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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA MOLECULAR

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA MOLECULAR

Patologia dos baculovírus: Efeito da ação de

enzimas heterólogas e análise da resposta

transcricional do hospedeiro durante a

infecção viral

Aline Welzel Gramkow

Orientador: Dr. Bergmann Morais Ribeiro

Tese apresentada ao Departamento de

Pós-Graduação em Patologia Molecular, da

Faculdade de Ciências da Saúde da

Universidade de Brasília, como parte dos

requisitos necessários à obtenção do título de

Doutor em Patologia Molecular.

(2)

ii

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA MOLECULAR

Patologia dos baculovírus: Efeito da ação

de enzimas heterólogas e análise da

resposta transcricional do hospedeiro

durante a infecção viral

Aline Welzel Gramkow

Orientador: Dr. Bergmann Morais Ribeiro

Tese apresentada ao Departamento

de Pós-Graduação em Patologia

Molecular, da Faculdade de Ciências

da Saúde da Universidade de

Brasília, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de

Doutor em Patologia Molecular.

(3)

iii

ÍNDICE

Figuras ... vii

Tabelas ... viii

Citação ... x

Agradecimento a Deus... xi

In memorian ... xii

Dedicatória ... xiii

Agradecimentos gerais ... xiv

Abreviaturas e símbolos ... xvii

Resumo ... xix

Abstract ... xx

Introdução ... 023

Revisão bibliográfica ... 026

A. Baculovírus ... 026

B. Modo de infecção in vivo ... 029

C. Regulação da expressão gênica ... 032

D. Baculovírus como vetor de expressão: AcMNPV ... 033

E. Anticarsia gemmatalismultiplenucleopolyhedrovirus (AgMNPV) ... 037

F. Baculovírus recombinante para controle biológico ... 040

G. Proteases... 043

I. Classificação ... 043

(4)

iv

III. Catepsina-L ... 046

IV. Quitinase ... 047

H. Sistema Imune de insetos ... 050

Capítulo I ... 056

1. Introdução ... 056

2. Objetivos ... 060

3. Materiais e Métodos ... 060

3.1. Vírus e células ... 060

3.2. Construção dos plasmídeos e vírus recombinantes ... 061

3.3. Bioensaios ... 063

3.4. Análise estrutural e ultraestrutural dos tecidos internos de larvas S. frugiperda infectadas ... 064

3.5. Ensaio para atividade de fenoloxidase ... 065

3.6. Ensaio para atividade de quitinase ... 065

4. Resultados ... 067

4.1.Construção dos plasmídeos e dos vírus recombinantes ... 067

4.2.Bioensaios ... 069

4.3.Análise estrutural e ultraestrutural dos tecidos das larvas S. frugiperda infectadas com os diferentes vírus ... 073

(5)

v

4.5.Atividade de quitinase ... 079

5. Discussão ... 080

Capitulo II ... 086

1. Introdução ... 086

2. Objetivo ... 092

3. Materiais e Métodos ... 092

3.1. Vírus ... 092

3.2. Insetos ... 093

3.3. Extração do RNA total e síntese dos cDNAs ... 093

3.4. Hibridização subtrativa e obtenção de bibliotecas subtraídas ... 094

3.5. Sequenciamento dos cDNAs e geração de ESTs ... 095

3.6. Processamento das ESTs, anotação e análise de expressão diferencial .... 096

3.7. PCR em tempo real (qPCR) ... 096

4. Resultados ... 098

4.1. Síntese das fitas de cDNAs e ensaio de RDA ... 098

4.2. Análise das sequências dos clones obtidos ... 101

4.3. PCR em tempo real (qPCR) ... 116

5. Discussão ... 118

Perspectivas ... 124

(6)
(7)

vii

FIGURAS

Figura 1: Ultraestrutura de um baculovírus. ... 027

Figura 2: Esquema da infecção de uma larva de um inseto da ordem Lepidóptera por

baculovírus, in vivo. ... 031

Figura 3: Foto de uma larva de Anticarsia gemmatalis ... 039

Figura 4: Foto de uma larva de Spodoptera frugiperda ... 059

Figura 5: Esquema mostrado o gene da poliedrina do vírus selvagem AcMNPV e os

diferentes vírus recombinantes. ... 068

Figura 6: Análise estrutural da cutícula de larvas de S. frugiperda infectadas pelo

AcMNPV selvagem e recombinantes ... 074

Figura 7: Esquema mostrando uma lagarta de S. frugiperda não infectada ... 075

Figura 8: Análise estrutural dos tecidos internos de larvas de S. frugiperda. ... 076

Figura 9: Ultraestrutura de intestinos de larvas S. frugiperda infectadas com os vírus

96 h p.i. ... 077

Figura 10: Atividade de fenoloxidase em hemolinfa de S. frugiperda infectada ... 078

Figura 11: Atividade quitinolítica de amostras de poliedros de AcMNPV e vSynQuit.

... 079

Figura 12:Esquema da metodologia de RDA ... 088

Figura 13: Eletroforese em gel de agarose 1,5% da segunda fita de cDNAs driver e

produtos diferenciais corados com brometo de etídeo. ... 099

Figura 14: Eletroforese emgel de agarose 1,5% dos produtos diferenciais corados com

brometo de etídeo ... 101

Figura 15: Sequência de nucleotídeos do gene e de aminoácidos da proteína do cognato

de choque térmico de 70 kDa de A. gemmatalis... 115

(8)

viii

TABELAS

Tabela 1: Valores de TL50 para o vírus selvagem e os recombinantes vSynScathL e

vSynKerat injetados em larvas de S. frugiperda 3º ínstar. ... 070

Tabela 2: Valores de TL50 para o vírus selvagem e o recombinante vSynQuit injetados

em larvas de S. frugiperda 3º ínstar. ... 071

Tabela 3: Valores de CL50 para o vírus selvagem e os recombinantes vSynScathL e

vSynKerat em larvas neonatas de S. frugiperda infectadas oralmente com poliedros . 071

Tabela 4: Valores de CL50 para o vírus selvagem e o recombinante vSynQuit em larvas

neonatas de S. frugiperda infectadas oralmente com poliedros. ... 072

Tabela 5: Valores de TL50 para o vírus selvagem e os recombinantes vSynScathL e

vSynKerat em larvas neonatas de S. frugiperda infectadas oralmente com poliedros

... 072

Tabela 6:Valores de TL50 para o vírus selvagem e o recombinante vSynQuit em larvas

neonatas de S. frugiperda infectadas oralmente com poliedros ... 073

Tabela 7: Oligonucleotídeos utilizados nas etapas do RDA, sequenciamento, clonagem

e PCR em tempo real ... 097

Tabela 8: Análise dos contigs por Blastx derivados de ESTs resultantes do

sequenciamento da biblioteca subtrativa obtida de cDNAs de hemócitos das larvas de A.

gemmatalis infectadas e não infectadas, mostrando genes reprimidos quando utilizado o

AcMNPV como driver ... 103

Tabela 9: Análise dos contigs por Blastx derivados de ESTs resultantes do

sequenciamento da biblioteca subtraída obtida de cDNAs de hemócitos das larvas de A.

gemmatalis infectadas e não infectadas, mostrando genes induzidos quando utilizado o

(9)

ix Tabela 10: Análise dos contigs por Blastx derivados de ESTs resultantes do

sequenciamento da biblioteca subtraída obtida de cDNAs de hemócitos das larvas de A.

gemmatalis infectadas e não infectadas, mostrando genes reprimidos quando utilizado o

AgMNPV como driver ... 107

Tabela 11: Análise dos contigs por Blastx derivados de ESTs resultantes do

sequenciamento da biblioteca subtraída obtida de cDNAs de hemócitos das larvas de A.

gemmatalis infectadas e não infectadas, mostrando genes induzidos quando utilizado o

AgMNPV como tester ... 110

Tabela 12: Transcritos gênicos e frequência obtidos pelo sequenciamento através da

técnica RDA ... 111

Tabela 13: Produtos gênicos e funções dos transcritos obtidos do sequenciamento da

biblioteca subtrativa obtida de cDNAs de hemócitos das larvas de A. gemmatalis

(10)

x

“Consulte não a seus medos, mas a suas esperanças e sonhos.

Pense não sobre suas frustrações, mas sobre seu potencial não

usado. Preocupe-se não com o que você tentou e falhou, mas com

aquilo que ainda é possível você fazer."

