CLÁUDIA ALVES DE ALMEIDA
DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO DE
ESPÉCIES DE Colletotrichum ASSOCIADAS A
Annona spp.
LAVRAS – MG
2015
DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum ASSOCIADAS A Annona spp.
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fitopatologia, para a obtenção do título de Mestre.
Orientador
Dr. Ludwig H. Pfenning
LAVRAS - MG
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca Universitária da UFLA, com dados informados pela própria autora.
Almeida, Cláudia Alves de.
Diversidade e caracterização de espécies de Colletotrichum associadas a Annona spp / Cláudia Alves de Almeida. – Lavras : UFLA, 2015.
75 p. : il.
Dissertação (mestrado acadêmico)–Universidade Federal de Lavras, 2015.
Orientador: Ludwig Heinrich Pfenning. Bibliografia.
1. Annonaceae. 2. Antracnose. 3. Filogenia molecular. 4. Doença de planta. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum ASSOCIADAS A Annona spp.
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fitopatologia, para a obtenção do título de Mestre.
APROVADA em 16 de julho de 2015.
Dra. Elaine Aparecida de Souza UFLA
Dr. Jorge Teodoro de Souza UFLA
Dra. Tatiana T. M. S. Rodrigues IFNMG-Câmpus Januária
Dr. Ludwig H. Pfenning Orientador
LAVRAS - MG 2015
A Deus, por toda a proteção, saúde, consolo nas horas difíceis e por preencher minha vida de paz, esperança e amor.
A meus amados pais José Maria e Maria, pelo amor, força, orações e incentivo aos estudos. A Flávio, meu irmão, pelo carinho e companheirismo. Ao meu namorado Sérgio, pelo amor, força, paciência e compreensão.
A Deus, pelo dom da vida.
À Universidade Federal de Lavras (UFLA) e ao Departamento de Fitopatologia (DFP), pela oportunidade concedida para a realização do mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
Agradeço ao professor Ludwig H. Pfenning, pela orientação, disponibilidade e amizade.
Agradeço também à primeira professora de Fitopatologia, Tatiana Tozzi Martins Souza Rodrigues, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Norte de Minas Gerais – Câmpus Januária (IFNMG), por ter me proporcionado oportunidades de pesquisa e me iniciado no meio acadêmico.
Agradeço a todos os professores do Programa de Pós-graduação de Fitopatologia, que compartilharam seus conhecimentos e não mediram esforços para nos ensinar.
Agradeço ao colega Mateus J. Comé, Dra. Sarah C. Guimarães e a Dra. Tatiana T. M. S. Rodrigues, pelo apoio no desenvolvimento prático e teórico deste trabalho.
Aos membros da banca examinadora: Dra. Elaine Aparecida de Souza, Dr. Jorge Teodoro de Souza e a Dra. Tatiana T. M. S. Rodrigues, por contribuírem na avaliação e correção desta dissertação.
Agradeço a todos do Laboratório de Sistemática e Ecologia de Fungos, técnico, colegas e amigos, pela convivência diária, companheirismo e aprendizado.
À equipe do Laboratório de Fitopatologia do IFNMG, em especial ao Allieksiei C. Perim e a Prof. Tatiana T. M. S. Rodrigues, que me ajudaram na condução dos testes de patogenicidade.
interminável jornada. Sem vocês, esta conquista não teria sido alcançada. Ao meu namorado Sérgio pelo amor, dedicação, compreensão, amizade e apoio. Obrigada por estar sempre ao meu lado.
Aos amigos queridos, de casa, de turma, de UFLA, de Lavras, que, de uma forma ou de outra, contribuíram para alegrar meu dia a dia, sempre dedicados e companheiros, me estimulando a completar a trajetória, agradeço e homenageio a todos.
Enfim, a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
A antracnose, causada por espécies de Colletotrichum, ocorre em várias frutíferas de clima tropical e temperado. No Brasil é a principal doença das anonáceas. Neste estudo foi avaliada a diversidade de espécies de Colletotrichum em associação com espécies de Annona por meio de análise filogenética multigênica, avaliação de caracteres morfológicos e da cultura e teste de patogenicidade. 84 isolados foram obtidos de frutos, flores e folhas apresentando antracnose, e de frutos mumificados de espécies comerciais e nativas coletados em plantios comerciais e em pomares domésticos. Sequências parciais do gene GAPDH de 31 isolados de Colletotrichum foram analisadas pelo método de Máxima Parcimônia (MP). Baseados nos agrupamentos gerados e na origem geográfica foi selecionado um subgrupo de quatorze isolados para serem analisadas as sequências parciais dos genes ACT e TUB2, bem como para a análise combinada das três regiões gênicas realizada pelo método de Inferência Bayesiana e MP. Os mesmos quatorze isolados também foram caracterizados com base na morfologia dos conídios e apressórios, taxa de crescimento micelial (TCM), cor da colônia e utilizados em testes de patogenicidade em mudas de pinha. Foram identificadas cinco espécies: C. fructicola, C. theobromicola, C. gloeosporioides stricto sensu no complexo ‘gloeosporioides’; C. nymphaeae no complexo ‘acutatum’; e C. karstii no complexo ‘boninense”. Outros cinco isolados não foram filogeneticamente resolvidos. Este é o primeiro relato de C. fructicola, C. nymphaeae e C. karstii em anonáceas no Brasil. Os caracteres morfológicos não foram informativos o suficiente para separação de complexos e de espécies. Todos os quatorze isolados de Colletotrichum avaliados foram patogênicos a Annona squamosa, causando sintomas típicos de antracnose nas folhas. A correta identificação dessas espécies será útil em estudos epidemiológicos e em programas de melhoramento, contribuindo desta forma no manejo correto e eficiente da doença, minimizando as perdas provocadas pelo patógeno na pré e pós-colheita.
Palavras-chave: Annonaceae. Antracnose. Filogenia molecular. Doença de planta.
ABSTRACT
Anthracnose, caused by Colletotrichum species, occurs in various fruit of tropical and temperate. In Brazil is the main disease of Annonaceae. We evaluated the diversity of species of Colletotrichum in association with species of Annona through multigene phylogenetic analysis, evaluation of morphological characters and culture and pathogenicity test. 84 isolates were obtained from fruits, flowers and leaves showing anthracnose, and mummified fruits of commercial and native species collected in commercial plantations and orchards. Partial sequences of the GAPDH gene of 31 isolates of Colletotrichum were analyzed by the Maximum Parsimony method (MP). Based on the generated clusters and geographical origin was selected a subset of fourteen isolates are analyzed for the partial sequences of ACT and TUB2 genes as well as for the combined analysis of the three gene regions performed by Bayesian inference method and MP. The same fourteen isolates were also characterized based on morphology of conidia and appressoria, mycelial growth rate (TCM), colony color and used in pathogenicity tests in sweetsop seedlings. Five species were identified: C. fructicola, C. theobromicola, C. gloeosporioides stricto sensu in the complex ‘gloeosporioides’; C. nymphaeae in the complex ‘acutatum’; and C. karstii in the complex ‘boninense’. Other five isolates couldn’t be resolved phylogenetically. This is the first report of C. fructicola, C. nymphaeae and C. karstii in Annonaceae in Brazil. The morphological characters were not informative enough for separating complex and species. All fourteen Colletotrichum evaluated were pathogenic to Annona squamosa, causing typical symptoms of anthracnose on the leaves. The correct identification of these species will be useful in epidemiological studies and in breeding programs, thus contributing to the correct and efficient management of the disease, minimizing the losses caused by the pathogen in the pre and post-harvest.
