UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
ÉLISTON COMPARIN
MARCAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE VEGF E COX-2 NO PROCESSO DE REPARO DE ENXERTO ÓSSEO PARTICULADO EM DEFEITO DE CALOTA CRANIANA
DE COELHOS E INIBIÇÃO DE COX-2
BAURU
2013
ÉLISTON COMPARIN
MARCAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE VEGF E COX-2 NO PROCESSO DE REPARO DE ENXERTO ÓSSEO PARTICULADO EM DEFEITO DE CALOTA CRANIANA
DE COELHOS E INIBIÇÃO DE COX-2
Tese apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Sagrado Coração, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor no Programa de Doutorado em Biologia Oral com área de concentração em Implantodontia, sob a orientação da Prof. Dra.
Mariza Akemi Matsumoto.
BAURU
2013
Comparin, Eliston C73727m
Marcação imuno-histoquímica de VEGF e COX-2 no processo de reparo de enxerto ósseo particulado em defeito de calota craniana de coelhos e inibição de COX- 2 / Eliston Comparin -- 2013.
59f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Mariza Akemi Matsumoto.
Tese (Doutorado em Biologia Oral – Cirurgia e
traumatologia bucomaxilofacial) - Universidade Sagrado Coração - Bauru – SP
1. Enxerto ósseo. 2. Reparo ósseo. 3. COX-2. 4.
VEGF. I. Matsumoto, Mariza Akemi. II. Título.
ÉLISTON COMPARIN
MARCAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE VEGF E COX-2 NO PROCESSO DE REPARO DE ENXERTO ÓSSEO PARTICULADO EM DEFEITO DE
CALOTA CRANIANA DE COELHOS E INIBIÇÃO DE COX-2
Tese apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Sagrado Coração, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor no Programa de Doutorado em Biologia Oral com área de concentração em Implantologia, sob a orientação da Prof. Dra. Mariza Akemi Matsumoto.
Banca examinadora:
__________________________________
Professora Dra. Mariza Akemi Matsumoto Universidade Sagrado Coração- USC __________________________________
Professor Dr. Rogério Leone Buchaim Faculdade de Odontologia de Bauru- FOB __________________________________
Professor Dr. Jesus Carlos Andreo Faculdade de Odontologia de Bauru- FOB __________________________________
Professor Dr Roberto Yoshio Kawakami Universidade Sagrado Coração - USC __________________________________
Professor Dr Paulo Henrique Weckwerth Universidade Sagrado Coração - USC
Bauru,11 de outubro de 2012.
Dedico este trabalho à minha mãe Nélsi Salete Comparin (in memorian), a pessoa mais incrível que tive oportunidade de conhecer, a maior incentivadora que tive para estudar e viver. Ao meu pai, meus irmãos Rodrigo e Daniel e a minha esposa que tanto amo.
AGRADECIMENTOS
À DEUS, pelo presente de ter nascido em uma família amorosa, carinhosa, honesta, dedicada. Por me fazer entender diariamente que a vida é algo fantástico, que o simples fato de estar vivo merece comemoração e agradecimento.
Ao meu amado avô Olindo Comparin, que com seus 88 anos de vida me ensina diariamente ser bondoso, honesto, alegre, cuidadoso.
Ao meu pai Darnes Comparin, que não mediu esforços e sacrifícios, junto com minha mãe, abdicando de confortos pessoais para que eu pudesse estudar. Ao seu exemplo diário de bom pai, companheiro e amigo de todas as horas.
À minha mãe Nélsi Salete Comparin (in memorian) pelo grande exemplo de vida.
Aos meus irmãos Rodrigo e Daniel Comparin.
À minha amada esposa Ellen Christina Inoue Comparin, companheira de todas as horas, de todas as viagens, de todos os desafios.
À minha orientadora Professora Doutora Mariza Akemi Matsumoto pelos ensinamentos, exemplo de grande pesquisadora. Pela paciência e compreensão nos momentos de dificuldades.
Aos alunos de Graduação do Curso de Odontologia da USC: Cláudia Biguetti e Gustavo Caviquioli, colegas de pesquisa, pelo cuidado como trataram os coelhos e o modo responsável como realizaram a pesquisa.
Ao colega de mestrado e agora Professor da USC: Leandro de Andrade Holgado pelas demonstrações cirúrgicas e ajuda nas cirurgias dos coelhos.
Aos técnicos do biotério da USC: Sérgio Henrique e Mateus, pelos cuidados que tiveram com nossos coelhos, pela boa vontade de estarem sempre dispostos a ajudar.
À técnica de laboratório de histologia: Maira Cristina Couto, pela confecção das lâminas histológicas e da análise imunoistoquímica.
À Professora Sandra Simeão Fiorelli, pelo auxílio com a análise estatística.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio na fomentação desta pesquisa (Processo n 2008/11485-7).
Aos colegas de Mestrado: Luis Augusto Bombassaro e Emilio Jose Marquardt Filho.
Aos colegas de doutorado: Eduardo Moreschi e Leonardo Mendes Campos. Aos também colegas de mestrado e agora de doutorado, muito mais do que simples colegas irmãos por afinidade Hernando Valentim, Francisco Giraldi e Diogo Rubim.
Aos funcionários da USC, principalmente aqueles envolvidos diretamente no programa de doutorado.
À USC, pela oportunidade de cursar mestrado e doutorado em uma das mais reconhecidas instituições de ensino odontológico deste país.
“Na vida, não vale tanto o que temos, nem tanto importa o que somos. Vale o que realizamos com aquilo que possuímos e, acima de tudo, importa o que fazemos de nós!”
CHICO XAVIER
RESUMO
Os grandes benefícios alcançados com as reabilitações bucomaxilofaciais, especialmente no que diz respeito à reabilitação dentária com os implantes osteointegráveis, incentivam o desenvolvimento de técnicas e materiais; bem como o aprimoramento na compreensão dos mecanismos de reparo tecidual, diretamente envolvidos no processo reabilitador. O presente estudo objetivou analisar o efeito da inibição da ciclo-oxigenase 2 (COX-2) durante o reparo de enxerto ósseo particulado em defeito de calota craniana de coelhos.
Vinte e quatro coelhos machos tipo Nova Zelândia foram divididos em dois grupos: Grupo Controle: tratados com soro fisiológico 0,9%; Grupo Anti-inflamatório não esteroidal (AINE): tratados diariamente com etoricoxibe na dose de 6mg/Kg por via oral. Após os períodos de 7, 14 e 30 dias os animais foram eutanasiados e as áreas enxertadas removidas para análises morfológica microscópica, histomorfométrica e imuno- histoquímica para COX-2 e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os dados da análise histomorfométrica foram submetidos ao teste estatístico de Mann-Whitney (porcentagem), onde se observou diferença estatisticamente significante entre o grupo controle (197 mediana dos pontos) e o grupo AINE (59 mediana dos pontos) para o período de 14 dias e (237 mediana dos pontos) e (68,5 mediana dos pontos) respectivamente para o período de 30 dias. Na análise imuno-histoquimica, utilizando a proteína COX-2 como marcador, observamos que no período de 14 dias, houve uma formação óssea mais evidente no grupo controle, indicando que a ausência do AINE melhorou o reparo ósseo neste período. Concluímos que o uso de AINE atrasou o processo de reparo ósseo para o Grupo AINE no período de 14 e 30 dias.
Palavras Chaves: COX-2.Enxerto ósseo. Reparo ósseo. VEGF.
