PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ANÁLISE PRELIMINAR DO TRANSCRIPTOMA DE CÉLULAS
DENDRÍTICAS HUMANAS APÓS INFECÇÃO POR Trypanosoma
cruzi
NATALIA GIL JARAMILLO
ii PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ANÁLISE PRELIMINAR DO TRANSCRIPTOMA DE CÉLULAS
DENDRÍTICAS HUMANAS APÓS INFECÇÃO POR Trypanosoma
cruzi
NATALIA GIL JARAMILLO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Medicina-UnB como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Jaime Martins de Santana
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Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Interação Patógeno-Hospedeiro (LIPH) do Departamento de Biologia Celular da UnB.
Apoio financeiro:
Curso de mestrado realizado com bolsa da Capes
Projeto PRONEX “Interface entre biotecnologia, genômica funcional e garimpagem molecular de drogas para tratamento de leishmaniose e doença de Chagas” financiado por CNPq e FAPDF.
iv Dedico este trabalho a Margarita Jaramillo, meu eterno exemplo a seguir.
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AGRADECIMENTOS
Eu agradeço…À minha mãe, que sempre me deu forças para continuar. Seu amor e compreensão sempre recarregaram minhas baterias, e seu exemplo sempre tem sido uma inspiração para mim.
À minha irmã, que sempre teve uma história engraçada para colocar um sorriso no meu rosto. Sua cumplicidade foi fundamental no processo.
Aos meus amigos de Medellín: Julian, Sebastián, Jorge, Sara e Alejandro, a companhia apesar da distância. Obrigada por escutar minhas histórias e me encher de conselhos bons, suportando às vezes (espero que não sempre) certo nível de monotonia nas minhas conversas. Sempre terei vocês no meu coração.
Aos amigos maravilhosos que fiz no Brasil, especialmente a Luz e Grazi, que com a sua alegria e companhia aliviaram o peso de certos dias complicados. Aproveito também para agradecer a família da Grazi: dona Graciete, Diego Henrique, Lorena, Diego e Anna Laura, a acolhida no seu lar como mais uma de vocês. Prometo não esquecer nunca minha família brasileira.
Às minhas amigas e colegas de laboratório: Milene, Camila, Clênia, Yanna e Paula, os conselhos, apoio e companhia que me foram dados. Não posso esquecer a Raquel, de quem aprendi muito e por quem sinto muita admiração.
Aos meus professores de ciência e de vida: Izabela, Carla, Cecília, David, meu orientador Jaime, e, especialmente, Flávia, quem me ajudou infinitamente não só no âmbito acadêmico, mas também no meu processo de amadurecimento pessoal. Assim como às professoras Claudia e Gloria pela formação inicial.
vi LISTA DE ABREVIATURAS
APCs: Células apresentadoras de antígenos CCL2: Ligante de quimiocina 2
CCR5: Receptor de quimiocina 5 CCR7: Receptor de quimiocina 7 cDNA: DNA complementar
CMSP: Células mononucleares de sangue periférico CTLA-4: Antígeno 4 do linfócito T citotóxico
DAPI: 4’,6-Diamidino-2-phenylindole DCs: Células dendríticas
DNA: Ácido desoxirribonucleico DTU: Discrete typing units EST: Expressed sequence tag
FACS: Separação de células ativada por fluorescência Fc: Fração constante dos anticorpos
GM-CSF: Fator estimular de colônias de macrófagos e granulócitos gp35/50: Glicoproteína de superfície 35/50 do Trypanosoma cruzi gp82: Glicoproteína de superfície 82 do T. cruzi
gp90: Glicoproteína de superfície 90 do T. cruzi GPI: Glicosilinositol fosfato
HLA: Antígeno leucocitário humano IFN-γ: Interferon gama
IgG: Imunoglobulina G IgM: Imunoglobulina M IL-10: Interleucina 10 IL-12: Interleucina 12
IL-12p40: Interleucina 12 subunidade p40 IL-12p70: Interleucina 12 subunidade p70 IL-17: Interleucina 17
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IL-4: Interleucina 4 IL-6: Interleucina 6 kDNA: DNA mitocondrial
LPS: molécula de lipopolissacarídeo
MHC I/ II: Complexo principal de histocompatibilidade de classe I/ II MyD88: Proteína de resposta primária da diferenciação mielóde 88 mRNA: Ácido ribonucléico mensageiro
NF-κβ: Fator de trascrição nuclear κβ NK: Células Natural Killer
PAMPs: Padrões moleculares associados ao patógeno pb: pares de bases
PBS: Tampão fosfato salino
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PD-1: Proteína de muerte celular programada 1 PD-L1: Ligante de muerte celular programada 1 PE: Ficoeritrina
PIP3: Fosfatidil inositol trifosfato
PRR: Receptor de reconhecimento padrão qPCR: PCR em tempo real
RIN: Número de integridade do RNA RNA: Ácido ribonucléico
SFB: Soro Fetal bovino
Siglec-E: sialic acid-binding Ig-like lectin-E TAU: Traitomine artificial urine medium
TAU3AAG: Traitomine artificial urine medium com glicose, prolina, glutamato, aspartato
Tc: Trypanosoma cruzi
TcMUC: Glicoproteínas tipo mucinas do T. cruzi TGF-β: Fator de crescimento transformante beta Th1: T auxiliador tipo I
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TLR: Receptores tipo Toll TM: Tripomastigota metacíclico TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
ix LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Rotas de migração e número estimado de casos reportados em outros
continentes. ... 4
Figura 2. Diferentes estágios de desenvolvimento de T. cruzi. ... 6
Figura 3. Ciclo de vida do T. cruzi ... 8
Figura 4. Distribuição geográfica dos seis DTUs de T. cruzi na América ... 9
Figura 5. A produção de citocinas pode afetar o desenvolvimento da doença ... 14
Figura 6. Os três sinais emitidos pelas APCs para ativação de linfócitos T ... 17
Figura 7. Morfologia das DCs derivadas de monócito. a). DC imatura b). DC ativada ... 18
Figura 8. Metodologia de sequenciamento por Illumina... 25
Figura 9. Fluxograma da metodologia realizada durante cada experimento ... 28
Figura 10. Microscopia óptica de cultura (com 35 dias) de epimastigotas de T. cruzi (cepa G) contendo TMs ... 39
Figura 11. Microscopia óptica de tripomastigotas metacíclicos (cepa G) após incubação em SFB ativo ... 40
Figura 12. Produtos de PCR visualizados em gel de agarose 1,5%... 43
Figura 13. Citometria de fluxo representativa dos PBMCs totais ... 44
Figura 14. Citometria de fluxo representativa da fração positiva após passagem na coluna de separação magnética para células CD14+ ... 45
Figura 15. Citometria de fluxo representativa da fração negativa após passagem na coluna de separação magnética para células CD14+ ... 46
Figura 16. Microscopia de luz para observação simples da morfologia das células durante a diferenciação em cultura ... 47
Figura 17. Citometria de fluxo representativa da diferenciação de monócitos para DCs com marcação para HLA ... 48
Figura 18. Citometria de fluxo representativa da diferenciação de monócitos para DCs com marcação para CD1a ... 48
Figura 19. Porcentagem de marcadores de superfície após 12h de infecção com T. cruzi, Cepa CL Brener ... 50
Figura 20. Fotografias representativas das DCs a). Controle não-infectadas b). Infectadas após 12 horas de infecção ... 50
Figura 21. a). Taxa de infecção das DCs por doador, b). Número de amastigotas por DC infectada de cada doador ... 52
Figura 22. a). Porcentagem global de ativação das DCs controle e infectadas; b). Porcentagem de ativação por doador ... 52
Figura 23. Micrografias representativas dos ensaios de imunofluorescência em diferentes tempos de infecção na presença/ausência de LPS ... 54
Figura 24. Medida da fluorescência total da faloidina por célula dendrítica (DC) quando incubadas com formas tripomastigotas metacíclicas ... 55
Figura 25. Medida da fluorescência total da faloidina por célula dendrítica (DC) quando incubadas com formas tripomastigotas metacíclicas ... 56
x Figura 26. Medida da fluorescência total da faloidina nas células dendríticas (DC) quando incubadas com LPS e as formas tripomastigotas metacíclicas ... 56 Figura 27. Taxa de infecção das DCs pela cepa CL Brener na presença ou não de LPS . 57 Figura 28. Número de amastigotas por célula infectada nos diferentes tempos de
incubação na presença ou não de LPS ... 58 Figura 29. Análise por Bioanalyzer da integridade do RNA extraído de DCs após infecção com o parasito ... 59 Figura 30. Distribuição dos fragmentos de cDNAs obtidos a partir das bibliotecas. ... 60 Figura 31.Quantificação da concentração dos fragmentos de cDNA obtidos na produção de bibliotecas ... 61 Figura 32. Distribuição dos reads obtidos a partir do doador A nos cromossomas humanos ... 66 Figura 33. Distribuição dos reads obtidos a partir do doador B nos cromossomas humanos ... 67 Figura 34. Distribuição dos reads obtidos a partir do doador C nos cromossomas humanos ... 68 Figura 35. Matriz de correlação entre todas as amostras usando o coeficiente de