Keywords: Annonaceae. Anthracnose. Molecular phylogeny. Plant disease.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 13
2 REFERENCIAL TEÓRICO... 16
3 MATERIAL E MÉTODOS... 23
3.1 Obtenção dos isolados e preservação... 23
3.2 Seleção dos isolados para a caracterização molecular, morfológica e patogênica... 30
3.3 Extração de DNA, amplificação de fragmentos e sequenciamento... 30
3.4 Análises filogenéticas... 32
3.5 Caracterização morfológica e características da cultura.... 39
3.6 Testes de patogenicidade em mudas de pinha... 40
4 RESULTADOS... 42
4.1 Isolados obtidos... 42
4.2 Análises filogenéticas... 42
4.3 Avaliação de marcadores morfológicos e características da cultura... 50
4.4 Testes de Patogenicidade... 58
5 DISCUSSÃO... 62
6 CONCLUSÕES... 69
1 INTRODUÇÃO
O gênero Annona é considerado o mais importante da família Annonaceae, por constituir espécies frutíferas de importância econômica a nível mundial. A pinha (Annona squamosa), graviola (Annona muricata), cherimóia (Annona cherimola) e a atemóia (Annona squamosa x Annona cherimola) são as que se destacam por apresentarem potencial para consumo in natura e na forma processada. O interesse neste grupo de plantas é ainda maior quando se leva em consideração que compostos secundários encontrados em várias anonáceas possuem atividade pesticida e antitumoral (São José et al., 2014; Lemos, 2014).
Um dos grandes problemas fitossanitários que vem causando perdas nestas culturas está sendo associados à antracnose. Esta doença é considerada a mais importante na pinha, graviola e atemóia no Brasil por causar danos em pré e pós colheita, inviabilizando a comercialização e o consumo. Os sintomas são observados em folhas, ramos, flores e frutos, tanto na sua fase inicial de desenvolvimento quanto em estádio mais avançado. Nas folhas são observadas manchas de cor preta de contorno irregular com centro esbranquiçado, podendo ocorrer o seu coalescimento e queda posterior. Em flores é observado o escurecimento das pétalas levando ao seu aborto. Nos frutos jovens a superfície fica escura e culmina com a mumificação e em frutos perto do amadurecimento causa podridão escura de rápida evolução (Junqueira & Junqueira, 2014).
No Brasil, até o momento, a espécie Colletotrichum gloeosporioides é considerada o principal agente causal da antracnose em anonáceas (Takahashi, 2009; Junqueira & Junqueira, 2014), entretanto, a definição da espécie foi baseada apenas em caracteres morfológicos e teste de patogenicidade. De acordo com o conhecimento atual, não é possível diferenciar espécies do gênero Colletotrichum apenas com base em tais caracteres (Cannon et al., 2012).
No estado de Alagoas e de São Paulo outras espécies de Colletotrichum foram recentemente descritas associadas à antracnose da pinha, da graviola e da atemóia por meio da análise de dados morfológicos e moleculares. Através da morfometria de conídios e apressórios, e por meio do sequenciamento da região ITS, quatro espécies de Colletotrichum foram relatadas associadas à pinha e a graviola em Alagoas, sendo elas, C. gloeosporioides, C. boninense, C. theobromicola e C. magna (Kamei et al., 2014). No estado de São Paulo, as espécies C. acutatum e C. boninense foram encontradas em associação à atemóia por meio da análise filogenética de dados baseados nas regiões β-tubulina, α-elongase e ITS-5.8S rDNA do DNA (Firmino et al., 2014).
Embora a espécie C. gloeoporioides seja considerada o principal agente causal da doença no país, a associação de mais de uma espécie deste patógeno causando antracnose em um mesmo hospedeiro parece ser comum, a exemplo do que ocorre com a antracnose da graviola na Colômbia, que pode ser causada pelas espécies C. theobromicola, C. tropicale, C. siamense, C. karstii e C. gloeosporioides stricto sensu.
A análise de seqüências de ácidos nucléicos tem sido considerada a técnica mais confiável para a classificação de espécies do gênero Colletotrichum. Embora a análise filogenética baseada em sequências da região ITS do rDNA tenha sido considerada uma abordagem útil na determinação de espécies do gênero, em algumas situações o sequenciamento de outras regiões genômicas é requerido, especialmente quando se trata de C. gloeosporioides (Weir et al., 2012). Recentemente, várias outras regiões do genoma de fungos do gênero Colletotrichum têm sido analisadas em conjunto com o ITS gerando dados altamente confiáveis através de clados bem suportados na análise filogenética, entre as quais a β-tubulina, Calmodulina, Glutamina sintetase, Actina e Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (Prihastuti et al., 2009).
Devido ao fato de duas ou mais espécies de Colletotrichum parasitando um mesmo hospedeiro poder dificultar o controle da antracnose,
tornando-a uma doença ainda mais importante, fato que se deve em função ao comportamento diferenciado entre espécies, como já verificado para a antracnose do pimentão no Brasil, a identificação correta das espécies de Colletotrichum ocorrendo nestas hospedeiras de importância econômica é de grande valia para o conhecimento da variabilidade da população do patógeno. Além disso, como existem espécies de anonáceas nativas de regiões semiáridas no Brasil, sendo possível que estas sejam um reservatório de espécies de Colletotrichum que ocorrem em plantas cultivadas, a identificação do fungo pertencente a este gênero nestas hospedeiras também é importante. Essas informações são fundamentais para o desenvolvimento ou recomendação de medidas adequadas de manejo da doença, seja ela baseada em métodos culturais, genéticos ou químicos.
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de Colletotrichum por meio da morfologia, filogenia e de teste de patogenicidade, associados às diferentes espécies do gênero Annona, exploradas comercialmente e nativas, oriundos de pomares comerciais e não comerciais de regiões produtoras do Brasil. Este estudo permitirá conhecer a diversidade da população do patógeno associada a estas hospedeiras, oferecendo informações claras para o manejo da doença e, consequentemente, permitindo melhor orientação em programas de melhoramento genético.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
A família Annonaceae compõe um grupo de plantas que se destaca em várias partes do mundo, principalmente por produzirem frutos de grande interesse comercial. A cherimóia (Annona cherimola), a pinha (A. squamosa), a atemóia (híbrido A. squamosa x A. cherimola), e a graviola (A. muricata) são os mais destacados membros desta família. No Brasil, o interesse pelo seu cultivo se deve ao alto preço do fruto in natura e da polpa alcançados nos mercados interno e externo como o europeu e americano (Sobrinho, 2010).
Economicamente, as anonáceas são importantes para muitos países da África, Ásia, e também da América Central, do Norte e do Sul. Os principais países produtores de cherimóia são Austrália, Chile, Espanha, Estados Unidos, Nova Zelândia e Israel, de graviola o México, Brasil, Venezuela e Costa Rica e de pinha o Brasil, Índia, Tailândia, Filipinas e Cuba (São José et al., 2014).
Dentre as espécies de importância comercial a cherimóia tem sido pouco cultivada no Brasil devido às condições de clima e altitude que são desfavoráveis ao desenvolvimento da espécie, a qual é exigente em temperaturas baixas. A pinha, atemóia e graviola são produzidas em diversas regiões do país suprindo à demanda dos mercados de frutas frescas e processadas. Algumas outras espécies e híbridos de anonáceas apresentam bom potencial para os dois mercados, mas carecem de maior divulgação e pesquisas que selecionem tipos superiores e técnicas de produção compatíveis com sua exploração comercial como as espécies Annona reticulata, A. diversifolia, A. crassiflora, A. salzmanii e Rolinia mucosa (Lemos, 2014).
