Relatório de estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária

UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO

RIO GRANDE DO SUL

DEPARTAMENTO DE ESTUDOS AGRÁRIOS

CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

Ana Virginia Gottwald

RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM

MEDICINA VETERINÁRIA

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Ijuí, RS

2018

Ana Virginia Gottwald

RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

Relatório do estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária, Área de Clínica e Reprodução de Grandes Animais, apresentado ao Curso de Medicina Veterinária da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ, RS), como requisito parcial para a obtenção do grau de Médico Veterinário.

Orientadora: Profª. Dra. Med. Vet. Maria Andréia Inkelmann

Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul Departamento de Estudos Agrários

Curso de Medicina Veterinária

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova o

RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

Elaborado por Ana Virginia Gottwald

Como requisito parcial para obtenção do grau de Médico Veterinário

COMISSÃO EXAMINADORA:

__________________________________________ Drª. Maria Andréia Inkelmann, (UNIJUÍ)

(Orientadora)

__________________________________________ Drª. Denize da Rosa Fraga, (UNIJUÍ)

(Banca)

AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha família pelo apoio e conforto nas dificuldades. Agradeço a minha mãe que estive presentes me incentivando e apoiando em todas as decisões, mesmo diante de todas as dificuldades não medindo esforços e sendo essencial para que eu chegasse até aqui.

Agradeço em especial ao amor de minha vida que nunca mediu esforços para me incentivar a buscar o novo e o melhor, e foi decisivo para eu conquistar este mérito.

Agradeço a toda equipe da In Vitro Brasil pela oportunidade de estágio e pelos conhecimentos passados durante o estágio. Em especial agradeço a toda equipe do laboratório de Mogi Mirim que estiveram sempre dispostos a sanar minhas dúvidas enriquecendo cada dia mais o meu estágio.

Agradeço a minha orientadora Maria Andréia Inkelmann, pela orientação, paciência e incentivo o que tornaram possível a realização deste trabalho. Aos professores da UNIJUÍ por todos os conhecimentos passados ao longo da graduação, todos foram essenciais para a minha formação.

RESUMO

RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

AUTOR: Ana Virginia Gottwald ORIENTADORA: Maria Andréia Inkelmann

O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado na In Vitro Brasil LTDA, localizado na cidade de Mogi Mirim, São Paulo Brasil, no período de 03 de setembro a 28 de setembro de 2018, totalizando 150 horas de atividades, na área de Reprodução Animal, com ênfase a produção in vitro de embriões bovino (PIV). A supervisão interna ficou sob responsabilidade da Técnica e Bióloga Junia Aparecida Bernardes Afonso de Carvalho e a orientação da Doutora professora Médica Veterinária Maria Andréia Inkelmann. O estágio teve como objetivo principal a aplicação dos conhecimentos teóricos e práticos adquiridos durante a formação acadêmica, possibilitando o contato e a troca de experiências com profissionais qualificados, permitindo assim, aprimorar conhecimentos sobre o uso das biotécnicas reprodutivas, especialmente a rotina que envolve a PIV. Durante o estágio foram desenvolvidas atividades que serão expressas em forma de tabelas, sendo nestas apresentadas as atividades acompanhadas. Para o desenvolvimento deste relatório foi selecionada para a discussão a técnica de PIV, sendo descrita a rotina do laboratório acompanhado durante o estágio e comparada a literatura. A realização do Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária proporcionou grande aprendizado junto à formação acadêmica, promovendo o crescimento pessoal e profissional, juntamente com a troca de conhecimentos e experiências entre acadêmicos, técnicos e supervisora, agregando crescimento pessoal e profissional, além de colocar em prática a teoria aprendida ao longo da graduação em Medicina Veterinária.