(11)

xi

“Deus é meu amparo, minha fortaleza, meu consolo forte na

tribulação.”

(12)

xii

In memorian

(13)

xiii

Ao meu querido marido Daniel, meus queridos pais, Almiro e

Silvia e minha querida irmã Alessandra

Dedico de todo o meu coração, por toda força e confiança

depositada, em todos os momentos ...

(14)

xiv

Agradecimentos gerais

A DEUS que me deu a vida e a oportunidade de realização dessa pesquisa, o

que seria de nós sem fé!

Ao meu querido e amado marido Daniel, que mesmo nos momentos de

desânimo, me levantou e incentivou a continuar. Obrigada por toda a ajuda e amor,

pelos conselhos dados, mesmo nos momentos angustiantes. Amo você!

Aos meus pais, Almiro e Silvia, por serem meu porto seguro, por toda a

confiança depositada, por todo carinho, amor e ânimo, fundamentais para o

desenvolvimento desta tese.

A minha irmã Ale, obrigada por tudo! Por cada momento de coragem e por

seu ombro amigo sempre presente! Nossas conversas foram fortificantes!

Ao meu orientador Dr. Bergmann Morais Ribeiro, por toda confiança

depositada, por toda a paciência e orientação na minha formação acadêmica e

profissional, meu obrigado!

Aos meus sogros Heinz e Márcia por todas as conversas, correções

ortográficas e preocupações. E também a todos os Gramkow por toda a ajuda.

Obrigada!

A toda minha família que está longe, meu querido avô, tios, tias, primos por

todo o incentivo e curiosidade pelo meu trabalho.

Às minhas queridas amigas Bel e Carla por todo o apoio e amizade durante

todos esses anos. Obrigada por toda a paciência de me escutarem em muitos momentos

difíceis e me aconselharem.

Aos meus amigos dos Jovens Mais, ao Pastor Bolla, Pastor Joachim, Pastor

(15)

xv ao grupo de Estudo Bíblico Comunhão em Família da Igreja Evangélica Luterana e

grupo de dança. Obrigada por toda a torcida e curiosidade sobre meu trabalho.

À minha amiga Anabele, por toda amizade, “comidinhas”, conversas e

amadurecimento que tivemos durante todos esses anos, espero de coração que nossa

amizade seja eterna! À minha amiga Bruna de igual forma, por toda a amizade e

companheirismo, consolo durante essa jornada e claro, não por última à minha amiga

Dra. Gláucia, plena em sua bondade, obrigada pela amizade, por todos os conselhos e

puxões de orelha.

Aos meus queridos amigos do Laboratório de Microscopia Eletrônica, os mais

antigos Su, Aninha, Maria (Obrigada meninas, por tudo!), Roberto, Raimundo, Bruno,

Breno, Tati, Dani (muito obrigada pela hospedagem e conversas que tivemos!), Greice,

Lorrainy, Vírginia, Raíssa, Clarinha e os mais novos, Raul, Raphael, Mari, Carol,

Daniel, Fabrício, Briana, Lorena.

À querida Érica e Paulo, obrigada por toda a ajuda profissional incondicional,

indispensáveis ao trabalho, por todas as dicas e desabafos e também ao Vinícius e Dra.

Rose pela ajuda e pelos insetos

Aos professores do Laboratório de Microscopia Eletrônica Sônia e Renato pela

ajuda quando era necessária.

Ao grupo da Universidade de Goiânia, principalmente Dra Célia e Dr

Alexandre pela ajuda com RDA e qPCR.

A todos do Núcleo de Controle Biológico e da criação de insetos, que me

forneceram os insetos.

Aos secretários do Curso de Pós-Graduação em Patologia Molecular,

Alessandro, Jaqueline por todos os esclarecimentos.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro.

(16)

xvi Aos membros da banca, pela disponibilidade em contribuir com nosso

trabalho.

A todos que de alguma forma contribuíram na minha formação, considerando

que essa tese é fruto de uma caminhada de muitos anos, agradeço a todos que direta ou

indiretamente participaram dessa construção, que não mediram esforços para me apoiar

(17)

xvii

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

BSA Albumina Sérica Bovina

cDNA DNA complementar

CL50 Concentração Letal em 50% das larvas

df graus de liberdade

DNA ácido desoxirribonucléico

DNS ácido dinitrosalicílico

EDTA ácido etilenodiaminotetracético

ESTs Expressed sequence tag

g grama

GlcNac N-acetilglucosamina

h hora

h p.i. horas pós-infecção

IM Intestino médio

kDa quilodalton

KDEL

Possível sinal de localização no retículo endoplasmático (K -Lisina,

D - ácido aspártico, E - ácido glutâmico e L - leucina).

L litro

L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine

LF

Limite fiducial

M molar: mol/l

mg miligrama

nL nonolitro

(18)

xviii mL mililitro

µL microlitro =10-6 litro

µM micromolar (micromol por litro)

mM milimolar

NaCl Cloreto de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

pb pares de base

PCR reação em cadeia da polimerase

pfu Unidade formadora de placa

pH potencial de hidrogênio

qPCR PCR em tempo real

RDA Análise de Diferença Representacional

RNA ácido ribonucléico

RNAi RNA de interferência

s segundo

SD desvio padrão

T Traquéia

TD média do tempo de morte

TL50 Tempo letal em 50% das larvas

TG Tecido gorduroso

TM Túbulo de Malphigui

Tris tris(hidroximetil) aminometano

U unidade enzimática

X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galactopiranosídeo

°C grau Celsius

(19)

xix

RESUMO

Os baculovírus compreendem o maior grupo de vírus de insetos estudados no

mundo, principalmente pela eficiência em matar pragas da agricultura. Neste trabalho,

três baculovírus recombinantes contendo os genes ScathL (Catepsina L) de Sarcophaga

peregrina (vSynScathL), Kerat (Queratinase) do fungo Aspergillus fumigatus

(vSynKerat) e Quit (Quitinase) do fungo Metarhizium anisopliae (vSynQuit) foram

construídos e suas propriedades bioinseticidas analisadas em larvas de Spodoptera

frugiperda. Bioensaios em larvas neonatas e de 3º ínstar de S. frugiperda infectadas

com os baculovírus vSynScathL, vSynKerat e vSynQuit mostraram uma diminuição no

tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus

selvagem. O vSynScathL apresentou uma TL50 e TD de 47 horas e 2,62 dias,

respectivamente, enquanto o AcMNPV, uma TL50 de 136 horas e TD de 5,37 dias,

respectivamente para larvas de S. frugiperda de 3º ínstar. Isso representa uma

diminuição significativa de 65,5% para TL50 e 50,09% para TD, no tempo necessário

para o vírus matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem. A TL50 e

TD para o vírus vSynKerat foi de 91 horas e 3,70 dias, respectivamente, com uma

redução de 32,8% para TL50 e 30,21% para TD, no tempo necessário para o vírus matar

os insetos infectados quando comparado ao vírus AcMNPV. Já, o vírus recombinante

vSynQuit apresentou uma TL50 de 110,67 horas, o que foi 23,6% menor do que o vírus

selvagem (TL50 de 144,97). Já em larvas neonatas de S. frugiperda o vSynScathL

mostrou uma TL50 de 77 horas comparado ao AcMNPV de 104 horas quando inoculado

com 102 corpos de oclusão/nL, já o TD foi de 3,46 dias para o vírus recombinante e

4,16 dias para o AcMNPV. Isso representa uma redução de 26% na TL50 e 16,82% para