ABSTRACT
The major benefits achieved with maxillofacial rehabilitation, especially with regard to rehabilitation with dental implants osteointegráveis, encourage the development of techniques and materials, as well as the improvement in the understanding of the mechanisms of tissue repair, rehabilitation directly involved in the process. The present study aimed to analyze the effect of inhibition of cyclooxygenase 2 (COX-2) during repair of bone graft particulate calvarial defect of rabbits. Twenty-four New Zealand male rabbits type were divided into two groups: Control group: treated with 0.9% saline, Group nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID): etoricoxib treated daily with a dose of 6mg/kg orally. After periods of 7, 14 and 30 days the animals were euthanized and the grafted areas removed for microscopic morphological analysis, histomorphometry and immunohistochemistry for COX-2 and vascular endothelial growth factor (VEGF). Data from histomorphometric analysis were subjected to the Mann-Whitney test (percent), where there was a statistically significant difference between the control group (median 197 points) and the NSAID group (median 59 points) for the period and 14 days (median 237 points) and (median 68.5 points) respectively for 30 days. In immunohistochemical analysis using the COX-2 protein as a marker, we found that in 14 days, there was a more obvious bone formation in the control group, indicating that the absence of NSAIDs, improved bone healing in this period. We conclude that the use of NSAIDs delayed bone repair process for the Group NSAID within 14 and 30 days.
Keywords: Bone repair. Bone grafting. COX-2. VEGF
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 12
2 .DESENVOLVIMENTO ... 13
2.1 REVISÃO DA LITERATURA... 13
2.1.1 ENXERTOS ÓSSEOS AUTÓGENO PARTICULADOS... 13
2.1.2 CICLOOXIGENASE-2... 15
2.1.3 FATOR DE CRSCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR... 17
2.2. OBJETIVOS... 19
2.3 MATERIAL E MÉTODOS ... . 20
2.3.1 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO... 20
2.3.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA MICROSCÓPICA... 23
2.3.3 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA... 23
2.3.4 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA... 24
2.3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 25
3. ARTIGO CIENTÍFICO ... 26
4. CONCLUSÃO ... 52
REFERÊNCIAS... 53
ANEXO... 57
1. INTRODUÇÃO
O cirurgião-dentista é desafiado diariamente pela necessidade de recuperar a perda óssea em seus pacientes, devido a vários fatores etiológicos. Devolver a estes pacientes uma função mastigatória aceitável associada a um sorriso harmônico significa um trabalho árduo no consultório odontológico. Várias técnicas de enxertos ósseos ou substitutos ósseos tem sido utilizadas com o objetivo de devolver ao paciente uma condição mínima necessária para uma reabilitação com a utilização de implantes odontológicos osteointegráveis.
Nas últimas décadas, diversos estudos têm buscado compreender melhor os fenômenos moleculares e celulares envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos. Em relação aos estudos sobre reparo ósseo, têm-se buscado entender a regulação da aposição e reabsorção óssea. O avanço nesta área poderá contribuir para o desenvolvimento ou melhora no tratamento de perdas ósseas, diminuindo o tempo de reparo.
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) pode ativar ou regular uma grande variedade de funções celulares, estimulando a diferenciação, proliferação e migração celular. Possui efeito sobre células da mesma classe ou sobre células de outras classes dentro do tecido, podendo agir localmente ou como reguladores sistêmicos do metabolismo esquelético, possuindo ação direta e importante tanto no crescimento celular, como na aposição e reabsorção óssea. O VEGF é identificado como o principal regulador da vasculogênese e angiogênese durante o desenvolvimento. Os macrófagos e os queratinócitos da região em reparo aumentam de forma pronunciada a expressão gênica de VEGF e seus receptores estão aumentados nos vasos sanguíneos do tecido de granulação.
A ciclo-oxigenase-2 (COX-2) produz aumento da quantidade de prostaglandina E2, que pode induzir proteínas ósseas morfogenéticas (BMP’s) e cooperar com BMP’s para aumentar a expressão de Cbfa1 e osterix. A expressão da COX-2, após estímulos, aumenta rapidamente nas células envolvidas na inflamação, como fibroblastos, monócitos e endotélio vascular.
Portanto, este trabalho procurou analisar a marcação da proteína VEGF e da COX-2 no processo de reparo de enxerto ósseo particulado em defeito de calota craniana de coelhos Nova Zelândia, os quais foram submetidos à inibição medicamentosa de COX- 2, por meio de análise morfológica microscópica e análise imuno-histoquímica.
2. DESENVOLVIMENTO
2.1 REVISÃO DA LITERATURA
O presente capítulo será dividido em três temas: enxertos ósseos autógenos particulados, COX-2 e VEGF.
2.1.1 Enxertos ósseos autógenos particulados
Defeitos de tecidos duros resultantes de infecções odontogênicas, traumas ou perda de elementos dentais, muitas vezes levam a uma anatomia desfavorável dos ossos da maxila ou mandíbula, inviabilizando ou dificultando as reabilitações orais através dos implantes ósseos sem a utilização de enxertos. As técnicas de reconstrução alveolar bem como de levantamento do seio maxilar visam aumentar o nível do rebordo alveolar horizontal e verticalmente em uma determinada região para posterior reabilitação com implantes. Uma variedade de tipo de enxertos ósseos, bem como materiais aloplásticos têm sido utilizados nos últimos anos, entretanto o enxerto ósseo autógeno é considerado o “padrão ouro”, devido a sua compatibilidade e potencial osteogênico para formar o novo osso através da osteogênese, osteoindução e osteocondução. O osso autógeno em bloco, particulado ou a combinação de ambos são os mais utilizados, tendo como área doadora regiões intra e exta-orais.1
Implantes dentários na região posterior de maxila, geralmente requerem aumentos ósseos. A utilização de enxertos ósseos autógenos particulados é uma excelente opção para este tratamento, entretanto, possui como uma grande característica desfavorável a necessidade de uma cirurgia adicional para a remoção do enxerto ósseo.2 SBORDON et al 2011 3,realizaram um estudo onde compararam as mudanças de volume de enxeto ósseo autógeno, em procedimento de aumento do seio maxilar. Os autores avaliaram neste estudo: a remodelação óssea; características dimensionais; bem como a densidade do osso enxertado; comparando osso autógeno de bloco ao osso autógeno particulado. Concluíram que quando utilizado uma espessura menor do que 4 mm de osso autógeno particulado, a reabsorção óssea deste enxerto é mínima.
Em um estudo retrospectivo de procedimentos de enxertos ósseos antes da colocação de implantes, os autores RABELO et al 2010 4, compararam os enxertos realizados na Universidade Federal de Uberlândia no período entre julho de 2000 a julho
de 2007. Foi avaliada a utilização de enxertos ósseos em bloco, particulado, bem como a associação de ambos. Os autores concluíram que a utilização de osso autógeno para reconstruções alveolares é um procedimento confiável para pacientes com osso insuficiente, complicações existem entretanto em somente 6,6% dos casos não foi possível a reabilitação com implantes.
No estudo de URBAN et al 2009 5, onde os autores avaliaram os resultados da regeneração óssea vertical guiada com enxertos de osso autógeno particulado.
Observaram clinica e radiograficamente as taxas de sucesso e sobrevivência de 82 implantes colocados após enxertos ósseos. Concluíram que o aumento vertical com membranas e enxerto ósseo particulado é um tratamento seguro e previsível, o sucesso e a taxa de sobrevivência de implantes colocados em osso verticalmente aumentado com a técnica de regeneração óssea guiada parece semelhante aos implantes colocados em osso nativo.
