ÍNDICE GERAL
Capítulo 1 - Introdução Geral 1
Capítulo 2 - Epidemiologia da Infecção HIV em STP 45 Capítulo 3 - Epidemiologia Molecular do HIV-1 em São Tomé e Príncipe 99 Capítulo 4 - Resistência Genotípica do HIV-1 151
Capítulo 5 - Conclusões Gerais 183
Referências Bibliográficas 187
ÍNDICE DETALHADO TÍTULO DEDICATÓRIA i AGRADECIMENTOS iii RESUMO vii ABSTRACT ix ÍNDICE GERAL xi
ÍNDICE DETALHADO xiii
LISTA DE FIGURAS & TABELAS xvii
LISTA DE ABREVIATURA xxi
Capítulo 1 - Introdução Geral 1
1.1. Descoberta da Síndroma da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) 3
1.2. Vírus da Imunodeficiência Humana 3
1.3. Fisiopatologia 5
1.4. Situação Epidemiológica Global da Infecção por HIV 7 1.5. Factores de Risco Associados a Transmissão de Infecção 11
1.6. Estrutura do Virião 12 1.7. Organização Genómica 13 1.8. Gene pol 16 1.8.1. Protease Viral 16 1.8.2. Transcriptase Reversa 17 1.8.3. Integrase 19 1.9. Ciclo Replicativo 19
1.10. Diagnóstico Laboratorial do HIV-1 21
1.10.1. Testes de Detecção de Anticorpos 21
1.10.1.1. Testes “Rápidos e Simples” 22
1.10.1.2. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) 22
1.10.1.3. Western Blot 22
1.10.1.4. Radioimunoprecipitação 23
1.10.1.5. Imunofluorescência Indirecta 23
1.10.2. Teste de Detecção de Antigénio 23
1.10.3. Técnicas de Cultura Viral 24
1.10.4. Testes de Amplificação dos Genomas Virais 24
1.11. Diversidade Genética do HIV-1 25
1.12. Classificação do HIV-1 27
1.13. Distribuição Geográfica das Variantes do HIV-1 32 1.14. População de Estudo: São Tomé e Príncipe 36
1.14.1. Situação Geo-morfológica 36
1.14.2. Perfis Histórico e Político 37
1.14.3. Divisão Administrativa 38
1.14.3.1. Distrito de Água Grande 39
1.14.3.2. Distrito de Mé Zóchi 39 1.14.3.3. Localidades e Domicílios 39 1.14.4. Características Sócio-Demográficas 40 1.14.4.1. Crescimento Demográfico 41 1.14.4.2. Estrutura Etária 42 1.14.4.3. Educação e Saúde 42 1.14.4.4. Indicadores Económicos 43
Capítulo 2 - Epidemiologia da Infecção HIV em STP 45 2. Objectivos 47 2. 1. Objectivos Gerais STP 47 2.1.1. Objectivos Específicos 47 2.2. Introdução 48 2.2.1. Epidemiologia Descritiva 48
2.2.2. Detecção dos Anticorpos Específicos dos HIVs 49
2.3. Material e Métodos 51
2.3.1. Inquérito de Seroprevalência dos HIVs em STP 51
2.3.2. Plano de Estudo 51
2.3.2.1. Definição da População de Estudo 53
2.3.2.2. Amostragem 53
2.3.2.2.1. Amostragem por Distrito 53
2.3.2.2.2. Amostragem por Localidade 54
2.3.2.2.3. Amostragem por Domicílio 54
2.3.3. Cálculo do Tamanho da Amostra 55
2.3.4. Instrumento de Medição ou Notação para Recolha de Dados 56 2.3.5. Definição Operacional das Variáveis de Estudo 57 2.3.5.1. Características “Sócio-Demográficas 57 2.3.5.2. “Factores de Risco de Transmissão por HIVs” 59 2.3.5.3. “Sintomas e Sinais” da Doença 60
2.3.6. Trabalhos de Campo 61
2.3.6.1. Aplicação dos Questionários 61
2.3.6.2. Colheita e Processamento de Amostras 62 2.3.6.3. Teste de Rastreio dos HIV1/2 (Testes Rápido/Simples) 62 2.3.6.4. Conservação e Transporte de Amostras 64 2.3.7. Diagnóstico Serológico Complementar 65 2.3.7.1. Imunoensaio de Fluorescência (ELFA) 65