No Brasil, a região Nordeste, em especial a Bahia, é o estado que mais produz anonáceas, sendo o maior produtor de pinha e graviola. No Sudeste, Minas Gerais e São Paulo, concentram a produção de pinha, atemóia e cherimóia. No estado de Minas, a região Norte destaca-se como pólo fruticultor com pomares localizados nas áreas dos projetos irrigados de Jaíba, Janaúba e nos municípios de Nova Porteirinha, Pirapora e Matias Cardoso (Sobrinho, 2010).
A antracnose ou podridão-negra-dos-frutos é a doença mais importante das anonáceas. As perdas provocadas pela doença, em períodos de chuvas prolongadas durante a floração e formação dos frutos, podem chegar a 70% e incide preferencialmente nos tecidos jovens de folhas, ramos, flores e frutos. Nas folhas os sintomas são caracterizados por manchas de cor preta de contorno irregular, esbranquiçadas no centro e que se desenvolvem provocando sua deformação e queda. Nas flores aparecem manchas escuras nas pétalas e aborto do órgão. Os frutos podem ser infectados em qualquer estádio do desenvolvimento. Em frutos jovens a superfície fica escura e culmina com a mumificação e em frutos perto do amadurecimento causa podridão escura de rápida evolução inutilizando-o para o consumo ou comercialização (Junqueira & Junqueira, 2014).
Na literatura brasileira a espécie C. gloeosporioides é descrita como sendo a principal responsável pela antracnose em pinha, graviola, atemóia e cherimóia (Junqueira & Junqueira, 2014). Entretanto, a atribuição da doença ao agente causal, baseou-se apenas em características morfológicas e patogênicas.
Uma das características do ciclo de vida de C. gloeosporioides em outras espécies frutíferas é apresentar infecções quiescentes e desenvolvimento apenas após o amadurecimento dos frutos (Freeman et al., 1998). No gênero Annona, o comportamento do patógeno é distinto, pois este apresenta lesões em frutos verdes em qualquer estádio do desenvolvimento. Em frutos jovens a superfície fica escura e culmina com a mumificação e em frutos perto do amadurecimento causa podridão escura de rápida evolução, nos quais podem ser observada esporulação do patógeno significando que não há período de quiescência característico (Morales & Manica, 1998).
Recentemente, outras espécies de Colletotrichum têm sido descritas nesses hospedeiros por meio de estudos que associam características morfológicas à filogenia molecular. As espécies C. acutatum e C. boninense foram descritas em associação à antracnose da atemóia no estado de São Paulo (Firmino et al., 2014). Adicionalmente, as espécies C. gloeosporioides, C.
fragariae (= C. theobromicola), C. theobromicola, C. magna e C. boninense foram relatadas provocando a antracnose em pinha e graviola no Estado de Alagoas (Kamei et al., 2014).
Na Colômbia, a espécie C. gloeosporioides não é a única responsável pela antracnose da gravioleira. Outras espécies como C. theobromicola, C. tropicale, C. siamense e C. karstii são descritas como a causa da antracnose nesta hospedeira (Álvarez et al., 2014). Em cherimóia, no México, além de C. gloeosporioides, as espécies C. fragariae (= C. theobromicola) e C. orbiculare foram isoladas a partir de sintomas de antracnose (Villanueva-Arce et al., 2008). Há relatos também da espécie C. theobromicola ocorrendo em graviola no Panamá (Rojas et al., 2010). Além de dois isolados não identificados dentro do clado C. siamense lato sensu ocorrendo em espécies nativas de Annona na Tailândia (Udayanga et al., 2013).
Colletotrichum é o estágio assexuado de Glomerella, pertencente ao Filo Ascomycota, Classe Sordariomycetes, Família Glomerellaceae (Index Fungorum, 2015). Este gênero é responsável pela antracnose em frutos tropicais de uma vasta gama de espécies hospedeiras, incluindo espécies exploradas comercialmente como o café (Coffea arabica), condessa (Annona reticulata), figo (Ficus racemosa), manga (Mangifera indica), neem (Azadirachta indica), mamão (Carica papaya), abacate (Persea americana), banana (Musa spp.), dentre outras (Weir et al., 2012), e de espécies hospedeiras vivendo em seu habitat natural (Hyde et al., 2009; Phoulivong et al., 2010; Cannon et al., 2012; Udayanga et al., 2013).
Colletotrichum spp. são conhecidas como patógenos que apresentam infecções quiescentes (Dean et al., 2012) e agente causal de doenças pós-colheita (Phoulivong et al., 2010). Entretanto, endófitos tem sido também obtidos de partes de plantas assintomáticas (Cai et al., 2009; Rojas et al., 2010), além de saprófitos (Prihastuti et al., 2009). Este gênero é considerado economicamente importante pelo fato de causar antracnose em várias espécies de plantas frutíferas, cereais, gramíneas e plantas ornamentais em regiões tropicais e temperadas (Freeman et al., 2001; Rojas et al., 2010). Além disso,
pode atacar diferentes órgãos das plantas como flor, folha, ramos e frutos, em vários estádios de desenvolvimento, em diferentes regiões geográficas.
Tradicionalmente, as espécies de Colletotrichum têm sido identificadas baseadas em características morfológicas como o tamanho e forma dos conídios e apressórios, células conidiogênicas, presença ou ausência de setas, escleródios e acérvulos, presença de teleomorfo, cor, taxa de crescimento e textura da colônia (Sutton, 1980). Adicionalmente, especificidade por hospedeiro e local de origem são atributos também avaliados, que podem ajudar na diferenciação de espécies. Entretanto, a alta variabilidade das características morfológicas e culturais tem tornado este critério incerto para identificação do patógeno em nível de espécie (Weir et al., 2012). Além disso, várias espécies podem ser encontradas infectando ou colonizando a mesma planta hospedeira (Lima et al., 2013; Kamei et al., 2014; Firmino et al., 2014; Álvarez et al., 2014) ou causando infecção cruzada (Phoulivong, 2012), tornando a identificação do agente causal por meio destas características incerta.
Sistemática com base em morfologia de fungos pode gerar incerteza na identificação de espécies, devido à sobreposição dos valores de tamanho de conídios, conidióforos, número de septos, formato e tamanho de apressórios. Para que se faça uma identificação segura de espécies, devem-se examinar caracteres que exibam variações apropriadas para o discernimento de indivíduos diferentes e sempre que possível associar a análise morfológica à filogenética.
As espécies C. kahawae e C. gloeosporioides constituem um bom exemplo de que caracteres morfológicos apenas, não podem separar espécies. Contudo, suas distinções são suficientemente suportadas em outros caracteres como utilização de citrato e tartarato como a única fonte de carbono e dados de sequências de DNA (Prihastuti et al., 2009).
Filogenia multigênica tem sido fundamental para identificação de espécies de Colletotrichum, além de possibilitar o entendimento das relações entre elas (Weir et al., 2012). A análise de sequências dos genes Actina (ACT),
β-tubulina (TUB2), Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), Calmodulina (CAL), Glutamina sintetase (GS), regiões do gene ITS e região intergênica de apn2 e dos genes MAT1-2-1 (ApMAT) (Weir et al., 2012; Sharma et al., 2013) tem sido utilizadas em publicações recentes, adicionalmente à avaliação de caracteres morfológicos, para identificar espécies do gênero superando a incerteza dos métodos tradicionais.
