Resumo
Introdução: A susceptibilidade genética na ocorrência da sarcoidose é sugerida por alguns factores, nomeadamente pela observação de casos de agregação familiar e a associação da raça a diferentes tipos de incidência e gravidade da doença. Vários estudos têm evidenciado a associação da classe I e especialmente da classe II do sistema HLA com a susceptibilidade à sarcoidose. Objectivos: Estudo dos polimorfismos genéticos da classe I e II do sistema HLA e do TNF- num grupo de doentes com sarcoidose, nomeadamente a sua influência na susceptibilidade, apresentação clínica e evolução da doença.
Material e Métodos: Foram incluídos 104 doentes com sarcoidose, tendo sido estudadas a apresentação clínica, funcional, radiológica e os resultados do LBA. Foram usados métodos de biologia molecular na genotipagem do HLA-A*, B*, C*, DRB1*, DQB1* e TNF-. O DNA foi extraído do sangue periférico e foram usados os métodos PCR-SSP e PCR-Reverse Hibridization. As frequências alélicas foram comparadas com controlos da mesma região geográfica pelo teste χ2, sendo usado o teste Kruskal-Walis para variáveis contínuas.
Resultados: Comparativamente com os
controlos, os doentes incluídos apresentavam frequências aumentadas de:
B*08 (10,6% vs 6,1%), O.R.=1,8, I.C.=[1,1;3,1], p=0,02; DRB1*12 (4,3% vs 1,7%), O.R.=2,63, I.C.=[1,1;6,1], p=0,03.
Os doentes com eritema nodoso apresentaram aumento das frequências alélicas de B*51 (14% vs 3,3%), R.R.=2,55, I.C.=[1,5;4,4], p= 0,01; DRB1*03 (28% vs 9,3%), R.R.=2,39, I.C.=[1,5;3,8], pc=0,01;
DQB1*02 (38% vs 18%), R.R.=2,1, I.C.=[1,3;3,3], pc=0,02. O alelo DQB1*03 está diminuído nos doentes que apresentam síndrome ventilatório obstrutivo R.R.=0,53, I.C.=[0,3;0,9], pc=0,05. O alelo DRB1*15 encontra-se significativamente associado quer ao síndrome ventilatório restritivo quer á diminuição da transferência alvéolo- capilar (21,1% vs 6,6%), R.R.=2,46, I.C.=[1,35;4,48], p= 0,01 e (18,1% vs 3,8%), R.R.=1,87, pc= 0,05 respectivamente. Por sua vez o genotipo A/A (high) do TNF-α apresentou uma frequência aumentada (p=0,04) nos doentes com eritema nodoso.
Conclusões: Os resultados obtidos adicionam evidência ao facto de, quer a classe I como a classe II do sistema HLA, influenciam a susceptibilidade, tipo de apresentação, envolvimento orgânico e
Estudo de polimorfismos genéticos do HLA (classes I e II) e do TNF- α em doentes com sarcoidose
HLA class I and II and TNF-α gene polymorphisms in sarcoidosis patients.
António Morais, Helena Alves, Bruno Lima, Luís Delgado, Ricardo Gonçalves, Sandra Tafulo
Serviço de Pneumologia do Hospital São João
Centro do Histocompatibilidade do Norte
Serviço de Imunologia da Faculdade de Medicina do Porto
eritema nodoso parece-se relacionar com o genótipo de elevada produção de TNF-α, associação essa já anteriormente descrita.
Abstract
Introduction: Several factors suggest a genetic predisposition to sarcoidosis namely the recognition of the race as a risk factor and the occurrence of familiar clustering of cases. Several studies have reported an association of sarcoidosis and HLA-class I and especially class II alleles in different populations.
Aim: HLA class I, class II and TNF-
genotyping in a group of sarcoidosis patients and its relation with clinical presentation and outcome.
Material and methods: A total of 104 sarcoidosis patients were included. Clinical presentation, organ involvement, functional, radiological and LBA findings were studied.
HLA- A*, -B*, -C*, DRB1*, DQB1* and TNF-α were genotyped by molecular biology methods. DNA was extracted from peripheral blood and PCR-SSP and PCR- Reverse Hibridization methods have been used. Allele’s frequencies were compared with controls from the same region. X test2 was used for discrete values and for continuous values was used the Kruskal- Walis test.
Results: When patients are compared with controls we note increased frequencies of B*08 (10.6% vs 6.1%), O.R.=1.8, I.C.=[1.1;3.1], p=0.02; DRB1*12 (4.3% vs 1.7%), O.R.=2.63, I.C.=[1.1;6.1], p=0.03.
Patients with erithema nodosum have increased frequencies of the alleles: B*51 (14% vs 3.3%), R.R.=2.55, I.C.=[1.5;4.4], p= 0.01; DRB1*03 (28% vs 9.3%), R.R.=2.39, I.C.=[1.5;3.8], pc=0.01;
DQB1*02 (38% vs 18%), R.R.=2.1, I.C.=[1.3;3.3], pc=0.02. The allele DQB1*03 is decreased in patients with obstructive pattern R.R.=0.53, I.C.=[0.3;0.9], pc=0.05.
TNF-α A/A (high) genotype is significantly associated with erithema nodosum (p=0.04).
Conclusions: These data add support to the genetic association of HLA class I and II with sarcoidosis in what concerns susceptibility, type of presentation, organ involvement and evolution. Moreover as previously described in other populations, TNF-α A/A (high) genotype has a significant association with erithema nodosum.
Introdução
A sarcoidose é uma doença associada a uma
inflamação granulomatosa com
envolvimento multisistémico1,2,3. O envolvimento torácico é o mais comum, afectando cerca de 90% dos doentes1,2,3. A sua causa não é conhecida, conjecturando-se que possa ser resultante da exposição a um agente ambiental por parte de um indivíduo com predisposição para desenvolver a doença1,2,3. Alguns dos factores que sugerem a predisposição genética são a ocorrência de agregação familiar descrita com um risco relativo entre 5-10% e a diferente prevalência, tipo de apresentação clínica e grau de gravidade associados a diferentes raças e regiões, como é exemplo a maior incidência e gravidade da doença nos negros americanos comparativamente com os caucasianos4,5. Existem vários estudos sobre polimorfismos genéticos e a sua associação com a susceptibilidade da doença, como por exemplo os relacionados com o sistema de Antigénios Leucocitários Humanos (HLA)
do Complexo Major de
Histocompatibilidade (MHC), com as citocinas, quimocinas ou com a enzima de conversão da angiotensina sérica (SACE)4. O sistema HLA localizado no braço curto do cromossoma 6 participa na regulação da resposta imune nomeadamente através do reconhecimento de antigénios, no seu processamento e na sua apresentação aos linfócitos CD4 através da sua classe II, ou aos linfócitos CD8 pela sua classe I6,7. Por outro lado as citocinas são fundamentais para a comunicação celular e,
consequentemente, podem ser elementos determinantes na modulação da resposta imune. Vários estudos têm permitido estabelecer uma conexão entre determinados genótipos da TNF-, TGF-1, IL-10, IL-6 e IFN- e os níveis de expressão destas citocinas. Os polimorfismos nas regiões promotoras destes genes têm significado funcional, podendo estar envolvidos na susceptibilidade ou severidade de várias doenças nomeadamente de natureza autoimune ou de etiologia infecciosa. Estes polimorfismos estão relacionados com níveis diferentes de produção de citocinas em células específicas (linfócitos, monócitos e macrófagos). Dado a localização do TNF-
no MHC, foi igualmente objecto de análise no âmbito deste estudo.