TD no tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus

(20)

xx 48% comparado ao vírus AcMNPV e o TD de 3,87 dias, reduzindo 6,97% no tempo

necessário para matar os insetos; já a TL50 do vírus vSynQuit foi de 86 horas, com uma

redução de 45,2% comparado ao vírus selvagem e o TD de 3,75 dias comparado com o

vírus selvagem de 4,43 dias, representando uma redução de 15,34% no tempo

necessário para matar os insetos. Também mostramos que os vírus vSynScathL e

vSynKerat foram capazes de aumentar a atividade de fenoloxidase na hemolinfa de

larvas de S. frugiperda em relação ao vírus selvagem e à larva não infectada. A

expressão de proteases em larvas infectadas resulta na destruição dos tecidos internos

em estágios tardios da infecção, podendo ser uma das razões para o aumento da

velocidade para matar as larvas de S. frugiperda, como observado na microscopia

eletrônica de varredura para os vírus vSynScathL e vSynKerat em relação ao vírus

selvagem e à larva não infectada. O ensaio enzimático com quitina regenerada mostrou

também uma diferença quitinolítica significativa em relação aos corpos de oclusão do

vírus vSynQuit em comparação ao vírus selvagem. A transcrição de genes celulares em

hemócitos derivados de larvas de Anticarsia gemmatalis infectados (12 h p.i.) pelos

baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) e/ou

Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) também foram

analisados neste trabalho pela técnica análise de diferença representacional (RDA). Os

trancritos mais abundantes encontrados foram para proteases celulares, que estão

provavelmente envolvidas na resposta do inseto à infecção viral. Outros genes, como

por exemplo, hsp70 e hsc70, proteínas ribossomais, aminopeptidase, beta 1,3 glicanase,

proteína induzida pelo hormônio juvenil, lipase também foram detectados. Todos esses

transcritos podem de alguma maneira ter um papel na defesa celular e/ou

estabelecimento da infecção viral. Para confirmação dos dados obtidos pela RDA, a

transcrição do gene hsc70 foi analisada por PCR em tempo real e confirmou sua

(21)

xxi

ABSTRACT

Baculovirus comprise the largest group of insect viruses most studied

worldwide, mainly because they efficiently kill agricutural insect pests. In this study,

tree recombinant baculoviruses containing the ScathL gene (Cathepsin L) from

Sarcophaga peregrina (vSynScathL), the Kerat gene (Keratinase) from the fungus

Aspergillus fumigatus (vSynKerat) and Quit gene (Chitinase) from the fungus

Metarhizium anisopliae (vSynQuit) were constructed and their insecticidal properties

analysed against Spodoptera frugiperda larvae. Bioassays of third-instar and neonate S.

frugiperda larvae with vSynScathL,vSynKerat and vSynQuit showed a decrease in the

time needed to kill the infected insects when compared to the wild type virus. The

vSynScathL showed LT50 and TD of 47 hours and 2.62 days respectively, while

AcMNPV, a LT50 of 136 hours and TD of 5.37 days, respectively for third-instar S.

frugiperda.larvae. This represents a significant decrease (from 65.5% for LT50 and

50.09% for TD) in the time required to kill the virus infected insects compared to wild

virus. The LT50 and TD for vSynKerat was 91 hours and 3.70 days, respectively,

showing also a reduction (32.8% for LT50 and 30.21% for TD), in the time required to

kill the virus infected insects compared to AcMNPV. Also, the vSynQuit in another

bioassay, showed a LT50 of 110.67 hours, which was 23.6% lower than the wild type

virus (LT50 of 144.97 hours). Using neonate larvae of S.frugiperda, the vSynScathL

showed a LT50 77 hours compared to 104 hours of AcMNPV when inoculated with 102

occlusion bodies/nL, since the TD was 3.46 days for the recombinant virus and 4.16

days for AcMNPV. This represents a 26% reduction in LT50 and 16.82% for TD

compared to wild type virus AcMNPV. The LT50 of the virus vSynKerat was 54 hours

with a 48% reduction compared to AcMNPV and in the TD of 3.87 days, 6.97%; with

(22)

xxii and TD of 3.75 days compared with 4.43 days for wild type virus, a reduction of

15.34%. We have also shown that vSynScathL and vSynKerat were able to increase

phenoloxidase activity in the hemolymph of S. frugiperda larvae compared with the

wild type virus and with larvae not infected. The expression of proteases in infected

larvae resulted in destruction of internal tissues late in infection, which could be the

reason for the increased viral speed of kill, as observed in scanning electron microscopy

for viruses vSynScathL and vSynKerat compared to the wild type virus and uninfected

larvae. The enzyme assay with regenerated chitin also showed a significant chitinolytic

difference with occlusion bodies of the vSynQuit compared to wild type virus . The

transcription of cellular genes in hemocytes derived from infected larvae of Anticarsia

gemmatalis (12 h p.i.) by Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus

(AgMNPV) and/or Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)

were also analyzed in this work by the representational difference analysis (RDA).

Transcrits more abundants were cellular proteases, which are probably involved in

insect response to viral infection. Other genes, such as hsc70 and hsp70, ribosomal

proteins, aminopeptidase, beta 1.3 glucanase, protein induced by juvenile hormone,

lipase were also detected. All of these transcripts can somehow play a role in cellular

defense and/or establishment of viral infection. To confirm the data obtained by RDA,

the hsc70 gene transcription was analyzed by real time PCR and confirmed their

(23)

23

INTRODUÇÃO

A produção agrícola no mundo sofre perdas significativas devido ao ataque de

insetos. Esse ataque é um importante fator na redução da produção de várias culturas,

sendo necessário algum tipo de controle da população do inseto-praga para sua

diminuição (Turnipseed & Kogan, 1987). Isso leva à utilização, pelos agricultores, de

inseticidas químicos em doses elevadas, a fim de assegurar os níveis de produção. Além

de causar resistência às pragas com o uso constante dessas substâncias, os pesticidas

causam danos ao meio ambiente e à saúde humana, demandando alto investimento

financeiro.

Novas alternativas no controle de pragas e doenças tornam-se necessárias a

fim de minimizar os efeitos causados pelo uso de inseticidas químicos. Alternativas

seguras e mais econômicas são possíveis com o uso de agentes biológicos (Szewczyk et

al., 2008). Os bioinseticidas, por serem mais seletivos, mais seguros ao aplicador e por

não poluírem o meio ambiente como os agrotóxicos, são alternativas verdadeiramente

ecológicas e sustentáveis, que contribuem para manter o equilíbrio biológico (Secchi,

2002). Estes são mais seletivos, possuem maior tempo de vida útil, dado à dificuldade

da praga se tornar resistente ao seu uso, além de serem mais específicos e menos

poluentes. Porém, em contrapartida, exigem estudos mais aprofundados, tanto no

isolamento de novos patógenos como nos testes de seleção, produção e formulação.

Vários países utilizam bioinseticidas para controle de pragas da lavoura e esses agentes,

atualmente, representam mais de 2% do mercado de inseticida do mundo (Ribeiro et al.,

(24)

24 Dentre os métodos de controle biológico, destaca-se o uso de produtos à base

de vírus, principalmente os baculovírus (Souza et al., 2002). Estes têm sido estudados

como agentes de controle biológico desde a década de 60 (Payne, 1986) e compreendem

o maior grupo de vírus de insetos, tendo grande potencial como agentes de controle

biológico de insetos-praga na agricultura e em áreas florestais (Martignoni, 1984;

Payne, 1986; Moscardi & Sosa-Gómez, 1992, 1993; Moscardi, 1998).

A vantagem em utilizar os baculovírus é por serem específicos em relação ao

seu hospedeiro e inofensivos aos humanos. O caso de maior sucesso mundial no uso de

controle biológico é o uso do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple

nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) contra a lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis),

quando, na safra de 2003/2004, por volta de dois milhões de hectares de plantação de

soja no País foram tratados com formulações desse vírus (Moscardi, 1999; Moscardi &

Santos, 2005). Os principais danos causados à cultura da soja ocorrem na fase larval de

A. gemmatalis, comem tanto o limbo como as nervuras, podendo ocasionar 100% de

desfolhamento até atingirem o seu desenvolvimento máximo, para tornarem-se pupa.

Até completar o seu desenvolvimento larval, cada lagarta pode consumir em média 90

cm2 de folhas, ou seja, o equivalente a 2,1 vezes a sua própria massa a cada 24 horas

(Gallo et al., 2002).

Além disso, existem outros programas em países como Rússia e China e

também para outras pragas no Brasil, como Spodoptera frugiperda e Spodoptera

litorallis (Melo & Azevedo, 1998). Um programa brasileiro resulta no combate à lagarta

do cartucho do milho (S. frugiperda), coordenado pela Embrapa Milho e Sorgo em Sete

Lagoas/MG. Essa lagarta é a principal praga da cultura do milho, podendo reduzir a

(25)

25

frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), produzido na forma de pó

molhável (Valicente, 2009 ).