Palavras-chave: Produção in vitro. Reprodução. Embriões. Bovinos.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Atividades laboratoriais acompanhadas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na In Vitro Brasil S/A, Mogi Mirim, São Paulo, Brasil, no período de 03 setembro a 28 setembro de 2018...3

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Linha do tempo das etapas da FIV com o meio SOF. Fonte: In Vitro Brasil Figura 2 – Esquema de desenho de placas de cultivo. Fonte: In Vitro Brasil

Figura 3 – Eppendorfs preparados e identificados com o nome do touro. Fonte: In Vitro Brasil Figura 4 – Preparo do sêmen pelo método de Lavagem. Fonte: In Vitro Brasil

Figura 5 – Cultivo sendo realizado após 24 horas da FIV Fonte: In Vitro Brasil Figura 6 – Linha do tempo das etapas da FIV com o meio C4. Fonte: In Vitro Brasil Figura 7 – Esquema da palheta de envase de embriões. Fonte: In Vitro Brasil Figura 8 – Transportadora de embriões. Fonte: In Vitro Brasil

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ECSMV – Estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária IVB – In Vitro Brasil LTDA

RS – Rio Grande do Sul SP – São Paulo

MIV – Maturação In Vitro FIC – Fertilização In Vitro CIV – Cultivo In Vitro

PIV – Produção In Vitro de Embriões OPU – ovum pick-up

CCO – complex cúmulos-oócito

PHE – penicilamina, hipotaurina e epinefrina D-1 – Dia menos um D 0 – Dia zero D 1 – Dia um D 2 – Dia dois D 3 – Dia três D 4 – Dia quatro D 5 – Dia cinco D 6 – Dia seis D 7 – Dia sete LH – Hormônio Luteinizante TE – Transferência de Embriões μL - Microlitros

rpm – Rotações por minuto

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 1 2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ... 3 3 DESENVOLVIMENTO ... 5

3.1 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES ... 5

3.2 ETAPAS DA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES (PIVE) ... 6

3.2.1 Aspiração folicular de ovários ... 7

3.2.2 Maturação ... 8

3.2.3 Fertilização in vitro de embriões ... 9

3.2.4 Preparação do sêmen ... 10

3.2.5 Cultivo in vitro de embriões ... 12

3.2.6 Feeding ... 13

3.2.7 Meio de Cultivo C4 ... 14

3.2.8 Previsão ... 14

3.2.9 Envase ... 15

3.2.10 Transferência de Embrião (TE) ... 15

3.2.11 Criopreservação ... 16

4 CONCLUSÃO ... 16

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 18

1 INTRODUÇÃO

O estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado no período de 03 de setembro a 28 de setembro de 2018, totalizando 150 horas de atividades, na In Vitro Brasil LTDA (IVB). A supervisão interna ficou sob responsabilidade da Técnica e Bióloga Junia Aparecida Bernardes Afonso de Carvalho e sob a orientação da Doutora professora Médica Veterinária Maria Andréia Inkelmann, UNIJUÍ.

A empresa In Vitro Brasil S/A foi fundada em 2002, com o intuito de atender o mercado crescente de produção in vitro de embriões bovinos (PIV). A matriz está localizada na Fazenda-Haras São Francisco, localizada no município de Mogi Mirim no interior de São Paulo. Possui hoje 30 laboratórios, divididos entre afiliados e próprios, em 11 países, sendo 15 no Brasil e 15 no exterior (África do Sul, Colômbia, Estados Unidos, Rússia, Argentina, Austrália, Uruguai, Panamá, Paraguai e Venezuela). Os serviços oferecidos pela empresa incluem fecundação in vitro de embriões (FIV) de bovinos, equinos, ovinos e caprinos, criopreservação de embriões, clonagem de bovinos e equinos e preservação de linhagens celulares. A PIV, sua principal atividade, possibilita aos criadores produzirem embriões de seus melhores animais, em alta escala num curto período de tempo, acelerando o processo de melhoramento genético.

A empresa possui projetos de PIV com Integralat, Lactobom, Sekita, Codelac (Colômbia), BR Foods e Santa Luzia. A PIV com o uso de sêmen sexado possibilita a produção de fêmeas com alto potencial produtivo nos rebanhos leiteiros. Hoje, é a maior empresa do mundo na produção in vitro de embriões. No ano de 2011, foram produzidos mais de 180.000 embriões e em 2012, a empresa bateu a marca dos 203 mil embriões bovinos, em 12 países diferentes (Arquivo In Vitro Brasil S/A).