Objectivos
Estudo da associação de polimorfismos das classes I e II do sistema HLA e do TNF-α com a susceptibilidade da sarcoidose, assim como a eventual influência na sua forma de apresentação clínica, funcional e radiológica, na sua gravidade e evolução.
Material e Métodos
Amostra do estudo
Neste estudo foram incluídos 104 doentes do Norte de Portugal diagnosticados com sarcoidose. Em 76 (73,1%) doentes obteve- se confirmação histológica de sarcoidose. Os restantes apresentavam alterações radiológicas (estádio I ou II) e do LBA (linfocitose com relação CD4/CD8 > 3,5) que permitiram fazer o diagnóstico de acordo com o Statement da ERS/ATS/WASOG1. Por outro lado todos os casos sem confirmação histológica foram seguidos pelo menos durante 2 anos, não havendo na sua evolução qualquer alteração
Os doentes incluídos foram tipados para os loci HLA-A*, -B*, -C*, -DRB1* e -DQB1*
do HLA. As frequências alélicas foram comparadas com controlos do norte de Portugal, não tendo nenhum a doença estudada. A população controlo era constituída por 650 indivíduos, 51,1% dos quais do sexo femenino, tipados para os loci HLA-A*, -C*, -B* e -DRB1*, e 405 tipados em -DQB1*. Dos doentes que fazem parte deste estudo, 83 foram tipados para o TNF- α, sendo as frequências dos genótipos comparadas com as frequências de 124 controlos. Foi analisada a região promotora desta citocina, que apresenta um polimorfismo que está relacionado com diferentes produções de TNF-α, estando os genótipos relacionados com o nível de
produção desta citocina.
Foi estudado o polimorfismo na posição -308, dado que se verificou que os altos respondedores são os que têm o
genótipo TNF-alfa -308 A,
podendo estar em homozigotia A/A (high/high) ou em heterozigotia A/G (high/low)."
Genotipagem
O DNA foi extraído a partir de sangue periférico fresco por um procedimento de Salting-Out com 6M NaCl seguido de incubação de 1h com proteinase K.
A genotipagem dos loci HLA-A*, -B*, -C*, -DRB1* e -DQB1* foi feita pela técnica PCR-SSP (Sequence Specific primers) em que os pares de “primers” escolhidos, específicos de determinada sequência, só amplificam quando o terminal 3’ do primer é complementar da sequência alvo. Portanto, os alelos ou grupo de alelos são determinados pela presença de produto da PCR específico.
Os polimorfismos genéticos da citocina TNF- foram determinados através da técnica de PCR-SSP (utilizando kits comerciais da One Lambda, Inc. Canoga Park, CA, USA). Os fragmentos de DNA
de electroforese em gel de agarose e posteriormente visualizados por coloração com brometo de etídio e exposição a luz ultravioleta.
A interpretação dos resultados baseia-se na presença ou ausência de fragmentos específicos de DNA amplificado. Tendo em conta que, durante a reacção de PCR, a amplificação pode ser afectada por vários factores, é incluído um controlo interno em cada reacção de PCR (amplificação de uma região conservada do gene da -globulina humana, presente em todas as amostras de DNA), de modo a verificar a integridade de cada reacção. Uma reacção positiva para um alelo específico de uma citocina, ou para um grupo de alelos, é visualizada no gel como um fragmento de DNA amplificado situado entre a banda do produto do controlo interno e a banda de primers não incorporados.
Tipagem HLA. Electroforese dos produtos PCR em gel de agarose.
Análise estatística
A comparação das frequências dos doentes com os controlos foi feita com o teste χ2, tendo sido utilizada a correção de Fisher sempre que se justificou. Os valores de p do teste χ2 foram corrigidos para as múltiplas comparações (pc) através da formula pc = 1 – (1 – p)n sendo n o número de alelos por cada locus ou o número de genótipos para a citocina (n=17 para A*; n=24 para B*; n=13 para C*; n=13 para DRB1*; n=5 para DQB1*). Os valores de p são considerados estatisticamente significativos quando menores que 0,05. Odds Ratio (O.R.), Risco
Relativo (R.R.) e intervalos de confiança (I.C.) a 95% foram calculados para quantificar as possíveis associações. Foram também calculadas as frequências relativas (%) de cada alelo ou genótipo em cada grupo. O teste de Kruskal-Walis foi utilizado para testar a hipótese de os valores médios das contagens de linfócitos, neutrófilos e da razão CD4/CD8 serem iguais. O recurso à correcção para múltiplas comparações dos valores de p é prática comum nos estudos de associação alélica com o HLA dado que os loci desta região são muitos polimórficos e recorrendo aos valores corrigidos garante-se que as possíveis associações encontradas não são fruto do acaso. A alternativa à correcção dos valores de p para as múltiplas comparações passa pela replicação dos resultados com valores de p não corrigidos que sejam estatisticamente significativos. É por esta razão que neste trabalho são apresentados tanto os valores de p corrigidos para as múltiplas comparações (pc) como os valores de p não corrigidos (p) devendo estes ser tidos em conta sempre que hajam dados na literatura que sejam coincidentes. Valores de p não corrigidos estatisticamente significativos podem ser considerados como indicadores de futuras hipóteses de estudo.
Toda a análise estatística foi feita utilizando os softwares SPSS v11.5 e EpiInfo.
Resultados
Amostra dos doentes estudada
Os 104 doentes estudados apresentavam uma média de idades de 38,1±11,3 anos, sendo 64 (61,5%) do sexo feminino. Dez (9,6%) doentes estavam assintomáticos na altura em que foi efectuado o diagnóstico, sendo nos sintomáticos a dispneia (48%), a tosse (43,2%) e o eritema nodoso (EN) (25%) os sintomas/sinais clínicos mais comuns. No estudo funcional efectuado inicialmente, 43,6% dos doentes não apresentaram alterações, 21,8%
apresentavam diminuição dos débitos expiratórios intermédios, 12,6% síndrome ventilatório obstrutivo, 18,3% síndrome ventilatório restritivo e 3,4% síndrome ventilatório misto. Os estadios radiológicos, segundo observação da TAC torácica, com cortes de alta resolução, distribuíam-se da seguinte forma: I- 33,7%, II- 46,9%, III- 10,8%, IV- 8,13%. Observou-se envolvimento extratorácico em 45,2% dos doentes incluídos. Foi possível determinar com precisão a evolução clínica em 81 doentes, verificando-se regressão total da doença em 39 (48,1%) doentes e evolução para a cronicidade em 42 (51,9%), tendo estes últimos pelo menos 2 anos de seguimento em consulta. Dos doentes incluídos 74 (71,2%) realizaram Lavado Broncoalveolar (LBA) no estudo efectuado na altura do diagnóstico. O valor médio dos linfócitos era de 40,1 ± 19,2, da relação CD4/CD8- 5,8 ± 4,9 e dos neutrófilos 3,2±4,9.