Para aumentar a velocidade de morte das larvas, baculovírus recombinantes

têm sido construídos, aumentando a sua propriedade bioinseticida. Uma maneira de

melhorar a virulência dos baculovírus é a inserção de genes de hormônios e/ou

(26)

26

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A.

Baculovírus

Os baculovírus compreendem o maior grupo de vírus de insetos já estudado,

sendo usados como agentes de controle biológico (Martignoni, 1984; Payne, 1986;

Moscardi & Sosa-Gómez, 1992, 1993; Moscardi, 1998; Castro et al., 1999; Szewczyk et

al., 2008), como vetores de expressão (Luckow & Summers, 1988; O´Reilly et al.,1992;

Richardson, 1995; Bonning & Hammock, 1996; Jarvis et al.,1997; Condreay et al.,

2007) e como possíveis vetores de terapia gênica (Tani et al., 2003; Van Oers et al.,

2006; Raty et al., 2008). Uma das razões pelas quais vários grupos de pesquisa estudam

baculovírus como uma ferramenta biotecnológica é a sua segurança, pois são altamente

específicos a uma ou a poucas espécies de insetos relacionadas, não afetando outros

organismos (Gröner, 1986). O uso dos baculovírus como agente de controle biológico é

facilitado pela característica desses vírus de serem encapsulados em uma oclusão

cristalina de natureza protéica, que confere proteção aos vírions no meio ambiente e

permite a formulação de biopesticidas com fácil tecnologia de aplicação, representando

economia e segurança em relação aos inseticidas químicos (Castro et al., 1999).

São vírus com DNA de dupla fita, circular, superenovelados (supercoiled),

pertencentes à família Baculoviridae, possuindo um ou mais vírions com envelope em

formato de bastão (báculo), contendo no seu genoma entre 80 e 200 kilobases (kb)

(Lauzon et al, 2006). O nome Baculoviridae tem origem a partir da palavra latina

(27)

27 (Fields et al., 2001). Possuem uma característica única entre os vírus conhecidos, por

apresentarem dois fenótipos distintos durante um único ciclo de infecção: o BV ou vírus

extracelular (BV do inglês budded virus), que é responsável pela transmissão do vírus

de célula a célula; e o OB, vírus ocluso ou corpo de oclusão (OB do inglês occlusion

body) (Smith et al., 1983), sendo responsável pela transmissão horizontal do vírus de

inseto a inseto (Figura 1).

Figura 1: Ultraestrutura de um baculovírus. (A) Microscopia eletrônica de transmissão mostrando uma partícula viral extracelular (budded virus – BV) entrando em uma célula por endocitose. (B) A figura mostra através de microscopia eletrônica de transmissão as partículas virais oclusas (ODV) em uma

matriz protéica (corpo de oclusão, OB ou poliedro). A seta em A mostra uma partícula viral extracelular e

em B mostra múltiplas partículas virais envelopadas (vírus oclusos) no interior de um poliedro. (Fontes:

foto A: adaptada de www.cheque.uq.edu.au/research/bioengineering/research/Baculovirus/Baculo2.gif e

foto B: cedida pelo Dr. Bergmann Morais Ribeiro).

Na década de 90, a classificação do Comitê Internacional de Taxonomia de

Vírus dividiu a família Baculoviridae em apenas dois gêneros: Nucleopolyhedrovirus,

composto pelos NPV, e Granulovirus, compreendendo os GV (Murphy et al., 1995;

(28)

28 Os NPV possuem corpos de oclusão poliédrica (PIB), também chamados de poliedros,

variando seu diâmetro de 0,15 a 15 µm (Bilimoria, 1991) e contendo vários vírions. Sua

principal proteína é denominada poliedrina, com massa molecular em torno de 30.000

daltons (Summers et al., 1980), correspondendo a cerca de 95% do seu conteúdo

protéico (Maruniak, 1986). Os vírus desse gênero podem conter apenas um

nucleocapsídeo por vírion (Single nucleopolyhedrovirus - SNPV) ou vários

nucleocapsídeos por vírion (Multiple nucleopolyhedrovirus - MNPV) (Bilimoria, 1991;

Theilmann et al., 2005), enquanto os GV são caracterizados pela forma ovicilíndrica do

corpo de oclusão, denominado grânulo, com cerca de 0,3 x 0,5 µm (Crook, 1991) e

geralmente possuem um ou raramente dois a três vírions por grânulo. Assim como a

poliedrina, a granulina é o principal componente protéico do grânulo. Os GV ainda são

pouco estudados, devido a limitações no tocante à replicação viral em cultura de células,

(Winstanley & Crook, 1993) e por possuírem uma restrita gama de hospedeiros (Dwyer

& Granados, 1988; Funk & Consigli 1992; Winstanley & Crook 1993). Por sua vez, os

NPV são encontrados em mais de 700 espécies hospedeiras documentadas para esse

tipo de vírus (Moscardi, 1999; Herniou & Jehle, 2007) e diferentes linhagens de células

de inseto em cultura susceptíveis foram descritas (Miller, 1997).

Baseando-se em estudos filogenéticos de baculovírus, utilizando o gene da

poliedrina, os NPV foram classificados em grupo I e grupo II (Zanotto et al., 1993;

Herniou et al., 2003).

A maioria dos baculovírus tem sido isolada a partir de lepidópteros, com

centenas de espécies confirmadas como hospedeiras. Além de lepidópteros, os

baculovírus também infectam himenópteros e dípteros (Theilmann et al., 2005).

Análise dos genomas de 29 baculovírus demandou uma revisão na

(29)

29 proposta, existem quatro gêneros: Alphabaculovírus, NPV Lepidópteros específicos;

Betabaculovírus, GV Lepidópteros específicos; Gammabaculovírus, NPV himenópteros

específicos; e NPV Deltabaculovírus, dípteros específicos (Cartens & Ball, 2009).

B.

Modo de infecção

in vivo

A principal rota natural de infecção por baculovírus é pela ingestão de

alimento contaminado com o vírus na forma ocluída, o OB (poliedro ou grânulo,

dependendo do gênero). Os ODV, presentes na matriz cristalina dos OB, estão

protegidos da degradação ambiental e são liberados do OB após a dissolução dos

mesmos no ambiente altamente alcalino (pH 9,5 a 11,5) do intestino médio da larva do

inseto, dando início à infecção das células colunares epiteliais do intestino médio pela

fusão dos nucleocapsídeos virais com a membrana das microvilosidades (Horton &

Burand, 1993). A partir da progênie viral da infecção primária, é estabelecida a infecção

secundária, ou seja, outros tecidos são infectados (Hom & Volkman, 2000). Dentro da

célula, o vírus perde seu capsídeo e o DNA viral é liberado no núcleo ou então o próprio

nucleocapsídeo entra no núcleo e perde a sua capa protéica. Após a entrada no núcleo, o

DNA viral é replicado e novos nucleocapsídeos são produzidos. Estes são então

transportados para a região basolateral das células colunares do intestino médio e

eventualmente são liberados para infectar células do sistema traqueal. Estas células

atravessam a lâmina basal e servem de vias para o deslocamento do vírus tanto para

células epidermais da traquéia quanto para a hemolinfa (Hom & Volkman, 2000). Os

vírus podem também passar direto pelas células intestinais via membrana basal do

(30)

30 Após oito horas da infecção, o núcleo torna-se hipertrofiado, o nucléolo

aumenta de tamanho e forma-se um estroma virogênico no seu centro. A montagem e

maturação dos nucleocapsídeos ocorrem, ainda, no núcleo, perifericamente ao estroma

virogênico (Williams & Faulkner, 1997) e, logo após, os nucleocapsídeos brotam da

membrana nuclear para o citoplasma (Federici, 1997). As células epiteliais infectadas

produzem um segundo fenótipo, os BV, que brotam através das células da membrana

basal que contém a glicoproteína GP64 ou LD130, dependendo do vírus, permitindo a

entrada dos mesmos nas células-alvo, promovendo a fusão do envelope com as

membranas vesiculares endocíticas (Engelhard et al., 1994; Volkman, 2007) (Figura 2).

A infecção em insetos da ordem Lepidoptera geralmente se espalha rapidamente para

outros tecidos e o inseto morre em poucos dias. Na maioria das vezes, após a morte da

larva do inseto infectada pelo vírus, o seu tegumento se desintegra, liberando os OB no

meio ambiente. A quantidade de OB presente em uma larva em seu último estágio de

desenvolvimento antes de se tornar adulta é de até 1010 OB nos NPV e 1011 OB nos

GV (Payne, 1986).