O Laboratório de Reprodução em Mogi Mirim -SP é dividido em: escritório, composto pelo setor administrativo, onde é realizado o contato com clientes, as cobranças e as reuniões; sala de materiais de campo, onde ficam guardados os materiais de aspiração, de seleção de oócitos e transferência de embrião, transportadoras de oócitos e transportadoras de embriões; laboratório, onde são realizadas as fertilizações in vitro (FIV), o cultivo e estoque dos oócitos e embriões produzidos, a avaliação de sêmen, a produção e testes de novos meios de cultivo, os testes com diferentes tipos de fertilizações, congelamentos e descongelamentos de embriões; laboratório de clonagem animal; sala de lavagem e esterilização de materiais; sala de estoque de materiais;

A realização do Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária na IVB proporcionou aperfeiçoar os conhecimentos que envolvem a área da Reprodução Animal, bem

2 como aprimorar o conhecimento, auxiliando na formação da postura profissional e maximizar os conhecimentos práticos e teóricos ministrados durante a graduação.

O presente trabalho tem como objetivo apresentar e descrever as atividades desenvolvidas no laboratório, enfatizando a FIV.

A filial de Mogi Mirim, possui técnicos laboratoriais para a PIV, técnicos para a confecção dos meios utilizados no processo, técnicos para o laboratório de clonagem, e técnicos que realizam o trabalho a campo como aspiração de oócitos e a transferência de embriões. Contam também como a equipe administrativa, a de controle de estoque e de manutenção.

2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

As atividades acompanhadas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foram direcionadas para produção in vitro de embriões bovinos que abrange todo o processo de seleção de oócitos, maturação de oócitos in vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV), cultivo in vitro (CIV), avaliação do desenvolvimento embrionário, criopreservação de embriões e classificação embrionária. Além disso, foram desenvolvidas atividades relacionadas à manutenção do laboratório, tais como a limpeza e esterilização de materiais utilizados na técnica de produção in vitro. As atividades desenvolvidas no Laboratório de Reprodução Animal que envolvem a técnica de produção in vitro de embriões estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1 – Atividades laboratoriais acompanhadas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na In Vitro Brasil S/A, Mogi Mirim, São Paulo, Brasil, no período de 03 setembro a 28 setembro de 2018.

Atividades Acompanhadas Espécie Total de

horas %

Limpeza, esterilização e organização de materiais do laboratório

- 40 26,66

Troca de 50% do meio de cultivo (Feeding) Bovino 20 13,33

Cultivo in vitro de oócitos Bovino 20 13,33

Fecundação in vitro de oócitos Bovino 20 13,33

Maturação in vitro de oócitos Bovino 20 13,33

Envase de embriões para TE Criopreservação de embriões Bovino Bovino 15 15 10 10 Total 150h 100

A limpeza e esterilização de materiais no laboratório seguiam as normas básicas de biossegurança, sendo que a limpeza dos materiais deveria ser precedida de acordo com a sua categoria. O material utilizado na produção de embriões deveria ser cuidadosamente limpo para evitar contaminação por microrganismos.

Para a permanência no laboratório era obrigatório o uso de jaleco, propés e máscara. As mãos eram lavadas com sabão clorexidine 2%, secas com papel toalha e, após, era passado álcool 70% nas mãos e antebraços antes de iniciar o procedimento.

O material usado na produção in vitro dos embriões era esterilizado e preparado anteriormente. Nas capelas de fluxo laminar era feita a limpeza com álcool 70% diariamente antes de começar os procedimentos, e, nas segundas-feiras, os técnicos realizavam uma limpeza criteriosa com a aplicação de sabonete desinfetante, água destilada e álcool 70%. As capelas de

4 fluxo laminar eram mantidas ligadas durante todo o dia de trabalho. As incubadoras eram desmontadas e limpas com álcool 70% a cada quatro meses. Os aparelhos de ar condicionado eram limpos a cada seis meses. A limpeza das paredes e bancadas era realizada apenas com papel toalha umedecido com álcool 70%. O piso do laboratório era limpo diariamente com água e álcool.