correlação de Pearson. ... 69 Figura 36. Correlação entre as duplicatas biológicas de cada doador baseado no nível de expressão dos genes humanos nas amostras (FPKM ... 70 Figura 37. Vulcano plot para os genes humanos diferencialmente expressos nas amostras ... 72 Figura 38. Análise de agrupamento dos genes humanos diferencialmente expressos nas amostras controle e infectadas dos três doadores ... 73
xi LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Porcentagem de metaciclogênese de acordo com o tempo de cultura da cepa G. ... 38 Tabela 2. Porcentagens de metaciclogênese para o protocolo de Canavaci e
colaboradores ... 41 Tabela 3. Resumo da padronização de metaciclogênese ... 42 Tabela 4. Porcentagem de DCs infectadas ou controle que expressando HLA-DR e CD1a nos diferentes doadores ... 49 Tabela 5. Dados da infecção de DCs pelo T. cruzi nas 4 réplicas biológicas realizadas. .. 51 Tabela 6. Quantificação e qualidade do RNA total extraído das DCs após infecção com o parasito. ... 60 Tabela 7. Resumo do resultado dos sequenciamentos usando a plataforma Illumina HiSeq 2500. ... 62 Tabela 8. Resultado do mapeamento dos reads obtidos usando o genoma humano de referência. ... 62 Tabela 9. Resultado do mapeamento dos reads obtidos usando o genoma de referência do T. cruzi. ... 64 Tabela 10. Número de genes humanos com diferentes níveis de expressão nas 12
xii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 3
1.1. Trypanosoma cruzi ... 5
1.2. Resposta imune do hospedeiro humano durante a doença de Chagas ... 12
1.3. Importância das células dendríticas na imunidade ... 15
1.4. Interação entre as Células dendríticas e T. cruzi ... 20
1.5. Fagocitose e T. cruzi ... 22
1.6. Transcriptoma e tecnologias de sequenciamento ... 24
2. JUSTIFICATIVA ... 26 3. OBJETIVO ... 27 3.1. Atividades ... 27 4. METODOLOGIA ... 28 4.1. Parasitos ... 29 4.1.1. Epimastigotas ... 29
4.1.2. Padronização da obtenção das formas tripomastigotas metacíclicas ... 29
4.2. Teste para descartar infecção prévia pelo T. cruzi nos doadores ... 30
4.3. Obtenção das células dendríticas humanas ... 32
4.3.1. Obtenção de monócitos de sangue periférico ... 32
4.3.2. Separação de monócitos a partir das CMSP ... 32
4.3.3. Diferenciação das células dendríticas a partir de monócitos ... 33
4.4. Coleta das células dendríticas e interação com T. cruzi ... 33
4.5. Determinação da taxa de infecção ... 33
4.6. Avaliação da diferenciação das DCs por citometria de fluxo ... 34
4.7. Ensaio de imunofluorescência ... 35
4.8. Extração de RNA total das DCs após ensaios de interação ... 36
4.9. Concentração e integridade do RNA ... 37
4.10. Parâmetros para produção do transcriptoma de células dendríticas após 12 horas de infecção por formas tripomastigotas metacíclicas. ... 37
5. RESULTADOS ... 38
5.1. Obtenção das formas tripomastigotas metacíclicas de T. cruzi ... 38
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5.1.2. Cultivo em meio Schneider ... 39
5.1.3. Lise em SFB ativo de uma cultura em fase estacionária ... 40
5.1.4. Indução da metaciclogênese utilizando o protocolo de Canavaci e colaboradores (2010) ... 40
5.2. Teste para descarte da infecção por T. cruzi nos doadores ... 42
5.3. Diferenciação e obtenção de células dendríticas ... 43
5.3.1. Verificação de mononucleares de sangue periférico ... 43
5.3.2. Enriquecimento da amostra com monócitos ... 44
5.3.3 Diferenciação de células dendríticas ... 46
5.4. Coleta das células dendríticas diferenciadas e infecção pelo T. cruzi ... 49
5.5. Taxa de infecção ... 50
5.6. Imunofluorescência das DCs ativadas após infecção por T. cruzi ... 53
5.7. Extração e controle de qualidade do RNA total das DCs extraído após infecção com Trypanosoma cruzi ... 58
5.8. Transcriptoma preliminar das DCs após infecção com T. cruzi ... 60
5.9. Revisão bibliográfica da interação DCs-T. cruzi em forma de manuscrito ... 73
6. DISCUSSÃO ... 74 7. CONCLUSÃO ... 85 8. PERSPECTIVAS ... 86 9. REFERÊNCIAS ... 87 10. APÊNDICE ... 101 10.1. Manuscrito aceito ... 101
1
RESUMO
As células dendríticas (DCs) são um dos mais importantes componentes do sistema imunológico e desempenham funções essenciais como reconhecimento do antígeno no local da infecção bem como sua internalização e apresentação de forma eficiente. Estas células tem papel central na ligação das respostas imunes naturais e adquiridas contra
Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. As DCs podem modular a
resposta imunológica do hospedeiro, dependendo da sua subpopulação, do seu nível de maturação, das citocinas presentes no meio e do receptor dessas células envolvido nas interações com o T. cruzi, influenciando o desenvolvimento das formas clínicas da doença. Dentro desde contexto, esta dissertação apresenta a padronização da obtenção de DCs provenientes de monócitos de três doadores voluntários e otimização da diferenciação da forma tripomastigota metacíclica (TM) do parasito in vitro para posterior interação entre ambas as células e extração do RNA total para sequenciamento e montagem do transcriptoma por duplicata. Entre as cepas G e CL Brener de T. cruzi, a 2ª mostrou um melhor rendimento no que diz respeito a velocidade de crescimento em cultura, porcentagens finais de metaciclogênese e taxa de infecção. Durante a obtenção e diferenciação das DCs, três técnicas foram aplicadas para confirmação, incluindo citometria de fluxo, visualização em microscópio óptico e de fluorescência. O tempo estabelecido para interação parasito-célula hospedeira foi de 12 h, depois de transcorrido esse tempo obteve-se 39% de taxa de infecção, média de 2,4 amastigotas/DC infectada e 80% de DCs infectadas ativadas contra 47% das células controle. O passo seguinte foi a extração do RNA total das amostras controle e infectadas para sequenciamento e a montagem dos reads. Os resultados provenientes deste processo mostram ser confiáveis devido à cobertura satisfatória dos reads dentro do genoma humano com ~23.000.000 reads por amostra, e ao coeficiente de correlação próximo a 1 entre as duplicatas, fortes indícios da qualidade dos dados. A obtenção de uma visão detalhada da biologia das células apresentadoras de antígenos após os contatos iniciais com T. cruzi poderá proporcionar novos alvos para o tratamento da doença e ajudará no entendimento da evolução diferencial da doença nos pacientes e nos mecanismos de resistência e tolerância ao T.
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ABSTRACT
Dendritic cells (DCs) are one of the most important components of human immunologic system and are able to develop essential functions like antigen recognition at the infection site and its internalization and presentation are accomplished with high efficiency. These cells play a central role in linking natural and acquired immune response against
Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. DCs can modulate host
immunologic response depending on their subset, maturation level, cytokine milieu and DC receptor involved in the interactions with T. cruzi, influencing the development of the disease clinic forms. Therefore, this dissertation presents the standardization of DCs derived from monocyte obtained from three voluntaries and the optimization of in vitro metacyclic trypomastigote form differentiation to proceed to interaction between both cells and subsequently total RNA extraction for sequencing and transcriptome assembly. Among G and CL Brener T. cruzi strains, the second yielded more with respect to culture grow velocity, final metacyclogenesis percentages and infection rate. During DCs obtainment and differentiation, three technics were applied to confirmation, including flow cytometry and optic or fluorescence microscopy visualization. A parasite-host cell interaction time of 12 h was established and after it, infection rates of about 39%, an average of 2.4 amastigotes/infected DC were obtained and also 80% of DCs from infected assays were activated. The next step was extraction of total RNA from control and infected samples for sequencing and assembly of the reads accordingly to human reference genome. These results showed good reliability because of the satisfactory human genome coverage obtained with ~23,000,000 reads per sample, and correlation coefficient of ~1 between duplicates, which are strong indications of data quality. A detailed vision of antigen presenting cells biology after initial contacts with T. cruzi could provide new targets for the disease treatment and it will help understanding the differential evolutions of Chagas disease in patients and in resistance and tolerance to parasite.
