_(I)

_{103 Pijãe (P. vulgaris); (2)}

GL,-0441 (P. _{acutifolius),} e“ Híbridos _{RZCI: (3262, 3267, 3272,}

21

4. 4.

_Estudos

_{de Ligação}

Todas

_{as bandas}

_{polimórficas obtidas de DNA}

_e

_{proteínas, foram}

lançadas

em uma matriz

_baseada

_na

_{presença e ausência}

_{de bandas, e então}

analisados

no programa Mapmaker,

versão

3.0, _para

_estudos

_{de ligação. Foi}

_então

_{obtido dois} grupos de ligação, um _{maior composto pelos marcadores 27 kDa, 34kDa, 33.4 kDa,} OPB-10b, OPB-10a

_e

_{OPS-11, totalizando 125,5 cM, e outro menor formado pelos} marcadores 23 kDa, 29 kDa, 28 kDa

_e

_{31.4 kDa, totalizando 32.2 cM. Quatro}

marcadores

121 _{kDa, 63.6 kDa, 65 kDa e OPB-10c não}

apresentaram

ligação (Figura6). No maior_{grupo, 33.4 kDa e o OPB-10b,}

_representam

_{um ligação formada} porum _{marcador de proteína}

_e

_{outro de DNA,}

_separados

_{por 21.8 cM.}

A _{maior distância entre os}

_marcadores

_{foi de 31.9 GM, e a menor de}

10.4 cM.

4. 5.

_{Distâncias Genéticas}

A _estimativa

_das

_distâncias

_genéticas

envolvendo genitores

_e

_progênies

RZC1, _{realizada pelo programa de estatística, distinguiu}

dois clusters, distantes em 65%,

_sendo

_{um maior ao qual}

_{pertence a}

_{cultivar lca Pijão com 29}

indivíduos,

_e

outro menor com a cultivar GL—0441, _{com 12 indivíduos. As proporções em número}

de indivíduos _{aproxima-se de}

₃₁

_{(Figura7). Dentrodo}

_cluster

_{do GL-0441,}

há ainda outra subdivisão,

_{separando este}

_{em dois menores}

_clusters

_{distanciados por uma} distância genética de 47%, O indivíduo mais próximo do GL—0441

é

_{o 3262,}

distanciados _{em 17%. As distâncias}

_genéticas

_{entre os indivíduos do}

menor

cluster

são

_{maiores que}

_as

_distâncias

_genéticas

_{entre os indivíduosdo maior cluster.}

No

_cluster

_{ao qual pertence}

_a

_{cultivar lca Pijão, verifica—se}

menores distâncias

genéticas

entre

_seus

_indivíduos,

_sendo

_{que a maior distância}

_observada

_{foi de 31 %.} Os indivíduos _{mais próximos de cultivar lca Pijão, 10880, 10874, 10871}

)

)

)))))

))))

)

Fig6.

Lec27kDa

__

31.9 cM

34kDa

_—

25.0 cM

33.4kDa

21.8 cM OPB-lOb———

25.0CM

OPB-IOa

_——

21.8CM

OPS-11

—_

125,5 cM

Lec 23kDa

_

29 kDa F—

IO.4cM

28kDa

_—

21.8 cM

31.4 kDa

%—

32,2 cM

OPB-1Ob II

Os

OPB-lOa = _530pb

600 pb OPB-lOc

:

1230_pb

marcadores:

121 _kDa, 63.6 _kDa, 65. _{kDa, OPB-lOc,}

não estão ligados a

nenhum grupo de

ligação.

Mapa de _{ligação construído a partir dos marcadres bio}

)

)))))))))

)

)))))

)))))))))

)

))))))))

)

)

)))

4101 DDB _{HTS 11.29} 1159 (1:19

9.59

Linkage Distance

Fig 7. _{Diagrama da distância genética entre P. vulgaris, P. acutifolis}

ehíbridosR2C1.

0.69

24

5. DISCUSSÓES

5. 1.