3 DESENVOLVIMENTO

Ana Virginia Gottwald, Maria Andréia Inkelmann, Junia Aparecida Bernardes Afonso de Carvalho

3.1 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES

A crescente exigência mundial para produção de alimentos seguros e de forma sustentável tem obrigado a pecuária bovina a sofrer adaptações, buscando o aumento da eficiência reprodutiva e produtiva dos animais em áreas cada vez menores. Nesse sentido, as biotécnias de reprodução animal têm contribuído para a produção de animais com genótipo superiores e com eficiência produtiva destacada. Além disso a fecundação in vitro (FIV) é uma importante ferramenta para acelerar o melhoramento genético em rebanhos de alo valor e encurtar o intervalo entre gerações, facilitando as observações comparativas entre os produtos dos diferentes acasalamentos, promovendo uma rápida seleção dos animais mais produtivos (MARTINS, 2010). O Brasil é uma referência mundial na área da reprodução animal, ocupando o 1º lugar na produção in vitro de embriões do mundo em 2011 e se mantendo até hoje na primeira colocação. Em 2016, dos 600 mil embriões produzidos no mundo, 450 mil foram no Brasil. Apesar do grande potencial a Produção In Vitro de embriões (PIV) apresenta fatores limitantes como a baixa taxa de embriões que atingem o estádio transferível (mórula e blastocisto), as anormalidades fetais e neonatais, o baixo índice de desenvolvimento embrionário após o processo de criopreservação, e a alta produção de embriões machos superando 50% (SANTOS et al., 2017).

Na PIV tem-se a previsão do produto nascido através das características genéticas do pai e da mãe são conhecidas, dessa forma o produto oferecido é eficiente e produtivo, atendendo aos mais exigentes plantéis. O progresso ocorrido com a PIV no Brasil nos últimos 40 anos causou um grande impacto econômico, demonstrado pela eficiência e produtos dessa biotécnica (SANTOS et al., 2017).

A PIV é uma biotécnica reprodutiva que surgiu e se consolidou no Brasil para auxiliar no desenvolvimento do melhoramento animal. Nos últimos 40 anos, o progresso ocorrido com a utilização desta biotécnica causou um considerável impacto no setor econômico brasileiro, demonstrando assim, que o seu uso não é dependente apenas da eficiência em sua utilização, mas também dos fatores econômicos do mercado que esta biotécnica utiliza e consegue gerar, promovendo assim, o avanço de outras tecnologias (LIMA et al., 2014).

A PIV se caracteriza pela produção de embriões por manipulação de gametas fora do organismo materno. O potencial de multiplicação dos bovinos é maior que na Transferência de

6 Embriões (TE), pois aumenta consideravelmente o número de produtos vaca/ano, acelerando a produção de animais geneticamente superiores e impedindo que ocorra o desgaste involuntário e precoce de fêmeas de alto valor genético (MARTINS, 2010).

Dentre as biotécnicas da reprodução, a produção in vitro (PIV), associada à coleta de oócitos a partir da punção folicular guiada por ultrassom (Ovum Pick Up - OPU), tem sido utilizada como instrumento importante para exploração maximizada do potencial reprodutivo dos rebanhos bovinos, pois viabiliza a utilização de fêmeas a partir dos seis meses de idade, gestantes até o terceiro mês ou no período pós-parto podem ser usadas como doadoras de oócitos, diminuindo o intervalo de gerações e permitindo selecionar matrizes potenciais, levando à produção de novilhas de reposição apenas de animais geneticamente superiores, o que contribui para a otimização do melhoramento genético (VARAGO et al., 2008; MELLO et al., 2016).

O principal objetivo da PIV consiste na obtenção de embriões viáveis a partir de fêmeas saudáveis de alto valor genético e também aquelas que não estão mais aptas a produzirem descendentes pelas técnicas convencionais. Outra vantagem está no fato de que não é necessário o uso de hormônios para a recuperação dos oócitos, aumentando a vida reprodutiva das doadoras e diminuindo o intervalo de produção dos embriões (MELLO et al., 2016).