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1.
INTRODUÇÃO
A doença de Chagas ou tripanossomíase americana é caraterizada por uma fase aguda com grande quantidade de parasitos circulantes no sangue e sintomas leves, imprecisos ou ausentes, e uma fase crônica que se apresenta com problemas cardíacos em 30% dos casos e desordens digestivas em 10% (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015). Foi descrita pela primeira vez por Carlos Ribeiro Justiniano Chagas, quem entre outros sintomas descreveu uma anemia profunda com grande decadência orgânica, edemas em zonas determinadas, às vezes esplenomegalia considerável, hepatomegalia e perturbações funcionais especialmente no sistema nervoso, sintomas agora conhecidos como pertencentes ao quadro grave da fase aguda (BASTOS et al., 2010; CHAGAS, 1909).
Embora seja pouco usual, depois de uma a três semanas de incubação, o paciente infectado pode apresentar febre, calafrios, náuseas, vômito, diarreia, erupções cutâneas e irritação meníngea. Uma lesão inflamatória cutânea (chagoma) pode se desenvolver na área de entrada do parasito, assim como o sinal de Romaña, um tipo de conjuntivite unilateral cuja presença é um indicativo da doença de Chagas (DELAPORTE, 1997; HOFF et al., 1978). A maior parte dos pacientes consegue controlar os sintomas sem necessidade de tratamento entre dois e quatro meses após a infecção, mas uma pequena porcentagem (aproximadamente 2%) não sobrevive à fase aguda (MACHADO et al., 2013). Quando a parasitemia é controlada e os sintomas desaparecem, os pacientes entram na fase crônica indeterminada, caraterizada por sorologia positiva, mas nenhuma manifestação clínica. O indivíduo pode permanecer nessa fase durante o resto da sua vida ou apresentar uma das formas clínicas conhecidas. A cardiomiopatia congestiva dilatada é a manifestação clínica de maior importância, que pode se apresentar aos poucos como uma falha cardíaca ou abruptamente como uma arritmia e/ou uma apoplexia (CAROD-ARTAL; VARGAS; FALCAO, 2011). As manifestações gastrointestinais não são tão comuns quanto às cardíacas, mas têm se reportado algumas síndromes dos megas relacionadas às estruturas tubulares do trato digestivo, sendo elas mais frequentes no centro do Brasil, menos
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vistas na Bolívia, e quase inexistentes em países ao norte da bacia amazônica (MACHADO et al., 2013; PINAZO et al., 2010).
Se calcula que existam entre 7 e 8 milhões de pessoas infectadas, principalmente na América Latina, onde a transmissão do parasito causador da doença pode acontecer por meio do contato com as fezes contaminadas de insetos da subfamília Triatominae (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2015). No entanto, nos últimos anos, devido às abundantes migrações, tem-se reportado múltiplos casos em outros continentes, com 300.000 infectados nos Estados Unidos (MANNE-GOEHLER; REICH; WIRTZ, 2015), uma estimativa de 59.000 a 108.000 casos da doença na Europa (ANGHEBEN et al., 2011), mais de 3.000 casos no Japão e 1.500 reportados na Austrália (COURA; ALBAJAR-VIÑAS, 2010). Além da transmissão vetorial, já foram confirmados casos de transmissão oral, congênita e por transfusão de sangue ou transplante de órgãos e existem suspeitas de transmissão sexual (RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010; RIBEIRO et al., 2016), motivos pelos quais a doença de Chagas tem se tornado um problema de saúde de importância mundial (Figura 1).
Figura 1. Rotas de migração e número estimado de casos reportados em outros continentes. Tomada de (COURA; ALBAJAR-VIÑAS, 2010).
O Brasil tem realizado com sucesso um plano de controle da transmissão vetorial da doença pelo Triatoma infestans, e em 2006 obteve a certificação da
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interrupção desta via pela Organização Panamericana da Saúde. Embora ainda exista uma predominância dos casos crônicos de infecção pela via vetorial de décadas passadas, os casos de transmissão oral devido ao suco de cana e açaí contaminado, agora são de grande importância, tendo sido reportados principalmente na região norte do país, e em especial no estado do Pará. Adicionalmente, a transmissão por transfusão sanguínea foi eliminada graças a triagem atualmente realizada no sangue dos doadores (DA SILVA; LUNA, 2013; MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2015).
O tratamento da doença de Chagas é administrado preferencialmente durante a fase aguda, mas também em casos de reativação da infecção ou de transmissão congênita sempre com o objetivo de eliminar os parasitos circulantes no sangue (RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010). O Benzonidazol é o medicamento de primeira escolha e o único administrado no Brasil; isso se deve ao fato de ser o mais eficiente e causar menos efeito colateral para o paciente do que o Nifurtimox, medicamento proibido no país. No entanto, esses fármacos podem induzir vários efeitos colaterais como dermatite, particularmente depois de uso prolongado, polineuropatia, leucopenia, danos no fígado e granulocitose (FRAGATA-FILHO et al., 2016; VIOTTI et al., 2009). Além disso, as cepas de T. cruzi possuem grande capacidade para desenvolver resistência aos medicamentos, motivo pelo qual somente cerca de 50% dos pacientes respondem bem ao tratamento atual (MUÑOZ-SARAVIA et al., 2012).
A administração de Benzonidazol ou Nifurtimox é realizada em adultos e crianças, mas não está indicada para mulheres grávidas, pois pode induzir danos renais ou hepático. Em adição, não é recomendada para etapas avançadas da doença de Chagas, sendo o transplante o único tratamento possível em alguns casos (HABERLAND et al., 2013).
1.1. Trypanosoma cruzi
O protozoário Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Pertence à Ordem Kinetoplastida e à Família Trypanosomatidae e se caracteriza por ter um flagelo e uma única mitocôndria denominada cinetoplasto,
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que contém grande quantidade DNA organizado em forma circular como minicírculos e maxicírculos (DE LANA; MARQUES; MACHADO, 2010).
O T. cruzi apresenta diferentes estágios de desenvolvimento morfológicos e fisiológicos que podem ser identificados pela posição relativa do núcleo e cinetoplasto referente ao flagelo: os tripomastigotas são conhecidos classicamente como as formas infecciosas, mas não são replicativos. Podem estar presentes no sangue do hospedeiro mamífero (tripomastigota sanguíneo) ou nas fezes e urina do triatomíneo (tripomastigota metacíclico/TM). Seu flagelo se origina depois do núcleo alongado, e o cinetoplasto se desloca até a parte posterior (Figura 2a). As formas amastigotas são intracelulares e multiplicativam-se no hospedeiro mamífero; elas apresentam um flagelo interno, núcleo grande e cinetoplasto com formato de bastão (Figura 2b). Epimastigotas, formas não infectivas em mamífero, também são capazes de se replicar por fissão binária; estão localizados no trato intestinal e na urina do inseto vetor. Seu cinetoplasto em forma de bastão está localizado na parte anterior do núcleo (Figura 2c) (DE LANA; MARQUES; MACHADO, 2010; DE SOUZA, 2002).
Figura 2. Diferentes estágios de desenvolvimento de T. cruzi: a. Forma tripomastigota, b. Forma amastigota, c. Forma epimastigota. F: flagelo, C ou K: cinetoplasto, N: núcleo. Barras = 1 μm. Tomada de (DE SOUZA, 2009).
Das formas descritas acima, os TMs foram utilizados no trabalho para os ensaios de infecção. A metaciclogênese acontece no intestino posterior do triatomíneo, onde epimastigotas se aderem na camada superficial da cutícula para se diferenciar em TM (BOKER; SCHAUB, 1984). Durante a metaciclogênese acontecem mudanças na estrutura nuclear, estabilidade diferencial do mRNA, e remodelamento da cromatina, tendo como resultado uma expressão proteica
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diferente, mudanças na morfologia, infectividade e proliferação (BAYER-SANTOS et al., 2013). A molécula de superfície gp82 é um exemplo de expressão diferencial estágio dependente. Esta glicoproteína confere capacidade de adesão à mucosa gástrica ajudando na invasão das células epiteliais, ou seja, a invasão e replicação em células do epitélio gástrico é exclusiva dos TMs (BAYER-SANTOS et al., 2013; RAMIREZ et al., 1993). A gp82 é uma trans-sialidase que induz fluxo de Ca2+, indispensável para a entrada do parasito de forma receptor dependente (MANCHOLA et al., 2015). Este processo pode ser reproduzido in vitro usando os meios TAU e TAU3AAG, que contêm os aminoácidos prolina, glutamato e aspartato requeridos e, adicionalmente, simulam condições de adesão ao substrato e estresse nutricional do intestino posterior do triatomíneo (BONALDO et al., 1988; CONTRERAS et al., 1985).