_Faseolina

A _{faseolina é uma proteína extremamente conservada,}

e está

diretamente relacionada com o centro de _{origem da}

_espécie

_(MA, & _{BLISS, 1978). A análise do}

perfil _{eletroforético de faseolina não indicou diferenças entre}

as duas espécies,

provavelmente devido a origem _comum,

_{mesoamericana}

_de

_ambas

_{(VIEIRA ,1967).} Esta hipótese

é

_{reforçada, pelo comportamento}

_dessa

_herança

_{obtido na progênie,}

onde

_pode-se

verificar _{que todos os indivíduos}

_apresentam

_{padrão idêntico}

ao dos genitores (Figura1).

5. 2.

_{Proteínas Solúveis em}

_{NaCl 0,5 M}

Estma—se _{que no retrocruzamento com o pai recorrente lca}

Pijão, aproximadamente 87,5% do genoma já

_{esteja presente}

_{na progênie R201,}

_e

_a proporção de indivíduos homozigotos para heterozigotos deve

_ser

_{de 3:1(Figura 8).}

A _{característica em homozigose}

_herdada

pelos híbridos deve pertencer ao genitor recorrente.

As

_{análises das}

₁₀

_bandas

_protéicas

_{estudadas, neste}

trabalho, revelou que a

_segregação

dos

_genes

_para

_essas

_{bandas estão}

_{seguindo uma proporção de 3:1}

,

sendo

75% _{de características homozigotas}

_herdadas

_{do genitor recorrente,}

NUi

de

_{características}

_{homozigóticas}

_herdadas

_{do genitor doador (Figura}

7). A

ocorrência de indivíduos _{heterozigotos, foi}

_constatada

_em

_{apenas duas das}

_dez

bandas analisadas

(27 kDa

_e

23 kDa),

as

da _{lecitina, com frequência na progênie} baixa _{(7,69%), não correspondendo com o}

_esperado

de 25% de heterozigose, por banda analisada.

A

_estes

_{resultados, muitas}

_hipóteses

_{tentam explicar,}

a

ocorrência

_dessas

bandas

_{homozigóticas do genitor doador, e a não ocorrência de}

_bandas

heterozigõticas. Embora entre

_espécies

_{próximas, a hibridação interespecífica já traz} no próprio _{termo que diferenças}

_genéticas

_deverão

_{ser superadas para}

_o

sucesso

do cruzamento. Barreiras a nível _{de cromossomos}

_{e genes, são esperadas,}

_{devido à} divergências

_genéticas

_{ocorridas durante o}

_processo

_{de evolução de}

_ambas

espécies.

As _principais

_espécies

_{de plantas cultivadas hibridizam facilmente} com

espécies

_{geneticamente mais próximas dela (KNOTT, 1987). Porém a substituição}

do _{segmento cromossômico da}

_espécie

_{receptora por um}

segmento

cromossômico de outra

_espécie

_{afim pode resultar em duplicações, em}

deieções

ou em

associações

_{gênica indesejáveis,}

_esses

_{efeitos são, particularmente, maiores em}

espécies

diplóides (PRESTES & _{GOULART, 1985).}

A _{substituição total de um cromossomo do P. vulgaris por}

um do P. _acutifo/ius pode ter ocorrido, originando assim

_bandas

_{homozigóticas do P. acutifo/ius, entre os} indivíduos _{da progênie.}

Outro _{fator a}

_se

_{considerar, é a}

_supressão

_{cromossômica,}

_demonstrada

por Gustafson & Ross _{(1990), onde a}

_expressão

_{gênica pode}

ser

parcial ou totalmente inibida,

_dependendo

_{do genoma}

_para

_{o qual os}

_genes

_{foram transferidos. Esta}

supressão

pode

estar

_{ocorrendo quando em heterozigose, o cromossomo ou}

_a

região cromossômica do _{P. acutifo/ius, suprime o cromossomo ou a região} cromossômica do _{P. vulgaris,}

_{expressando apenas seu}

_{produto de transcrição.}

Todas

_as

_{possíveis hipóteses que justifiquem a falta de correlação entre}

as

frequências

_{esperadas e as}

_observadas,

_{estão baseadas}

_{em problemas surgidos} durante o

_processo

meiótico.

Estes desarranjos estão

_{apoiados na mistura de}

_genomas

_parcialmente