Estudo do sistema HLA- classes I e II Da comparação das frequências alélicas do HLA dos doentes com os controlos verifica- se que os alelos B*08 (O.R.=1,83), DRB1*03 (O.R.=1,83) e DRB1*12 (O.R.=2,63) são os mais associados à doença, não apresentando no entanto significância estatística quando os seus valores de p são corrigidos para as múltiplas comparações. As frequências dos alelos B*44, B*51, C*14, DRB1*04, DRB1*07 e DRB1*08 têm as frequências diminuídas nos doentes, não sendo igualmente os valores de p quando corrigidos para múltiplas comparações estatisticamente significativos (tabela1).
Em relação à apresentação clínica os alelos DRB1*03 (R.R.=2,39) e DQB1*02 (R.R.=2,05) são os que mostram maior associação com os doentes com EN, sendo os seus valores de p estatisticamente significativos depois de corrigidos para as múltiplas comparações (pc=0,01 e pc=0,02 respectivamente) (tabela2).
Na análise efectuada ao estudo funcional respiratório, salienta-se a frequência aumentada do alelo DRB1*15 nos doentes com síndrome ventilatório restritivo (21,1%
vs 6,6%, R.R.=2,46, I.C.=[1,35;4,48], p=
0,01) e também naqueles com diminuição da transferência alveolo-capilar, sendo apenas nestes o valor de p estatisticamente significativo quando corrigido para múltiplas comparações (18,1% vs 3,8%;
R.R.=1,87; pc=0,05) (tabela3).
Os alelos B*14, C*08 e DRB1*11 parecem estar associados com as formas mais graves da doença, definidas pelo estadio radiológico III e IV (R.R.=2,52; R.R.=2,52 e R.R.=2,31, respectivamente). No entanto os valores de p depois de corrigidos não são estatisticamente significativos.
Nos doentes com envolvimento extratorácico não foram encontrados alelos com frequências significativamente
aumentadas. Foram estudados
separadamente os doentes com envolvimento hepático e cutâneo (em cada uma das apresentações observaram-se 21 doentes-20,1%). Os doentes com atingimento hepático apresentavam frequências aumentadas do alelo B*14 (16,7% versus 5,8% com p=0.05(f)), R.R = 2,25 e 95%C.I.= 1,2;4,2. Não encontramos nenhuma associação em relação à sarcoidose cutânea. Não foi analisado nenhum outro envolvimento orgânico, dado o escasso número da amostra.
No estudo dos resultados do LBA, o alelo C*04 parece ter um efeito protector para valores da razão CD4/CD8 > 3,5 (R.R.=0,37, pc=0.04) (tabela 4).
As frequências do alelo DRB1*04 estão aumentadas nos doentes que evoluíram para cronicidade quando comparadas com a dos que apresentam regressão (valores estatisticamente não significativos, após correcções de p). Já os alelos A*01, B*18 e DRB1*03 têm as suas frequências diminuídas nos doentes que evoluem para cronicidade, não sendo igualmente os valores de p, quando corrigidos, estatisticamente significativos.
Estudo dos genótipos promotores de TNF-α
Analisando os génotipos da citocina TNF-α em relação ao EN, o genótipo A/A (high) tem uma frequência aumentada (p=0,04).
Não foram encontradas outras associações com significância em relação à doença estudada (tabela 5).
Discussão
O trabalho descrito teve como objecto de estudo uma população de doentes com sarcoidose do Norte de Portugal, com características que se pretenderam representativas, nomeadamente em relação à sua apresentação clínica e distribuição radiológica. Devido ao facto de haver uma percentagem importante de doentes cuja apresentação clínica e radiológica é francamente sugestiva de sarcoidose e não necessitarem de confirmação histológica, como é exemplo aqueles que cursam com síndrome de Löfgren’s, levou-nos à inclusão de alguns doentes que apresentavam os critérios de diagnóstico da ATS/ERS mas não tinham confirmação histologica, pois pareceu-nos que a sua não inclusão retiraria representatividade à amostra.
Os estudos sobre a associação do sistema HLA e a sarcoidose privilegiaram inicialmente a classe I deste complexo. As várias publicações existentes na literatura internacional referem algumas associações entre alelos desta classe e a susceptibilidade à sarcoidose, sendo a mais comum a ligação com o HLA-B8 em populações caucasianas8-
13. Estão descritas outras associações, nomeadamente com o HLA-A1, HLA-B13, HLA-B15, HLA-B22, HLA-B35, HLA-Cw7 e nos afro-americanos com o HLA- B710,11,13,14,15,16,17. Por outro lado o HLA-B8 foi relacionado com a apresentação aguda, de curta duração e de regressão espontânea16. Mais recentemente foi dado um maior ênfase à classe II do HLA por esta envolver os linfócitos T CD4+ na apresentação do antigénio, sendo assim mais
provável a sua relação com a sarcoidose.
Segundo alguns autores as associações encontradas com a classe I do HLA poderiam ser resultantes de desequilíbrios de ligação com genes da classe II de maior relevância4. No entanto, mais recentemente a classe I do HLA tem sido objecto de novos estudos, agora com métodos de biologia molecular, estando descritas conexões significativas com o HLA-B*07 e HLA- B*08 apresentando-se estes como factores de risco independentes para a susceptibilidade na sarcoidose18. Por outro lado a combinação alélica HLA-B*07, HLA-B*08 e HLA-DRB1*15 mostrou uma associação significativa com a cronicidade da doença18. Para além destes alelos, o HLA- A*01, HLA-B*08 e HLA-C*03 mostraram influência no prognóstico ao associarem-se de forma significativa à regressão da doença7,19. Estes resultados sugerem que a classe I do HLA desempenha uma função importante conjuntamente com a classe II na susceptibilidade e prognóstico da doença4,7. No estudo por nós efectuado observou-se igualmente um aumento significativo da frequência do HLA-B*08. Embora esta significância não se mantenha após a correcção do p para as múltiplas comparações, a persistência da associação deste alelo com a susceptibilidade à sarcoidose em vários estudos publicados, leva-nos a valorizar esta associação. Como foi referido, a classe II do HLA tem sido recentemente objecto de maior atenção dado aparentar uma maior relação com a fisiopatologia da sarcoidose. Dentro da classe II, os antigénios HLA-DR têm sido aqueles mais frequentemente estudados.