O ciclo de vida do T. cruzi é desenvolvido em dois hospedeiros – mamífero (incluindo humanos) e triatomíneo (várias espécies da família Reduviidae). Este se inicia quando o triatomíneo se alimenta do sangue do hospedeiro mamífero infectado por formas tripomastigotas sanguíneas (1). Dentro do intestino médio do inseto vetor, estas formas se diferenciam em epimastigotas, replicam-se (2) e migram para o intestino posterior, aonde irão se transformar em TMs (3), sendo excretados nas fezes e urina do triatomíneo após repasto do invertebrado (4). As formas metacíclicas entram através da lesão provocada pela picada do inseto ou por contato com membranas mucosas do hospedeiro mamífero, invadindo múltiplos tipos de células nucleadas (5), envolvidos por um vacúolo parasitóforo. Uma vez dentro da célula, em pH baixo, os tripomastigotas diferenciam-se na forma amastigota, secretam proteínas que conseguem destruir o vacúolo, e no citoplasma, sofrem vários ciclos de multiplicação (6), sendo estes limitados possivelmente pelo espaço da célula hospedeira e por um lapso de tempo que depende da cepa. Acontecem várias transformações até virarem tripomastigotas, lesarem a célula (7) e serem liberados no sangue circulante (8). Estes tripomastigotas podem reiniciar o ciclo no momento em que um inseto vetor se alimentar do sangue deste hospedeiro infectado (BERN, 2015; DE LANA; MARQUES; MACHADO, 2010). Na natureza, o T. cruzi apresenta este ciclo de maneira silvestre quando o parasito infecta
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mamíferos silvestres como, por exemplo, gambás, morcegos, tatus e macacos. Esses animais também podem atuar como hospedeiro-reservatório (COURA et al., 2002; MILES; FELICIANGELI; DE ARIAS, 2003).
Figura 3. Ciclo de vida do T. cruzi. Modificada de (BERN, 2011)
O T. cruzi apresenta uma população genêticamente heterogênea que se propaga clonalmente durante vários ciclos com a capacidade de realizar troca de material genético, justificando assim sua ampla diversidade biológica (DE LANA; MARQUES; MACHADO, 2010; RAMÍREZ et al., 2010). O parasito apresenta também um grande polimorfismo decorrente de vários aspectos morfológicos, bioquímicos e da capacidade de infecção em vertebrados e invertebrados. Por tudo isto, diversos sistemas de classificação das diferentes cepas de T. cruzi já foram sugeridos, como zimodemas, schizodemas, biodemas, linhagens e, mais
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recentemente, DTUs. Os DTUs são definidos como os conjuntos de populações que se encontram mais relacionados entre si que com qualquer outra população e são identificáveis por aspectos genéticos ou moleculares, ou marcadores imunológicos em comum (TIBAYRENC, 1998). Atualmente, isolados e cepas deste protozário são classificados em seis diferentes DTUs (TcI a TcVI) de acordo com a genotipagem multilocus, sistema estabelecido no Second Satellite Meeting realizado no Brasil em 2009 (ZINGALES et al., 2009). A distribuição dos diferentes DTUs nas Américas é apresentada na Figura 4, ressaltando os lugares com predominância de ciclos de transmissão silvestres e domésticos.
Figura 4. Distribuição geográfica dos seis DTUs de T. cruzi na América, apresentando os ciclos doméstico e silvestre. Modificada de (ZINGALES et al., 2012).
Como ilustrado na Figura 4, o DTU dominante na região da Amazônia brasileira, Venezuela, Colômbia, Equador, Peru, América Central e sul da América do Norte é o TcI, grupo mais encontrado tanto nos vetores invertebrados quanto em mamíferos, e mais relacionado aos casos de cardiomiopatia crônica e aguda (CARRASCO et al., 2012; OCANA-MAYORGA et al., 2010; RAMÍREZ et al., 2010; SANTANA et al., 2014). Este genótipo é considerado grande causador de infecções por via oral, graças à alta expressão da molécula de superfície gp82 nas formas
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TMs, que ainda persiste na membrana destas cepas mesmo após certo grau de degradação da membrana celular do parasito pela pepsina gástrica do hospedeiro mamífero. A gp82 também permite a adesão do T. cruzi à mucina gástrica do hospedeiro para que ele possa atravessar esta camada e alcançar às células epiteliais (YOSHIDA, 2006). Estudos de genética de populações demonstraram que o TcI possui menor quantidade de DNA e cromossomas pequenos em comparação com outros DTUs, mas apresenta grande variabilidade genética (CURA et al., 2011). Alguns representantes deste grupo são as cepas G, Colombiana, PALC, Sylvio/X10 c11 (ZINGALES et al., 2009).
A cepa G, uma das estudadas no presente trabalho, foi isolada de gambá da Amazônia brasileira (YOSHIDA, 1983). Embora algumas das cepas do TcI sejam consideradas como virulentas, nenhum caso de infecção em humanos por parasitos da cepa G foi reportado até o momento apesar da possibilidade de transmissão por via oral após contato com secreção das glândulas anais de gambás, talvez por contaminação de alimentos com suas fezes (DEANE; LENZI; JANSEN, 1984). A baixa virulência desta cepa se deve, possivelmente, à alta expressão da molécula de superfície gp35/50, que induz uma resposta de Ca2+ deficiente, e da gp90 que impede a interação da glicoproteína gp82 com a mucina gástrica, resultando na dificuldade do parasito em atravessar esta camada e alcançar às células epiteliais (RUIZ et al., 1998; YOSHIDA, 2006). Estudos in vivo demostraram a sensibilidade da cepa G ao IFN-γ, citocina produzida por linfócitos T e células Natural Killer (NK) para induzir a ativação de mecanismos antiparasitários em células do sistema imune. Esta ativação dependente de IFN-γ por si só pode controlar a infecção (RODRIGUES et al., 2012). No entanto, alguns estudos in vitro têm demostrado a virulência de amastigotas da cepa G (RODRIGUES et al., 2012). Estas formas extracelulares se mostraram grandes indutores de fagocitose em fagócitos não profissionais, estimulando sua própria internalização por um processo que envolve a polimerização de actina, similar àquela presente em fagócitos profissionais, desde que as moléculas de superfície do parasito estejam intactas. Segundo esta observação, Fernandes e colaboradores sugerem considerar a hipótese de que a persistência do T. cruzi no hospedeiro mamífero pode também estar relacionada ao
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mecanismo de fagocitose por fagócitos não profissionais juntamente com a lise de células infectadas, este último favoreceria a liberação de amastigotas que poderiam ser internalizados por células adjacentes (FERNANDES et al., 2013).
O DTU TcVI, associado com a doença na área central da América do Sul, é conhecido como um grupo híbrido oriundo dos DTUs TcII e TcIII que provavelmente hibridizaram numa coinfecção em humanos, em mamíferos peridomésticos ou em Triatoma infestans domiciliados (ZINGALES et al., 2012). Segundo o modelo atual, a evolução de um novo DTU envolve a acumulação de mutações discretas devido à replicação clonal mais do que a eventos de intercâmbio genético. No entanto, tendo em conta a possibilidade de recombinação, múltiplas provas da heterozigosidade têm sido coletadas (BOGLIOLO; LAURIA-PIRES; GIBSON, 1996; BRISSE et al., 1998; CHAPMAN et al., 1984). O TcVI ainda não foi encontrado em infecções silvestres e estudos ecológicos precisam ser aprofundados para aumentar o conhecimento do seu comportamento em vetores silvestres e sinantrópicos, o que poderia alterar sua classificação (ZINGALES et al., 2012). As cepas Tulahuen, CL e CL Brener são exemplos típicos deste DTU.