Estudo desenvolvido por SBORDONE et al 2009 6, onde os autores pesquisaram o sucesso de implantes em levantamento de seio maxilar e osso nativo em um estudo clínico de três anos. Os autores observaram que durante o período de 2000 a 2002, no departamento de cirurgia da Universidade de Pisa – Itália, foram realizados 39 implantes em áreas de levantamento de seio maxilar e 24 implantes em áreas de osso nativo, o resultado foi 85% de sucesso dos implantes nas regiões onde foram realizados enxertos ósseos autógenos e 95,8% nas regiões onde não foram realizados enxertos ósseo, áreas onde foi utilizado o osso nativo do paciente. Concluíram que o uso de enxerto ósseo autógeno particulado em procedimentos de elevação do seio maxilar parece não produzir resultados ótimos.
AIMENTTI et al 2008 7, estudaram o enxerto de osso autógeno particulado e a utilização de plasma rico em plaquetas, resultado histológico em humanos. Quatro pacientes parcialmente desdentados receberam osso autógeno particulado e plasma rico em plaquetas em um seio maxilar, e osso autógeno particulado somente no seio maxilar contralateral. Após 6 meses de cicatrização, dois ou três implantes foram inseridos, e um mini-implante adicional foi colocado através da parede lateral do seio maxilar. Na conexão do pilar protético os mini-implantes foram recuperados para exame histológico. Apesar de semelhantes padrões de cura clinica e radiográfica, uma maior taxa de contato osso- implante foi observado nos implantes colocados em osso associado ao plasma rico em plaqueta quando comparado aos colocados sem a utilização do plasma rico em plaquetas.
2.1.2 COX-2
Os inibidores seletivos da COX-2 surgiram com o objetivo de reduzir os efeitos colaterais dos antiinflamatórios seletivos não-esteroidais. Os mecanismos pelos quais os inibidores seletivos da COX-2 afetam o osso durante o processo de cicatrização não são totalmente compreendidos, mas há indícios que demonstram que a enzima COX-2 é um regulador crítico da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos e que participa na osteogênese. Os efeitos clínicos desejados dos inibidores seletivos da COX-2 são os resultados de sua regulação da síntese de prostaglandinas, principalmente através da enzima COX-2. Ao inibir a enzima COX-2 e da subsequente produção de prostaglandinas, inibidores seletivos de COX-2 não só atingem os seus efeitos antiinflamatórios desejados, mas também inibem o aumento da produção de agentes que são necessários para que a cicatrização óssea ocorra. 8,9,10,11,12,13.
Segundo SATO et al 1997 11, ambas as enzimas, COX-1 e COX-2 podem estar envolvidas com a osteogênese, sendo que a COX-2 apresenta essencial importância na maturação dos osteoblastos após o início do processo de formação óssea. Já LIU et al 2005 14 acreditam que a COX-2 poderia desempenhar um papel na formação de células de reabsorção óssea (osteoclastos) e remodelação óssea.
Alguns estudos (OBEID et al 1992 15, HO et al 1999 16, GOODMAN et al 2002 17, ARASAPAM et al, 2006 18, GIANNOUDIS et al 2001 19, SIMON et al 2002 20, ENDO et al 2005 21, GURGEL et al 2005 22, LEONELLI et al 2006 23) têm explorado o papel da COX-2 na cicatrização da fratura óssea utilizando inibidores de COX-2 durante o reparo da fratura.
GOODMAN et al, 2002 17 avaliaram fraturas de tíbia de coelhos a fim de comparar o efeito do naproxeno (anti-inflamatório não-específico) em relação ao rofecoxibe (anti- inflamatório específico). Após avaliação histológica para a quantidade de formação óssea e avaliação imunoistoquímica de fosfatase alcalina, concluíram que a porcentagem de crescimento ósseo mostrou-se estatisticamente menor nos dois grupos tratados com antiinflamatórios não esteroidais (seletivo ou não) quando comparada ao grupo controle, sem medicação. Os autores sugerem que AINES que inibem em maior intensidade a enzima COX-2 possuem maior impacto negativo sobre a formação do tecido ósseo.
Alguns autores como SIMON et al, 2002 20 e LEONELLI et al 2006 23 relataram prejuízos na cicatrização da fratura óssea em ratos tratados com celecoxib e rofecoxib, respectivamente.
GURGEL et al 2005 22 demonstraram que o meloxicam foi capaz de reduzir o reparo ósseo em defeitos de calvárias de ratos após sua administração contínua, sendo observado prejuízo no processo de reparo inclusive em períodos curtos de administração da droga.
A COX-2 produz aumento da quantidade de prostaglandina E2, que pode induzir proteínas ósseas morfogenéticas (BMP’s) e cooperar com BMP’s para aumentar a expressão de Cbfa1 e osterix. Existem ainda relatos de que a COX-2 têm um papel indispensável na formação do osso durante a cicatrização óssea e que esta enzima regula fatores de transcrição essenciais para o processo de osteoblastogênese.
Entretanto, alterações do metabolismo ósseo e na reparação óssea prejudicada foram observados após a administração da COX-2 seletivo em muitos estudos. Recentemente demonstrou-se que o uso de inibidores seletivos de COX-2 podem também influenciar negativamente na cicatrização óssea ao redor de implantes de titânio após sua contínua administração.9
OLIVEIRA et al, 2008 24 realizaram um trabalho com 120 ratos Wistar, onde os autores testaram se o antiinflamatório meloxicam poderia reduz a expressão do VEGF e a perda óssea alveolar em doença periodontal. Dividiram os animais em 2 grupos, sendo grupo 1 (controle) e grupo 2 tratado com meloxicam (3mg/kg/dia, intraperitoneal, por 3, 7, 14 e 30 dias). Concluíram que uma redução na reabsorção do osso alveolar foi observada no grupo tratado com meloxicam em comparação ao grupo controle em todos os períodos estudados (p<0,05). O RT-PCR revelou que havia uma correlação positiva entre a COX-2 e o VEGF mRNA no tecido gengival e na doença periodontal. O meloxicam reduziu significativamente o aumento da expressão VEGF mRNA em tecidos doentes após 14 dias de tratamento em relação ao grupo controle.
Cinqüenta e quatro ratos com idade de 6 semanas do sexo masculino, pesando aproximadamente 120 g foram distribuídos aleatoriamente em três grupos de estudo, grupo 1 recebendo COX-2 (celecoxib), grupo 2 inibidor de iNOS (aminoguanidina hemissufato), grupo 3 solução salina, uma vez ao dia por gavagem. A administração das drogas foi iniciada dois dias antes da lesão cirúrgica e continuou-se até o dia da cirurgia.
Foi realizado uma perfuração na porção central da tíbia direita dos ratos utilizando uma broca odontológica sob anestesia local. Os ratos foram eutanasiados nos dias 1, 8, 14 após a cirurgia por overdose de CO2, foram removidos placas de crescimento de todas as tíbias direitas dos ratos para observar a reação inflamatória bem como a remodelação óssea. Apesar de não haver uma diferença estatística significante no trabalho de ARASAPAM et al, 2006 18 entre os grupos tratados e o grupos controle, houve uma
aparente demora na transformação de células mesenquimais de tecido cartilaginoso que os autores acreditam se tratar de um possível atraso no processo de cicatrização quando da utilização de COX-2.