2.3.7.2. Western Blot 66
2.38. Metodologia Estatística 69
2.4. Resultados 71
2.4.1. Caracterização da População de Estudo 71 2.4.1.1. Características “Sócio-Demográficas” 71 2.4.1.1.1. “Grupos Etários” 71 2.4.1.1.2. “Sexo” 72 2.4.1.1.3. “Distritos” e “Localidades” 73 2.4.1.1.4. “Filhos” 75 2.4.1.1.5. “Profissão/Ocupação” 76 2.4.1.1.6. “Viagem” 77
2.4.1.2. “Factores de Risco” Associados a Infecção HIV 79 2.4.1.2.1. “Transfusão Sanguínea” 79
2.4.1.2.2.“Cirurgia” 79
2.4.1.2.3.“Sangria”ou “Escarificação” 81
2.4.1.2.4. “Parceiro Sexual” 82
2.4.1.3. “Sinais e Sintomas da Infecção” 84
2.4.2. Diagnóstico Laboratorial 85
2.4.3. Correlação dos Anticorpos de HIV-1 na Amostra 88
2.5. Discussão 91
Capítulo 3 - Epidemiologia Molecular do HIV-1 em São Tomé e Príncipe 99
3.1. Objectivos Gerais 101
3.1.1. Objectivos Específicos 101
3.2. Introdução 102
3.2.1. Técnicas 102
3.2.2. Epidemiologia Molecular do HIV-1 em São Tomé e Príncipe 105
3.3. Material e Métodos 107
3.3.1. Tipo de Estudo 107
3.3.2. População e Amostras 107
3.3.3. Definição das Variáveis de Estudo 108
3.3.4. Colheita e Processamento de Amostras 108
3.3.5. Genotipagem 108
3.3.5.1. Extracção do RNA Viral 109
3.3.5.2. Amplificação do Gene pol de HIV-1 109 3.3.5.3. RT-PCR (reacção de transcrição reversa seguida por PCR) 110
3.3.5.4. PCR (amplificação do cDNA) 111
3.3.5.4.1. Quantificação do DNA por Electroforese 111 3.3.5.4.2. Purificação do DNA em Membrana “Microcon Spin Column” 112
3.3.5.5. Sequenciação do DNA 113
3.3.6. Determinação do Subtipo de HIV-1 114
3.3.6.1. Análise Filogenética das Sequências Nucleotídicas 114 3.3.6.2. Análise dos Alinhamentos Múltiplos 115 3.3.7. As Variantes CRF02_AGs Identificadas 116
3.3.8. Análise Estatística 117
3.4. Resultados 118
3.4.1. Características da Amostra 118
3.4.2. Variantes do HIV-1 Circulantes em STP: prevalência 119 3.4.2.1. Determinação por “HIVSeq Subtyping Tool” (Stanford Database) 121 3.4.2.2. Determinação por “REGA Subtyping Tool” 122 3.4.2.3. Discrepâncias Entre os Algoritmos Utilizados 123
3.4.2.4. Algoritmo jpHMM-HIV 130
3.4.3. Análise das Relações Filogenéticas entre os Vírus Subtipados 132 3.4.4. Análise das Relações Filogenéticas entre as CRF02_AG Identificadas em
STP e as de alguns Países da Costa Ocidental Africana 135
3.5. Discussão 141
Capítulo 4 - Resistência Genotípica do HIV-1 151
4.1. Objectivos Gerais 153
4.1.1. Objectivos Específicos 153
4.2. Introdução 154
4.2.1. Identificação de Mutações de Resistência aos ARVs 155 4.2.2. Caracterização das Mutações de Resistência 156 4.2.2.1. Inibidores da Transcriptase Reversa 157 4.2.2.1.1. Inibidores Análogos de Nucleosídeos (NRTIs) 157 4.2.2.1.2. Inibidores Não-Nucleosídeos (NNRTIs) 159 4.2.2.3. Inibidores de Protease Viral (PIs) 160
4.2.2.4. Inibidores da Fusão 161
4.2.2.5. Inibidores dos co-Receptores 161
4.2.2.6. Inibidores da Integrase 162
4.2.3. Testes de Resistência 163
4.2.3.1. Testes Fenotípicos 163
4.2.3.2. Testes Genotípicos 163
4.2.3.3. O “Fenótipo Virtual” 165
4.3. População, Material e Métodos 166
4.3.1. Mutações de Resistência e Polimorfismos 166
4.3.2. Análise Estatística 167