A espécie C. gloeosporioides é uma das mais comuns e amplamente distribuída em todo o mundo podendo causar doença em mais de 470 gêneros de plantas de diferentes famílias botânicas (Sutton, 1980). Entretanto, a espécie, tal como é identificada atualmente, apresenta-se como um agregado de subgrupos que contém diferenças em patogenicidade, especificidade por hospedeiros e homogeneidade genética (Hyde et al., 2009).
A epitificação de C. gloeosporioides (Cannon et al., 2008), seguida da lista de nomes correntes em uso para o gênero (Hyde et al., 2009), além da abordagem polifásica para estudos com Colletotrichum (Cai et al., 2009) e filogenia multigênica (Weir et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b), possibilitou uma nova visão na taxonomia e estudos filogenéticos do gênero. O que era considerado como sendo uma única espécie, é na verdade, um complexo de espécies, nomeado, complexo de espécies C. gloeosporioides, composto por mais de 22 espécies geneticamente distintas, mas morfologicamente indistinguíveis (Weir et al., 2012).
Por meio de análise filogenética multigênica para identificação de espécies pertencentes ao gênero Colletotrichum, outros clados foram também bem definidos, superando a instabilidade dos caracteres morfológicos na separação de espécies, a saber, o clado acutatum (complexo de espécies C. acutatum) composto por 31 espécies (Damm et al., 2012a) e o clado boninense (complexo de espécies C. boninense) composto atualmente por cerca de 18 espécies (Damm et al., 2012b).
Embora C. gloeosporioides e, em menor extensão, C. acutatum, tenham sido relatados por serem o agente causal de podridão de frutos tropicais, nenhum dos 25 isolados de Colletotrichum provenientes de banana
(Musa sp.), pimenta (Capsicum spp.), goiaba (Psidium guajava), jujuba (Zizyphus mauritiane), longan (Dimocarpus longan), manga (Mangifera indica), mamão (Carica papaya) e de jambo-rosa (Syzygium jambos), em Laos e Tailândia, foram identificados como sendo uma das duas espécies por meio da análise das sequências dos genes ACT, TUB, GAPDH e ITS (Phoulivong et al., 2010). Ao contrário do que se pensava, a espécie C. gloeosporioides sensu stricto parece ter uma gama de hospedeiros limitada. Udayanga et al. (2013) identificaram a espécie C. gloeosporioides sensu stricto somente em Citrus aurantifolia e Syzygium samarangense, dentre os 15 hospedeiros de importância comercial estudados, além de outras espécies hospedeiras nativas no norte da Tailândia.
No Brasil, a antracnose da cultura da mangueira (Mangifera indica) foi atribuída exclusivamente à C. gloeosporioides em estudos que analisaram características morfológicas do patógeno (Santos Filho & Matos, 2003). Trabalho recente demonstrou que as espécies C. asianum, C. fructicola, C. tropicale, C. karstii e uma nova espécie descrita como C. dianesei estão associadas a esta doença no nordeste do Brasil (Lima et al., 2013).
A associação de mais de uma espécie de Colletotrichum causando antracnose em um mesmo hospedeiro também é relatada em outras frutíferas, como por exemplo, o maracujazeiro, que pode ser atacado por C. acutatum, C. boninense e C. gloeosporioides (Tozze Júnior et al., 2010).
A ocorrência de duas ou mais espécies de Colletotrichum parasitando um mesmo hospedeiro pode dificultar o controle da antracnose, tornando-a uma doença ainda mais importante uma vez que as espécies podem apresentar comportamento diferenciado. Essa situação já foi verificada para a antracnose do pimentão no Brasil, doença causada por C. acutatum, C. boninense, C. capsici, C. coccodes e C. gloeosporioides, onde as espécies apresentam sensibilidade diferenciada aos fungicidas azoxistrobina, carbendazim, tiabendazol e tebuconazol (Tozze Júnior et al., 2011).
Desta forma, a identificação de espécies de Colletotrichum ocorrendo em anonáceas é necessária para se conhecer a variabilidade da população do
patógeno e compreender o seu ciclo de vida. Estas informações poderão auxiliar em estudos epidemiológicos, contribuindo para o desenvolvimento de programas de melhoramento, garantindo ao produtor a aplicação de um manejo mais sustentável e econômico.
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Sistemática e Ecologia de Fungos do Departamento de Fitopatologia da UFLA, com exceção do teste de patogenicidade que foi conduzido no Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Norte de Minas Gerais – Câmpus Januária (IFNMG-Câmpus Januária), em Januária/MG.
3.1 Obtenção dos isolados e preservação
Um total de 84 isolados de Colletotrichum foram obtidos de folhas, flores e frutos. Dentre os isolados de frutos, cinco foram obtidos de fruto com sintoma de antracnose e 19 de frutos mumificados (Tabela 1). Coletas foram realizadas em regiões localizadas em Minas Gerais e São Paulo. Além disso, dois isolados cedidos ao IFNMG-Campus Januária pela Embrapa Agroindústria são também utilizados neste estudo. Os hospedeiros de coleta foram a pinha, atemóia, graviola, condessa e espécies da família Annonaceae vivendo em seu habitat natural.
A partir de lesões típicas e ativas do patógeno, bem como de frutos mumificados, o fungo foi isolado de acordo com a metodologia descrita por Cai et al. (2009). Foram feitas secções de tecidos infectados, em locais de lesões jovens, desinfestadas superficialmente com álcool 70% (1 min.) e hipoclorito de sódio 1% (1 min.) e lavadas em água destilada por duas vezes; em seguida, transferidas para placa de Petri contendo meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar). Isolamento a partir de frutos mumificados foram realizados de acordo com a metodologia descrita anteriormente a partir do corte de pequenos fragmentos superficiais onde o tecido se encontrava escurecido. No caso de frutos apresentando a esporulação do patógeno em sua superfície, optou-se pelo método de isolamento direto, onde, com o auxílio de uma pinça estéril e uma lupa, foi transferida uma pequena quantidade da massa mucilaginosa para o meio de cultura (Cai et al. 2009). As placas foram
mantidas a temperatura ambiente e observadas diariamente, por cerca de cinco dias, para acompanhamento do desenvolvimento de colônias fúngicas. No meio de cultivo, foi adicionado o antibiótico sulfato de antamicina (50 mg/mL) com a finalidade de inibir o crescimento de bactérias contaminantes. Após a constatação de crescimento fúngico foram confeccionadas lâminas para identificação do gênero.
Culturas monospóricas foram obtidas para todos os isolados a partir da suspensão de esporos em 5 ml de água destililada esterilizada presente em microtubos tipo eppendorf e diluídos por 5 vezes. Em seguida, alíquotas de 10 µl da suspensão foram colocadas em placas de Petri com meio ágar-água e incubadas à temperatura ambiente. Após 6 horas, os conídios que apresentavam tubos germinativos foram transferidos para meio BDA para crescimento das culturas e posterior preservação. Todos os isolados estudados foram depositados como culturas monospóricas na Coleção Micológica de Lavras (CML) por três diferentes métodos de preservação: a criopreservação em glicerina 15%, a preservação em água e a preservação em microtubos tipo Eppendorf (Leslie & Summerell, 2006). Para realização dos estudos posteriores, os isolados preservados em microtubos tipo Eppendorf foram armazenados em incubadora tipo BOD a temperatura de ±10 ºC.
