Obtenção do extrato hidroalcoólico da folha de nogueira (juglans regia l.) E identificação de parâmetros físico-químicos e microbiológicos para múltiplas aplicações / Obtaining hydro-alcoholic extract from walnut leaf (juglans regia l.) And parameter iden

(1)

Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p.56116-56127 aug. 2020. ISSN 2525-8761

Obtenção do extrato hidroalcoólico da folha de nogueira (juglans regia l.) E

identificação de parâmetros físico-químicos e microbiológicos para múltiplas

aplicações

Obtaining hydro-alcoholic extract from walnut leaf (juglans regia l.) And

parameter identification physical-chemical and microbiological for several

applications

DOI:10.34117/bjdv6n8-140

Recebimento dos originais: 12/07/2020 Aceitação para publicação: 12/08/2020

Bruna Calixto de Jesus

Graduanda em Nutrição pela Universidade Nove de Julho (Uninove) Programa de Iniciação Científica - Departamento de Ciências da Saúde Endereço: Rua Vergueiro, 235/249 – Liberdade 01525-000 São Paulo/SP

E-mail: brunacalixto.j@hotmail.com

Camila Shiokawa Kakazu

Graduanda em Nutrição pela Universidade Nove de Julho (Uninove) Programa de Iniciação Científica - Departamento de Ciências da Saúde Endereço: Rua Vergueiro, 235/249 – Liberdade 01525-000 São Paulo/SP

E-mail: camilashiokawa@hotmail.com

Letícia Alves Luciano

Bacharela em Farmácia pela Universidade Nove de Julho (Uninove) Programa de Iniciação Científica - Departamento de Ciências da Saúde Endereço: Rua Vergueiro, 235/249 – Liberdade 01525-000 São Paulo/SP

E-mail: leticialuciano51@gmail.com

Ester Regina Gomes Tito

Bacharela em Nutrição pela Universidade Nove de Julho (Uninove) Programa de Iniciação Científica - Departamento de Ciências da Saúde Endereço: Rua Vergueiro, 235/249 – Liberdade 01525-000 São Paulo/SP

E-mail: estertitogomes@gmail.com

Elineides Santos Silva

Mestra em Biofotônica Aplicada às Ciências da Saúde pela Universidade Nove de Julho (Uninove)

Orientadora do Programa de Iniciação Científica – Departamento de Ciências da Saúde Endereço: Rua Vergueiro, 235/249 – Liberdade 01525-000 São Paulo/SP

(2)

RESUMO

Conhecida como Noz-da-Pérsia ou Noz comum, a Nogueira apresenta diversas propriedades farmacologicamente ativas com uso medicinal, inclusive. Extratos são obtidos de matérias-primas vegetais com uso de um solvente caracterizado pela baixa toxicidade e/ou baixo potencial de poluição ambiental. As plantas podem produzir metabólitos secundários como óleos essenciais, compostos fenólicos, terpenos, alcaloides etc., que poderão produzir efeitos terapêuticos. As características físico-químicas desses produtos podem ser influenciadas pela localização geográfica, idade da planta, condições climáticas, características do solo, tipo de extração. Despertou-se o interesse na Nogueira devido à escassez de informações sobre suas características e utilização. Foi utilizado o álcool 70° como solvente hidroalcoólico na obtenção do extrato da folha de Nogueira e posterior identificação das propriedades físico-químicas e microbiológicas para aplicações diversas. Utilizou-se álcool etílico hidratado 70° (v/v), folha de Nogueira seca (Farmaervas), filtro de papel descartável (n° 102), balança de precisão (0,0001 g) no laboratório cedido pela Uninove. Executou-se 3 vezes no mesmo dia, sob as mesmas condições. Após pesagem de 5 g da folha seca de Nogueira sem os talos, foi feita a maceração manual com o acréscimo gradativo do solvente, até volume máximo de 150 ml. O conteúdo foi transferido para um béquer, e colocado coberto no agitador em velocidade máxima por 2 horas ininterruptas. Depois, o extrato ficou em repouso por 72 horas à temperatura ambiente (25 ± 3 °C). Após o repouso, fez-se a filtragem, o volume foi completado para 150 ml com o solvente. Em seguida, submetido às análises. Foram obtidos e tabelados os parâmetros microbiológicos e físico-químicos da amostra. Diversos são os fatores que podem influenciar a eficiência da extração e as características obtidas: densidade, pressão, temperatura, vazão do solvente. As aplicações dos extratos vegetais são diversas podendo ser através dos alimentos, cosméticos e medicamentos. Destaca-se ainda a aplicação para o controle de pragas agrícolas, como repelentes, bactericida e fungicida, inibidores de micotoxinas e relevante capacidade antioxidante. Evidencia-se a importância de maior exploração das características do referido composto com o objetivo de melhor subsidiar suas aplicações e oferecer maior segurança ao uso.