O tempo de inibição da enzima COX-2 parece ser um dos fatores que determinam sua ação deletéria sobre a reparação tecidual, como em estudo desenvolvido por MATSUMOTO et al, 2008 25. Foram confeccionados defeitos em tíbia de 48 ratos Albinus Wistar, distribuídos em três grupos: Grupo 1) Controle negativo, cujos animais receberam água e ração; Grupo 2) animais tratados com celecoxibe por gavagem; e Grupo 3) animais tratados com cetaprofeno por gavagem, ambos na dosagem de 1mg/Kg, iniciando uma hora antes do procedimento cirúrgico e continuando a cada 12 horas, por três dias consecutivos. Os animais foram eutanasiados nos períodos de 48 horas, 7, 14 e 21 dias, quando as tíbias foram removidas para análise morfológica e histomorfométrica.
Os resultados demonstraram que a administração dos AINES em curtos períodos de tempo, não interferiram no processo de reparo ósseo em tíbias de ratos.
Um dos fatores que podem explicar o efeito negativo dos inibidores seletivos de COX-2 sobre o reparo ósseo é o fato de haver uma interação entre os metabólitos da COX-2 e as proteínas ósseas morfogenéticas (BMP’s) no processo de reparo do tecido ósseo. Determinadas BMP’s, tais como BMP-2, BMP-4 e BMP-7, não somente estimulam a diferenciação osteoblástica de células osteoprogenitoras, como também transdiferenciam células mesenquimais não osteogênicas em células da linhagem osteoblástica. 26
2.1.3 VEGF
O VEGF é um membro da família das citocinas que exercem funções críticas na angiogênese fisiológica. No final da década de 80, o VEGF foi caracterizado como um fator potente para a proliferação vascular, difusível e específico para células do endotélio, conduzindo a hipótese de que esta molécula desempenharia um papel ímpar na regulação do crescimento vascular. A ativação do VEGF desencadeia diversas rotas de sinalização intracelular que resultam em proliferação, sobrevivência, mitogênese, migração e diferenciação das células endoteliais, assim como sua atuação no aumento da permeabilidade vascular.24,27
Segundo VILLARS et al 2000 29, um número crescente de trabalhos (BERSE et al, 1992 30, CULLINAN-BOVE et al, 1993 31, FERRARA et al, 1997 32) sugerem que o VEGF é um fator de angiogênese fisiológica em tecidos altamente vascularizados. No entanto, a possibilidade de que o VEGF tenha um efeito direto na diferenciação, migração ou
proliferação de células osteoblásticas é debatido, os estudos sobre a interação entre osteoblastos e células semelhantes são contraditórios.
A expressão do VEGF é induzida principalmente por fatores de crescimento osteoindutivos assim como as prostaglandinas. O VEGF, por sua vez, regula o recrutamento, a sobrevivência e a atividade das células endoteliais, osteoblastos e osteoclastos, estimulando a angiogênese. A íntima conexão física e bioquímica entre vasos sanguíneos e células ósseas têm sido reconhecido há muito tempo. Estudos genéticos, bioquímicos e farmacológicos identificaram e caracterizaram fatores envolvidos na ligação entre as células endoteliais e osteoblastos durante a formação e o reparo ósseo. A inibição da atividade do VEGF inativa o reparo da fratura femural e dos defeitos no processo tecidual do osso cortical dos ratos, diminuindo o fluxo sanguíneo e levando a não união das fraturas radiais em coelhos. Portanto, a atividade do VEGF é essencial para a angiogênese normal e para a correta arquitetura do calo ósseo e a mineralização em resposta a lesão óssea. Estas descobertas confirmam a hipótese de que a invasão dos vasos sanguíneos têm um papel chave no reparo dos tecidos e sugerem que a produção do VEGF é o maior mecanismo pelo qual angiogênese e osteogênese estão fortemente associados durante o reparo ósseo. 33,34,35
2.2 OBJETIVOS
O presente estudo objetivou investigar o processo de reparo de enxerto ósseo autógeno particulado em defeitos de calota craniana de coelhos sob a inibição de droga anti-inflamatória não-esteroidal específica para COX-2. Foram utilizados como parâmetros de análises os métodos morfológico microscópico, histomorfométrico e imuno- histoquímico para marcação das proteínas COX-2 e VEGF.
2.3. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa da Universidade Sagrado Coração (USC) de Bauru através do protocolo n 115/09 (Apêndice A). Foram utilizados 24 coelhos machos Nova Zelândia, com idade variando de 4 a 6 meses de idade e peso medio variando de 3 a 4 Kg. Os animais foram colocados em gaiolas de grade metálica, forradas com bandeja metálica, as quais foram limpas diariamente.
Durante todo o período experimental, os animais permaneceram no biotério da Universidade Sagrado Coração, recebendo água e ração sem restrição.
2.3.1 Procedimento Cirúrgico
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob rigorosos princípios de técnica e assepsia. Os animais foram submetidos à anestesia geral por meio de injeção intramuscular de sedativo Xilazina (0,30ml/Kg) (Laboratório Bayer, Monheim – Alemanha) e de anestésico geral Quetamina (0,20ml/Kg) (Laboratório Ceva, Paulínia – São Paulo).
Com o animal devidamente anestesiado, realizou-se a tricotomia da região do crânio e logo após, o procedimento de anti-sepsia da região com gaze embebida em solução tópica de polivinilpirrolidona-iodo a 1% e anestesia local com cerca de 1 ml de solução de Cloridrato de Mepivacaína a 2% com adrenalina 1:200.000 (Laboratório DFL Jacarepaguá – Rio de Janeiro) para hemostasia local. (Figuras 1a e b).
Figura 1 - a) Tricotomia; b) Antissepsia com PVPI 1% e aplicação de anestesia local
Posteriormente, realizou-se a incisão de aproximadamente 4 cm na região de sutura interparietal, seguida da divulsão pele-periosteal para exposição do tecido ósseo a ser abordado. Com brocas trefinas de 10 mm de diâmetro externo (8 mm no diâmetro
a b
interno) e motor de baixa rotação com irrigação constante com solução fisiológica estéril a 0,9% (Laboratório Texon, Viamão – RS), foi realizada a perfuração, lateralmente à linha de incisão alcançando, porém não abrangendo a dura-máter, removendo-se o tecido ósseo da calota craniana (Figura 2 a, b, c).
Figura 2 – a) Exposição do tecido ósseo; b) Remoção do enxerto de calota com broca trefina; c) Descolamento cuidadoso do fragmento ósseo para manutenção da dura-máter
Como padronização, ficou estipulado que no lado direito da calota o defeito confeccionado foi preenchido por enxerto ósseo autógeno triturado (utilizando para este processo um moedor ósseo manual tipo pilão convencionalmente utilizado para realização de enxerto ósseo particulado em implantodontia, marca Implant Kopp) sendo que este enxerto foi removido da própria calota craniana do animal do lado esquerdo à linha de incisão. O defeito ósseo do lado direito foi totalmente preenchido com osso autógeno particulado mais coágulo sanguíneo (Figura 3). Posteriormente a isso, o retalho foi reposicionado e realizou-se a sutura por planos com pontos simples e em pele com fios de nylon 3-0 (Ethicon J & J, São Paulo – São Paulo, Brasil).
a b c
Após os períodos estabelecidos, todos os animais foram eutanasiados por meio de sobredosagem anestésica, a fim de se realizar nova incisão e divulsão da região previamente operada, para obtenção dos espécimes, com brocas de carborundum montadas em motor de baixa rotação, sob constante refrigeração. As peças cirúrgicas foram acondicionadas em frascos contendo formol a 10% tamponado (Merck, Darmstadt, Alemanha), por período de 48 horas. Após este período, as peças foram lavadas em água corrente por 24 horas para então serem imersas em desmineralizador EDTA 10%, com trocas a cada 48 horas, até que as peças adquirissem consistência suficiente para serem cortadas em micrótomo. Posteriormente, foram submetidas a procedimento histotécnico de rotina para coloração em Hematoxilina e Eosina (H. E.) e Tricrômico de Masson.