Tem-se observado alguma variabilidade nas associações encontradas nomeadamente com a origem geográfica dos doentes. A associação significativa com a susceptibilidade à sarcoidose foi descrita inicialmente em relação aos antigénios HLA-DR2, DR5, DR6, DR8, DR9 e posteriormente a alelos DRB1*17,20,21,22,23. Dentro dos vários estudos que encontraram associação com o locus HLA-DRB1*, verificou-se igualmente uma grande
variação nos alelos: DRB1*03, DRB1*08,
DRB1*11, DRB1*12, DRB1*14,
DRB1*1514,19,24,25,26. Está também descrita a associação de alelos do locus HLA-DPB1 com a susceptibilidade para a ocorrência de sarcoidose23. Por sua vez os estudos efectuados com o locus HLA-DQB1 revelaram uma associação significativa com alguns dos seus alelos, nomeadamente em populações afro-americanas27. No nosso estudo encontramos também uma associação da susceptibilidade com o alelo, HLA- DRB1*03 e DRB1*12, embora não significativa após correcção estatística para as múltiplas comparações, o que parece estar de acordo com a influência do locus HLA- DRB1* na susceptibilidade para a ocorrência da sarcoidose. Por outro lado encontram-se descritas na literatura alelos que parecem conferir protecção como os DRB1*03, DRB1*08, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*14, DRB1*15, DQB1*0202, DQB1*0301, DQB1*0501, DQB1*0601, DQB1*0602 e DQB1*020314,19,24,25,28. No nosso estudo os alelos DRB1*04, DRB1*07 e DRB1*08 apresentaram-se diminuídos nos doentes com sarcoidose em relação aos controlos, resultados esses que no entanto não foram significativos após a correcção estatística das múltiplas comparações.
Estão igualmente descritas associações com diferentes apresentações clínicas, nomeadamente entre o síndrome de Löfgren’s e DQB1*0201 e o DRB1*0328,29,30. Estes resultados são coincidentes com aqueles por nós obtidos, dada a relação estatisticamente significativa encontrada para os alelos DQB1*02 e DRB1*03.
A avaliação funcional respiratória não tem sido objecto de análise nos estudos referentes ao HLA no contexto da sarcoidose. A série de doentes estudada revelou uma relação significativa do alelo DRB1*15 com o síndrome restritivo e com a diminuição da transferência alveolocapilar, embora em relação a este último não mantenha a significância quando ajustado para as múltiplas comparações. Estes
deste alelo com a gravidade da doença, dado as alterações funcionais com que se correlacionou serem geralmente apresentados pelos doentes com doença mais severa.
Noutros estudos sobre eventuais associações com a gravidade da doença definida pelos estadios radiológicos, foi encontrada uma associação significativa com o DQB1*0201 e estádio radiológico I e entre o alelo DQB1*0602 e estádios radiológicos mais avançados26,28. No nosso estudo não encontramos uma associação evidente entre nenhum alelo e os estádios radiológicos.
Pese embora o alelo DRB1*11 esteja aumentado nos estádios III e IV, não adquiriu a significância estatística quando corrigido. Também o tipo de evolução parece estar relacionado com alguns dos componentes do sistema HLA tendo a evolução para a cronicidade sido relacionado com os antigénios HLA-DR2, DR5, DR14, DR15 e o alelo DRB1*15
14,17,22,31. Por outro lado a doença limitada foi relacionada ao HLA-DR2 e DR1717,31. O nosso estudo encontrou uma associação entre a cronicidade e o alelo HLA- DRB1*04, que no entanto não apresentou significância quando corrigida.
As citocinas libertadas pelos macrófagos e linfócitos T apresentam um papel fundamental na patogénese da sarcoidose, nomeadamente na inflamação e formação do granuloma. Por este motivo variações nos genes que codificam estas citocinas poderão ser determinantes na susceptibilidade, grau de gravidade ou evolução desta doença4,32. Neste estudo incluímos a avaliação dos polimorfismos genéticos do TNF-α, dada a importância desta citocina no mecanismo inflamatório e imunológico, nomeadamente no recrutamento das células mononucleares e na formação e manutenção dos granulomas e por se encontrar igualmente englobado no complexo MHC. O complexo TNF encontra-se localizado na região MHC, entre o locus HLA-B e a região de alguns genes de factores de complemento, sendo constituído pelo TNF-α e pela linfotoxina β
se no entanto em discussão se os polimorfismos genéticos associados ao TNF serão funcionais ou corresponderão a desequilíbrios de ligação com outras zonas do complexo HLA4. Por outro lado, parece não haver uma correlação entre os polimorfismos encontrados e o grau de libertação de TNF pelos macrófagos, quer a nível sérico quer a nível do LBA34. Estudos efectuados anteriormente relataram associações entre polimorfismos do TNF quer com a susceptibilidade, o grau de gravidade, a evolução e ainda com o envolvimento orgânico, nomeadamente o cardíaco. Os alelos TNF--857T e TNF308*A apresentaram um aumento significativo em doentes com sarcoidose35-37. Foram igualmente encontradas associações entre os alelos TNFA*2, nomeadamente o TNF308*A e o síndrome de Löfgren’s30,35,36,38,39,40. Por outro lado o haplótipo 2 do alelo -875T associou-se significativamente ao estádio I e regressão da doença, enquanto que o haplótipo 4 se associou com os estádios II-IV e evolução desfavorável da doença36. Foi também observada a relação entre o alelo TNFB*1 do TNF-β e o prolongamento da doença, tendo neste trabalho sido verificado a produção quer de TNF-α quer TNF-β neste polimorfismo, o que poderá significar um papel funcional deste41. Foi igualmente descrita na população japonesa a associação entre doença cardíaca e o alelo TNF A*2, em desequilíbrio de ligação com o alelo HLA-DQB1*060142. Na nossa série de doentes, apenas encontramos associação entre o genótipo A/A (high) e os doentes que apresentaram EN, não tendo sido observada qualquer relação nomeadamente com a susceptibilidade, outros tipos de apresentação clínica e evolução.
Pensamos ser este estudo mais uma evidência de que os polimorfismos genéticos a nível do sistema HLA poderão influenciar a susceptibilidade à doença, a sua expressão clínica ou ainda a evolução. São, no entanto, necessários mais estudos, com amostras maiores de doentes e uma maior associação das diferenças alélicas encontradas em
diferentes populações para uma melhor precisão da sua influência.
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Tabela 1- Comparação das frequências alélicas entre os doentes com sarcoidose e a população controlo. Na amostra de doentes estudada, foram observadas relações entre haplótipos quer da classe 1 quer da classe 2 do HLA e a susceptibilidade da doença, que no entanto não se revelaram significativas na correcção para as múltiplas comparações (pc).
(f) valor para o teste exacto de Fisher ns - valores estatisticamente não significativos
Tabela 2- Comparação das frequências alélicas entre os doentes com e sem eritema nodoso.
Verifica-se uma associação significativa com os alelos DRB103 e DQB102
(f) valor para o teste exacto de Fisher ns - valores estatisticamente não significativos
Tabela 3- Comparação das frequências alélicas entre os doentes com síndrome ventilatório obstrutivo na 1ª tabela e com síndrome ventilatório restritivo na 2ª tabela e os outros doentes. No primeiro grupo verificou-se uma associação significativa entre o alelo DQB103 e no segundo um aumento significativo de DRB115.