As lagartas são mais susceptíveis à infecção viral durante os primeiros estágios

larvais. Os sintomas mais comuns da infecção por NPV incluem perda de apetite,

clareamento da epiderme devido ao acúmulo de vírus nos núcleos das células

epidermais e adiposas, parada no desenvolvimento larval e diminuição de movimentos

(31)

31

.

Figura 2: Esquema da infecção de uma larva de um inseto da ordem Lepidoptera por baculovírus: Em (1) o inseto ingere o poliedro (OB), que eventualmente havia sido liberado no meio ambiente, por um outro inseto morto por infecção causada por baculovírus. O poliedro é, então, dissolvido no intestino médio (2), pela ação do pH alcalino, liberando as

partículas virais. Com a ruptura da membrana peritrófica, o vírus pode então infectar células colunares (caracterizando a infecção primária) inicialmente, e, em seguida, partindo para a

infecção de outros tipos celulares, como traqueócitos e hemócitos, (caracterizando a infecção secundária) (3). A infecção se espalha, causando a morte da larva (4) e esta se torna um

(32)

32

C.

Regulação da expressão gênica

A expressão gênica dos baculovírus pode ser dividida em duas fases distintas:

fase precoce (“early”) e fase tardia (“late”). Podem existir ainda subdivisões

representadas pelas fases: a) imediata precoce (“immediately early”), correspondendo a

genes expressos logo nas primeiras horas de infecção; e b) muito tardia (“very late”),

representando os genes expressos a partir de 18 horas de infecção, sendo que nessa fase,

a proteína viral mais produzida nos NPV é a poliedrina (Maruniak, 1986). A fase

precoce ocorre antes da replicação do DNA viral, como no caso do Autographa

californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), onde esses genes são

dependentes da RNA polimerase II do hospedeiro para serem expressos e estão

envolvidos no processo de replicação viral que ocorre posteriormente. A fase tardia

ocorre após a replicação do DNA viral quando há o “desligamento” da expressão gênica

da célula hospedeira e a produção de BV (Ribeiro et al., 1998). Os genes tardios estão

envolvidos na montagem do vírus e os genes muito tardios no processo de oclusão

(Jarvis et al., 1997; Thiem et al., 1996; Lu & Miller, 1997).

Os genes expressos durante a fase precoce, a partir de 30 minutos após a

infecção (p.i.) e até aproximadamente 8 horas após a infecção (h p.i.), correspondem a

fatores de transcrição, principalmente, mas também podem ser proteínas pertencentes à

maquinaria de replicação do DNA viral. Esses genes são prontamente reconhecidos pelo

complexo de transcrição celular, sendo, por esse motivo, transcritos rapidamente

(Passarelli & Miller, 1993; Xu et al., 1995; Todd et al., 1996; Guarino et al., 1998;

Gross & Shuman, 1998). Os genes produzidos durante essa fase são necessários para as

(33)

33 Os genes expressos durante a fase tardia, entre 6 e 18 h p.i., correspondem ao

início da replicação viral. Essa fase coincide com a produção de BV, que são produzidos

pelo empacotamento de novos DNA virais sintetizados em nucleocapsídeos que deixam

o núcleo e brotam através da membrana plasmática celular (Lu & Miller, 1997).

Os genes expressos durante a fase muito tardia, iniciando a 18 h p.i.,

coincidem com a produção dos OB, que são produzidos depois que o nucleocapsídeo

torna-se envelopado dentro do núcleo, resultando em vírions que são embebidos em

uma matriz protéica cristalina, formando corpos nucleares conhecidos como poliedros

ou grânulos, dependendo de sua aparência morfológica (Lu & Miller, 1997).

D.

Baculovírus como vetor de expressão: AcMNPV

O conhecimento sobre o genoma dos baculovírus permitiu um estudo mais

detalhado de seus genes e promotores. Os primeiros relatos do uso de baculovírus como

vetor de expressão foram publicados por Smith et al. (1983 b) e Pennock et al. (1984),

que usaram o AcMNPV para produzir β-interferon e β-galactosidase, respectivamente, em células de S. frugiperda. As vantagens para utilização de baculovírus como vetores

de expressão segundo O’ Reilly et al., 1992; Jarvis, 1997; e Ribeiro et al., 1998, Castro

et al., 1999; Kost et al., 2005 são as seguintes:

1. Potencial para expressão de proteínas heterólogas em altos

níveis (varia de 10 a 100 mg de proteína por 109 células de inseto, mas há

casos de 600 mg/109 células);

2. Facilidade de purificação da proteína heteróloga;

3. Existência de promotores fortemente ativos durante a fase

(34)

34 4. Diferentes fases na regulação gênica do ciclo viral,

oferecendo oportunidade de expressão de genes heterólogos sob diferentes

condições celulares;

5. Capacidade para clonagem de grandes inserções;

6. Eficiência na expressão de genes contínuos (sem íntrons) e

cDNA;

7. Simplicidade de manipulação;

8. Ambiente eucariótico para expressão de proteínas

complexas de eucariotos. Principalmente, quando as proteínas necessitam de

modificações pós-traducionais exclusivas de sistemas eucariotos para serem

ativas como N-glicosilação; O-glicosilação; clivagem proteolíticas etc.; e

9. Alta especificidade dos baculovírus, que os torna um

sistema seguro de ser utilizado.

O sistema de expressão baculoviral também possui algumas limitações, entre

elas encontramos o fato de que células de inseto são incapazes de produzir complexos

N-glicosilados com resíduos de galactose, no penúltimo, e ácido siálico no último

resíduo de sua cadeia. Isso ocorre porque células de insetos e células de mamíferos

possuem caminhos para a modificação pós-traducional de N-glicosilação diferentes.

Ensaios enzimáticos demonstram que células de inseto possuem pouca ou nenhuma

atividade de galactosiltransferase ou sialiltransferase envolvidas no processo de

N-glicosilação, dificultando a adição desses resíduos no final da cadeia proteica.

Modificações de N-glicosilação, principalmente resíduos terminais de ácido siálico,

contribuem para diferentes funções biológicas da glicoproteína. Para algumas aplicações

(35)

35 recombinantes, a falta dos resíduos de ácido siálico é inaceitável (Jarvis et al., 2001;

Kost et al., 2005).

Outra modificação pós-traducional que não é tão eficiente em células de inseto

quanto em células de mamíferos é a sumolização, adição de moléculas da proteína

Sumo (semelhante a ubiquitina) na proteína recém traduzida. Para suprir essa limitação,

Langereis (2007) introduziu, em linhagens celulares de insetos, componentes da

sumolização de mamíferos por co-infecção com baculovírus recombinantes. Os

recombinantes expressavam individualmente cada componente deste processo. A

expressão dessas proteínas foi necessária e suficiente para ativar a sumolização de

proteínas testes.

O sistema de expressão de proteínas heterólogas usando baculovírus baseia-se

na introdução de genes exógenos no genoma viral no lugar de um gene não-essencial

para replicação, sob o comando de um promotor forte (por exemplo, o promotor do gene

da poliedrina, polh). A inativação desse gene por deleção ou inserção de uma seqüência

de DNA produz um vírus que é capaz de se replicar em células de inseto, mas não

produz poliedrina e, como consequência, não ocorre a formação da forma oclusa do

vírus (OB). As células infectadas pelo vírus, que não produz OB, são de fácil

localização através da observação ao microscópio óptico, pela ausência de OB

intracelulares característicos dos vírus normais. A expressão do gene polh é conduzida a

partir de um promotor forte, pois, por volta de 72 h p.i., a poliedrina compõe cerca de

20-50% da proteína produzida pela célula infectada. Dessa forma, o modelo mais

simples de vetores para o sistema de expressão em baculovírus foi a troca do gene da

poliedrina por um gene heterólogo de interesse sob o controle do promotor do gene polh

(36)

36 A tecnologia para construção de vetores de baculovírus é feita com base em

plasmídeos de transferência. Estes são unidades replicativas que contêm regiões

flanqueadoras do gene que se pretende substituir no genoma viral, incluindo ou não a

seqüência codificante, seu promotor e um sítio de clonagem (Miller et al., 1986). Após

a construção do plasmídeo, é feita a co-transfecção da célula do inseto, utilizando-se o

DNA do vírus parental e o DNA do plasmídeo. Durante a infecção viral, por

recombinação homóloga, o gene original no vírus é substituído pelo gene de interesse

contido no plasmídeo. O vírus recombinante formado é, então, selecionado por

plaqueamento em células infectadas (Castro et al., 1999).