2.3.2 Análise morfológica microscópica
A descrição morfológica microscópica das áreas de defeito preenchidas por tecido ósseo particulado considerou a região central do defeito. Cortes de 6µm de espessura foram realizados até se alcançar o maior diâmetro do defeito (1 cm). Com as lâminas coradas em H.E. e Tricrômico de Masson, analisou-se a presença de tecido de granulação, infiltrado inflamatório, tecido ósseo neoformado, maturação e remodelação óssea, registradas por meio de descrição morfológica.
2.3.3 Análise histomorfométrica
A análise histomorfométrica foi realizada utilizando-se o método de contagem de pontos adaptado por MELO et al (2007)39. Foram determinados dois campos correspondentes às porções mais centrais dos cortes histológicos da região do defeito, corados em Tricrômico de Masson, sendo estas capturadas diretamente do microscópio Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokio, Japão), com aumento de 20x, com resolução de 300 dpi.
O retículo adotado apresentou um total de 322 pontos dispostos na forma de traços horizontais não coincidentes, com espaçamento e largura de 200 micrometros, confeccionados numa folha transparente de tamanho A4. Como foram selecionados dois campos de cada corte histológico para contagem, sendo analisado um corte histológico para cada espécime, um total de 644 pontos foi considerado como 100% ou área total do defeito.
As imagens capturadas foram observadas pelo programa Microsoft Office Power Point® versão 2007, em monitor de 19 polegadas em tela do tipo widescreen, onde
o sistema de retículo foi sobreposto. Foram utilizados dois critérios: os pontos dentro do osso e pontos fora do osso. Os pontos considerados dentro do osso incidiam sobre a matriz óssea neoformada. Já os pontos coincidentes com o enxerto ósseo particulado, tecido conjuntivo, coágulo, dentre outras estruturas, foram considerados como pontos fora do osso.
Ao final da contagem, os valores totais de pontos dentro e fora do osso dos dois campos de cada corte foram somados, para posteriormente calcular-se a porcentagem de osso neoformado em relação à área total do defeito (644 pontos), conforme o exemplo abaixo:
Tabela 1 - Valores dos pontos relativos ao coelho x
Os valores percentuais foram submetidos a tratamento estatístico.
2.3.4 Análise imuno-histoquímica
Para a determinação dos padrões moleculares seguindo a reparação óssea sob influência ou não de terapia antiinflamatória, foram utilizados marcadores imuno- histoquímicos para VEGF e COX-2. Desse modo, cortes de 3 µm foram tratados com proteinase K por 30 minutos, a temperatura ambiente. A peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 2% por 10 minutos e lavados em PBS (Phosphate buffer solution). Após este período, foram utilizados anticorpos primários policlonais anti-VEGF e anti-COX-2 (Santa Cruz, USA), em temperatura ambiente por 24 horas, e lavados com PBS por 30 minutos, por três vezes. Após isto, os cortes foram incubados com o anticorpo secundário por 30 minutos, em seguida, corados com o DAB (diaminobenzidina) (Dako, Lab.) e contra-corados com Hematoxilina de Harris. Para controle negativo foi omitido o anticorpo primário.
Uma vez realizada as marcações, três campos com aumentos de 40x foram registrados com fotomicroscópio Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokio, Japão) para posterior avaliação.
CAMPO 1 CAMPO 2 SOMA %
PONTOS FORA DO OSSO 232 183 415 64
PONTO DENTRO DO OSSO 90 139 229 35,6
AREA TOTAL 322 322 644 100
2.3.5 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio de testes não paramétricos sobre variáveis quantitativas de amostras independentes para comparação entre grupos dentro de um mesmo período, bem como para análise de um mesmo grupo em função dos períodos experimentais. Os valores foram comparados pelo teste de Mann-Whitney, aplicados por meio dos programas GraphPad InStat e GraphPad Prisma 5 (GraphPad Software, San Diego, CA). Os valores de P<0.05 foram considerados estatisticamente significantes em todas as análises.
3. ARTIGO CIENTÍFICO
MARCAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE VEGF E COX-2 NO PROCESSO DE REPARO DE ENXERTO ÓSSEO PARTICULADO EM DEFEITO DE CALOTA
CRANIANA DE COELHOS E INIBIÇÃO DE COX-2
RESUMO
Os grandes benefícios alcançados com as reabilitações bucomaxilofaciais, especialmente no que diz respeito à reabilitação dentária com os implantes osteointegráveis, incentivam o desenvolvimento de técnicas e materiais; bem como o aprimoramento na compreensão dos mecanismos de reparo tecidual, diretamente envolvidos no processo reabilitador. O presente estudo objetivou analisar o efeito da inibição da ciclo-oxigenase 2 (COX-2) durante o reparo de enxerto ósseo particulado em defeito de calota craniana de coelhos. Vinte e quatro coelhos machos tipo Nova Zelândia foram divididos em dois grupos: Grupo Controle: tratados com soro fisiológico 0,9%;
Grupo Anti-inflamatório não esteroidal (AINE): tratados diariamente com etoricoxibe na dose de 6mg/Kg por via oral. Após os períodos de 7, 14 e 30 dias os animais foram eutanasiados e as áreas enxertadas removidas para análises morfológica microscópica, histomorfométrica e imuno-histoquímica para COX-2 e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os dados da análise histomorfométrica foram submetidos ao teste estatístico de Mann-Whitney (porcentagem), onde se observou diferença estatisticamente significante entre o grupo controle (36,6±8,38 % dos pontos) e o grupo AINE (9,8±3,7%
dos pontos) para o período de 14 dias e (42,28±15,73,7% dos pontos) ,(13,2±2,95% dos pontos) respectivamente para o período de 30 dias. Na análise imuno-histoquimica, utilizando a proteína COX-2 como marcador, observamos que no período de 14 dias, houve uma formação óssea mais evidente no grupo controle, indicando que a ausência
do AINE melhorou o reparo ósseo neste período. Concluímos que o uso de AINE atrasou o processo de reparo ósseo para o Grupo AINE no período de 14 e 30 dias.
Palavras Chaves: COX-2.Enxerto ósseo. Reparo ósseo. VEGF.
INTRODUÇÃO
O cirurgião-dentista é desafiado diariamente pela necessidade de recuperar a perda óssea em seus pacientes, devido a vários fatores etiológicos. Devolver a estes pacientes uma função mastigatória aceitável associada a um sorriso harmônico significa um trabalho árduo no consultório odontológico. Várias técnicas de enxertos ósseos ou substitutos ósseos têm sido utilizadas com o objetivo de devolver ao paciente uma condição mínima necessária para uma reabilitação com a utilização de implantes odontológicos osteointegráveis.
Este estudo procurou analisar a marcação da proteína VEGF e da COX-2 no processo de reparo de enxerto ósseo particulado em defeito de calota craniana de coelhos Nova Zelândia, os quais foram submetidos à inibição medicamentosa de COX-2, por meio de análise morfológica microscópica e análise imuno-histoquímica.
Ao inibir a enzima COX-2 e da subsequente produção de prostaglandinas, inibidores seletivos de COX-2 não só atingem os seus efeitos antiinflamatórios desejados, mas também inibem o aumento da produção de agentes que são necessários para que a cicatrização óssea ocorra.( Kawaguchi et al., 1995; Ribeiro et al., 2007; Ribeiro et al., 2009; Sato et al., 1997; Talley et al., 2000;Zhang et al., 2002)..