(f) valor para o teste exacto de Fisher ns - valores estatisticamente não significativos
Tabela 4- Comparação das frequências alélicas entre os doentes com diferente relação CD4/CD8 no lavado bronco-alveolar. O alelo C04 apresentou-se significativamente aumentado nos doentes com relação CD4/CD8 < 3,5, mostrando uma tendência para se associar a uma menor expansão de linfócitos CD4+ no pulmão profundo.
(f) valor para o teste exacto de Fisher ns - valores estatisticamente não significativos
Tabela 5- Comparação dos génotipos da citocina TNF- em doentes com e sem eritema nodoso (EN). O genótipo correspondente aos altos produtores de TNF-α apresenta uma associação estatisticamente significativa com os doentes que apresentam eritema nodoso.
Estudo dos polimorfismos dos genes promotores das citocinas pró- inflamatórias IL-6 e IFN- e das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e
TGF- em doentes com sarcoidose
António Morais, Helena Alves, Bruno Lima, Ricardo Gonçalves, Sandra Tafulo, Luís Delgado
Serviço de Pneumologia do Hospital São João
Centro do Histocompatibilidade do Norte
Serviço de Imunologia da Faculdade de Medicina do Porto
Resumo
Introdução: O processo inflamatório na sarcoidose caracteriza-se pela actividade de várias citocinas, que participam de forma relevante na fisiopatologia e evolução da doença. Mutações pontuais ou substituições de nucleotídeos na região reguladora dos genes das citocinas afectam a produção das mesmas, podendo ser determinantes na susceptibilidade genética à doença e/ou na dinâmica da resposta imunológica.
Objectivos: Estudo dos polimorfismos genéticos de citocinas pró e anti-inflamatórias num grupo de doentes com sarcoidose, avaliando a sua influência na susceptibilidade, apresentação clínica e evolução da doença.
Material e Métodos: Foram incluídos 110 doentes com sarcoidose, tendo sido estudadas a apresentação clínica, funcional, radiológica e as características do lavado broncoalveolar (LBA).
Foram usados métodos de biologia molecular na genotipagem de TGF1, IL-10, IL-6 e IFN-γ. O DNA foi extraído do sangue periférico e foram usados os métodos PCR-SSP e PCR-Reverse Hibridization. As frequências alélicas foram comparadas com controlos da mesma região geográfica. A comparação das frequências dos doentes com os controlos foi feita com o teste χ2, sendo usado o teste Kruskal-Walis para variáveis contínuas.
Resultados: O genótipo IFN- T/T (high) associou-se significativamente com a sarcoidose (p=0,03) e com a presença de um síndrome ventilatório obstrutivo (p=0,05). Não foram encontradas associações significativas com os polimorfismos da IL-6. O genótipo IL-10 ATA/ATA (low) relacionou-se significativamente com o risco (p=0,04; O.R. = 2,12) enquanto o IL-10 GCC/ACC (int) foi protector (p=0,007; O.R. = 0,43). O genótipo IL-10 GCC/GCC (high) associou-se significativamente ao eritema nodoso (p=0,01) e com a neutrofilia no LBA (p=0,05).
Por outro lado o genótipo IL-10 ATA/ATA (low) associou-se significativamente com o envolvimento extra-torácico (p=0,04), cutâneo (p=0,05), elevação da ECA (p=0,03) e com a evolução para a cronicidade (p=0,05). Relativamente ao TGF-, não se verificou qualquer relação com a susceptibilidade à doença. No entanto, o genótipo TGF- C/C C/C (low) associou- se ao eritema nodoso (p=0.04) enquanto o T/T G/G (high) associou-se com o síndrome ventilatório restrictivo (p=0.05) e a evolução para a cronicidade (p=0.04).
Conclusões: Estes resultados parecem confirmar que a susceptibilidade e evolução clínica na sarcoidose são influenciadas por genes que codificam citocinas pró e anti-inflamatórias, podendo ser determinantes nessa relação alguns polimorfismos nas suas regiões promotoras.
Abstract
Introduction: The inflammatory response in sarcoidosis is characterized by the activity of various cytokines which may influence the course of the disease. Point mutations or single nucleotide substitutions in the regulatory regions of cytokine genes affect cytokine expression and could be associated to the susceptibility to immunologic mediated disorders and/or influence the strength and duration of the immune response.
Aims: IL-6, IFN-, IL-10, TGF- genotyping in a group of sarcoidosis patients, evaluating its relation with the susceptibility, clinical presentation and outcome of the disease.
Material and methods: A total of 110 sarcoidosis patients were included. Clinical presentation, organ involvement, functional, radiological and BAL findings were studied. TGF-β1, IL-10, IL-6 e INF-γ were genotyped by molecular biology methods. DNA was extracted from peripheral blood and PCR-SSP and PCR-Reverse Hybridisation methods have been used. Allele’s frequencies were compared with controls from the same geographical region. X2 test was used for discrete values and the Kruskal-Walis test for continuous variables.
Results: IFN- T/T (high) was significantly related with sarcoidosis susceptibility (p=0.03) and with an obstructive pattern in pulmonary function tests (p=0.05). No significant associations were found with IL-6 genotypes. IL-10 ATA/ATA (low) was related with a significantly increased risk of sarcoidosis (p=0.04; OR=2.12) and IL-10 GCC/ACC (int) was protective of the disease (p=0.007; OR=0.43). IL-10 GCC/GCC (high) was associated with erithema nodosum (p=0.01) and with BAL neutrophilia (p=0.05). IL-10 ATA/ATA (low) was significantly associated with extra-thoracic (p=0.04) and cutaneous (p=0.05) involvement, elevated SACE (p=0.03) and with chronicity (p=0.05). TGF- C/C C/C (low) had a significant association with
erithema nodosum (p=0.04) while T/T G/G (high) was associated with a functional restrictive pattern (p=0.05) and with chronicity (p=0.04).
Conclusions: These results seem to confirm that the susceptibility and clinical course of sarcoidosis are under the genetic influenced of pro and anti-inflammatory cytokines and their genetic polymorphisms may have a determinant role in the disease main characteristics.