Inicialmente, os vírus recombinantes eram construídos com deleção do gene da

poliedrina, permitindo sua seleção através de placas ocluso-negativas. Para facilitar a

identificação, outros vírus, contendo genes marcadores como o lac-Z (β-galactosidase),

foram desenvolvidos (Summers & Smith, 1987; O’Reilly & Miller, 1990). Dessa forma,

a seleção de um clone recombinante é facilitada em presença do substrato sintético

(X-Gal). Neste caso, células infectadas com o vírus parental apresentam coloração azul,

enquanto as infectadas com o vírus que recebeu o inserto (gene da β-galactosidase

interrompido) apresentam coloração branca (O’Reilly et al.,1992).

Existem vários métodos para facilitar e aumentar a velocidade de construção

de um baculovírus recombinante e estes diferem apenas na localização onde o gene de

interesse será incorporado dentro do genoma do baculovírus. O primeiro método

acontece quando um vetor de transferência, contendo o gene clonado, é introduzido

juntamente com o DNA viral dentro de células de inseto, onde eventos de recombinação

ocorrerão. O uso do DNA circular do tipo selvagem para este processo foi amplamente

substituído pelo uso de formas lineares do genoma viral, não infeccioso. Este processo é

(37)

37 o gene de interesse é posicionado sob o comando de um promotor forte do baculovírus,

e o uso de um DNA viral linear com o mínimo de possibilidade de re-circularização

para que eventos não desejados de recombinação ocorram, diminuindo a infectividade e

aumentando a proporção de baculovírus recombinantes (Kitts et al., 1990; Airenne et

al., 2003). Outro método é a recombinação em células de Escherichia coli, DH10BacTM

(Invitrogen) a qual utiliza sítios de transposição Tn7 para inserir genes no locus do gene

polh e no meio do gene lac-Z, que codifica a enzima β-galactosidade (Lac-Z) no DNA viral na forma de um plasmídeo (bacmídeo) propagado em células de E. coli. Desse

modo, o vetor recombinante (onde ocorreu transposição do gene de interesse) gerará

apenas colônias brancas, devido à interrupção da sequência codificadora da β -galactosidase, diferentemente do vetor íntegro que produzirá β-galactosidase e colônias bacterianas azuis (Luckow et al., 1993). Esse método consiste de um vetor de

transferência (por exemplo, o pFastBacTM1) que contém o gene de interesse sob o

comando de um promotor específico do baculovírus e, quando propagadas em células

de E. coli, DH10BacTM, ocorre a transposição do cassete de expressão do gene

heterólogo para o bacmídeo dentro da célula hospedeira.

E.

Anticarsia gemmatalis

multiple

nucleopolyhedrovirus

(AgMNPV)

O baculovírus mais estudado até hoje é o Autographa californica multiple

nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), sendo considerado espécie-tipo do gênero

Alphabaculovírus (Theilmann et al., 2005). Também foi o primeiro baculovírus a ser

sequenciado (Ayres et al., 1994). No Brasil, o baculovírus mais utilizado como

(38)

38 para o controle de uma praga. A utilização do AgMNPV para o controle da lagarta da

soja, A. gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), foi desenvolvido a partir do

final da década de 70 e início da década de 80 pela Embrapa Soja em Londrina/PR

(Figura 3). Parâmetros de controle biológico, bem como método de produção massal,

controle de qualidade, epizootiologia e tecnologia de aplicação foram estabelecidos por

Moscardi (1983, 1989). Ao lado das vantagens ecológicas no uso do vírus, existe

também uma vantagem econômica de aproximadamente 70% quando comparado ao uso

de pesticidas químicos. Esse fato indica que milhões de litros de inseticida químico não

estão sendo aplicados anualmente e consequentemente há uma economia de milhões de

dólares e menor contaminação do meio ambiente com resíduos químicos (Ribeiro et al.,

1998). A mortalidade das larvas tem sido acima de 80% e o desfolhamento da soja

tem-se mantido abaixo do limiar de dano econômico, quando o biointem-seticida é aplicado nas

condições recomendadas (Moscardi, 1983, 1989; Moscardi & Correa-Ferreira, 1985;

Moscardi & Sosa-Gómez, 1996). Esses resultados levaram ao desenvolvimento de uma

formulação do bioinseticida, permitindo sua industrialização e comercialização

(39)

39

Figura 3: Fotos de uma larva de Anticarsia gemmatalis saudável (A) e infectada pelo baculovírus AgMNPV (B). Adaptado de www.viarural.com.ar/viarural.com.ar/insumosagropecuarios/agricolas/ agroquimicos/cheminova/especies/anticarsia-gemmatalis-05.htm (A) e de www.embrapa.gov.br/ (B).

O genoma do AgMNPV foi sequenciado (Oliveira et al., 2006) e contém

132.242 pares de bases (pb) e a sua análise inicial revelou que o AgMNPV pertence aos

NPV do grupo I, possuindo uma maior identidade de sequência e organização genômica

com os vírus Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus (CfDefMNPV),

Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) e Choristoneura

fumiferana multiple nucleopolyhedrovirus (CfMNPV), conforme árvore filogenética

construída por Dalmolin et al. (2005). O AgMNPV se replica em células de

Trichoplusia ni (TN368), S. frugiperda (IPLB-Sf21-AE), A. gemmatalis (UFL-AG-286)

(Hink, 1970; Vaugh et al., 1977; Sieburth & Maruniak, 1988; Castro et al., 2006) e

(40)

40

F.

Baculovírus recombinante para controle biológico

A utilização de baculovírus como agente de controle biológico nas lavouras,

atualmente, é dificultada por alguns fatores que interferem no seu uso no campo, como a

inativação do vírus pela radiação solar, a folha onde o mesmo é depositado, o momento

da aplicação, a temperatura, a qualidade e quantidade de inóculo e a baixa velocidade do

baculovírus selvagem para matar seu hospedeiro (Moscardi, 1998; Fuxa, 1991). Uma

das soluções encontradas para o último fator é a construção e utilização de baculovírus

capazes de aumentar a virulência e consequentemente diminuir o tempo de vida dos

insetos infectados.

Avanços na engenharia genética tem tornado possível manipular

geneticamente baculovírus selvagens para realçar suas propriedades como agentes de

controle de pragas (Booth et al., 1992; Van Beek & Hughes, 1998; Ashour et al., 2007).

Genes codificando neurotoxinas, enzimas e hormônios peptídicos de insetos

têm sido introduzidos nos genomas de baculovírus para produzir baculovírus

recombinantes com o aumento da velocidade de morte, reduzindo os prejuízos causados

pelos insetos-pragas. Alguns dos mais efetivos baculovírus recombinantes expressam

neurotoxinas específicas para inseto (Smith et al., 2000; Treacy et al., 2000; Van Beek

& Hughes, 1998). Em hospedeiros susceptíveis, estas neurotoxinas, expressas pelos

vírus, reduzem os danos à lavoura e o tempo necessário para matar 50% dos insetos em

bioensaios (TL50) estimados para 25-50% quando comparado às larvas infectadas com o

vírus selvagem (Cory et al., 1994; McCutchen et al., 1991; Stewart et al., 1991;

(41)

41 Em 1988, o primeiro gene de toxina inseto-específica foi inserida no genoma

do baculovírus AcMNPV sob o comando do promotor da poliedrina (polh). O gene

inserido codifica a toxina-1 do escorpião Buthus eupeus (Belt). No entanto, essa toxina

não aumentou a eficiência do baculovírus recombinante (Carbonell et al., 1988).

Genes da toxina Cry da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) foram inseridosem

baculovírus (Merryweather et al., 1990, Pang et al., 1992; Ribeiro & Crook, 1993;

Ribeiro et al., 1998; Martens et al., 1995; Chang et al., 2003; Aguiar et al., 2006;

Martins et al., 2008). Todas as proteínas Cry foram expressas em grande quantidade e

mostraram atividade biológica similar às proteínas nativas. Entretanto, apenas quando a

proteína Cry foi expressa na forma fusionada com a proteína poliedrina do baculovírus

AcMNPV (Chang et al, 2003), o vírus recombinante apresentou uma maior virulência

em relação à dose necessária para matar 50% dos insetos em bioensaios (CL50) para

Plutella xylostella quando comparado ao vírus selvagem.