Scanavez et al. (2013) ainda ressalva que o uso da PIV em larga escala ainda é bastante restrito devido ao seu alto custo operacional e ao tempo requerido para a rotina de produção, além de se fazer necessária a monitoração rigorosa das doadoras, receptoras e embriões para assegurar a eficiência no uso da técnica. Fatores como a taxa de perdas embrionárias precoces ou tardias e os nascimentos de conceptos relativamente grandes, também devem ser levados em consideração no uso da PIV, já que estes representam elevados riscos à rentabilidade da biotécnica.

O objetivo deste relatório é descrever as atividades de PIV de embriões bovinos acompanhadas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado no Laboratório da In Vitro Brasil S/A, Mogi Mirim, São Paulo, Brasil, no período de 03 de setembro a 28 de setembro de 2018.

3.2 ETAPAS DA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES (PIVE)

Durante o período de Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado no Laboratório de Reprodução In Vitro Brasil LTDA foi possível acompanhar todas as etapas que envolviam e eram direcionadas ao processo da PIV. O processo de PIV no laboratório

envolve as etapas a maturação de oócitos in vitro (MIV), a fecundação in vitro (FIV) e o cultivo embrionário in vitro (CIV) até a preparação dos embriões para o transporte ou a criopreservação.

A In Vitro Brasil seguia uma linha de tempo, desde a coleta dos oócitos até a transferência para as receptoras ou a criopreservação dos embriões. O processo todo compreendia 8 dias. O dia da OPU era considerado o dia -1. FIV o D0. CIV o D1. 1ºfeeding o D3 e o 2ºfeeding o D5. A previsão de quantos embriões serão produzidos era feita no D6 e o envase (congelamento ou transferência) no D7. Na figura 1 está demostrado um desenho esquemático deste cronograma em forma de linha de tempo (Protocolo 1 – SOF).

Estas etapas que envolvem o processo da PIV de embriões bovinos e que são realizadas no Laboratório de Reprodução Animal serão descritas a seguir:

3.2.1 Aspiração folicular de ovários

A aspiração folicular é realizada em animais de alto valor genético com a finalidade de aumentar sua progênie. Os oócitos provenientes de aspiração são fecundados in vitro e transferidos para receptoras de baixo valor genético que levarão a gestação a termo.

Inicialmente, no laboratório, os criotubos eram identificados com o número da vaca a ser aspirada e o nome da fazenda ou do proprietário, e adicionados 300 μl de óleo e 400 μl de meio MIV (meio de maturação). Os criotubos, na caixa transportadora de oócitos, eram encaminhados para a fazenda onde a equipe técnica da In Vitro, fazia a coleta dos oócitos por OPU, seleção, contagem, limpeza e demais processos. Os oócitos eram acondicionados em seus respectivos criotubos de acordo com o número de identificação da doadora presente no mesmo. O criotubo recebia, antes de ser vedado com a rolha de borracha, um fluxo de gás (CO2, O2 e N2) por 25 segundos e então era acondicionado na transportadora de oócitos.

A OPU é considerada o D-1 no calendário da FIV.

A transportadora de oócitos mantêm a temperatura das estruturas em 38,5º C até a chegada ao laboratório. No laboratório as rolhas são substituídas por tampas de plástico que permite a troca de gás e então são colocados na incubadora permanecendo por 24 horas, com duas horas de tolerância para mais ou para menos. Após esse período do processo de maturação é realizada a fertilização in vitro (FIV) dos oócitos.

8 3.2.2 Maturação

A maturação de oócitos é apenas o primeiro passo para a produção in vitro de embriões, mas também, a base para a prática e investigação da clonagem e da produção de animais transgênicos (PALMA, 2008). A função do oócito é constituir o futuro desenvolvimento do embrião. Esse processo se estabelece gradualmente durante a ovogênese, através da configuração celular e molecular que lhe concedem a capacidade de completar a meiose, garantir a fecundação espermática e cumprir as fases do desenvolvimento de acordo com as excreções maternas de RNA mensageiro e proteínas em um produto saudável.