Introdução
A sarcoidose é uma doença inflamatória granulomatosa sistémica de etiologia desconhecida, na qual há evidência da persistência de uma resposta inflamatória de mediação imunológica, em indivíduos com predisposição genética.1,2
As citocinas são cruciais no desenvolvimento e manutenção do processo inflamatório, não só através da quimiotaxia, activação e proliferação celulares, como também através de actividade anti-apoptótica, acções exercidas, entre outras, pela IL-2, TNF-α e IFN-.1,3 Por outro lado, algumas das funções destas citocinas podem ser determinantes na evolução da sarcoidose, como é exemplo o TNF-α que, ao estimular a proliferação de fibroblastos, a síntese de colagéneo e a angiogénese, pode ser um elemento chave na evolução para a fibrose.4,5 Contrariamente, o IFN- tem actividade antifibrótica, ao inibir a proliferação de fibroblastos e a síntese de colagéneo.6
O processo que conduz à formação do granuloma parece iniciar-se pela activação de linfócitos T, nomeadamente CD4+, feita após contacto com o(s) antigénio(s) apresentado(s) pelas células apresentadoras de antigénios, como os macrófagos ou as células dendítricas, que iniciariam assim a expansão clonal T.7,8 Após a activação, as células T produzem uma resposta do tipo Th1 segregando, entre outras citocinas, a IL-2, IFN-, linfotoxina, que atraem outras células mononucleares para os alvéolos.3,6 A presença de monócitos e macrófagos constitui um componente fundamental no processo inflamatório da sarcoidose, para o qual podem contribuir através da produção de citocinas, tais como a IL-1, IL-15, TNF-α ou IL-12, promotoras de uma resposta do tipo Th1.6,7 Os macrófagos alveolares segregam igualmente uma série de quimocinas como a macrophage inflammatory-1 protein (MIP1)-, MIP1- e MIP3-, que também contribuem para o processo inflamatório através do recrutamento de células T para o pulmão assim como para a constituição do granuloma, nomeadamente através da formação de células epitelióides.7,9 Também sob a influência de algumas citocinas, como o M-CSF e GM-CSF, os macrófagos evoluem para células gigantes multinucleadas, outro dos componentes do
granuloma.6,7 Por sua vez, as células T activadas dispõem-se na camada exterior, produzindo citocinas responsáveis pela manutenção do granuloma.6
O facto de uma parte relevante dos doentes com sarcoidose apresentar uma regressão espontânea da doença, levanta a hipótese de citocinas anti-inflamatórias participarem na imunoregulação da sarcoidose. Poderá ser o caso do TGF-, uma citocina de múltiplas actividades, nomeadamente a inibição de citocinas libertadas pelos macrófagos e linfócitos, a par de propriedades pró fibróticas.10,11 A expressão de TGF- encontra-se aumentada nos doentes com sarcoidose, embora nestes ela esteja significativamente diminuída nos doentes que necessitam de terapêutica, o que sugere um papel na limitação do processo inflamatório.12 Embora menos estudada na sarcoidose a IL-10 parece ter um papel anti-inflamatório importante ao exercer um efeito frenador sobre a libertação de citocinas pelos macrófagos e linfócitos.10,13
Concluí-se assim que a evolução do processo inflamatório granulomatoso para a regressão ou para a sua persistência com eventual evolução para a fibrose, poderá depender de um delicado balanço de células inflamatórias, células reguladoras, apoptose e resposta citocínica- as citocinas reguladoras (TGF-, IL-10) necessitam de contrabalançar o efeito das citocinas pró- inflamatórias (TNF-α, IFN-) de forma a favorecer a regressão.
Mutações pontuais ou substituições únicas de nucleotídeos (SNPs) na região reguladora dos genes dos promotores das citocinas levam a diferenças na produção e na dinâmica das mesmas.14 Encontram-se descritas na literatura várias polimorfismos funcionais relacionados com citocinas participantes no processo inflamatório da sarcoidose, como são exemplo os casos da IL-6, IL-10, TGF-, IFN- ou TNF-α.14-17 Este facto indica a hipótese de que a presença destes polimorfismos em doenças com mediação imunológica, mediante o diferente nível de produção da respectiva citocina, poderá predispor para a manifestação da doença, como ainda poderá condicionar o seu grau de gravidade e evolução.7,14
Tabela 1. Citocinas envolvidas na inflamação granulomatosa da sarcoidose
Objectivos
Estudo dos polimorfismos dos genes promotores das citocinas próinflamatórias IL-6 e IFN- e antiinflamatórias IL-10 e TGF- em doentes com sarcoidose, nomeadamente a sua influência na susceptibilidade, fenótipo apresentado e evolução da doença.
Material e Métodos
Amostra do estudo
Neste estudo foram incluídos 110 doentes do Norte de Portugal com o diagnóstico de sarcoidose. Em 76 (69%) doentes obteve-se confirmação histológica de sarcoidose. Os restantes apresentavam alterações radiológicas (estadio I ou II) e do LBA (linfocitose com relação CD4/CD8 > 3,5) que permitiram fazer o diagnóstico de acordo com o Statement da ERS/ATS/WASOG.40 Por outro lado todos os casos sem confirmação histológica foram seguidos
A. Citocinas Th1
Interferão-gamma (IFN-)1,18 Interleucina 2 (IL-2)19,20 Linfotoxina-alfa (LT)21 Interleucina 12 (IL-12)22 Interleucina 18 (IL-18)23,24 Interleucina 27 (IL-27)25 Interleucina 15 (IL-15)26 B. Citocinas Pró-inflamatórias
Factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α)27,28 Interleucina 1 (IL-1)29,30
Osteopontina (OPN)31
Factor de inibição da migração dos macrófagos (MIF)32
Factor estimulante das colónias dos macrófagos e granulócitos (GM-CSF)33 Interleucina 6 (IL-6)34,35
C. Citocinas anti-inflamatórias
Transforming growth factor beta (TGF-)12 Interleucina 10 (IL-10)36
D. Citocinas pró-fibróticas
Transforming growth factor beta (TGF-)12
Factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF)37 Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)37
Factor de crescimento do tecido conectivo (CTGF)38 Basic fibroblast growth factor (bFGF)39
pelo menos durante 2 anos, não havendo na sua evolução qualquer alteração sugestiva de outro diagnóstico. Os resultados obtidos no estudo dos polimorfismos genéticos das citocinas foram comparados com 124 indivíduos controlos saudáveis no caso das citocinas IL-6, IFN- e TGF-1 e com 274 indivíduos para a IL-10.
Genotipagem
O DNA foi extraído a partir de sangue periférico fresco, por um procedimento de Salting- Out com 6M NaCl seguido de incubação de 1h com proteinase K.
Os polimorfismos genéticos das citocinas TGF-1, IL-10, IL-6 e IFN- foram determinados através da técnica de polymerase chain reaction – sequence-specific primer (PCR- SSP) de amplificação de primers (utilizando kits comerciais da One Lambda, Inc. Canoga Park, CA, USA). A localização das regiões dos polimorfismos testados são: a região promotora -174 bp da IL-6; as regiões promotoras -1082, -819 e -592 bp da IL-10; repetição do dinucleotido CA no intrão 1 do IFN-; e os codões 10 e 25 da sequência de sinal do TGF-.41
Os fragmentos de DNA amplificado foram depois separados através de electroforese em gel de agarose (2%) e posteriormente visualizados por coloração com brometo de etídio e exposição a luz ultravioleta.
A interpretação dos resultados baseia-se na presença ou ausência de fragmentos específicos de DNA amplificado. Tendo em conta que, durante a reacção de PCR, a amplificação pode ser afectada por vários factores, é incluído um controlo interno em cada reacção de PCR (consiste na amplificação de uma região conservada do gene da -globulina humana, presente em todas as amostras de DNA), de modo a verificar a integridade de cada reacção. Uma reacção positiva para um alelo específico de uma citocina, ou para um grupo de alelos, é visualizada no gel como um fragmento de DNA amplificado situado entre a banda do produto do controlo interno e a banda de primers não incorporados.