Palavras–chave: Extrato natural, Extrato hidro alcoólico, Nogueira, Juglans regia L, Folha de

Nogueira.

ABSTRACT

Known as Persian Walnut or Common Walnut, Walnut has several pharmacologically active properties with medical use, inclusive. Extracts are obtained from vegetable raw materials using a solvent characterized by low toxicity and / or low potential for environmental pollution. Plants can produce secondary metabolites such as essential oils, phenolic compounds, terpenes, alkaloids and etc., which can produce therapeutic effects. The physical and chemical characteristics of these products can be influenced by geographic location, plant age, climatic conditions, soil characteristics, type of extraction. Interest in Walnut was aroused due to the lack of information about its characteristics and use. Was used 70° alcohol as a hydro-alcoholic solvent to obtain the Walnut leaf extract and later identification physico-chemical and microbiological properties for different applications. 70° (v / v) hydrated ethyl alcohol, dry Walnut leaf (Farmaervas), disposable paper filter (No. 102), precision scale (0.0000035oz) were used in the laboratory provided by UNINOVE. It was performed 3 times on the same day, under the same conditions. After weighing 0,17637oz of the dry walnut leaf without the stems, manual maceration was performed with the gradual addition of the solvent, up to a maximum volume of 5,0721fl oz. The contents were transferred to a beaker, and placed covered on the agitator at maximum speed for 2 hours uninterrupted. Then, the extract was left to stand for 72 hours at room temperature (77 ± 37,4 °F). After resting, filtration was performed, the volume was made up to 5,0721fl oz with the solvent.

(3)

Then submitted to analysis. The microbiological and physical-chemical parameters of the sample were obtained and tabulated. There are several factors that can influence the extraction efficiency and the characteristics obtained: density, pressure, temperature, solvent flow. Are several the applications of plant extracts like in through food, cosmetics and medicines. It is possible the application for the control of agricultural pests, such as repellents, bactericide and fungicide, mycotoxin inhibitors and relevant antioxidant capacity. The importance of further exploration of the characteristics of this compound is evidenced, in order to better subsidize its applications and offer greater safety to use.

Keywords: Natural extract, Hydro alcoholic extract, Walnut, Juglans regia L, Walnut Leaf.

1 INTRODUÇÃO

O estudo de revisão de Andreo e Jorge (2006)1 mostrou que a extração com solventes orgânicos é frequentemente utilizada para obtenção de compostos bioativos, isto é, apresenta efeito em um organismo vivo, tecido ou célula. Segundo Delaviz, Mohammadi, Ghalamfarsa et al. (2017)2, Juglans regia L., é o nome científico da Nogueira, também chamada de Noz Persa, mas popularmente intitulada apenas por Noz. Pertencente à família Juglandaceae, é uma espécie que consegue se adaptar na maioria dos continentes. As Nogueiras são árvores com altura entre 10 a 25 m, geralmente. Eles têm flores masculinas e femininas sendo chamadas de plantas monoicas ou hermafroditas. Durante o período de inverno, as Nogueiras podem suportar até 11°C negativos (-11 ºC)².

Após apurado levantamento bibliográfico pôde-se concluir que há diversos estudos referentes ao fruto (Noz Persa) da Juglans regia L., porém é fatídico que não há embasamento da literatura referente as folhas, mesmo que muitos artigos relatam haver uma concentração maior de propriedades benéficas na folha do que no fruto. No Brasil, apesar da diversidade botânica, ainda existem muitos alimentos e plantas cujas características físico-químicas, microbiológicas, nutricionais e terapêuticas não são catalogadas, em razão da carência de pesquisas. Diante do contexto, Juglans regia L., foi escolhida para estudo, podendo assim contribuir com a literatura científica, sendo um importante instrumento e fonte de informações para futuras aplicações.