A cepa CL Brener é um clone derivado da cepa CL, que foi isolada a partir de T. infestans no Rio Grande do Sul, Brasil (ZINGALES et al., 2009). Brener e Pereira obtiveram a cepa a partir de um processo de clonagem de tripomastigotas sanguíneos da cepa CL. Este clone é o organismo de referência usado no projeto Genoma de Trypanosoma cruzi (EL-SAYED et al., 2005), e sua grande importância reside na presença de características interessantes do T. cruzi, como ter sido isolada de um vetor doméstico, virulência em camundongo, tropismo para células cardíacas e musculares, suscetibilidade ao tratamento com fármacos e sintomas claros na fase aguda (ZINGALES et al., 1997). O genoma haplóide da cepa CL Brener tem um tamanho de aproximadamente 55 Mpb (EL-SAYED et al., 2005) e a análise de suas sequências confirma o genoma híbrido rico em regiões repetitivas conservadas presentes também em Leishmania major e Trypanosoma brucei. Essa natureza híbrida e repetitiva do seu genoma dificulta a montagem das sequências, deixando o genoma de T. cruzi incompleto e impedindo comparações (FRANZÉN et al., 2011).
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1.2. Resposta imune do hospedeiro humano durante a doença de Chagas
O estudo da resposta imunitária humana durante a fase aguda é de grande importância na doença de Chagas, devido ao fato de que os eventos imunológicos durante esta fase podem influenciar de maneira ainda desconhecida o desenvolvimento da fase crônica. Além disso, o tratamento terapêutico só é efetivo durante este período, embora o diagnóstico seja complicado pela falta de sintomas que sejam característicos da doença (ANDRADE; GOLLOB; DUTRA, 2014).
Uma resposta imunitária robusta é desencadeada durante a fase aguda para conseguir controlar a alta parasitemia que se apresenta durante a etapa. Embora não se tenha o conhecimento completo das respostas relacionadas com o controle do parasito, acredita-se que células da resposta inata como macrófagos, células dendríticas (DCs), neutrófilos e células NK sejam de grande importância. O Interferon-γ (IFN-γ) e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) produzidos pelas células NK são fundamentais para a correta ativação de macrófagos e DCs e, portanto, para a eliminação do parasito. As células NK seriam ativadas para a produção dessas citocinas mediante o reconhecimento de moléculas de superfície do patógeno, como as GPI-mucinas de T. cruzi, as glicoproteínas mais expressas na sua membrana, e interleucina-12 (IL-12), citocinas produzida pelos fagócitos (ANDRADE; GOLLOB; DUTRA, 2014; ARGIBAY et al., 2002; BUSCAGLIA et al., 2006).
Macrófagos e DCs reconhecem os padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) do T. cruzi, após serem ativados pelo IFN-γ das células NK; ambas as células degradam o parasito dentro do fagolisossoma e produzem IL-12, necessária para a formação do ambiente inflamatório. Os TLRs (receptores tipo Toll), presentes na superfície destas células imunológicas, também encarregados deste reconhecimento, transmitem o sinal para o interior da célula, via domínio Toll/IL-1R, para o recrutamento de moléculas adaptadoras como MyD88 (proteína de resposta primária da diferenciação mielóide 88) até a membrana e a indução do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB). Este último induz a síntese de citocinas
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inflamatórias necessárias para a ativação da resposta adaptativa (MACHADO et al., 2013).
O IFN-γ é importante para o recrutamento dos linfócitos T (CAMARGO et al., 1997). Durante a fase aguda, linfócitos T auxiliares são ativados, embora os T citotóxicos específicos para os antígenos do T. cruzi apresentem uma ativação retardada, talvez devido à imunossupressão mediada pelo parasito para evadir a resposta imune do hospedeiro mamífero, o que facilita sua entrada nas células e sua propagação (OUAISSI et al., 2001). A resposta adaptativa para a infecção aguda também inclui o aumento de linfócitos B circulantes, além disso são achados anticorpos tipo IgM e IgG contra o protozoário no soro do paciente durante tal fase (ANTAS et al., 1999).
Por outro lado, a forma indeterminada e assintomática da doença de Chagas encontra-se associada com a produção de interleucinas do tipo regulatória como IL-10 o que representa um equilíbrio entre a eliminação do parasito e a proteção contra os danos em tecidos (DUTRA et al., 2009). Suprimidas durante a primeira etapa da infecção, as células T CD8+ circulam em grande quantidade no sangue durante o desenvolvimento da fase indeterminada. Estes linfócitos citotóxicos adquirem um fenótipo ativado, exercem sua função como efetores, e se transformam em células de memória, perpetuando a resposta para os próximos encontros com antígenos (BASSO, 2013; TZELEPIS; PERSECHINI; RODRIGUES, 2007). A presença do T. cruzi em alguns tecidos pode ser devido à falta de estimulação para o recrutamento dos linfócitos T CD8+ ou à inibição mediada por outras populações linfocitárias como CD4+, CD25+ e produtoras de TGF-β (PADILLA; BUSTAMANTE; TARLETON, 2009).
Apesar de que a maioria dos pacientes indeterminados permanece assintomática durante o resto da sua vida, estima-se que cerca de 2% destes indivíduos evoluem para forma clínica a cada ano, onde a cardiomiopatia crônica representa a maior causa de morte entre os pacientes infectados por T. cruzi (ALVAREZ et al., 2014). Alguns estudos demostraram que a predominância de citocinas pró-inflamatórias na fase indeterminada está relacionada com as formas crônicas (anomalias cardíacas e digestivas), enquanto que citocinas reguladoras do
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tipo de IL-10 e IL-17 se relacionam com a permanência na fase assintomática (ANDRADE; GOLLOB; DUTRA, 2014; DUTRA et al., 2015).
Desta forma, um ambiente pró-inflamatório para o controle do parasito durante a fase aguda seguido de um ambiente mais regulatório que previne danos teciduais após o controle da parasitemia parece ser necessário para não desenvolvimento da doença (Figura 5).
Figura 5. A produção de citocinas pode afetar o desenvolvimento da doença. Ambientes pró-inflamatórios (em vermelho) favorecem a eliminação do parasito, mas desencadeiam respostas exacerbadas que causam as formas sintomáticas; os ambientes regulatórios (em verde) evitariam esse resultado. Modificada de (DUTRA et al., 2015).
O fato do parasito não ser encontrado em corações inflamados de pacientes chagásicos tem levado à comunidade científica a sugerir a existência de mecanismos autoimunes envolvidos na patogênese da doença de Chagas, devido a reações cruzadas de receptores anti-antígenos do parasito contra epítopos próprios (mimetismo molecular). Segundo este pensamento, as formas clínicas seriam consequências de uma resposta auto-imune (ALVAREZ et al., 2014; CUNHA-NETO et al., 1995). A teoria da autoimunidade encontra-se baseada também na interação citotóxica acelerada dos linfócitos com células cardíacas não infectadas vista em alguns estudos (TEIXEIRA et al., 2011). Adicionalmente, este ataque imunológico é específico para células cardíacas e neurônios (TEIXEIRA et al., 1983), uma razão a mais para pensar que as lesões características da doença
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são causadas por uma reação autoimune. Esta autoimunidade poderia ser provocada pelo contato inicial entre o parasito e a célula hospedeira que desencadearia um dano tecidual por reação cruzada em caso de uma sobrecarga parasitária, mas a falta de sintomas nas fases iniciais leva a pensar na hipótese que a autoimunidade é desenvolvida em fases posteriores. Dessa forma, parece ser mais provável uma citotoxicidade dependente de anticorpos ou uma ativação direta autoreativa dos linfócitos T (TEIXEIRA et al., 2011).
Outra hipótese considera que durante a infecção, danos mecânicos importantes são causados pela liberação dos tripomastigotas, liberando antígenos próprios em meio com altas quantidades de mediadores de inflamação como citocinas, quimiocinas, linfotoxinas, grânulos, etc. Esta situação pode superar o limite de ativação gerando uma reação contra os antígenos próprios (BONNEY; ENGMAN, 2015). A transferência do DNA mitocondrial (kDNA) do T. cruzi ao genoma das células hospedeiras tem sido contemplada como outra explicação plausível. O DNA exógeno pode induzir alterações genotípicas e fenotípicas que desencadeiam a resposta autoreativa (TEIXEIRA et al., 2011). Para investigar esta hipótese, aves que possuem a capacidade de eliminar totalmente o parasito depois da saída do ovo foram utilizadas. Ao inocular as formas infectivas em ovos fecundados, o kDNA do T. cruzi foi encontrado inserido no genoma das células do embrião, que na etapa adulta apresenta uma reação autoimune contra a células cardíacas sem a presença do parasito. Adicionalmente, a eliminação específica das células com mutações provocadas pela inserção do kDNA, e o transplante de células de medula óssea saudáveis inibiu a patologia nas galinhas kDNA+, sendo isto uma prova forte a favor da teoria da autoimunidade (GUIMARO et al., 2014).