Um dos primeiros baculovírus recombinantes eficaz, construído com a

intenção de controle biológico, continha o gene do hormônio diurético que, quando

injetado em larvas de Bombyx mori, foi capaz de matar os insetos 20% mais rápido que

o vírus selvagem (Maeda, 1989).

Hammock et al., 1990, inseriram o gene da esterase do hormônio juvenil

(JHE) de Heliothis virescens no genoma do AcMNPV, mostrando uma pequena

melhora na virulência somente para larvas neonatas de T. ni. Entretanto, quando versões

mutadas do gene JHE, que aumentam a estabilidade da proteína, foram introduzidas no

genoma do AcMNPV, ocorreu um aumento na virulência contra larvas de diferentes

estágios de desenvolvimento de H. virescens (Bonning et al., 1999).

O gene da toxina derivada do ácaro Pyemotes tritici, TxP-1, foi também

(42)

42 & Miller, 1991, 1992; Lu & Miller, 1997). A ação dessa toxina é paralisante, causando

contração muscular. Resultados semelhantes foram encontrados com a toxina AaIT do

escorpião Androctonus australis. Sua ação ocorre nos canais de sódio dos neurônios,

causando um efeito excitatório pré-sináptico. Larvas infectadas com esses baculovírus

recombinantes exibem um aumento da irritabilidade e cessam sua alimentação.

Outras toxinas como Lqh&IT2 de escorpiões (Froy et al., 2000; Imai et al.,

2000), aranhas (Prikhod’ko et al., 1998), anêmonas do mar (Prikhod’ko et al., 1998) e

ácaros (Tomalski & Miller, 1991; Hughes et al., 1997; Burden et al., 2000) foram

também expressas usando baculovírus, mostrando, também, redução no tempo letal dos

vírus recombinantes.

Alguns baculovírus produzem uma proteína, Ecdisteroide UDP-Glicosil

Transferase (EGT), que inativa o hormônio da muda do inseto (O’Reilly & Miller,

1989; Rodrigues et al., 2001). A deleção ou inativação desse gene resulta em redução

do tempo letal (O’Reilly & Miller, 1989; Pinedo et al., 2003). Esse exemplo demonstra

a utilidade de deleção de um gene para acelerar a mortalidade inseto (O’Reilly, 1995;

Bonning & Hammock, 1996).

Baculovírus recombinantes que expressam proteases que degradam a

membrana basal dos tecidos dos insetos também foram desenvolvidos. Um AcMNPV

recombinante foi construído com a introdução do gene da catepsina L de Sarcophaga

peregrina, reduzindo o tempo de sobrevivência e o dano causado pelas larvas infectadas

quando comparado com o vírus selvagem (Harrison & Bonning, 2001; Li et al., 2008).

Outro gene com potencial inseticida é o gene da quitinase. Um AcMNPV

contendo o gene da quitinase de Manduca sexta, sob o comando do promotor do gene

(43)

43 de larvas de S. frugiperda, quando comparado ao vírus selvagem (Gopalakrishnan et al.,

1995).

G.

Proteases

As proteases são enzimas proteolíticas que catalisam a clivagem de ligações

peptídicas em outras proteínas. As proteases são enzimas degradativas capazes de

catalisar a hidrólise total de proteínas. Essa hidrólise requer sítios ativos dessas

proteases, com aminoácidos específicos no sítio ativo, sendo eles serina, cisteína,

aspartato e histidina. Essas enzimas ocupam uma posição importante pelas suas

aplicações tanto na fisiologia quanto na área comercial. São encontradas em vegetais,

animais e microrganismos (Rao et al., 1998).

As proteases possuem funções metabólicas funcionais e regulatórias em

processos fisiológicos e patológicos, tais como: catabolismo de proteínas, coagulação

sanguínea, migração celular, crescimento celular, arranjo de tecidos, morfogênese,

inflamação, crescimento de tumores e metástases, ativação de precursores, liberação de

hormônios, liberação de peptídeos farmacologicamente ativos, digestão, regulação do

metabolismo, nutrição, ciclo de replicação viral e regulação da expressão gênica

(Santos, 1996; Rao et al., 1998; Bressolier et al., 1999; Rawlings et al., 2002).

I. Classificação

Existem diversos critérios para classificar as proteases. Os principais estão

baseados no pH de atividade, na posição do sítio de clivagem e no tipo de substrato

(44)

44 Quanto à faixa de pH nas quais as proteases possuem maior atividade, estas

enzimas podem ser classificadas em proteases ácidas, básicas e neutras. As proteases

ácidas são representadas, principalmente, pelas aspartato-proteases e possuem atividade

na faixa de pH 2.0-6.0. As proteases neutras possuem atividade em pH neutro, na faixa

de 6.0-8.0, e incluem cisteíno-proteases, metalo-proteases e algumas serino-proteases.

Já as proteases alcalinas possuem maior atividade na faixa de pH 8.0-13.0 e são

representadas principalmente pelas serino-proteases (Santos, 1996; Rao et al., 1998).

Quanto ao sítio de clivagem, as proteases são classificadas em exopeptidases e

endopeptidases. As exopeptidases clivam as ligações peptídicas a partir das

extremidades amino ou carboxiterminais do substrato, sendo subdivididas em

aminopeptidases e carboxipeptidases. As carboxipeptidases clivam as ligações

peptídicas a partir da extremidade carboxiterminal, liberando um único resíduo de

aminoácido ou um dipeptídeo. Já as endopeptidases reconhecem uma sequência ou

grupo de aminoácidos de caráter específico e clivam ligações peptídicas internamente

na cadeia polipeptídica, liberando oligopeptídeos, e são subdivididas em

serino-proteases, serino-alcalino serino-proteases, subtilisinas, aspartato-serino-proteases,

cisteina/tiol-proteases e metalo-cisteina/tiol-proteases (Rao et al., 1998).

Quanto ao tipo de substrato, as proteases são denominadas em relação a sua

atividade como, por exemplo: colagenase, elastase e queratinase, que hidrolisam o

colágeno, elastina e queratina, respectivamente (Rao et al., 1998).

Uma classificação mais abrangente em relação às proteases é encontrada pelo

sistema de database MEROPS, onde as mesmas são classificadas em famílias e clãs

(45)

45

II. Queratinase

A queratinase é uma serino-protease, que pertence à família que utiliza

unicamente um resíduo ativo de serina para catalisar a hidrólise das ligações peptídicas

(Rawlings et al., 2002; Rao et al., 1998).

As serino-proteases representam 0,6% de todas as proteínas do genoma

humano e estão envolvidas em muitas funções vitais como a digestão, coagulação

sangüínea, fibrinólise, fertilização, ativação do sistema complemento e se relacionam

com muitas doenças como câncer, artrite e enfisema (Yousef et al., 2003).

As serino-proteases também desempenham papel importante em muitos

processos biológicos como desenvolvimento (Nakajima et al., 1997) e imunidade

(Gorman et al., 2000 a, b; Munier et al., 2004). Nos insetos, as serino-proteases são

importantes na coagulação da hemolinfa, síntese de peptídeos antimicrobianos e síntese

de melanina (Gorman & Paskewitz, 2001).

Serino-proteases pertencem ao principal grupo de enzimas do intestino de

insetos, envolvidas na digestão de proteínas da dieta (Lehane et al., 1998; Gorman &

Paskewitz, 1999; Gorman et al., 2000 a; Yan et al., 2001). As enzimas digestivas do

intestino médio são secretadas em resposta ao aumento da quantidade de proteína no

intestino e à mudança nos seus níveis no lúmen. Muitos genes de serino-proteases têm

sido identificados no intestino médio de insetos (Lehane et al., 1998; Yan et al., 2001;

Nakazawa et al., 2004). Uma serino-protease de B. mori mostrou atividade antiviral

contra BmNPV no início da infecção viral (Nakazawa et al., 2004).