4.4. Resultados 168
4.4.1. Protease Viral 168
4.4.2. Mutações Associadas à Resistência a PIs: prevalência 170
4.4.3. Transcriptase Reversa 172
4.4.4. Mutações Associadas a Resistência aos NRTIs e NNRTIs 173
4.5. Discussão 177
5. Conclusões 182
Capítulo 5 – Conclusões Gerais 183
Referências Bibliográficas 187
Anexos 211
Anexo I - Questionários 213
Anexo II – Quadro 2.1. Classificação Portuguesa de Profissões de 1994 214 Quadro 2.2. Medidas de Localização e de Dispersão da Variável “Idade”
(x, SD, S’2, máx., min., P
25, P50, e P75) 214
Quadro 2.3. Distribuição por “Sexo”, “Distritos” e “Localidades” 214
Anexo. III 215
Quadro 3.1. Composição da “Master Mix RT” 215 Quadro 3.2. Composição da “Master Mix PCR”/Condições de
Realização de PCR 215
Quadro 3.3. Listagem das estirpes de referência ou não, extraídas do GenBank, e das bases de dados de Los Alamos e NCBI incluídas nas árvores filogenéticas
(Figuras 3.17, 3.18 – pg 132-4 e Figuras 3.20a, 3.20b – pg 137) 216 Quadro 3.4. Listagem de estirpes recombinantes e outras variantes incluídas em
árvore filogenética (Figura 3.21a, pg 139) 217 Listagem das estirpes CRF02_AGs dos países da Costa Ocidental Africana
ÍNDICE DE FIGURAS & TABELAS
Figuras
Figura 1.1. Evolução de Infecção por HIV no Hospedeiro Humano 6 Figura 1.2. Evolução da Virémia, TCD4+ e Estádio
Imunoclínico na Infecção de HIV 7
Figura 1.3. Número de Casos Estimados de Pessoas infectadas por
HIVs no Mundo, em Adultos e Crianças Ainda Vivos 8 Figura 1.4. Estimativa de Novas Infecções por HIV no Mundo 9 Figura 1.5. Estimativa de Número de Óbitos por HIV no Mundo 10 Figura 1.6. Representação Estrutural do Virião dos HIVs 13 Figura 1.7. Representação Genómica do HIV-1 14
Figura 1.8. Protease Viral 17
Figura 1.9. Representação Esquemática do Modelo Estrutural da
Transcriptase Reversa 18
Figura 1.10. Ciclo Replicativo do HIV-1 20
Figura 1.11. Distribuição Geográfica das Variantes Genéticas do HIV-1 28 Figura 1.12. Estrutura Mosaico de CRF01_AE do HIV-1 (CM240) 31 Figura 1.13. CRF02_AG (Estirpe de referência: IbNG, subtipos A, G) 31 Figura 1.14. CRF04_cpx (Estirpe de referência: 94CY032 - A, G, H, K, U) 32 Figura 1.15. CRF05_DF (Estirpe de referência: VI1310, subtipos D, F) 33 Figura 1.16. CRF06_cpx (Estirpe de referência: BFP90, Subtipos - A, G, J, K) 34 Figura 1.17. CRF09_cpx (Estirpe de referência: P2911 - CRF02_AG, U) 34 Figura 1.18. CRF36_cpx (Estirpe de referência: NYU830 - A, G, CRF01_AE,
CRF02_AG) 35
Figura 1.19. CRF37_cpx (Estirpe de referência: NYU926, Subtipos - A, G,
CRF01_AE, CRF02_AG, U) 35
Figura 1.20. Localização Geográfica do Arquipélago de S. Tomé e Príncipe 36 Figura 1.21. Divisão Administrativa de São Tomé e Príncipe 38 Figura 1.22. Distribuição da População Estrangeira por Nacionalidade 41 Figura 1.23. Crescimento Demográfico (STP, 1940-2001) 42 Figura 2.1. Fórmula para Calcular a Dimensão da Amostra (Daniel, 1999) 56 Figura 2.2. Anticorpos da Infecção por HIVs Medidos em 4 classes 64 Figura 2.3. Distribuição da População Estudada por “Grupos Etários” 72 Figura 2.4. Distribuição por “Sexo” na Amostra 72 Figura 2.5. Distribuição por “Grupos Etários” e “Sexo” na População de Estudo 73 Figura 2.6. Distribuição por “Grupos Etários” e “Sexo” (Água Grande) 74 Figura 2.7. Distribuição por “Grupos Etários” e “Sexo” (Mé Zóchi) 75 Figura 2.8. Existência de Filhos na População Inquirida 76 Figura 2.9. Deslocações Nacionais Internacionais 78 Figura 2.10. Relação “Transfusionados/Não Transfusionados” 79 Figura 2.11. Expostos/Não Expostos a “Cirurgia” 80