Sabe-se que a Nogueira (Juglans regia L.) apresenta propriedades com ação antioxidante, anti-hipertensiva, anti-inflamatória, hipolipemiante, antimicrobiana e antifúngica além de auxiliar o controle do índice glicêmico e atuar na prevenção e tratamento do câncer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Apresenta elementos nutricionais básicos de extrema importância, além de ser protetor dos rins que, de acordo com os ensaios feitos por Ahn, Song, Kim et al. (2002)7 observaram que a administração do extrato de Nogueira teve um impacto significativo no tratamento da insuficiência renal aguda induzida e

(4)

pode ser eficaz na regeneração dos néfrons, in vitro, ou in vivo. O resultado da dissertação feito por Andreo e Jorge (2006)1 ratifica que a folha de Nogueira é fonte de flavonoides. Os flavonoides têm propriedades antioxidantes que, através da regulação imune e atividades anticancerígenas, inibem o efeito oxidativo das células 3. Nota-se que, diante das evidências sobre os benefícios e propriedades observadas do fruto da Nogueira, ainda são escassos os estudos que tratam as propriedades das folhas. Este trabalho intenciona contribuir com a literatura através da obtenção do extrato de folha de nogueira de forma a prospectar o interesse em suas propriedades e possibilidades de aplicação.

2 OBJETIVO

Utilizar o álcool 70° como solvente hidroalcoólico na obtenção do extrato da folha de Nogueira e identificar propriedades físico-químicas e microbiológicas para aplicações diversas.

3 METODOLOGIA

3.1 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

O trabalho teve como início um apurado levantamento bibliográfico na literatura científica de artigos nacionais e internacionais. Foram pesquisados artigos científicos em banco de dados da

SciELO, BIREME e PUBMED, com as seguintes palavras-chaves: Extrato natural. Extrato hidro

alcoólico. Nogueira. Juglans. regia L., Folha de Nogueira. O preceito de escolha foi de artigos a partir do ano de 2002 a 2019. Inicialmente foram escolhidos em torno de 32 artigos que, após criteriosa leitura, 23 foram selecionados para compor o trabalho.

A conferência foi desenvolvida com base na literatura disponível e não foram encontrados estudos sobre a obtenção do extrato da folha Juglans regia L. Após a análise dos artigos e vista a necessidade da exploração da folha de Nogueira, foi feito o experimento para obtenção do extrato hidroalcoólico com identificação de seus respectivos parâmetros físico-químicos e microbiológicos.

3.2 MATERIAIS

Para a etapa experimental utilizamos: Àlcool 70º (70:30 v/v); Pinça; Balança de precisão (0,0001 g); Almofariz; Béqueres; Espátula;

(5)

Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p.56116-56127 aug. 2020. ISSN 2525-8761 Pistilo;

Funil;

Falcons de 50 ml; Agitador;

Filtro de papel descartável (nº 102); Frasco âmbar com tampa (500 ml); Papel Alumínio;

Folha de nogueira seca (Farmaervas).

3.3 OBTENÇÃO DAS FOLHAS DA NOGUEIRA (JUGLANS REGIA L.)

As folhas secas da Nogueira foram obtidas da loja comercial Farmaervas, especializada em fitoterápicos e ervas medicinais, a qual apresenta minimamente informações sobre data de fabricação e/ou lote, nome popular, nome científico e informações do fabricante. Foi feito o uso de um único lote e fornecedor para reduzir viés experimental.

3.4 OBTENÇÃO DO EXTRATO

O trabalho foi desenvolvido no laboratório de pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) no campus Vergueiro. Foi feita a maceração dinâmica com uso de álcool etílico 70º para obtenção de solução sólido-líquido (m/v). Para esse procedimento, o produto deverá estar em temperatura ambiente, caracterizando uma extração convencional a frio. Devido à alterações oriundas do emprego da temperatura, o método de maceração a frio foi escolhido a fim de minimizar viés experimental. Ainda, é importante salientar que a maceração a frio não é capaz de esgotar a extração dos compostos presentes na folha.