Tabela 1 Identificação dos isolados de Colletotrichum estudados provenientes de anonáceas dos estados de Minas Gerais (MG), São Paulo (SP) e Ceará (CE) “continua” N° Código Isolado Espécie Hospedeiro/ substrato Origem Geográfica Tipo de sintoma Genes sequenciados
GAPDHe ACTf TUB2f
1 CAA1a C. theobromicola A. muricata/fruto Fortaleza/CE A x - -
2 CAA2ab Colletotrichum sp. A. muricata/fruto Fortaleza/CE A x x x
3 CAA4 Colletotrichum sp. A. cacans/frutoc Maria da Cruz/MG M x - -
4 CAA5b Colletotrichum sp. A. squamosa/folha Januária/MG A x x x
5 CAA7 Colletotrichum sp. A. squamosa/fruto Januária/MG A x - -
6 CAA8 Colletotrichum sp. A. muricata/flor Januária/MG A x - -
7 CAA9 Colletotrichum sp. A. squamosa/folha Januária/MG A x - -
8 CAA14 Colletotrichum sp. A. squamosa/folha Januária/MG A x - -
9 CAA28 Colletotrichum sp. A. reticulata/folha Januária/MG A x - -
10 CAA35 Colletotrichum A. muricata/folha Acari/MG A - - -
11 CAA36 Colletotrichum A. muricata/folha Acari/MG A - - -
12 CAA37 Colletotrichum sp. A. squamosa/folha Acari/MG A x - -
13 CAA38 Colletotrichum A. muricata/fruto Acari/MG M - - -
14 CAA70/1 C. theobromicola A. crassiflora/folhac Umbuzeiro/MG A x - -
15 CAA70/2 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Umbuzeiro/MG A - - -
16 CAA70 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Umbuzeiro/MG A - - -
17 CAA74 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Umbuzeiro/MG A - - -
18 CAA74/1 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Umbuzeiro/MG A - - -
19 CAA81b C. karstii A. crassiflora/frutoc Umbuzeiro/MG M x x x
20 CAA95b Colletotrichum sp. Annona sp. /folhac Acari/MG A x x x
21 CAA95/3 Colletotrichum Annona sp. / folhac Acari/MG A - - -
22 CAA96 Colletotrichum A. muricata/folha Acari/MG A - - -
Tabela 1 “continuação” “continua” N° Código Isolado Espécie Hospedeiro/ substrato Origem Geográfica Tipo de sintoma Genes sequenciados
GAPDHe ACTf TUB2f
24 CAA96/2 Colletotrichum A. muricata/folha Acari/MG A - - -
25 CAA99/1 Colletotrichum sp. A. muricata/folha Acari/MG A x - -
26 CAA99/2 Colletotrichum A. muricata/folha Acari/MG A - - -
27 CAA99/3 Colletotrichum A. muricata/folha Acari/MG A - - -
28 CAA107 Colletotrichum Annona sp. /folhac Acari/MG A - - -
29 CAA107/1 C. theobromicola Annona sp. /folhac Acari/MG A x - -
30 CAA107/3 Colletotrichum Annona sp. /folhac Acari/MG A - - -
31 CAA107/2 Colletotrichum Annona sp. /folhac Acari/MG A - - -
32 CAA109 Colletotrichum Annona sp. /folhac Acari/MG A - - -
33 CAA109/1 Colletotrichum Annona sp. /folhac Acari/MG A - - -
34 CAA110 Colletotrichum Annona sp. /folhac Acari/MG A - - -
35 CAA110/1 Colletotrichum Annona sp. /folhac Acari/MG A - - -
36 CAA113 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
37 CAA113/2 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
38 CAA113/1 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
39 CAA114 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
40 CAA114/3 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
41 CAA115 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
42 CAA115/1
b
C. gloeosporioides A. reticulata/folha Acari/MG A x x x
43 CAA115/2 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
44 CAA115/3 Colletotrichum A. reticulata/folha Acari/MG A - - -
45
CAA136
Colletotrichum A.
crassiflora/folhac Acari/MG
Tabela 1 “continuação” “continua” N° Código Isolado Espécie Hospedeiro/ substrato Origem Geográfica Tipo de sintoma Genes sequenciados
GAPDHe ACTf TUB2f
46 CAA136/1 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Acari/MG A - - -
47 CAA136/2 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Acari/MG A - - -
48 CAA137b C. fructicola A. crassiflora/folhac Acari/MG A x x x
49 CAA137/1 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Acari/MG A - - -
50 CAA138 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Acari/MG A - - -
51 CAA144 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Acari/MG A - - -
52 CAA147 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Acari/MG A - - -
53 CAA150 Colletotrichum A. crassiflora/folhac Acari/MG A - - -
54 CAA157b C. gloeosporioides A. muricata/fruto Lavras/MG M x x x
55 CAA157/1 Colletotrichum A. muricata/fruto Lavras/MG M - - -
56 CAA157/3 Colletotrichum A. muricata/fruto Lavras/MG M - - -
57 CAA159 Colletotrichum sp. A. squamosa/folha Mocambinho/MG A x - -
58 CAA160 Colletotrichum A. squamosa/folha Mocambinho/MG A - - -
59 CAA162b C. theobromicola A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M x x x
60 CAA163 Colletotrichum sp. A. squamosa/folha Mocambinho/MG A x - -
61 CAA165 Colletotrichum A. squamosa x A. cherimola/fruto Mocambinho/MG M - - - 62 CAA166 Colletotrichum A. squamosa x A. cherimola/fruto Mocambinho/MG M - - -
63 CAA167 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
64 CAA173 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Tabela 1 “continuação” “continua” N° Código Isolado Espécie Hospedeiro/ substrato Origem Geográfica Tipo de sintoma Genes sequenciados
GAPDHe ACTf TUB2f
61 CAA165 Colletotrichum A. squamosa x A. cherimola/fruto Mocambinho/MG M - - - 62 CAA166 Colletotrichum A. squamosa x A. cherimola/fruto Mocambinho/MG M - - -
63 CAA167 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
64 CAA173 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
65 CAA174 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
66 CAA176 Colletotrichum sp. A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M x - -
67 CAA181 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
68 CAA182 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
69 CAA183 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
70 CAA194 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/fruto
Mocambinho/MG M - - -
71 CAA195 Colletotrichum A. squamosa/fruto São Francisco/MG M - - -
72 CAA196 Colletotrichum sp. A. squamosa/fruto Pintópolis/MG M x - -
Tabela 1 “conclusão”
aIsolados provenientes da Embrapa Agroindústria Tropical (Fortaleza/CE). bIsolados utilizados no teste de patogenicidade. cHospedeiras nativas vivendo em seu habitat natural. dHospedeiro presente no Campus da UFLA. e31 isolados selecionados, a partir dos 84 isolados obtidos de Annona spp., para amplificação do gene GAPDH. fOs14 isolados de Colletotrichum selecionados representando as distintas linhagens filogenéticas a partir da árvore filogenética do gene parcial GAPDH. gA = antracnose, M = mumificação.