As enzimas, COX-1 e COX-2 podem estar envolvidas com a osteogênese, sendo que a COX-2 apresenta essencial importância na maturação dos osteoblastos após o início do processo de formação óssea. ( SATO et al., 1997).
Estudos de (ARASAPAM et al., 2006; ENDO et al., 2005; GIANNOUDIS et al., 2001; GOODMAN et al., 2002; GURGEL et al., 2005; HO et al., 1999; LEONELLI et al., 2006; OBEID et al., 1992; SIMON et al., 2002) têm explorado o papel da COX-2 na cicatrização da fratura óssea utilizando inibidores de COX-2 durante o reparo da fratura.
GOODMAN et al., 2002 concluíram que a porcentagem de crescimento ósseo mostrou-se estatisticamente menor nos dois grupos tratados com antiinflamatórios não esteroidais (seletivo ou não) quando comparada ao grupo controle, sem medicação. Os autores sugerem que AINES que inibem em maior intensidade a enzima COX-2 possuem maior impacto negativo sobre a formação do tecido ósseo.
Em estudos de (LEONELLI et al., 2006; SIMON et al., 2002) os autores relataram prejuízos na cicatrização da fratura óssea em ratos tratados com celecoxib e rofecoxib, respectivamente. GURGEL et al., 2005 demonstraram que o meloxicam foi capaz de reduzir o reparo ósseo em defeitos de calvárias de ratos após sua administração contínua, sendo observado prejuízo no processo de reparo inclusive em períodos curtos de administração da droga.
Estudo desenvolvido com 120 ratos Wistar, onde os autores testaram se o antiinflamatório meloxicam poderia reduz a expressão do VEGF e a perda óssea alveolar em doença periodontal. Os autores concluíram que uma redução na reabsorção do osso alveolar foi observada no grupo tratado com meloxicam em comparação ao grupo controle em todos os períodos estudados (p<0,05) (OLIVEIRA et al., 2008).
O tempo de inibição da enzima COX-2 parece ser um dos fatores que determinam sua ação deletéria sobre a reparação tecidual, como em estudo desenvolvido por (MATSUMOTO et al., 2008), os resultados demonstraram que a administração dos AINES em curtos períodos de tempo, não interferiram no processo de reparo ósseo em tíbias de ratos.
Segundo (VILLARS et al., 2000), um número crescente de trabalhos (BERSE et al., 1992; CULLINAN-BOVE et al., 1993; FERRARA et al., 1997) sugerem que o VEGF é um fator de angiogênese fisiológica em tecidos altamente vascularizados. No entanto, a possibilidade de que o VEGF tenha um efeito direto na diferenciação, migração ou proliferação de células osteoblásticas é debatido, os estudos sobre a interação entre osteoblastos e células semelhantes são contraditórios.
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa da Universidade Sagrado Coração (USC) de Bauru através do protocolo n 115/09 (Apêndice A). Foram utilizados 24 coelhos machos Nova Zelândia, com idade variando de 4 a 6 meses de idade e peso médio variando de 3 a 4 Kg. Os animais foram colocados em gaiolas de grade metálica, forradas com bandeja metálica, as quais foram limpas diariamente.
Durante todo o período experimental, os animais permaneceram no biotério da Universidade Sagrado Coração, recebendo água e ração sem restrição.
Procedimento Cirúrgico
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob rigorosos princípios de técnica e assepsia. Os animais foram submetidos à anestesia geral por meio de injeção intramuscular de sedativo Xilazina (0,30ml/Kg) (Laboratório Bayer, Monheim – Alemanha) e de anestésico geral Quetamina (0,20ml/Kg) (Laboratório Ceva, Paulínia – São Paulo).
Com o animal devidamente anestesiado, realizou-se a tricotomia da região do crânio e logo após, o procedimento de anti-sepsia da região com gaze embebida em solução tópica de polivinilpirrolidona-iodo a 1% e anestesia local com cerca de 1 ml de solução de
Cloridrato de Mepivacaína a 2% com adrenalina 1:200.000 (Laboratório DFL Jacarepaguá – Rio de Janeiro) para hemostasia local.
Posteriormente, realizou-se a incisão de aproximadamente 4 cm na região de sutura interparietal, seguida da divulsão pele-periosteal para exposição do tecido ósseo a ser abordado. Com brocas trefinas de 10 mm de diâmetro externo (8 mm no diâmetro interno) e motor de baixa rotação com irrigação constante com solução fisiológica estéril a 0,9% (Laboratório Texon, Viamão – RS), foi realizada a perfuração, lateralmente à linha de incisão alcançando, porém não abrangendo a dura-máter, removendo-se o tecido ósseo da calota craniana.
Como padronização, ficou estipulado que no lado direito da calota o defeito confeccionado foi preenchido por enxerto ósseo autógeno triturado (utilizando para este processo um moedor ósseo manual tipo pilão convencionalmente utilizado para realização de enxerto ósseo particulado em implantodontia, marca Implant Kopp) sendo que este enxerto foi removido da própria calota craniana do animal do lado esquerdo à linha de incisão. O defeito ósseo do lado direito foi totalmente preenchido com osso autógeno particulado mais coágulo sanguíneo (Figura 1). Posteriormente a isso, o retalho foi reposicionado e realizou-se a sutura por planos com pontos simples e em pele com fios de nylon 3-0 (Ethicon J & J, São Paulo – São Paulo, Brasil).
Os animais foram medicados com dose de antibiótico enrofloxacina (Flotril ® 2,5%, antimicrobiano bactericida de amplo espectro de ação (Schering-Plough S.A., Rio de Janeiro, Brasil) de 0,2ml/Kg (equivalente a 5mg/Kg de peso de enrofloxacina) e com analgésico de ação central cloridrato de tramadol intramuscular (0,10 ml/Kg) (Laboratório Medley, Campinas – São Paulo – Brasil) no pós-operatório imediato. Após o procedimento cirúrgico, os animais foram alimentados com ração sólida e água sem restrição.
Os animais foram distribuídos em dois grupos com 12 animais em cada: Grupo 1 - controle, Grupo 2 - tratado com etoricoxibe (Arcoxia® Laboratório - Merck & Co., Inc.,
Ekton, EUA), os quais foram subdivididos em 3 subgrupos de acordo com o tempo de eutanásia: a – 7 dias; b – 14 dias, c - 30 dias, dias conforme descrito a seguir:
Grupo 1: a, b, c, – grupo controle;
Grupo 2: a, b, c, – grupo tratado com etoricoxibe (Arcoxia®) por via oral.
Os coelhos dos Grupo 2 receberam por via oral a droga etoricoxibe (Arcoxia® - Merck & Co., Inc., Ekton, EUA) na proporção de 6mg/Kg, na forma de suspensão, administrados por seringa por via oral. Iniciando sua administração 72 horas antes do procedimento cirúrgico, continuando com a mesma dosagem a cada 24 horas até o período de eutanásia.(Matsumoto et al., 2008;Ozawa et al., 1998; Prockt et al., 2008).
Após os períodos estabelecidos, todos os animais foram eutanasiados por meio de sobredosagem anestésica, a fim de se realizar nova incisão e divulsão da região previamente operada, para obtenção dos espécimes, com brocas de carborundum montadas em motor de baixa rotação, sob constante refrigeração. As peças cirúrgicas foram acondicionadas em frascos contendo formol a 10% tamponado (Merck, Darmstadt, Alemanha), por período de 48 horas. Após este período, as peças foram lavadas em água corrente por 24 horas para então serem imersas em desmineralizador EDTA 10%, com trocas a cada 48 horas, até que as peças adquirissem consistência suficiente para serem cortadas em micrótomo. Posteriormente, foram submetidas a procedimento histotécnico de rotina para coloração em Hematoxilina e Eosina (H. E.) e Tricrômico de Masson.