Com base em protocolos de extração usualmente praticados, foram preparados 3 extratos com uso de álcool 70º. Em cada experimento, submetemos 5g de folhas secas da nogueira à maceração com acréscimo de 150 ml do álcool etílico hidratado (70º INPM) durante 15 minutos num recipiente de porcelana. Ao final do processo, o produto obtido foi transferido para um béquer envolto e coberto com papel alumínio para evitar a exposição à luz e colocado em um agitador em velocidade máxima (1500 a 1700 rpm) por 2 horas em temperatura ambiente. Após esse período, foi submetido ao repouso por 72 horas em temperatura ambiente ao abrigo da luz com uso de papel alumínio cobrindo todo o recipiente. Dada as 72 horas, com o auxílio de um filtro de papel (nº102) e um funil, filtrou-se o conteúdo do béquer, transferindo para um frasco de vidro devidamente limpo e autoclavado, previamente envolto em papel alumínio. Após filtrado, foi completado com o

(6)

reagente para volume final de 150 ml. Ao final, retirou-se uma alíquota de 50 mL que foi depositada em um Falcon de 50 ml, e transferiu-se o restante para um frasco âmbar devidamente identificado e armazenado sob refrigeração até 4ºC.

4 RESULTADOS

4.1 PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS:

As amostras foram conduzidas para o laboratório Food Intelligence®, especializado em análises microbiológicas e físico-químicas. Foram obtidos os parâmetros microbiológicos, conforme apresentados a seguir:

Tabela 1: Método analítico: contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos pelo método Plate Count Ágar a 30°C; Detecção de coliformes totais, termotolerantes e Escherichia Coli por meio de VRB agar.

Fonte: Elaborado pelo autor.

A Contagem Padrão em Placas (CPP) foi feita através do indicador Plate Count Ágar que identifica as populações gerais bacterianas em alimentos, águas, entre outros, sendo utilizada para se obter informações gerais sobre a qualidade de produtos8. Em concordância com o artigo explorado, pode-se confirmar que as bactérias do grupo Coliforme são consideradas como um dos principais grupos de microrganismos prenúncio de qualidade do produto alimentício, sendo um dos indicadores de segurança do produto a ser consumido9, pois assim é possível identificar se o alimento está seguindo as condições higiênico-sanitárias. Segundo Morelli (2017)10 esse grupo é dividido em Coliformes Totais e Coliformes Termotolerantes ou Fecais, sendo assim o resultado das amostras foram expressos em Unidade Formadora De Colônia(UFC/g) para todos os indicadores, os valores da amostra do extrato estudado, denotou uma contagem menor que 10 UFC/g, porém não existem parâmetros pertinentes a seguridade de extratos vegetais, mas tomando como base as drogas vegetais, pode-se considerar uma amostra segura, pois os resultados referentes a Contagem Padrão em Placas(CPP), Coliforme Totais e Coliformes Fecais estão satisfazendo as exigências contidas na instrução normativa da Agência Nacional de Vigilância Sanitária11.

(7)

Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p.56116-56127 aug. 2020. ISSN 2525-8761 4.2 PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS

Tabela 2: Método analítico: Determinação eletrométrica do pH; Determinação da Densidade a 20°C; Teor de Umidade e Voláteis e Sólidos totais por gravimetria; Sólidos Solúveis (°Brix) e Índice de Refração. Certificado de

ensaio nº FI 1892.

Fonte: Elaborado pelo autor

Para a medição do pH utilizou se o Peagâmetro, onde pode-se ver a escala do composto, mostrando se é ácida, neutra ou básica. O produto estudado apresentou característica ligeiramente ácida, visto que o valor de pH encontrado é 5,65 g / ml, abaixo da neutralidade. Adiante tem-se a tabela que foi utilizada para identificação do pH do extrato hidro-alcoólico da folha de Nogueira.

Tabela 3: Escala de pH (Potencial Hidrogeniônico).