…
Tabela 2. Polimorfismos genéticos das citocinas TGF-1, IL-10, IL-6, IFN-. Posições- posição de cada poço na placa de PCR
Tamanho do produto- indica o tamanho em pares de bases (bp), das bandas correspondentes ao produto específico amplificado em cada poço. Especificidade- os números correspondem a uma posição no gene e as letras correspondem ao ácido nucleico que ocupa aquela posição (ex. IL-6 promotor -174C, significa que uma citosina ocupa a posição 174 na região do promotor do gene que codifica a IL-6). Polimorfismos genéticos- na coluna da esquerda encontram-se os polimorfismos dos genes dos promotores das citocinas estudadas e a informação do nível de citocina produzida por cada um deles. Promotor- região reguladora de DNA localizada a montante de um gene (em direcção à região 5’), providenciando um ponto de controlo à transcrição do gene. Codão- sequência de 3 bases nitrogenadas de RNA mensageiro que codificam um determinado aminoácido ou que indicam o ponto de início ou fim de tradução da cadeia de RNAm. Isto significa que cada conjunto de três bases consecutivas é responsável pela codificação de um aminoácido. Intrão- secções de DNA de um gene que não codificam qualquer parte da proteína produzida pelo gene e que separa a sequência constituída pelos exões. Permitem que a célula realize um processo denominado splicing alternativo, onde formas proteicas diferentes podem ser traduzidas a partir de um mesmo RNAm.
1H/3H/ 1G/3G/ 1F/3F/ 1E/3E/ 1D/3D/ 1C/3C/ 1B/3B/ 1A/3A/ 2H/4H/ 2G/4G/ 2F/4F/ 2E/4E/ 2D/4D/ 2C/4C/ 2B/4B/ 2A/4A/
5H/7H/ 5G/7G/ 5F/7F/ 5E/7E/ 5D/7D/ 5C/7C/ 5B/7B/ 5A/7A/ 6H/8H/ 6G/8G/ 6F/8F/ 6E/8E/ 6D/8D/ 6C/8C/ 6B/8B/ 6A/8A/
9H/11H 9G/11G 9F/11F 9E/11E 9D/11D 9C/11C 9B/11B 9A/11A 10H/12H/ 10G/12G 10F/12F 10E/12E 10D/12D 10C/12C 10B/12B 10A/12A
750 125 125 200 200 200 200 300 300 300 250 250 175 175 250 250
Neg Ctrl TNF-α TNF-α TGF-β1 TGF-β1 TGF-β1 TGF-β1 IL-10 IL-10 IL-10 IL-10 IL-10 IL-6 IL-6 IFN-γ IFN-γ
promoter promoter codon codon codon codon promoter promoter promoter promoter promoter promoter promoter intron 1 intron 1 -308A -308G 10T 10C 25C 25G -1082A,-819T -1082G,-819C -1082A,-819C -819T,-592A -819C,-592C -174C -174G -874T -874A G/G (low)
G/A (high) A/A (high) T/T G/G (high) T/C G/G (high) T/C G/C (intermediate) C/C G/G (intermediate) T/T G/C (intermediate) C/C G/C (low) C/C C/C (low) T/T C/C (low) T/C C/C (low) GCC/GCC (high) GCC/ACC (intermediate) GCC/ATA (intermediate) ACC/ACC (low) ACC/ATA (low) ATA/ATA (low) G/G (high) G/C (high) C/C (low) T/T (high) T/A (intermediate) A/A (low) TNF-α
POSITIONS
SPECIFICITY RESULTS (mark positive locations) PRODUCT SIZE (bp)
TGF-β1
IL-10
IFN-γ IL-6
Análise estatística
As frequências dos genótipos foram calculadas por contagem directa. A comparação das frequências dos doentes com os controlos foi feita com o teste χ2, tendo sido utilizada a correcção de Fisher sempre que se justificou. Os valores de p do teste χ2 foram corrigidos para as múltiplas comparações (pc) através da formula pc = 1 – (1 – p)n sendo n o número de genótipos possíveis por (n=9 para TGF-1; n=6 IL-10; n=3 IL-6; n=3 IFN-). Os valores de p são considerados estatisticamente significativos quando menores que 0,05. Odds Ratio (O.R.), Risco Relativo (R.R.) e intervalos de confiança (I.C.) a 95% foram calculados para quantificar as possíveis associações. Foram também calculadas as frequências relativas (%) de cada alelo ou genótipo em cada grupo. O teste de Kruskal-Walis foi utilizado para testar a hipótese de os valores médios das contagens de linfócitos, neutrófilos e da razão CD4/CD8 serem iguais. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para valores de p < 0,05. A análise estatística foi feita utilizando os softwares SPSS v.14 e EpiInfo.
Resultados
População estudada
Os 110 doentes estudados apresentavam uma média de idades de 36.6 (± 11,4) anos, sendo 65 (59%) do sexo feminino. Dez (9%) doentes estavam assintomáticos na altura em que foi efectuado o diagnóstico, sendo nos sintomáticos a dispneia (47,2%), a tosse (44,5%) e o eritema nodoso (EN) (21,8%) os sintomas/sinais clínicos mais comuns. No estudo funcional efectuado inicialmente, 44,9% dos doentes não apresentaram alterações, 22,4% apresentavam diminuição dos débitos expiratórios intermédios, 11,2% síndrome ventilatório obstrutivo, 19,1%
síndrome ventilatório restritivo e 3,3% síndrome ventilatório misto. Os estadios radiológicos, segundo observação da TAC torácica, com cortes de alta resolução, distribuíam-se da seguinte forma: I- 33%, II- 48,3%, III- 10,2%, IV- 8,5%. Observou-se envolvimento extratorácico em 46% dos doentes incluídos. Foi possível determinar com precisão a evolução clínica em 82 doentes, verificando-se regressão total da doença em 39 (47,5%) doentes e evolução para a cronicidade em 43 (52,5%), tendo estes últimos pelo menos 2 anos de seguimento em consulta.
Dos doentes incluídos 81 (73,6%) realizaram Lavado Broncoalveolar (LBA) na avaliação
efectuada na altura do diagnóstico. O valor médio dos linfócitos era de 40,8 ± 18,6%, da relação CD4/CD8- 5,7 ± 4,8 e dos neutrófilos 3,3±4,8%.
Estudo dos genótipos dos promotores das citocinas pró-inflamatórias IFN- e IL-6
Quando comparados com os controlos, o genótipo T/T (high) do interferão associou-se significativamente com a susceptibilidade à doença (p=0,03). Este mesmo genótipo correlacionou-se com os doentes com síndrome ventilatório obstrutivo (p=0,05). O genótipo T/A (int) associou-se aos doentes que apresentavam um valor de enzima de conversão da angiotensina (ECA) aumentado (p=0,03). Não se encontraram associações significativas em relação à apresentação clínica, ao padrão radiológico, aos parâmetros do LBA, ao envolvimento extratorácico ou ainda à evolução clínica.
Os polimorfismos da região promotora da IL-6 não apresentaram associações estatisticamente significativas com a susceptibilidade, apresentação clínica, parâmetros funcionais respiratórios ou do LBA, estadio radiológico ou ainda com a evolução clínica.