1.3. Importância das células dendríticas na imunidade
As células apresentadoras de antígenos (APCs) representam uma ponte importante entre a imunidade inata e adaptativa. Este grupo inclui principalmente DCs, macrófagos e linfócitos B (PLANELLES et al., 2003). Estas são células ativadoras de linfócitos T virgens, que se diferenciam em células T efetoras, de suma importância no controle da parasitemia, ajudando na degradação do T. cruzi
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dentro da célula hospedeira (JANEWAY et al., 2001). Essa apresentação de antígenos é um primeiro sinal de ativação das células T e acontece por meio do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), proteína de superfície que expõe os antígenos do parasito para que sejam reconhecidos pelo receptor do linfócito T (KIERSZENBAUM; MORETTI; SZTEIN, 1993). Após este reconhecimento, os linfócitos T são ativados com ajuda das moléculas co-estimuladoras produzidas também pelas APCs (segundo sinal) (ALBA SOTO et al., 2003).
O MHC classe I, presente na maioria das células nucleadas do corpo, é reconhecido por linfócitos T citotóxicos ou T CD8+, cuja função é eliminar células infectadas ou cancerígenas (SCHLIENGER et al., 2000). Esses antígenos de origem intracelular são processados e, posteriormente, apresentados no MHC classe I, mostrando na superfície celular aquilo que está acontecendo no interior da célula (NEEFJES et al., 2011). O processamento clássico de antígenos para sua montagem no MHC classe I consiste na degradação de proteínas intracelulares pelo proteassoma, os peptídeos resultantes são transportados até o retículo endoplasmático onde são carregados no MHC classe I e, finalmente, os complexos MHC-peptídeo são transportados para membrana celular via Golgi (NEEFJES et al., 2011; VYAS; VAN DER VEEN; PLOEGH, 2008). No entanto, as células dendríticas possuem uma capacidade única de apresentação de antígenos extracelulares (fagocitados) por meio do seu MHC de classe I, processo chamado de apresentação cruzada, onde as proteínas exógenas tem acesso ao citoplasma da DC para serem processadas pelo proteassoma e seguirem na via de montagem e apresentação (VYAS; VAN DER VEEN; PLOEGH, 2008).
Por outro lado, o MHC classe II é praticamente exclusivo das APCs e é reconhecido pelos linfócitos T auxiliares ou T CD4+ (SCHLIENGER et al., 2000). Neste processo, os antígenos de origem extracelular são capturados pelas APCs e levados via fagossomos que serão fusionados aos lisossomos formando o fagolisossoma, local de interação do MHC classe II com os peptídeos exógenos; por último, os complexos MHC-peptídeo são levados até a superfície celular (NEEFJES et al., 2011; VYAS; VAN DER VEEN; PLOEGH, 2008).
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Um terceiro sinal necessário para a ativação completa das células T consiste na presença de citocinas pró-inflamatórias, que também podem ser produzidas pelas APCs (DEN HAAN; ARENS; VAN ZELM, 2014). A Figura 6 representa a interação entre linfócitos T e as APCs, mostrando os três sinais necessários para a ativação linfocitária.
Figura 6. Os três sinais emitidos pelas APCs para ativação de linfócitos T. O primeiro sinal é o reconhecimento do complexo peptídeo-MHC pelo TCR. O segundo é a ligação das proteínas das APCs, CD80/CD86, ao CD28, proteína dos linfócitos T. E por fim, para a ativação completa, a ligação de citocinas aos seus receptores específicos. Modificada de (DEN HAAN; ARENS; VAN ZELM, 2014).
As DCs são as APCs mais importantes, mostrando uma alta especialização na internalização de antígenos ao reconhecê-los no local da infecção. Esse processo induz a migração destas células até o linfonodo e a sua maturação para que as mesmas apresentem antígenos eficientemente para as células T. A DC madura expressará na sua superfície moléculas co-estimuladoras como CD40, CD80 (conhecida também como B7.1), CD86 (ou B7.2) e CD83, necessárias para enviar o segundo sinal de ativação para a célula T (DA COSTA et al., 2014; DEN HAAN; ARENS; VAN ZELM, 2014). Caraterísticas morfológicas também podem ser úteis para identificar DCs maduras, como extensões citoplasmáticas e grande quantidade de estruturas intracelulares (lisossomas, endossomas, grânulos, etc)
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relacionadas com o processamento de antígenos (Figura 7) (DUBSKY et al., 2005; O’NEILL; ADAMS; BHARDWAJ, 2004).
Figura 7. Morfologia das DCs derivadas de monócito. a). DC imatura b). DC ativada. Modificada de (O’NEILL; ADAMS; BHARDWAJ, 2004).
As DCs também podem ser um ponto chave na tolerância e no controle de reações contra antígenos próprios por conta da estimulação de expressão de receptores na célula T que emitem sinais inibitórios, como o CTLA-4, que reconhece os CD80 e CD86 com maior afinidade, ou PD-1, que reconhece a molécula PD-L1 expressa na superfície das DCs chamadas de tolerogênicas (Figura 6) (LEWIS; REIZIS, 2012; MCGOVERN; CHAN; GINHOUX, 2015). Além disso, as DCs podem apresentar antígenos próprios para induzir a geração e proliferação de linfócitos T regulatórios ou deleção clonal daqueles linfócitos que as reconheçam (LEWIS; REIZIS, 2012). A produção de citocinas anti-inflamatórias pelas DCs (principalmente IL-10 e TGF-β) é mais uma forma de regulação da resposta imune ou indução de tolerância (PONCINI et al., 2008). Estas citocinas podem limitar a ação antimicrobiana das DCs e dos macrófagos suprimindo sua capacidade fagocitária, limitar a produção de espécies reativas de oxigênio ou a migração até os linfonodos (CORINTI et al., 2001; DEMANGEL; BERTOLINO; BRITTON, 2002; MACHADO et al., 2013).
As DCs, junto com os monócitos e macrófagos formam o grupo dos fagócitos mononucleares. As primeiras se diferenciam dos outros principalmente por suas moléculas de superfície e por sua capacidade de circular entre tecidos, pois os últimos são considerados residentes, ou seja, fixos nos tecidos (HANIFFA et al.,
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2009). Diferentes análises taxonômicas também demostraram uma separação entre monócitos e DCs, reforçando o fato da DC ser considerada uma população independente (HANIFFA et al., 2012). Existem também múltiplas subpopulações de DCs que estão relacionadas aos diferentes níveis de ativação dos linfócitos T e com o direcionamento para resposta imunitária com perfil T auxiliar 1 (Th1) ou 2 (Th2). Em geral, todas as DCs expressam na sua superfície as moléculas MHC classe II, mas carecem de CD3 (linfócitos T), CD19/20 (células B) e CD56 (células NK). Dentre as subpopulações de DCs temos: mielóides, plasmocitóides, derivadas de monócito e células de Langerhans que se diferenciam pela expressão de marcadores de superfície, mostrando a grande diversidade e, possivelmente, funções variáveis para as DCs.
Em camundongos, as DCs mielóides são compostas por células residentes e migratórias, que por sua vez são subdivididas em dependentes do fator de transcrição Batf3 ou IRF4. As DCs mielóides migratórias/dependentes de Batf3 expressam CD11c, Clec9A, XCR1, CD103 e CD207; as residentes dependentes do mesmo fator de transcrição são identificadas pela expressão de CD11c, Clec9A, XCR1 e CD8. Por outra parte, as residentes/dependentes de IRF4 expressam CD11c, CD11b e CD172a; as migratórias expressam os mesmos marcadores junto com o CD206. Para as DCs plasmocitóides, os principais marcadores CD11c, Ly6c, B220 e SiglecH, enquanto que para as DCs derivadas de monócito são CD11c, CD11b, CD64, FcεRI, CD206, CD14, CD172a e Ly6c. Para células de Langerhans, população associada aos tecidos epiteliais, CD11c, CD207, EpCAM e E-caderina são os marcadores característicos (SEGURA, 2016).
Em humanos, as DCs mielóides expressam CD1c+, Dectina 1 (CLEC 7A) e Dectina 2 (CLEC6A); as plasmocitóides expressam CD303 (CLEC4C), CD304 (neuropilina) e CD123 (IL-3R). As células de Langerhans apresentam como principais marcadores CD1a e Langerina (COLLIN; MCGOVERN; HANIFFA, 2013). As DCs derivadas de monócito são positivas para CD14 e podem ser identificadas também pelas moléculas de superfície CD209 (DC-SIGN), CD16 e CD1c. Estas também são precursoras das DCs inflamatórias, cuja população aumenta drasticamente tanto nos tecidos quanto nos linfonodos durante uma infecção
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(COLLIN; MCGOVERN; HANIFFA, 2013). Elas expressam altas quantidades de MHC classe II, CD11c, CD40, CD80 e CD86. Porém, um marcador de superfície importante na sua caracterização é o CD1a, pois DCs derivadas de monócito que não expressam esta molécula não são consideradas produtoras de IL-12, porém produzem elevadas quantidades de IL-10, induzindo um ambiente regulatório Th2 (CHANG; WRIGHT; PUNNONEN, 2000).