N° Código Isolado Espécie Hospedeiro/ substrato Origem Geográfica Tipo de sintoma Genes sequenciados
GAPDHe ACTf TUB2f
74 CAA198 Colletotrichum sp. A. crassiflora/folhad Lavras/MG A x - -
75 CAA199b Colletotrichum sp. A. reticulata/folha Campo Belo/MG A x x x
76 CAA201b C. nymphaeae A. muricata/fruto Lavras/MG A x x x
77
CAA202
Colletotrichum sp. A. squamosa x A.
cherimola/folha Lavras/MG
A x - -
78 CAA204 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/folha
Lavras/MG A - - -
79 CAA205 Colletotrichum A. squamosa x A.
cherimola/folha Lavras/MG A - - - 80 CAA206b Colletotrichum sp. A. squamosa x A. cherimola/fruto Lavras/MG A x x x
81 CAA207b Colletotrichum sp. A. squamosa/folha São Paulo/SP A x x x
82 CAA208/1
b
C. karstii A. crassiflora/folha Elói Mendes/MG A x x x
83 CAA208/2 Colletotrichum A. crassiflora/folha Elói Mendes/MG A - - -
3.2 Seleção dos isolados para a caracterização molecular, morfológica e patogênica
Dos 84 isolados de Colletotrichum obtidos de órgãos sintomáticos de espécies de Annona, seleciou-se uma amostra de 31 isolados que representassem a maior diversidade de características fenotípicas, espécie hospedeira, tipo de sintoma provocado na planta, órgão de coleta e região geográfica de origem. Para os isolados amostrados amplificou-se a região gênica GAPDH para uma análise filogenética preliminar. Com base nos resultados observados na árvore filogenética procedeu-se a seleção de uma nova amostra composta por quatorze isolados para caracterização filogenética multi-locus dos genes Actina e β-tubulina, bem como, realização do teste de patogenicidade, caracterização morfológica e determinação das características da cultura (Tabela 1). O objetivo desta nova seleção foi selecionar aqueles isolados que pertenciam à distintas linhagens filogenéticas possibilitando a caracterização de um número maior possível de diferentes espécies.
3.3 Extração de DNA, amplificação de fragmentos e sequenciamento
Culturas monospóricas dos 31 isolados de Colletotrichum foram cultivadas em Extrato de Malte 2% líquido por três dias. Para a extração do DNA, o micélio de cada isolado foi filtrado em gaze, lavado com água destilada estéril e submetido à extração do DNA genômico, utilizando o kit Wizard Genomic DNA Purification Kit® (Promega), de acordo com o protocolo do fabricante. As concentrações de DNA foram mensuradas utilizando o NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) e padronizadas para 5 ng/µl. As reações de PCR foram realizadas utilizando-se o kit Promega GoTaq® Colorless Master Mix no termociclador My CyclerTM (Bio-Rad) e o
mesmo conjunto de primers foi utilizado para a reação de sequenciamento. O fragmento do gene gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi amplificado utilizando-se os primers GDF (forward;
5´-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3´) e GDR (reverse; 5´- GGGTGGAGTCGTACTTGAGCTGT-3´) (Templeton et al., 1992), utilizando as seguintes condições de ciclo: (1) desnaturação, por 4 minutos, a 94 °C; seguido por 34 ciclos de desnaturação, a 94 °C, por 45 segundos; (2) anelamento, por 45 segundos, a 60 °C; (3) extensão, a 72 °C, por 1 minuto e, (4) extensão final, a 72 °C durante 7 minutos (Prihastuti et al., 2009). Uma porção do gene beta tubulina (TUB2) foi amplificada utilizando-se os primers TB5 (forward; 5´-GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTT-3´) e TB6 (reverse; 5´-GCA GTCGCAGCCCTCAGCCT-3´) (Panaccione & Hanau, 1990), utilizando as seguintes condições de ciclo: (1) desnaturação, por 5 minutos, a 95 °C; seguido por 35 ciclos de desnaturação, a 94 °C, durante 30 segundos; (2) anelamento, a 62 °C, durante 30 segundos; (3) extensão, a 72 °C, por 2 minutos e, (4) extensão final a 72 °C durante 7 minutos (Talhinhas et al., 2002). O gene Actina parcial (ACT) foi amplificado utilizando-se os primers ACT-512F (forward; 5´-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3´) e ACT-783R (reverse; 5´-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3´) (Carbone & Kohn, 1999), utilizando as seguintes condições de ciclo: (1) desnaturação, a 95 °C durante 5 minutos; seguido por 35 ciclos a 94 °C durante 30 segundos; (2) anelamento, a 58 °C durante 30 segundos; (3) extensão, a 72 °C durante 45 segundos; (4) extensão final, a 72 °C durante 7 minutos (Weir et al., 2012).
Os fragmentos amplificados foram purificados com o kit Wizard® SV gel e PCR Clean-Up System (Promega) seguindo as instruções do fabricante. Todas as amostras de DNA amplificadas para as regiões GAPDH, Actin e TUB2 foram enviadas para Macrogen Corporation nos Estados Unidos da América (EUA) para o sequenciamento.
3.4 Análises filogenéticas
Sequências consenso foram montadas a partir das sequências forward e reverse, utilizando-se o programa SeqAssem ver. 07/2008 (SequentiX). Sequências adicionais de membros do complexo de espécies Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum acutatum e Colletotrichum boninense (Weir et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Cannon et al., 2012) foram obtidas a partir do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) (Tabela 2). As sequências foram alinhadas usando MUSCLE implementado no MEGA 5 (Tamura et al., 2011). As análises filogenéticas para os genes GAPDH, ACT e TUB2 foram realizadas pelo método de Máxima Parcimônia (MP) com teste de bootstrap de 1000 repetições, utilizando-se o programa MEGA 5. Para o conjunto de dados combinados, a árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Parcimônia e Inferência Bayesiana (Ronquist et al., 2012) com o programa MEGA5 e Mr Bayes 3.2, respectivamente. O modelo de substituição nucleotídica para a Inferência Bayesiana foi GTR+I+G (General time reversible with Invariable and Gamma distribution). Foram realizadas duas análises, cada qual contendo quatro cadeias de Markov "aquecidas" por incrementos durante 1.000.000 de gerações e amostradas a cada 100 gerações. Vinte e cinco por cento das 10.000 árvores geradas foram descartadas (25% of burning) e a árvore de consenso calculada foi visualizada com o auxílio do programa FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).