Figura 2.12. Antiguidade da “Cirurgia” 80
Figura 2.13. Expostos/Não Expostos a “Sangria” 81
Figura 2.14. Antiguidade da “Sangria” 81
Figura 2.15. “Número de Parceiros” 82
Figura 2.16. “Sinais e Sintomas possíveis da Infecção HIV” 84 Figura 2.17. Resultados Cruzados dos Dois Testes de Rastreio 85 Figura. 2.18. Distribuição dos HIV1/2 segundo
Figura 2.19. “Factores de Risco” possíveis de Transmissão dos HIVs em STP 87 Figura 3.1. Peso Molecular dos DNAs por Migração em Gel de Agarose 112 Figura 3.2. Os primers de PCR e Sequenciação usados no Sistema ViroSeq 113 Figura 3.3. Sequência Nucleotídica em Formato FASTA 115 Figura 3.4. Distribuição por Grupos Etários na Amostra 118 Figura 3.5a. Alinhamentos Múltiplos (Sequências Nucleotídicas - PR) 119 Figura 3.5b. Alinhamentos Múltiplos (Sequências Nucleotídicas - TR) 119 Figura 3.6. Distribuição das Variantes Virais de São Tomé e Príncipe
(HIVSeq SubtypingTool) 121
Figura 3.7. Prevalência das Variantes Virais de S. Tomé e P. (REGA Tool) 122 Figura 3.8. Estirpes Ambíguas, Recombinantes e não Recombinantes 125 Figura 3.9. Análise de Recombinação de ST52 (REGA Subtyping Tool) 125 Figura 3.10. ST80 em Análise de Recombinação (REGA Subtyping Tool) 126 Figura 3.11a. Análise de Recombinação dos Fragmentos de ST15 (Rega Tool) 127 Figura 3.11b. ST15 em Análise de Bootscaning (REGA Subtyping Tool) 127 Figura 3.12. Reavaliação por REGA S. Tool 128 Figura 3.13a. ST26 em Análise de Bootscaning (REGA S. Tool-1ª parte) 128 Figura 3.13b. ST26 em Análise de Bootscaning (REGA S. Tool-2ª parte) 129 Figura 3.14. Análise de Recombinação Genómica (jpHMM-HIV-1) 130 Figura 3.15. Estrutura Genómica de ST15 (REGA) 131 Figura 3.16. Estrutura Genómica da amostra ST15 (jpHMM-HIV-1) 131 Figura 3.17. Relações filogenéticas entre as sequências pol do HIV-1 dos vírus
subtipados e algumas seleccionadas na base de dados de Los Alamos 133 Figura 3.18. Árvore circular das sequências do gene pol do HIV-1 identificados
em STP e estirpes de referência 134
Figura 3.19. Relações filogenéticas entre as sequências do gene pol do HIV-1 das estirpes CRF02_AG de origem são-tomense 136 Figura 3.20a. Relações filogenéticas das sequências do gene pol de HIV-1
provenientes de residentes em STP e várias estirpes de subtipos e sub-subtipos do grupo M, seleccionados da base de
dados de Los Alamos 137
Figura 3.20b. Relações filogenéticas entre as sequências do gene pol HIV-1 das estirpes CRF02_AG de origem são-tomense e outras seleccionadas
aleatoriamente da base de dados de Los Alamos (árvore radial) 138 Figura 3.21a. Árvore com os recombinantes CRF02_AG de STP (azul) e outras