Análise morfológica microscópica
A descrição morfológica microscópica das áreas de defeito preenchidas por tecido ósseo particulado considerou a região central do defeito. Cortes de 6µm de espessura foram realizados até se alcançar o maior diâmetro do defeito (1 cm). Com as lâminas coradas em H.E. e Tricrômico de Masson, analisou-se a presença de tecido de
granulação, infiltrado inflamatório, tecido ósseo neoformado, maturação e remodelação óssea, registradas por meio de descrição morfológica.
Análise histomorfométrica
A análise histomorfométrica foi realizada utilizando-se o método de contagem de pontos, foram determinados dois campos correspondentes às porções mais centrais dos cortes histológicos da região do defeito, corados em Tricrômico de Masson, sendo estas capturadas diretamente do microscópio Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokio, Japão), com aumento de 20x, com resolução de 300 dpi.
O retículo adotado apresentou um total de 322 pontos dispostos na forma de traços horizontais não coincidentes, com espaçamento e largura de 200 micrometros, confeccionados numa folha transparente de tamanho A4. Como foram selecionados dois campos de cada corte histológico para contagem, sendo analisado um corte histológico para cada espécime, um total de 644 pontos foi considerado como 100% ou área total do defeito.
As imagens capturadas foram observadas pelo programa Microsoft Office Power Point® versão 2007, em monitor de 19 polegadas em tela do tipo widescreen, onde o sistema de retículo foi sobreposto. Foram utilizados dois critérios: os pontos dentro do osso e pontos fora do osso. Os pontos considerados dentro do osso incidiam sobre a matriz óssea neoformada. Já os pontos coincidentes com o enxerto ósseo particulado, tecido conjuntivo, coágulo, dentre outras estruturas, foram considerados como pontos fora do osso.
Ao final da contagem, os valores totais de pontos dentro e fora do osso dos dois campos de cada corte foram somados, para posteriormente calcular-se a porcentagem de osso neoformado em relação à área total do defeito.
Análise imuno-histoquímica
Para a determinação dos padrões moleculares seguindo a reparação óssea sob influência ou não de terapia antiinflamatória, foram utilizados marcadores imuno- histoquímicos para VEGF e COX-2. Desse modo, cortes de 3 µm foram tratados com proteinase K por 30 minutos, a temperatura ambiente. A peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 2% por 10 minutos e lavados em PBS (Phosphate buffer solution). Após este período, foram utilizados anticorpos primários policlonais anti-VEGF e anti-COX-2 (Santa Cruz, USA), em temperatura ambiente por 24 horas, e lavados com PBS por 30 minutos, por três vezes. Após isto, os cortes foram incubados com o anticorpo secundário por 30 minutos, em seguida, corados com o DAB (diaminobenzidina) (Dako, Lab.) e contra-corados com Hematoxilina de Harris. Para controle negativo foi omitido o anticorpo primário.
Uma vez realizada as marcações, três campos com aumentos de 40x foram registrados com fotomicroscópio Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokio, Japão) para posterior avaliação.
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio de testes não paramétricos sobre variáveis quantitativas de amostras independentes para comparação entre grupos dentro de um mesmo período, bem como para análise de um mesmo grupo em função dos períodos experimentais. Os valores foram comparados pelo teste de Mann-Whitney, aplicados por meio dos programas GraphPad InStat e GraphPad Prisma 5 (GraphPad Software, San Diego, CA). Os valores de P<0.05 foram considerados estatisticamente significantes em todas as análises.
RESULTADOS
Análise microscópica morfológica
Grupo Controle - No período de 7 dias observou-se no interior do defeito ósseo a presença dos fragmentos não viáveis do enxerto com discreta atividade osteoclástica em suas superfícies. De permeio, notaram-se focos de coágulo em meio a tecido de granulação moderadamente infiltrado por leucócitos mononucleares e polimorfonucleares neutrófilos. Após 14 dias, notou-se a formação de tecido ósseo primário em organização associado à intensa atividade osteoclástica, sobre as superfícies dos enxertos ósseos não viáveis. No período de 30 dias, obteve-se tecido ósseo em franca maturação, marcados por linhas basofílicas de reversão, em processo de substituição dos fragmentos de enxerto ósseo, com organização medular. Observou-se também uma organização periosteal. (Figura 2 a, b, c).
Grupo AINE – Aos 7 dias, observou-se um quadro microscópico semelhante ao grupo controle, visualizando-se os fragmentos de enxerto ósseo preenchendo o defeito em meio a focos de coágulo. No período de 14 dias, notaram-se áreas focais de deposição de osso primário, apresentando células osteoclásticas sobre suas superfícies.
Após 30 dias o tecido ósseo apresentou-se em maturação, marcado por linhas basofílicas de reversão. Notaram-se focos de deposição óssea ainda no período, em forma de trabéculas arredondadas e curtas, as quais, em determinados momentos, mostraram-se dispersas. Aos 30 dias, observou-se tecido ósseo trabecular organizado em maturação, mas ainda com presença de osso não viável referente aos fragmentos do enxerto. A medula óssea amarela com presença de feixes de tecido conjuntivo fibroso entremeando suas trabéculas. (Figura 3 a, b, c).
Análise histomorfométrica
A quantificação de matriz óssea neoformada nos defeitos preenchidos com osso particulado dos Grupos 1 e 2 nos períodos de 7, 14 e 30 dias podem ser observados na Tabela 2 e Gráfico 1.
Comparando-se os períodos experimentais dentro um mesmo grupo (colunas), notou-se um padrão similar de reparo entre G1 e G2 em função do tempo, havendo diferença estatisticamente significante apenas entre o dia 7 e os demais (p<0,05) no G2, com menor formação óssea aos 7 dias. Na comparação entre grupos (linhas), G1 e G2 foram estatisticamente diferentes aos 14 dias (p<0,012) e aos 30 dias (p<0,012), com menor formação óssea no G2.
Análise Imunoistoquímica
COX-2
Aos 7 dias, observou-se forte marcação citoplasmática para COX-2 no grupo Controle, nas células do tecido de granulação e nas células osteoblásticas próximas às áreas de osteogênese (Figura 4 a). O grupo AINE exibiu marcação mais moderada, predominantemente nas células do tecido de granulação (Figura 4 b). Aos 14 dias, o mesmo padrão do período de 7 dias se manteve, com forte marcação das células osteoblásticas no grupo Controle, onde a neoformação óssea se mostrava mais evidente (Figura 5 a), e moderada a intensa no tecido de granulação no grupos AINE (Figura 5 b).
No período de 30 dias, a marcação mostrou-se forte nos dois grupos, nos osteoblastos, nas células da medula óssea já organizadas, bem como no tecido conjuntivo de permeio (Figura 6 a, b)
VEGF
No período de 7 dias, notou-se forte marcação para VEGF no grupo Controle, no citoplasma das células do tecido conjuntivo, células osteoblásticas e do endotélio dos vasos sanguíneos (Figura 7 a). No grupo AINE, a marcação mostrou-se mais moderada, predominantemente nas células do tecido de granulação (Figura 7 b). Aos 14 dias, a marcação mostrou-se intensa nos dois grupos Controle e AINE, no tecido de granulação e células osteoblásticas, bem como nas células endoteliais. (Figuras 8 a, b). No período de 30 dias, a marcação foi intensa em ambos os grupos, observada nos osteoblastos e nos tecidos medular e conjuntivo permeando as trabéculas ósseas (Figuras 9 a, b).