Tabela 2 Isolados de referência de Colletotrichum representando espécies conhecidas, utilizados nas análises filogenéticas “continua” N° Espécie Código Isolado Hospedeiro Localização Geográfica
Número de acesso no GenBank
GAPDH ACT TUB2
1 C. aenigma ICMP 18608* Persea americana Israel JX010044 JX009443 JX010389
2 C. aeschynomenes ICMP 17673* Aeschynomene virginica USA JX009930 JX009483 JX010392
3 C. alatae ICMP 17919* Dioscorea alata India JX009990 JX009471 JX010383
4 C. alienum ICMP 12071* Malus domestica New Zealand JX010028 JX009572 JX010411
5 C. aotearoa ICMP 18537* Coprosma sp. New Zealand JX010005 JX009564 JX010420
6 C. asianum ICMP 18580* Coffea arabica Thailand JX010053 JX009584 JX010406
7 C. boninense ICMP 17904* Crinum asiaticum Japan JX009905 JX009583 JQ005588
8 C. clidemiae ICMP 18658* Clidemia hirta USA, Hawaii JX009989 JX009537 JX010438
9 C. cordylinicola ICMP 18579* Cordyline fruticosa Thailand JX009975 HM470235 JX010440
10 C. fructicola ICMP 18581* Coffea arabica Thailand JX010033 FJ907426 JX010405
11 C. fructicola ICMP18613 Limonium sinuatum Israel JX009998 JX009491 JX010388
12 C. gloeosporioides ICMP 17821* Citrus sinensis Italy JX010056 JX009531 JX010445
13 C. horii ICMP 10492* Diospyros kaki Japan GQ329681 JX009438 JX010450
14 C. kahawae ICMP 18539* Olea europaea Australia JX009966 JX009523 JX010434
Tabela 2 “continuação”
“continua”
N° Espécie Código Isolado Hospedeiro Localização
Geográfica
Número de acesso no GenBank
GAPDH ACT TUB2
16 C. nupharicola ICMP 18187* Nuphar lutea USA JX009972 JX009437 JX010398
17 C. psidii ICMP 19120* Psidium sp. Italy JX009967 JX009515 JX010443
18 C. queenslandicum ICMP 1778* Carica papaya Australia JX009934 JX009447 JX010414
19 C. salsolae ICMP 19051* Salsola tragus Hungary JX009916 JX009562 JX010403
20 C. siamense ICMP 18578* Coffea arabica Thailand JX009924 FJ907423 JX010404
21 C. siamense ICMP 18121 Dioscorea rotundata Nigeria JX009942 JX009460 JX010402
22 C. siamense ICMP17795 Malus domestica USA JX010051 JX009506 JX010393
23 C. theobromicola ICMP 18649* Theobroma cacao Panama JX010006 JX009444 JX010447
24 C. theobromicola ICMP 17895* Annona diversifolia Mexico JX010057 JX009568 JX010382
25 C. ti ICMP 4832* Cordyline sp. New Zealand JX009952 JX009520 JX010442
26 C. tropicale ICMP 18653* Theobroma cacao Panama JX010007 JX009489 JX010407
27 C. xanthorrhoeae ICMP 17903* Xanthorrhoea preissii Australia JX009927 JX009478 JX010448
28 C. endomangiferae CMM 3814* Mangifera indica Brazil-SP KC702955 KC702922 KM404170
29 C. endophytica MFLUCC
Tabela 2 “continuação”
“continua”
N° Espécie Código Isolado Hospedeiro Localização
Geográfica
Número de acesso no GenBank
GAPDH ACT TUB2
30 C. dianesei CMM4083* Mangifera indica Brazil-SFV KC517194 KC517298 KC517254
31 C. syzygicola MFLUCC
10-0624* Syzygium samarangense Thailand KF254880 KF157801 KF242156
32 C. viniferum GZAAS5.08601* V. vinifera cv. Shuijing China JN412798 JN412795 JN412813
33 C. viniferum GZAAS5.08622 V. vinifera cv. Shuijing China JN412796 JN412791 JN412812
34 C. acerbum ICMP 12921* Malus domestica New Zealand JQ948790 JQ949780 JQ950110
35 C. acutatum CBS 112996* Carica papaya Australia JQ948677 JQ005839 JQ005860
36 C. australe CBS 116478* Trachycarpus fortunei South Africa JQ948786 JQ949776 JQ950106
37 C. brisbanense CBS 292.67* Capsicum annuum Australia JQ948621 JQ949612 JQ949942
38 C. chrysanthemi CBS 126519 Chrysanthemum
coronarium Netherlands JQ948602 JQ949593 JQ949923
39 C. cosmi CBS 853.73* Cosmos sp. Netherlands JQ948604 JQ949595 JQ949925
40 C. costaricense CBS 330.75* Coffea arabica Costa Rica JQ948510 JQ949501 JQ949831
41 C. cuscutae IMI 304802* Cuscuta sp. Dominica JQ948525 JQ949516 JQ949846
Tabela 2 “continuação”
“continua”
N° Espécie Código Isolado Hospedeiro Localização
Geográfica
Número de acesso no GenBank
GAPDH ACT TUB2
43 C. godetiae CBS 133.44* Clarkia hybrida Denmark JQ948733 JQ949723 JQ950053
44 C. guajavae IMI 350839* Psidium guajava India JQ948600 JQ949591 JQ949921
45 C. indonesiense CBS 127551* Eucalyptus sp. Indonesia JQ948618 JQ949609 JQ949939
46 C. johnstonii ICMP 12926* Solanum lycopersicum New Zealand JQ948775 JQ949765 JQ950095
47 C. kinghornii CBS 198.35* Phormium sp. UK JQ948785 JQ949775 JQ950105
48 C. laticiphilum CBS 112989* Hevea brasiliensis India JQ948619 JQ949610 JQ949940
49 C. limetticola CBS 114.14* Citrus aurantifolia USA, Florida JQ948523 JQ949514 JQ949844
50 C. lupini CBS 109225* Lupinus albus Ukraine JQ948485 JQ949476 JQ949806
51 C. melonis CBS 159.84* Cucumis melo Brazil JQ948524 JQ949515 JQ949845
52 C. nymphaeae CBS 515.78* Nymphaea alba Netherlands JQ948527 JQ949518 JQ949848
53 C. nymphaeae IMI370491 Malus pumila Brazil JQ948534 JQ949525 JQ949855
54 C. orchidophilum CBS 632.80* Dendrobium sp. USA JQ948481 JQ949472 JQ949802
55 C. paxtonii IMI 165753* Musa sp. Saint Lucia JQ948615 JQ949606 JQ949936
56 C. phormii CBS 118194* Phormium sp. Germany JQ948777 JQ949767 JQ950097
Tabela 2 “continuação”
“continua”
N° Espécie Código Isolado Hospedeiro Localização
Geográfica
Número de acesso no GenBank
GAPDH ACT TUB2
58 C. pyricola ICMP 12924* Pyrus communis New Zealand JQ948776 JQ949766 JQ950096
59 C. rhombiforme CBS 129953* Olea europaea Portugal JQ948788 JQ949778 JQ950108
60 C. salicis CBS 607.94* Salix sp. Netherlands JQ948791 JQ949781 JQ950111
61 C. scovillei CBS 126529* Capsicum sp. Indonesia JQ948597 JQ949588 JQ949918
62 C. scovillei CBS 120708 Capsicum annuum Thailand JQ948599 JQ949590 JQ949920
63 C. simmondsii CBS 122122* Carica papaya Australia JQ948606 JQ949597 JQ949927
64 C. sloanei IMI 364297* Theobroma cacao Malaysia JQ948617 JQ949608 JQ949938
65 C. tamarilloi CBS 129814* Solanum betaceum Colombia JQ948514 JQ949505 JQ949835
66 C. walleri CBS 125472* Coffea sp. Vietnam JQ948605 JQ949596 JQ949926
67 C. annellatum CBS 129826* Hevea indica Colombia JQ005309 JQ005570 JQ005656
68 C. beeveri ICMP 18594* Brachyglottis repanda New Zealand JQ005258 JQ005519 JQ005605
69 C. boninense CBS 123755* Crinum asiaticum Japan JQ005240 JQ005501 JQ005588
70 C. brasiliense ICMP 18607* Passiflora edulis Brazil JQ005322 JQ005583 JQ005669
71 C. brassicicola CBS 101059* Brassica oleracea New Zealand JQ005259 JQ005520 JQ005606
Tabela 2 “conclusão”
* = cultura ex-tipo. As sequências foram obtidas no banco de dados de nucleotídeos do GenBank, ICMP: International Collection of Microorganisms from Plants, Landcare Research, Auckland, New Zealand; CBS: Centraalbureau voor Schimmel cultures, Utrecht, The Netherlands; IMI - CABI Genetic Resource Collection, UK; CMM: Culture Collection of Phythopathogenic Fung “Prof. Maria Menezes”, Recife, Brazil; MFLUCC: Mae Fah Luang University Culture Collection, Thailand; GZAAS: Guizhou Academy of Agricultural Sciences Herbarium, China.