1.4. Interação entre as Células dendríticas e T. cruzi
Infecções in vitro de DCs humanas derivadas de monócitos com a cepa Tehuantepec de T. cruzi mostraram uma redução significativa na expressão de moléculas co-estimulatórias e na produção de citocinas proinflamatórias (VAN OVERTVELT et al., 1999). A expressão das moléculas de MHC classe I também é afetada pela infecção pelo T. cruzi, inibindo a ação dos linfócitos T CD8+ na doença de Chagas (VAN OVERTVELT et al., 2002). De forma semelhante, camundongos infectados com a cepa altamente infectiva RA apresentaram DCs com inibição de sua ativação, mostrando indução, pela presença do parasito, de populações de DCs inibitórias (PONCINI et al., 2008). Outro estudo com camundongos usando a mesma cepa de T. cruzi mostrou a presença de DCs mielóides com funções diminuídas e redução na expressão do MHC classe II (ALBA SOTO et al., 2003), caraterística vista também nas DCs murinas, proveniente do baço, quando infectadas com a cepa Y (PLANELLES et al., 2003). Ao impedir as funções clássicas das células dendríticas, o T. cruzi pode induzir um estado anérgico reduzindo a estimulação dos linfócitos T e, por tanto, a habilidade de defesa do hospedeiro contra a infecção (BOUSSIOTIS et al., 1996; VAN OVERTVELT et al., 2002).
No entanto, parece que a redução na expressão destas moléculas depende da cepa presente na infecção. Van Overtvelt e colaboradores (1999) observaram essa redução em infecções com a cepa Tehuantepec do México; Rodríguez e colaboradores (2011) observaram o aumento na expressão de CD40, CD83, CD80 e MHC-II em DCs de feto e de adulto que interagiram com a cepa Tulahuen (TcVI). Interessantemente, a maioria das DCs apresentou um fenótipo de maturação embora não tivessem sido infectadas pelo T. cruzi (RODRIGUEZ; CARLIER;
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TRUYENS, 2012a, 2012b). Outro estudo comparou a infecção de cepas pertencentes aos DTUs TcI (AQ1.7 e MUTUM) e TcII (1849 e 2369) em células dendríticas murinas derivadas de medula. As cepas do TcI apresentaram uma taxa de infecção menor, e a cepa 2369 do TcII mostrou uma correlação maior entre taxa de invasão e o incremento da produção de IL-10 e PD-L1 (ligante de morte programada 1), sem mudança significativa na expressão de MHC classe II e CD40 ou na produção de TNF-α. Por outro lado, os níveis de expressão de CD40, CD80, MHC-II, CCR5 (receptor de quimiocina tipo 5), CCR7 (receptor de quimiocina tipo 7), TNF-α, IL-12, IL-6 e CCL2 (quimiocina ligante 2) dependem da cepa em questão. Segundo os autores, essa ativação diferenciada poderia significar o desenvolvimento de diferentes estratégias de escape entre as cepas de T. cruzi (DA COSTA et al., 2014).
No que concerne os receptores de reconhecimento de padrões, existe sinergia entre os sinais induzidos por TLR2 e TLR4 nas DCs murinas derivadas de medula, que induzem a produção de citocinas anti-inflamatórias (HIRATA et al., 2008). No entanto, Poncini e colaboradores (2010) demonstraram o papel importante para o TLR4 em associação ao NF-κB na produção de IL-10 pelo mesmo tipo celular, induzida pela presença do T. cruzi mediante um mecanismo ainda desconhecido na interação DCs-parasito (PONCINI et al., 2010). TLR9 parece ter grande importância no reconhecimento do T. cruzi pelas DCs; o estudo da interação DCs-T. cruzi mostrou forte relação entre este receptor e motivos CpG presentes nos genes de glicoproteínas tipo mucinas (TcMUC) no interior dos lisossomas dessas APCs. Esses motivos ficam expostos para reconhecimento no momento da destruição do parasito dentro do lisossoma (BARTHOLOMEU et al., 2008). O TLR9 age como um importante ativador de inflamação nas DCs obtidas de camundongos infectados pela cepa Y, induzindo produção de IL-12/IL-23p40 e contribuindo na defesa contra T. cruzi (GRAVINA et al., 2013).
Outros receptores expressos pela DC têm sido reportados no reconhecimento do T. cruzi. O receptor de bradiquinina 2 (B2R) mostrou um papel importante na ativação das DCs ao reconhecer quininas e moléculas C5a liberadas pelo T. cruzi por ação da cruzipaína. A ligação destas moléculas ao B2R induz
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produção de IL-12 ou IL-12p40/70, favorecendo a ativação de resposta Th1 (MONTEIRO et al., 2006; SCHMITZ et al., 2014). Por outro lado, receptores do tipo lectinas como as galectinas e o Siglec-E apresentaram um efeito imunossupressor em DCs, diminuindo sua capacidade de migração e tornando-as tolerogênicas (ERDMANN et al., 2009; PONCINI et al., 2015; VRAY et al., 2004).
Contudo, os estudos realizados sobre a interação da DC humana e o T. cruzi são poucos e a maioria se limita à medição de citocinas e moléculas de superfície. É necessário aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos de entrada e escape do parasito, sobre as proteínas envolvidas em processos que ocorrem dentro e fora do fagolisossoma, sobre os genes expressos ou reprimidos durante a interação, entre outros aspectos.
1.5. Fagocitose e T. cruzi
Diversos estudos têm demonstrado que o T. cruzi utiliza uma grande variedade de mecanismos para entrar na célula hospedeira. A endocitose mediada por clatrina, caveolina ou flotilina, a fagocitose e a autofagia são alguns dos mecanismos já descritos (BARRIAS; DE CARVALHO; DE SOUZA, 2013). Sabe-se que o T. cruzi é internalizado no vacúolo parasitóforo, onde permanece tempo considerável (ANDRADE; ANDREWS, 2005; DE SOUZA; ULISSES DE CARVALHO, 2013). Outra via de entrada descrita é independente de lisossomas, em que o parasito induz sua internalização estimulando o acúmulo de fosfatidil inositol trifosfato (PIP3) na membrana celular do hospedeiro (DE SOUZA; DE CARVALHO; BARRIAS, 2010; KIPNIS; CALICH; DA, 1979).
A fagocitose é um processo dependente do remodelamento dos filamentos de actina. Este mecanismo é de grande importância para a internalização do patógeno em macrófagos, DCs e outros fagócitos, sendo desencadeado pelo reconhecimento de diferentes tipos de ligantes (BARRIAS; DE CARVALHO; DE SOUZA, 2013). A superfície dos fagócitos apresenta receptores do tipo Fc (reconhecem imunoglobulinas), receptores do complemento, de manose, e de componentes da matriz extracelular, e receptores de reconhecimento de padrões (pattern recognition receptors - PRR) que reconhecem moléculas típicas nos
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patógenos e ativam sua internalização por meio de fagocitose (RITTIG et al., 1998). A fagocitose clássica ou tipo zíper forma prolongações bilaterais da membrana plasmática que engolfam o patógeno formando um vacúolo parasitóforo; esta é tipicamente desencadeada quando ligantes são reconhecidos pelos receptores Fc ou do complemento (RITTIG; BURMESTER; KRAUSE, 1998). Mas existem outros tipos de fagocitose não convencionais como a macropinocitose e fagocitose por enrolamento, que são características de fagócitos profissionais. O reconhecimento de ligantes multivalentes leva à fosforilação de tirosina quinases que ativam o remodelamento do citoesqueleto de actina, processo em que os fosfoinositídeos desempenham um papel importante (BARRIAS; DE CARVALHO; DE SOUZA, 2013).
Estudos usando citocalasina B (que bloqueia a formação dos filamentos de actina), diferentes linhagens celulares, e microscopia eletrônica de transmissão demonstraram que os tripomastigotas induzem a fagocitose clássica e que o PRR TLR2 está envolvido no processo (BARBOSA; MEIRELLES, 1995; HALL; FURTADO; JOINER, 1991; NOGUEIRA; COHN, 1976). No entanto, a entrada da forma amastigota parece depender da cepa, por exemplo, há indução da fagocitose por parasitos da cepa G em fagócitos não profissionais, mas não da cepa Y, cujos amastigotas são amplamente fagocitados por macrófagos (FERNANDES et al., 2013; MORTARA et al., 2008). As formas tripomastigotas metacíclicas, de outro modo, parecem apresentar um tipo de penetração ativa, com consumo de energia do parasito e reconhecimento e intervenção da célula hospedeira (DE SOUZA; ULISSES DE CARVALHO, 2013).