A queratinase do fungo Aspergillus fumigatus foi isolada por Santos (1996),

purificada e caracterizada com uma massa molecular de 31 kDa, com características de

serino-protease, codificada por um gene de 1.200 pares de bases, com poder

(46)

46 patógeno oportunista das vias aéreas, afetando humanos, pássaros e outros animais. É

responsável por uma variedade de doenças respiratórias e muitas infecções invasivas. É

um fungo caracterizado por produzir muitas enzimas proteolíticas, como elastases

(Frosco et al., 1992; Markaryan et al., 1994; Moser et al., 1994), serino-proteases

fibrinogenolíticas (Larcher et al., 1992) e colagenases (Monod et al., 1993), que estão

envolvidas em muitos eventos-chaves na fisiopatologia de A. fumigatus (Santos et al.,

1996).

A produção de elastases em A. fumigatus e a correlação das mesmas com a

invasibilidade e aumento da patogenicidade foi descrita em diversos experimentos em

camundongos (Blanco et al., 2002; Kolattukudy et al., 1993; Kothary et al., 1984).

III. Catepsina-L

Catepsina-L é uma protease lisossomal com pH ácido em torno de 5.0, sendo

encontrada em vários tipos de células. Ela é sintetizada como uma pro-enzima no

complexo de Golgi e transportada para os lisossomos, onde acumula como uma enzima

madura (VonFigura et al., 1986; Kornfeld, 1987; Kornfeld et al., 1989; Brown et al.,

1984). A catepsina-L tem em torno de 35 kDa de massa molecular e sua pro-enzima,

pro-catepsina L, em torno de 50 kDa. A catepsina-L é uma cisteíno-protease pertencente

à família da papaína (Homma et al., 1994).

Kageyama e Takahashi (1990) purificaram e caracterizaram uma

cisteíno-protease de B. mori. A pro-enzima tem em torno de 47 kDa e sua forma madura em

torno de 39 kDa. Essa protease mostrou ter uma alta similaridade com a catepsina-L de

mamíferos (Takahashi et al., 1993). Mais tarde, essa protease foi identificada como a

enzima catepsina-L (Yarygin et al., 2003). Essa protease foi também identificada na

(47)

47 células embrionárias e discos imaginais (Harrison & Bonning, 2001). A secreção e

atividade dessa enzima está correlacionada com a inversão in vitro dos discos imaginais

durante o desenvolvimento em estruturas primordiais adultas das pernas e a degradação

de duas proteínas com peso molecular de 200 e 210 kDa (Homma & Natori, 1996).

Essas proteínas estão localizadas na superfície dos discos imaginais e podem ser

componentes da membrana basal (Harrison & Bonning, 2001).

A catepsina-L é uma poderosa cisteíno-protease, envolvida no processo de

degradação protéica intracelular e extracelular. Como outras proteases, ela é sintetizada

como uma pré-pro-enzima e subsequentemente processada para sua forma ativa madura

(Ishido & Kominami, 1998). A pro-catepsina L pode ser processada para a forma

madura da catepsina L e estocada nos lisossomos ou secretada para o meio de cultura

(Homma et al., 1994; Ishido & Kominami, 1998).

IV. Quitinase

A enzima quitinase catalisa a hidrólise de β-1, 4-N-acetyl-D-glucosamina em

polímeros de quitina. Essa enzima tem sido detectada em muitos organismos, tendo uma

função importante em cada um, como a degradação do exoesqueleto em insetos e

crustáceos, crescimento e divisão celular em fungos, degradação da quitina como

nutriente para bactérias e defesa em plantas (Kramer & Muthukrishnan, 1997;

Merzendorfer & Zimoch, 2003).

Alguns micróbios entomopatogênicos produzem quitinases para penetração no

corpo hospedeiro (Kramer & Muthukrishnan, 1997; Gooday, 1999). Por outro lado,

baculovírus produzem quitinases para liquefazer o corpo do hospedeiro depois da

(48)

48 Quitinases de lepidópteros têm sido purificadas, como de M. sexta e B. mori, e

suas propriedades bioquímicas bem caracterizadas (Kramer & Muthukrishnan, 1997;

Merzendorfer & Zimoch, 2003). Esses genes que codificam essas enzimas foram

clonados e isolados em vários lepidópteros (Kramer et al., 1993; Kim et al., 1998;

Mikitani et al., 2000; Shinoda et al., 2001; Zheng et al., 2002). Um estudo

imunohistoquímico da quitinase de C. fumiferana (Zheng et al., 2003), um ortólogo da

quitinase de M. sexta e de B. mori, revelou que essas quitinases participam da

degradação da quitina durante o processo de muda dos insetos (Kramer &

Muthukrishnan, 1997; Merzendorfer & Zimoch, 2003).

O fungo Metarhizium anisopliae é um patógeno de inseto bem conhecido e

estudado, usado como controle biológico de muitas pragas na China, Rússia e Brasil

(Gillespie et al., 1988). M. anisopliae produz distintas serino-proteases extracelulares,

como as proteases subtilisinas, tripsinas, metaloproteases, bem como muitas

exo-peptidases, que provavelmente são importantes na degradação da cutícula do hospedeiro

(St. Leger et al., 1995 b, 1996 a). A quitinase do fungo M. anisopliae parece ser

derivada de várias enzimas que dissolvem a cutícula, como hidrolases, quitinases e

proteases. No caso de M. anisopliae, é proposto que a penetração do fungo no inseto é

facilitada pela liberação de proteases durante os passos de invasão, sugerindo que a

quitinase é um dos fatores principais na penetração da cutícula comparado com

proteases (St. Leger et al. 1991). Como as proteases, as quitinases parecem ser

determinantes patogênicos (Charnley et al., 1991). As quitinases são produzidas por

estruturas de infecção na superfície da cutícula em níveis baixos durante o processo de

penetração em M. sexta; níveis altos de quitinases acumulam no ponto da degradação

proteolítica, sugerindo que a liberação da quitinase é dependente da acessibilidade do

(49)

49 Após o sequenciamento do genoma do AcMNPV, foi possível avaliar a

composição gênica desse baculovírus. Um dos genes identificados em seu genoma é o

que codifica uma quitinase (Hawtin et al., 1995). O AcMNPV causa liquefação nas

larvas infectadas pela expressão do gene de uma quitinase (Ayres et al., 1994; Hawtin et

al., 1995) e do gene (vcath) de uma catepsina (Rawlings et al., 1992; Slack et al., 1995).

Estudos de mutantes de BmNPV e AcMNPV, incapazes de produzir V-CATH, também

não causam a liquefação terminal do inseto hospedeiro (Ohkawa et al., 1994; Slack et

al., 1995; Daimon et al., 2006). Vírus recombinantes sem um dos genes são incapazes

de liquefazerem os insetos, visto que a co-infecção com os dois recombinantes restaurou

o processo (Hawtin et al., 1997; Thomas et al., 1998, 2000). A desintegração do inseto

infectado pelo AcMNPV é vantajosa, pois permite uma disseminação máxima de

poliedros no ambiente (Saville et al., 2004). No genoma do AcMNPV, a quitinase está

localizada entre os genes lef-7 e vcath (Rawlings et al., 1992; Ayres et al., 1994; Hawtin

et al., 1995). A enzima tem seu nível de expressão máxima com atividade de

endoquitinase e exoquitinase a 12 h p.i (Hawtin et al., 1995; Thomas et al., 1998).

Saville et al. (2002) mostraram que a deleção do possível sinal de localização

no retículo endoplasmático (KDEL) da quitinase do AcMNPV e a expressão do gene

modificado sob o comando do promotor da poliedrina resultou no acúmulo da quitinase

no meio de cultura das células infectadas. Larvas de T. ni infectadas com o vírus

modificado possuem um tempo de liquefação menor comparado com o vírus controle,

Imagem

Figura 1:  Ultraestrutura de um baculovírus.  (A) Microscopia eletrônica de transmissão mostrando  uma partícula viral extracelular (budded virus – BV) entrando em uma célula por endocitose
Figura 2: Esquema da infecção de uma larva de um inseto da ordem Lepidoptera por baculovírus: Em (1) o inseto ingere o poliedro (OB), que eventualmente havia sido liberado  no meio ambiente, por um outro inseto morto por infecção causada por baculovírus
Figura 3: Fotos de uma larva de Anticarsia gemmatalis saudável (A) e infectada pelo baculovírus  AgMNPV  (B)
Figura 4: Foto de uma larva de Spodoptera frugiperda.
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Referências

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