variantes seleccionadas da base de dados de Los Alamos 139 Figura 3.21b. Relações filogenéticas entre as sequências CRF02_AG de STP
e as de alguns países da Costa Ocidental Africana 140 Figura 3.22. Variantes Genéticas do HIV-1 em Angola 144 Figura 3.23. Variantes Genéticas do HIV-1 nos Camarões 144 Figura 3.24. Variantes Genéticas do HIV-1 do Gabão 145 Figura 3.25. Variantes Genéticas do HIV-1 da Guiné Equatorial 145 Figura 3.26. Variantes Genéticas do HIV-1 da Nigéria 145 Figura 4.1. Alinhamento Parcial das Sequências de Aminoácidos – Protease 169 Figura 4.2. Alinhamento Parcial das Sequências de Aminoácidos da RT 172 Figura 4.3. Mutações de Resistência detectadas em STP 176
Tabelas
Tabela 2.1. Distribuição por “Grupos Etários” e “Sexo” 73 Tabela 2.2. Distribuição das “Profissões/Ocupações” na Amostra Estudada 77 Tabela 2.3. Distribuição de “Parceiro sexual”por “Grupos Etários” 83 Tabela 2.4. Identificação dos casos de HIVs, utilizando dois testes de rastreio 85 Tabela 2.5. Distribuição dos HIVs e as Características “Sócio-Demográficas” 88 Tabela 2.6. Distribuição dos possíveis “Factores de Risco”
e anticorpos dos HIVs 89
Tabela 4.1. Polimorfismos na Protease 171
Tabela 4.2. Lista das Mutações Associadas à Resistência 173 Tabela 4.3. Polimorfismos Localizados nos sítios da Transcriptase Reversa 174
LISTA DE ABREVIATURAS A Alanina α Alfa β Beta ABC Abacavir ARV Antirretroviral ATV Atazanavir AZT Zidovudina BrEt Brometo de Etídio
C Cisteína
CDC Center for Disease Control and Prevention, USA CHST Centro Hospitalar de São Tomé
CRF “Circulating Recombinant Forms”
D Aspartato
DDI Didanosina DDC Zalcitabina DLV Delavirdine
DNA Ácido desoxirribonucleico cDNA Cadeia de DNA complementar DRV Darunavir
D4T Estavudina
E Glutamato
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético EFV Efavirenz
ETV Etravirina
F Fenilalanina
FDA Food and Drug Administration, USA FTC Emtricitabina
FPV Fosamprenavir
G Glicina
gp Glicoproteina
H Histidina
HIV-1 “Human Immunodeficiency Virus” type 1 HIV-2 “Human Immunodeficiency Virus” type 2
I Isoleucina
IDV Indinavir
K Lisina
L Leucina
LPV Lopinavir
LTR Long terminal repeat
M Metionina
ml Mililitro
µl Microlitro
N Asparagina
NFV Nelfinavir
N-TAMs Não Análogos da Timidina
ng Nanograma
NNRTI “Non-nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor” NRTI “Nucleoside/nucleotide Reverse Transcriptase Inhibitor”
NSI Não indutor de sincício NVP Nevirapina
OMS Organização Mundial de Saúde
P Prolina
pb Pares de bases nucleotídicas
PCR Reacção de polimerização em cadeia PI Inibidor da protease
PR Protease
Q Glutamina
R Arginina
RANTES “Regulated on T-cell activation, normal T-cell expressed and secreted” RTV Ritonavir
RNA Ácido ribonucleico RNase Ribonuclease
RT Transcriptase reversa
RT-PCR Reacção de transcrição reversa seguida por PCR
S Serina
SQV Saquinavir
STP São Tomé e Príncipe SI Indutor de sincício
SIDA Sindroma da Imunodeficiência Adquirida
T Treonina
TARV Terapêutica Antirretroviral
TAMs Mutações de Análogos da Timidina (Thimidine-Associated Mutations) TDF Tenofovir
TPV Tipranavir UV Ultra violeta
URF “Unique Recombinant Form”
V Valina
W Triptofano
Y Tirosina