Fonte: Adaptado de www.todamateria.com.br

A densidade (D= Massa/Volume) é uma propriedade física importante e apresenta a relação entre a massa (dada em gramas ou quilos) e o volume (dado em mililitros ou litros). Esse parâmetro é de extrema importância na aplicação industrial para fabricação de alimentos e cosméticos pois interfere diretamente na textura, espalhabilidade, homogeneidade e qualidade final do produto. A densidade é também utilizada na identificação e no controle de qualidade de um determinado produto industrial, bem como ser relacionada com a concentração de soluções12. A relação existente entre a massa e o volume do material, resultou em 0,88. Relativo à umidade do extrato o resultado foi de 99,48 g / 100 ml. Brix (°Bx) é uma escala numérica que mede a quantidade de sólidos solúveis em uma solução de sacarose. A escala Brix é utilizada na indústria de alimentos para medir a quantidade aproximada de açúcares em matérias-primas e produtos alimentícios13. O valor de sólidos solúveis encontrado no extrato hidro-alcoólico foi de 20,63 % (g/100ml - m/v). Na escala de cores o produto final ficou identificado no número 4, de acordo com a tabela utilizada a qual se tem caráter informativo, com objetivo de identificar variações no produto com relação a sua cor para

(8)

alguma aplicação específica, como exemplo em alimentos, do qual seria capaz de trazer modificações no produto final, ou em cosméticos, podendo alterar as características inicias ou finais do produto. Essa transformação de cor pode ter influências de diversos fatores, como a composição da planta, tipo de solvente utilizado, produtos obtidos pela extração, quantidade utilizada, tempo de exposição e variáveis físico-químicas ou até mesmo microbiológicas.

Tabela 4: Escala visual de cores

Fonte: Elaborado pelo autor

5 DISCUSSÃO

Extratos são definidos como preparações concentradas podendo ser apresentadas sob diversas consistências, obtidas a partir de matérias-primas vegetais, que passaram ou não por tratamento prévio (inativação enzimática, moagem, secagem, etc.) e preparadas por processos envolvendo um solvente14, ou seja, o modo de extração depende do objetivo final para utilização do produto ou dos resultados a serem investigados. A extração consiste numa operação de transferência de massa, onde os sólidos solúveis e voláteis podem migrar para o solvente devido ao contato contínuo e técnicas auxiliares, como a maceração15.O extrato líquido da folha de Nogueira foi obtido através do solvente álcool 70º. Segundo Filho (1997)16, o solvente que apresenta melhor custo-benefício e vantagens na obtenção é o álcool 70º pois também tem ação antimicrobiana, contribuindo para o shelf life do produto e manutenção das características inicias. A utilização do álcool 70º é muito popular, por se tratar de um recurso de desinfeção imediato, acessível e econômico, que sucede com a eliminação de microrganismos, além disso, ele é um solvente muito utilizado por conta do preço somado aos seus diversos benefícios17.

Determinado estudo evidenciou que a utilização de solvente etanol combinado com ácido acético (70%: 2%, v / v), ultrassom e temperatura a 57ºC por 20 minutos, mostrou que a extração de composto fenólico da flor aromática Dendranthema Indicum Var, foi mais eficiente10. Observa-se uso crescente de compostos antimicrobianos naturais para a produção de aditivos alimentares.

(9)

Isso se dá devido ao desejo dos consumidores de evitar conservantes químicos2, ratificando que os conservantes químicos podem ser prejudiciais à saúde dos consumidores e provocam danos ao meio ambiente18. Segundo Amaral, Seabra, Andrade et al. (2004)19, as folhas de Nogueira podem ser primordiais para aplicação como agente antimicrobiano no tratamento de infecções gastrointestinais humanas e no tratamento de infecções causadas pela bactéria do gênero Propionibacterium acnes pois os elementos metabólicos provenientes das folhas de Nogueira demonstraram uma forte atividade tópica para tratamento cutâneo 20, 21.