Estudo dos genótipos dos promotores das citocinas anti-inflamatórias TGF- e IL-10
Quando comparadas as frequências dos genótipos da citocina IL-10 dos doentes com sarcoidose com os controlos, verifica-se que o genótipo ATA/ATA (low) tem a sua frequência aumentada (p = 0,04; O.R. = 2,12; I.C.95% = 0,95;4,69). Se somarmos as frequências dos genótipos da citocina IL-10 que expressam baixa produção obtemos igualmente uma diferença estatisticamente significativa (p = 0,01; O.R. = 1,8; I.C.95% = 1,1;2,9). Por outro lado verifica- se que o genótipo GCC/ACC (int) tem a sua frequência diminuída no grupo de doentes (p = 0,007; O.R. = 0,43; I.C.95% = 0,22;0,84).
Na apresentação clínica, os doentes com eritema nodoso, tinham de forma significativa o genótipo GCC/GCC (high) (p = 0,01; R.R. = 2,53; 1,27;5,03). Não foi encontrada nenhuma relação estatisticamente significativa com os estadios radiológicos e, em relação à avaliação funcional pulmonar, verificou-se uma frequência relativamente mais elevada do genótipo ACC/ATA (low) nos doentes com transferência alvéolo-capilar normal (p = 0,04).
Em relação ao LBA, o genótipo GCC/ACC (int) associou-se significativamente com a linfocitose intensa, definida como > 40% (p = 0,02), enquanto que a neutrofilia, definida como >
2%, se associou com o aumento de GCC/GCC (high) (p = 0,05; R.R.= 1,78; 1,01;3,15). e a diminuição de GCC/ATA (int).
A elevação da ECA relacionou-se com o genótipo ATA/ATA (low) (p = 0,03; R.R. = 1,96; I.C.95% = 1,49;2,58). O envolvimento extratorácico associou-se significativamente com o aumento do genótipo ACC/ACC (low) (p = 0,04; R.R. = 1,89; I.C.95% = 1,28;2,79) e com a diminuição do genótipo GCC/GCC (high) (p = 0,04; R.R. = 0,54; 0,28;1,05). Enquanto o envolvimento hepático não mostrou qualquer relação, o envolvimento cutâneo associou-se significativamente com o genótipo ATA/ATA (low) (p = 0,05; R.R. = 2,62; I.C.95% =
1,15;5,97) e com a diminuição do GCC/GCC (high) (p = 0,04; R.R. = 0,17; I.C.95% =
0,02;1,09). Os doentes que evoluíram para a cronicidade relacionaram-se significativamente com o genótipo ATA/ATA (low) (p = 0,05; R.R. = 1,64; I.C.95% = 1,14;2,35).
Relativamente à outra citocina anti-inflamatória estudada, o TGF-, não se verificou qualquer relação com a susceptibilidade à doença. No entanto, o genótipo T/T G/G (high) associou-se de forma significativa com o síndrome ventilatório restritivo (p = 0,05; R.R. = 2,14;
I.C.95% = 1,01;4,55) e com a evolução para a cronicidade (p = 0,04; R.R. = 1,52; I.C.95% =
1,05;2,21); o genótipo C/C C/C (low) apresentou uma associação significativa com o eritema nodoso (p = 0,04; R.R. = 5,05; I.C.95% = 3,41;7,48).
Discussão
A sarcoidose é uma doença que cursa com um processo inflamatório que conduz à formação de granulomas nos órgãos envolvidos.40,42 Na resposta imunológica que é predominantemente de tipo Th1, participam várias citocinas com diferentes propriedades, que tem um papel central neste processo, para além de provavelmente contribuírem para a determinação do tipo de apresentação clínica, da severidade da doença segundo parâmetros funcionais e radiológicos, para além da sua evolução.1,2 De acordo com este conceito, torna-se provável que polimorfismos funcionais destas citocinas sejam determinantes na caracterização e evolução da sarcoidose.43,44 Foi nosso propósito no estudo que agora descrevemos a avaliação de algumas destas citocinas, quer com propriedades predominantemente pró-inflamatórias como a IL-6 e o IFN- assim como as citocinas com propriedades anti-inflamatórias presentes na resposta imunológica da sarcoidose, a IL-10 e o TGF-.
A IL-6 é uma citocina codificada num gene localizado no braço curto do cromossoma 7, com propriedades pró-inflamatórias, nomeadamente através da activação e proliferação de
foram sendo descritos alguns polimorfismos funcionais, objecto de avaliação no nosso estudo, para além de terem sido descritas associações significativas com alguns parâmetros em outras doenças.47,48 Existem poucos estudos sobre os polimorfismos de IL-6 na sarcoidose, estando no entanto descrita a relação do genótipo IL-6-174 (G/C e C/C) com a susceptibilidade à doença.46 O genótipo IL-6-174 (G/C) encontra-se ainda correlacionado com a forma mais grave da doença, correspondente ao estadio radiológico IV.45 Uma vez que este polimorfismo está relacionado com uma produção aumentada de IL-6, esta associação poderá representar que o aumento e a persistência da acção da IL-6 está implicada na manutenção do processo inflamatório e secundariamente na sua evolução para a fibrose.45 O nosso estudo não revelou nenhuma correlação significativa com a susceptibilidade, tipo de apresentação, severidade ou com os diferentes tipos de evolução.
O IFN- é produzido pelas células Th1, encontrando-se aumentado no LBA de doentes com sarcoidose. Entre outras funções é um potente activador dos macrófagos, estimulando-os na produção de citocinas como é o caso do TNF-α e da IL-1 e um importante regulador na indução do granuloma, geralmente em sinergia com o TNF-α.6 Apresenta igualmente propriedades antifibróticas ao inibir a proliferação de fibroblastos e a síntese de colagéneo.6 Outra das propriedades do IFN- é a da inibição da apoptose através da expressão de níveis elevados de p21 (Waf1), o que leva á persistência da inflamação.49 Apesar da importância que esta citocina parece ter na fisiopatologia da sarcoidose, existem poucos relatos da associação de polimorfismos com a susceptibilidade e características da doença. Aquele que parece mais significativo é a correlação do IFN- 3,3, baixo produtor, em combinação com o alelo DRB103 do HLA com os doentes que apresentam eritema nodoso.50 No nosso estudo observou-se uma correlação significativa do genótipo T/T de produção elevada com a susceptibilidade da doença.
Este mesmo genótipo apresentou uma associação significativa com os doentes com síndrome ventilatório obstrutivo.
A ocorrência da regressão total e espontânea da doença num número considerável de doentes com sarcoidose levanta a hipótese da existência de mecanismos imunoreguladores que antagonizam o processo inflamatório. A presença e participação da IL-10 e da TGF- neste mesmo processo, citocinas com conhecidas propriedades anti-inflamatórias, sugere uma acção imunomoduladora das mesmas, com uma influência determinante na evolução da doença.51,52
A IL-10 que é libertada principalmente pelos linfócitos exerce o seu efeito anti- inflamatório através da inibição da libertação de citocinas pelos macrófagos e linfócitos.10,13 Apesar de estar aumentada na sarcoidose, o seu papel não está ainda completamente definido,