Os resultados estatísticos da análise quantitativa dos marcadores VEGF e COX-2 para G1 e G2, podem ser observados nas Tabelas 2 e 3 e nos Gráficos 2 e 3, respectivamente.
Para o marcador VEGF, G2 apresentou diferença estatisticamente significante entre os períodos de 7 (3,0±0,45) e 14 dias (3,8±0,45) (p<0,021), e uma tendência à significância entre os períodos de 7 e 30 dias (3,6± 0,55) (p<0,059). Já na comparação entre grupos, G1 e G2 foram estatisticamente diferentes entre si (p<0,021) apenas no período de 7 dias (Tabela 1, Gráfico 1).
Comparando a expressão de COX-2 durante os tempos reparo, G1 e G2 não apresentaram diferença estatisticamente significante entre os períodos de 7, 14 e 30 dias. Já na comparação entre ambos os grupos, G1 e G2 foram estatisticamente diferentes entre si aos 14 dias (p<0,007) e aos 30 dias (p<0,037) (Tabela 2, Gráfico 2).
DISCUSSÃO
O aumento na expectativa de vida dos indivíduos traz consigo uma maior possibilidade de se desenvolver uma série de condições patológicas, sendo que as inflamatórias crônicas sintomatológicas se encontram dentre as mais prevalentes (Boursinos et al., 2009). Em função disto, as drogas anti-inflamatórias não-esteroidais são amplamente administradas, podendo ocasionar diferentes reações adversas, principalmente relacionadas ao trato gastro-intestinal pela interferência na formação do muco gástrico em decorrência da inibição de prostaglandina (Wolfe et al., 1999). A fim de se minimizar os efeitos grastro-intestinais destes medicamentos, há disponíveis fármacos alternativos cuja ação prevalece sobre a enzima COX-2 (Needelman et al., 1997), não interferindo de maneira significativa na produção da COX-1, e portanto minimizando estes efeitos indesejáveis. Entretanto, as afecções músculo-esqueléticas que uma grande parte dos pacientes que fazem uso destas drogas apresenta, possibilitaram o conhecimento da importância e necessidade da COX-2 para o processo de reparo ósseo, sugerindo que inibidores seletivos para COX-2 podem alterar os mecanismos fisiológicos deste tecido (Simon et al., 2002).
Dessa forma, a influência negativa da inibição desta enzima vem sendo exaustivamente apresentada na literatura quando se trata de fraturas ósseas (GOODMAN et al., 2002; LEONELLI et al., 2006; SIMON et al., 2002). No entanto, há uma ausência de informações com relação a outras situações, como por exemplo, nos processos de reconstrução e reabilitação bucais. O mesmo aumento na expectativa de vida faz com que as pessoas procurem tratamento reabilitador odontológico em idades em que antes não o faziam, e nota-se uma preferência especial pelas reabilitações, como os implantes osseointegráveis. No entanto, para que este tipo de tratamento seja possível, há muitas vezes a necessidade de se recuperar o volume ósseo perdido por processos de
reabsorção alveolar e expansões dos seios maxilares. Por este motivo, o presente estudo procurou analisar a influência da inibição da COX-2 sobre o reparo de ósseo por meio de administração medicamentosa. A escolha do medicamento se deu devido à disponibilidade da droga no Brasil e de acordo com sua alta seletividade, de valor 225, considerando-se a relação COX-1/COX-2 IC50, qualificada com base na produção de tromboxana B2 durante a formação do coágulo sanguíneo, como índice de atividade da COX-1 nas plaquetas, e a produção de PGE2 por lipopolissacarídeo bacteriano no sangue total, como índice de atividade da COX-2 nos monócitos (Boursinos et al., 2009).
A dose utilizada para o modelo experimental empregado foi superior à dose correspondente em humanos, considerando-se o metabolismo mais acelerado do animal.
Além disso, informações correspondentes à administração do eterocoxibe em coelhos não foram encontradas na literatura . ( Cottrell e O’connor, 2010) revisaram trabalhos na literatura relacionados aos efeitos dos AINEs sobre o reparo ósseo destacando os modelos animais utilizados, drogas e posologia, entre outras informações. Foram encontrados estudos em coelhos relacionados ao uso de aspirina, celecoxibe, fluximin, ibuprofeno, indometacina, ketarolac, meloxican, naproxeno, piroxicam e rofecoxibe, mas não ao uso do etoricoxibe, especificamente. No entanto, os resultados obtidos no presente trabalho sugerem que a dose utilizada foi o suficiente para causar o efeito esperado.
A partir da análise morfológica microscópica pode-se notar um discreto atraso na neoformação óssea do Grupo AINE em comparação ao Controle, especialmente aos 30 dias, onde foi possível observar uma melhor integração do tecido ósseo primário com as partículas do enxerto. Neste mesmo período, o Grupo 2 ainda exibia suas partículas de enxerto bastante evidentes, podendo-se visualizar os seus contornos com facilidade, e focos de neoformação óssea ainda presentes. Estas observações puderam ser comprovadas na histomorfometria óssea, onde se detectou menor quantidade de matriz
óssea viável aos 14 e 30 dias no Grupo 2, em comparação ao Controle. Os resultados obtidos no presente estudo corroboram com a maioria daqueles demonstrados em reparação de fraturas e defeitos ósseos. Do mesmo modo, em estudo com enxerto ósseo (O’keefe et al., 2006), reconstruíram defeitos femorais em camundongos tratados com celecoxibe (25mg/Kg) e ketorolac (4mg/Kg) com enxerto alógeno congelado, registrando uma diminuição no crescimento ósseo de cerca de 60% quando da administração contínua destes medicamentos por cinco semanas, em comparação ao grupo não tratado. Assim, apesar das diferenças existentes entre o reparo de uma fratura óssea, onde os cotos ósseos continuam vascularizados, e os enxertos livres, os quais devem ser revascularizados ou substituídos, os efeitos da inibição ou diminuição atividade da COX-2 parecem semelhantes.
Com relação à marcação do VEGF, o Grupo Controle não exibiu diferença significante no decorrer do tempo. No entanto, o Grupo AINE mostrou menor marcação aos 7 dias, melhorando nos períodos posteriores, com significância estatística. Quando comparado ao Grupo Controle no mesmo período (7 dias), também detectou-se diferença estatística com menor marcação no Grupo AINE. Resultados semelhantes foram obtidos em análise do VEGF por meio de RT-PCR com administração de meloxicam em ratos (Oliveira et al., 2008). Possivelmente, o atraso na angiogênese nos dias iniciais do reparo tenha refletido em uma menor atividade osteogênica nos períodos subjacentes nos animais que receberam o eterocoxibe, atrasando a substituição das partículas do enxerto por osso viável. Apesar deste resultado, a marcação da enzima COX-2 no Grupo AINE mostrou-se semelhante ao Grupo Controle no período de 7 dias, porém, tornou-se menos intensa nos períodos subseqüentes considerando-se a mesma comparação.
Para melhor compreensão deste mecanismo, estudos em longo prazo poderiam ser sugeridos, a fim de se observar os efeitos da inibição da COX-2 no processo de remodelação óssea. No entanto, em se tratando de reconstruções para futura reabilitação
com implantes osseointegráveis, o tempo de espera é limitado, a fim de se manter o volume ósseo adquirido.
REFERÊNCIAS
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450-461.
2. Berse B, Brown LF, Van De WaterL, Dvorac HF, Senger DR. 1992. Vascular permeability fator -vascular endo-thelial growth fator- gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages an tumors. Mol Biol Cell 3:211-220.
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