O uso de plantas para fins terapêuticos é tão antigo quanto a espécie humana e, muitas vezes, o conhecimento sobre plantas medicinais é o único e mais acessível recurso terapêutico de comunidades e grupos étnicos22, ou seja, já é de senso comum o conhecimento sobre as propriedades curativas de diversas plantas, mas estudos aprofundados e com rigor científico são necessários para que fortaleçam essas informações. Com base no exposto, as folhas de Nogueira apresentam diversas propriedades interessantes, especialmente no que se refere a prevenção e controle das Doenças Crônicas Não Transmissíveis (DCNT) como diabetes tipo 2, hipertensão e câncer além da riqueza de antioxidantes 1,2,3, 4, 5. Akram, Olamafar, Zaringhalam et al. (2011)23 denotaram que o extrato hidro-alcoólico das folhas de Nogueira pode exercer importante ação protetora ao fígado através da mitigação de radicais livres e dos danos oxidativos imbuídos pelo tetracloreto de carbono. É interessante também destacar o uso da noz comum para o controle de pragas agrícolas, na formulação de repelentes, bactericidas, fungicidas e inibidores de micotoxinas e na fabricação de produtos com relevante capacidade antioxidante.

6 CONCLUSÃO

O presente trabalho possibilitou verificar que o método de extração é relevante, pois sem isso não seria capaz utilizar os benefícios que as plantas medicinais proporcionam, tendo em vista o cenário epidemiológico mundial e confirmando que os estudos destas plantas possuem impactos positivos na prevenção de doenças e tratamento delas. O resultado do uso do álcool 70º como solvente para extração da folha de Nogueira configura que é possível obter proventos para a população, com um solvente de baixo custo. A utilização de produtos naturais tem impacto positivo para a sociedade e natureza, permitindo enfatizar que além de incentivar a utilização de recursos naturais, também há valorização de propriedades de macronutrientes e micronutrientes necessários ao organismo, para uma vida saudável e com qualidade. O número de doenças crônicas não transmissíveis têm aumentado e esse fato é, também, proporcionado pela alimentação, além de outros fatores. A Nogueira (Juglans regia L.) apresenta elementos nutricionais e propriedades

(10)

físico-químicas de extrema importância. Fundamentado pelo processo de obtenção do extrato vegetal apresentado nesse estudo, podemos visar o uso dessas propriedades na indústria alimentícia, agropecuária, cosmética e farmacêutica, com baixo impacto ambiental e resultados promissores.

Este projeto possibilitou reconhecer que diversos são os fatores que podem influenciar a eficiência da extração e as características obtidas: densidade, pressão, temperatura e vazão do solvente. Evidencia-se a importância de maior exploração das características do referido composto, com o objetivo de melhor subsidiar suas aplicações e oferecer maior segurança ao uso.

(11)

REFERÊNCIAS

1. Andreo D, Jorge N. Antioxidantes Naturais: Técnicas de extração. Boletim Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos. 2006; 24 (2): 319-336.

2. Delaviz H, Mohammadi J, Ghalamfarsa G, Mohammadi B, Farhadi N. A Review Study on Phytochemistry and Pharmacology Applications of Juglans regia Plant. Rev. Pharmacogn. 2017; 11(22):145‐152.

3. Pollegioni P, Woeste K, Chiocchini F, Del Lungo S, Ciolfi M, Olimpieri I, et al. Rethinking the history of common walnu (Juglans regia L.) in Europe: Its origins andhuman interactions; 2017; 12(3):1-24 [internet]. [Acesso em 25 mai 2019]. Disponível em: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0172541

4. Liu MC, Yang SJ, Hong D, Yang JP, Liu M, Lin Y et al. A simple and convenient method for the preparation of antioxidant peptides from walnut (Juglans regia L.) protein hydrolysates. Chem Cent J. 2016; 10-39.

5. Raafat K. Phytochemical analysis of Juglans regia oil and kernel exploring their antinociceptive and anti-inflammatory potentials utilizing combined bio-guided GC–FID, GC–MS and HPLC analyses. Revista Brasileira de Farmacognosia 2018; 28(3): 358-368 [internet]. [Acesso em 26 mai

2019]. Disponível em:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0102695X17306865?via%3Dihub

6. Panth N, Paudel KR, Karki R. Phytochemical profile and biological activity of Juglans regia. J Integr Med 2016; 14, (5):359-373.

7. Ahn CB, Song CH, Kim WH, Kim YK. Effects of Juglans sinensis dode extract and antioxidant on mercury chloride-induced acute renal failure in rabbits. J Ethnopharmacol; 2002. Vol: 82, p.45-49.