N° Espécie Código Isolado Hospedeiro Localização
Geográfica
Número de acesso no GenBank
GAPDH ACT TUB2
73 C. constrictum ICMP 12941* Citrus limon New Zealand JQ005325 JQ005586 JQ005672
74 C. cymbidiicola IMI 347923* Cymbidium sp. Australia JQ005253 JQ005514 JQ005600
75 C. dacrycarpi ICMP 19107* Dacrycarpus
dacrydioides New Zealand JQ005323 JQ005584 JQ005670
76 C. hippeastri CBS 125376* Hippeastrum vittatum China JQ005318 JQ005579 JQ005665
77 C. novae-zelandiae ICMP 12944* Capsicum annuum New Zealand JQ005315 JQ005576 JQ005662
78 C. oncidii CBS 129828* Oncidium sp. Germany JQ005256 JQ005517 JQ005603
79 C. parsonsiae ICMP 18590* Parsonsia capsularis New Zealand JQ005320 JQ005581 JQ005667
80 C. petchii CBS 378.94* Dracaena marginata Italy JQ005310 JQ005571 JQ005657
81 C. phyllanthi CBS 175.67* Phyllanthus acidus India JQ005308 JQ005569 JQ005655
82 C. karstii CBS 132134* Vanda sp. China HM585391 HM581995 HM585428
83 C. karstii CBS 127552 Eugenia uniflora Brazil JQ005304 JQ005565 JQ005651
3.5 Caracterização morfológica e características da cultura
Para a avaliação dos caracteres morfológicos e características da cultura, quatorze isolados monospóricos de Colletotrichum foram cultivados em triplicatas, em meio BDA e incubados a 25±2ºC sob fotoperíodo de 12 h. Para tal avaliação, foram depositados no centro de placas de Petri de 90 mm de diâmetro, contendo meio de cultura BDA, discos de micélio de 5 mm de diâmetro retirados da área periférica de colônias dos isolados de aproximadamente 5 dias de idade. As características das culturas avaliadas foram a taxa de crescimento micelial (TCM), cor das colônias e a presença ou não de microescleródios e setas. A TCM foi determinada medindo-se diariamente o diâmetro das colônias em dois sentidos diametralmente opostos, com auxílio de uma régua milimetrada durante seis dias, tempo suficiente para que qualquer um dos isolados avaliados atingissem o diâmetro completo da placa. Os dados gerados foram utilizados para o cálculo das taxas médias de crescimento, em mm.dia-1 (Cai et al., 2009). A cor da colônia foi determinada
no último dia de avaliação da TCM com o auxílio da Carta Munsell- Soil Color Charts - Washable-Edition (Munsell, 2000).
Para a caracterização morfológica foram avaliados o tamanho e formato de 50 conídios e apressórios escolhidos aleatoriamente. Os conídios foram avaliados no último dia de avaliação da TCM a partir da confecção de lâminas semipermanentes com o auxílio de um microscópio com ocular micrométrica. Para indução da formação do apressório dos isolados em estudo, utilizou-se a técnica de microcultivo em que pedaços de meio BDA de aproximadamente 10 mm² foram transferidos para o centro de lâminas presentes no interior de placas de Petri forrada com papel filtro esterilizado. Após, inoculou-se os quatro lados do meio BDA com esporos oriundos da respectiva colônia de cada isolado, e uma lamínula estéril foi colocada sobre o meio BDA inoculado. As placas foram mantidas a temperatura de 25 ºC sob fotoperíodo de 12h e após sete dias, o formato e o tamanho do apressório formado na parte inferior da lamínula foi registrado. Os formatos de conídios
e apressórios foram avaliados de acordo com Sutton (1980). O experimento foi implementado em Delineamento em Blocos Casualizados onde cada placa constituiu a parcela experimental. Os valores médios da TCM, largura e comprimento dos conídios e apressórios foram submetidos à análise de variância e comparados pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de significância.
3.6 Testes de patogenicidade em mudas de pinha
Mudas de pinha obtidas de viveiros comerciais foram mantidas em vasos em casa de vegetação. As necessidades nutricionais das mudas foram supridas de acordo com as recomendações para a cultura (Cordeiro et al., 2000). Sete meses após o transplantio das mudas para os vasos, quando estas atingiram aproximadamente 40 cm de altura, foi realizada a inoculação dos isolados via aspersão de esporos sob toda a superfície do limbo foliar (face adaxial) de acordo com metodologia descrita por Cai et al. (2009).
Para obtenção do inóculo, os quatorze isolados de Colletotrichum foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA e mantidos em incubadora tipo BOD a 25±2ºC sob fotoperíodo de 12h durante quatorze dias. Após, para cada isolado, foi preparado uma suspensão de conídios na concentração de 1,0 x 106 esporos/ml. A suspensão de conídios foi calibrada
com auxílio da Câmara de Neubauer (hemocitômetro). As plantas na pré e pós-inoculação permaneceram por 24 e 48 horas, respectivamente, em condições de câmara úmida a fim de fornecer condições ideais de umidade e temperatura para iniciar os processos de germinação e penetração nos tecidos do hospedeiro.
O experimento foi realizado em Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC), com 3 repetições. A parcela experimental foi representada por uma planta e a testemunha foi constituída por mudas pulverizadas apenas com água destilada e esterilizada. Avalições do aparecimento e desenvolvimento de sintomas foram realizadas semanalmente durante 30 dias
após a inoculação. Para a quantificação da severidade utilizou-se a escala diagramática desenvolvida para a cultura da pinheira por Correia et al. (2011) (Figura 1). Para aplicação da escala diagramática, avaliou-se as três primeiras folhas da parte inferior de cada planta, totalizando nove folhas/ tratamento (isolado).
O reisolamento do patógeno foi realizado das margens da lesão e este cultivado em meio BDA a temperatura de 25±2ºC, em BOD, para comparação das suas características morfológicas com o isolado originalmente inoculado.
Figura 1 Escala diagramática para avaliação da severidade da antracnose em pinha. Abaixo de cada folha é indicando os níveis, em porcentagem, de área lesionada. Fonte: Correia et al. (2011).
4 RESULTADOS
4.1 Isolados obtidos
Um total de 84 isolados de Colletotrichum foram obtidos de oito espécies de Annona apresentando sintomas de antracnose ou mumificação, sendo elas A. muricata, A. squamosa, A. reticulata, A. cacans, A. crassiflora, A. squamosa x A. cherimola (híbrido) e duas espécies de Annona nativas não identificadas devido ao período de coleta ter sido realizado no momento em que não havia floração e frutificação (Tabela 1).
Dentre os 84 isolados, dezenove foram obtidos a partir de frutos com sintoma de mumificação. Os demais isolados foram oriundos de folhas, flores e frutos com sintoma de antracnose. Nas folhas foram observadas lesões de cor marrom-escuro a enegrecida de contorno irregular, às vezes com o centro esbranquiçado, no caso de lesões mais velhas. Em flores havia o escurecimento das pétalas.
4.2 Análises filogenéticas
A análise inicial das sequências do gene parcial GAPDH obtidas para 31 isolados de Colletotrichum pelo método de MP revelou que os isolados agruparam em três diferentes complexos, ‘gloeosporioides’, ‘acutatum’ e ‘boninense’ (Figura 2). Os resultados demonstram ainda a distribuição destes isolados em maior número no complexo de espécies C. gloeosporioides. Os isolados de anonáceas deste estudo agruparam com isolados de referência de C. fructicola, C. gloeosporioides stricto sensu, C. theobromicola, C. nymphaeae e C. karstii. Além disso, dentro do complexo ‘gloeosporioides’, foi formado um grupo monofilético bem suportado (valor de bootstrap de 93%) apenas com isolados de anonáceas. Devido estes isolados terem formado um clado bem suportado e possivelmente se tratarem de uma nova espécie, este grupo monofilético foi denominado de Colletotrichum sp.1.