Possivelmente, a escolha do mecanismo de entrada do parasito depende da natureza da célula hospedeira ou do receptor que reconhece determinado ligante, assim como da cepa ou a forma de desenvolvimento do T. cruzi. Mas pouco é conhecido sobre essas relações até o momento e poucas linhagens celulares foram utilizadas nos experimentos (BARRIAS; DE CARVALHO; DE SOUZA, 2013; DE SOUZA; ULISSES DE CARVALHO, 2013). Nesse contexto, um estudo utilizando técnicas de imagem de fluorescência da interação entre a célula dendrítica humana
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e diferentes cepas e formas de vida de T. cruzi poderá ampliar o conhecimento atual sobre o contato inicial e os estágios iniciais da infecção pelo parasito.
1.6. Transcriptoma e tecnologias de sequenciamento
Todas as células de um organismo multicelular apresentam um genoma, mas não todos os genes ali presentes são expressos da mesma forma em cada tecido, o que é conhecido como expressão gênica. Um transcriptoma é então a parte do genoma que é transcrita em forma de moléculas de RNA em determinado momento e condições da vida célula. Em humanos, o transcriptoma representa só 5% do que o genoma pode codificar. Além de genes transcritos e não transcritos, uma célula pode expressar (dependendo do momento) certo gene em maior quantidade, ou fazer mais modificações do tipo splicing alternativo. Por tanto, o transcriptoma atinge níveis de complexidade que o estudo do genoma não consegue atingir (ADAMS, 2008).
Existem diversas metodologias para o estudo do transcriptoma, um exemplo são as análises de expressão gênica global clássicas que consistem em arranjos de hibridização de RNA de alta densidade ou microarrays. Estas permitem conhecer o perfil dos genes expressos entre diferentes tecidos, mas são limitadas devido ao fato de que os mesmos só podem ser comparados a genes já conhecidos. Outra metodologia de anotação de um transcriptoma é a clonagem do cDNA ou EST (Expressed Sequence Tag), que proporciona sequencias parciais de clones individuais de cDNA mas é um processo custoso, complicado e sensível aos erros na clonagem (SULTAN et al., 2008).
O sequenciamento High-throughput de RNA ou RNA-Seq se apresenta como uma ferramenta para o entendimento detalhado do transcriptoma, pois permite a anotação e a quantificação de genes e de suas isoformas. Sua análise é um desafio computacional, que se aperfeiçoa com o desenvolvimento de novas ferramentas a cada dia (GARBER et al., 2011). O RNA-Seq permite o sequenciamento em massa de cDNAs sintetizados a partir dos RNAs celulares (CLOONAN; GRIMMOND, 2008). Essa abordagem pode ser usada para a construção de um mapa completo dos genes transcritos, facilitando comparações entre tecidos diferentes ou
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condições distintas. Estudos atuais usam esta ferramenta para responder alguns problemas biológicos específicos como a quantificação de splicings alternativos entre tecidos, populações e doenças (MELÉ et al., 2015).
O sequenciamento pelo sistema Illumina, usado para o RNA-Seq, é uma técnica que aproveita a incorporação de cada base dentro de uma fita que está sendo sintetizada a partir do cDNA molde da amostra; essa incorporação emitirá um sinal reconhecido pelo equipamento para identificar a base que foi adicionada. Para garantir a leitura de todos os fragmentos na amostra, adaptadores complementares aos primers usados são ligados a estes antes do sequenciamento, homogeneizando assim a leitura de cada transcrito (Figura 8) (KIRCHER; KELSO, 2010).
Figura 8. Metodologia de sequenciamento por Illumina. Os nucleotídeos marcados são incorporados e detectados simultaneamente em uma PCR que usa como molde cDNA sintetizado a partir do RNA das amostras e, como iniciador, um oligonucleotídeo complementar aos adaptadores previamente ligados aos fragmentos de cDNA. Modificada de (KIRCHER; KELSO, 2010)
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2.
JUSTIFICATIVA
As DCs são células importantes na modulação da resposta imunológica e no desenvolvimento da doença de Chagas. Baseado no que se conhece sobre os processos que ocorrem no início da interação dessas células com o T. cruzi, e tendo em conta que grande parte desse conhecimento se limita à medição de citocinas ou de expressão de marcadores de superfície, o transcriptoma diferencial do contato inicial faz-se necessário para o melhor conhecimento dos mecanismos moleculares que o hospedeiro utiliza para se defender. Além disso, a obtenção de uma visão detalhada da biologia das células apresentadoras de antígenos profissionais após os contatos iniciais com T. cruzi poderia proporcionar novos alvos para o tratamento da doença e ajudará no entendimento da evolução diferencial da doença nos pacientes e nos mecanismos de resistência e tolerância ao T. cruzi.
A cepa CL Brener, sendo uma cepa de referência que apresenta boa infectividade, crescimento relativamente rápido em cultura e rendimento no processo de meatciclogênese, foi escolhida para os ensaios de interação e infecção. Adicionamente, embora seja uma cepa heterozigótica, a cepa CL Brener possui genoma seuqenciado, o que pode facilitar a exclusão das suas sequencias durante a análise dos genes diferencialmente expressos nas DCs.
Não existe transcriptoma das células do sistema imune humano durante sua infecção/interação com o T. cruzi. De igual maneira, o transcriptoma do parasito durante a infecção de células imunes nunca antes foi feito.
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3.
OBJETIVO
Estudar a modulação da expressão gênica de DCs humanas após a interação inicial com as formas TMs de T. cruzi in vitro.
3.1. Atividades
Padronização da obtenção de TMs com capacidade de infecção usando as cepas G e CL Brener;
Obtenção de populações homogêneas de DCs derivadas de monócito para a infecção;
Validação da interação DCs-TMs por meio da quantificação da expressão de moléculas de superfície, nível de ativação das DCs, taxa de infecção e amastigotas/DC infectada;
Estudo usando técnica de imagem de fluorescência da infecção de células dendríticas humanas por tripomastigotas metacíclicos da cepa CL Brener em tempos de 0 até 24 h;
Extração do RNA total das células após interação durante 12h para sequenciamento e montagem do transcriptoma;
Análise preliminar da expressão diferencial de genes de DCs infectadas e não infectadas pelas formas TMs da cepa CL Brener de T. cruzi.
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4.
METODOLOGIA
O fluxograma da metodología proposta para a realização do presente trabalho após a padronização das condições apresenta-se na Figura 9.
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4.1. Parasitos
4.1.1. Epimastigotas
As infecções das células dendríticas foram realizadas com as cepas G e CL Brener de T. cruzi. As formas epimastigotas destas cepas foram mantidas em meio LIT pH 7,3 contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e 100 μg/ml de gentamicina a 28ºC.
4.1.2. Padronização da obtenção das formas tripomastigotas metacíclicas Para a obtenção das formas tripomastigotas metacíclicas foram testadas quatro metodologias, avaliando a porcentagem da diferenciação final bem como a capacidade de infecção:
Depois da fase estacionária de crescimento, os tripomastigotas metacíclicos podem ser encontrados na cultura de epimastigotas, de forma que o primeiro método foi o de permitir o envelhecimento da cultura em meio LIT a 28ºC por até 35 dias. A coloração de panótico foi realizada a cada cinco dias para calcular a porcentagem de metaciclogênese (YOSHIDA, 1983);
O meio Schneider, pouco nutritivo, foi utilizado para recriar as condições do intestino posterior do triatomíneo. Os parasitos foram cultivados nesse meio a 28ºC durante 10 dias. A porcentagem de metaciclogênese foi determinada no quinto dia usando corante panótico;
A terceira metodologia testada foi adição de SFB ativo para induzir a lise dos epimastigotas no final da fase estacionária. 15 ml de cultura celular nesta fase de crescimento foram centrifugados a 1.600 x g por 10 min a temperatura ambiente. Em seguida, o sedimento foi ressuspendido em 7 ml de SFB ativo e incubado a 37ºC durante 24 h. Após esse período, os epimastigotas lisados sedimentam, enquanto que os tripomastigotas metacíclicos nadam na parte líquida. Lavagens sucessivas desse sobrenadante foram feitas com PBS 1X, centrifugando a 740 x g durante 10 min. A porcentagem de metaciclogênese foi determinada pela coloração de panótico e os parasitos ressuspendidos em PBS para a infecção;