8. Plate Count Ágar. [Bula]. Rua Cassemiro de Abrel, 521- Vargem Grande 83.321-210 Pinhais/PR. Laboratorio de Análises Clínicas Laborclin LTDA; 2018.

9. Sousa CP. Segurança alimentar e doenças veiculadas por alimentos: Utilização do grupo coliforme como um dos indicadores de qualidade de alimentos. Rev APS, 2006: 9(1):83-88 [internet]. [Acesso em 20 de Jul de 2019]. Disponível em: http://www.ufjf.br/nates/files/2009/12/Seguranca.pdf

10. Morelli AMF. Escherichia coli O157:H7: Ocorrência em ambiente de produção de leite na microrregião de Viçosa, adesão em diferentes superfícies e resistência a sanitizantes [tese]. Minas Gerais: Universidade Federal de Viçosa; 2008.

11. Brasil. Ministério da Saúde/Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução da Diretoria da Colegiada (RDC) Nº 10, de 9 de março de 2010. Dispõe sobre a notificação de drogas vegetais junto à Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e

dá outras providências. [Online]. Disponível em:

(12)

12. Marco JC, Paoli A, Andrade JC. A Determinação da Densidade de Sólidos e Líquidos. Chemkeys-liberdade para a prender 2004; 1-8.

13. Pilling S. Prática 11 – Refratometria. Determinação do índice de refração de líquidos. Universidade do Vale do Paraíba-SP 2017; 1-8 [internet]. [Acesso em mai de 2019]. Disponível em: https://www1.univap.br/spilling/FQE2/FQE2_EXP11_Refratometria.pdf

14. Extratos vegetais. Revista Food Ingredientes Brasil 2010; 11: 16-20.

15. Dutra LS. Desenvolvimento e Validação de Metodologia Analíticas para Quantificação ß ensina em extratos de Aesculus hippocastanum L. (Castanha da Índia) [dissertação]. Juiz de Fora: Universidade Federal de Juiz de Fora; 2012.

16. Filho VC. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade Departamento de Química - Universidade Federal de Santa Catarina, 1997; 99-105 [internet]. [Acesso em 07 de jun 2019]. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n1/3475.pdf

17. Longhini R, Raksa SM, Oliveira ACP, Svidzinski TIE, Franco SL. Obtenção de extratos de própolis sob diferentes condições e avaliação de sua atividade antifúngica. Rev. Bras. Farmacogn 2007; 17 (3): 388-395.

18. Ganesh N, Akthar S, Shah TI. Preliminary Phytochemical Evaluation and Antibacterial Potential of Different Leaf Extracts of Juglana regia: A Ubiquitous Dry Fruit from Kashmir-India Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res 2013; 19 (2): 93-96.

19. Amaral JS, Seabra RM, Andrade PB, Valentão P, Pereira JA, Ferreres F. Phenolic profile in the quality control of walnut (Juglans regia L.) leaves. Food Chemistry; 2004.p.373–379

20. Chaleshtori AS, Chaleshtori RS, Chaleshtori FS, Rafieian M. Antibacterial effects of ethanolic extract of walnut leaves (Juglans regia) on propionibacterium acnes. J Adv Med Biomed Res 2010; 18 (71) :42-49.

21. Neves JR, Francesconi F, Costa A, Ribeiro BM, Follador I, Almeida LMC. Propionibacterium acnes e a resistência Bacteriana. Surg Cosmet Dermatol 2015;7 (3): 27-38.

22. Maciel MAM, Pinto AC, Veiga VF. Plantas medicinais: A necessidade de estudos multidisciplinares. Quím. Nova 2002; 25(3): 429-438.

23. Akram E, Olamafar S, Zaringhalam J, Rezazadeh S, Eidi M. Protective effect of Walnut (Juglans regia L.) extract against CCl4 – induced hepatotoxicity in rats. Induced hepatotoxicity in rats. Research in Medicine. 2011; 35 (2) :87-92 [internet]. Disponível em: [Acesso em 7 de jul 2019]. Disponível em: http://pejouhesh.sbmu.ac.ir/article-1-886-en.html.