A maturação possui duas fases, a nuclear (visualizada pela extrusão do segundo corpo polar) e citoplasmática (alterações bioquímicas e estruturais). A maturação, fertilização e desenvolvimento bem-sucedidos antes da implantação dependem do crescimento e diferenciação adequados dos oócitos imaturos e das células cumulus circundantes (MALEKI et al., 2016). A maturação completa quando ocorre naturalmente vai do período que antecede a ovulação até a fertilização, na PIV todos esses processos ocorrem em laboratório, com o objetivo de maximizar a quantidade e a qualidade dos embriões. Durante todo o processo de desenvolvimento o oócito encontra-se no estádio de diplóteno da prófase I ou estágio de vesícula germinativa até se comprometerem a ovulação ou a atresia (MELLO et al., 2016).

A maturação final do oócito no folículo pré-ovulatório de uma vaca cíclica, inicia com uma onda pré-ovulatório de LH, para progredir do estágio de prófase I a metáfase II nas 20-24 horas seguintes. In Vitro, o início da meiose ocorre de forma espontânea no momento em que o oócito é separado do folículo não ovulatório (2 a 8 mm) e alcança a metáfase II em 18-24 horas de cultivo. A primeira modificação visível do núcleo é a condensação da cromatina e a dissolução da membrana nuclear, processo conhecido como a ruptura da vesícula germinativa. A última manifestação do amadurecimento nuclear culmina com o final da meiose (PALMA, 2008).

Além da maturação nuclear, se faz necessário que os oócitos adquiram durante a fase de crescimento folicular, a capacidade para completar a sua maturação citoplasmática no processo de desenvolvimento embrionário. A maturação citoplasmática são modificações ultra-estruturais, moleculares e bioquímicas no citoplasma e na membrana plasmática do oócito, possibilitando que o mesmo tenha competência para realizar seu desenvolvimento e o mecanismo enzimático relacionado ao bloqueio da polispermia (MELLO et al., 2016).

3.2.3 Fertilização in vitro

A fecundação consiste no processo em que o espermatozoide entra em contato com o oócito, dando origem ao zigoto, que, posteriormente, se desenvolve até a fase de blastocisto. No processo in vivo os espermatozoides precisam chegar até a ampola da tuba uterina para fecundar o oócito, durante este trajeto, substâncias presentes no sistema reprodutor da fêmea como os glicosaminoglicanos, induzem a capacitação dos espermatozoides, e este processo reflete na desestabilização da membrana plasmática pela remoção de algumas proteínas e modificações bioquímicas que levam a hiperativação espermática. Assim, desta forma, este processo torna possível a ligação da membrana do espermatozoide aos receptores específicos na zona pelúcida do oócito, onde acontece a reação acrossômica (MELLO et al., 2016).

Para a realização da fertilização in vitro de embrião é necessário que as placas e os meios a serem utilizados se estabilizem na incubadora no mínimo uma hora antes da realização do procedimento. É feito o cálculo de quanto meio FIV será utilizado no dia, conforme a quantidade de oócitos a serem fertilizados. O meio FIV era composto por heparina, PHE (penicilamina, hipotaurina e epinefrina) e antibiótico. As placas de FIV eram montadas conforme os touros que serão utilizados de cada proprietário, não misturando em nenhuma condição mais de um touro por placa devido ao risco de as gotas coalescerem e os oócitos perderem controle de identificação. As gotas de FIV eram de 90 μL quando usado sêmen convencional e de 25 μL quando usado sêmen sexado, com 4 mL de óleo mineral. A FIV é considerada o dia 0 (D0) do procedimento. Após a placa de maturação estar pronta era colocada na incubadora com ambiente de 38 a 39ºC e 4,5 a 5,5% de CO2 deixando-a por no mínimo uma hora, para o alcance do equilíbrio do meio de maturação.

Na chegada dos oócitos ao laboratório, é retirado dos criotubos a rolha de borracha e trocado por uma tampa de plástico, os mesmos são colocados na incubadora. A FIV inicia-se, aproximadamente 24 horas após a OPU, com a retirada dos oócitos dos criotubos e a lavagem dos mesmos em uma gota de 100 μL de TL-sêmen, que possui função adstringente, para que os oócitos maturados tendam a se separar uns dos outros e das células do cumulus, e outra gota de 100 μL de meio MIV, meio que os oócitos irão ficar na nova placa. Após a lavagem os oócitos vão para as placas já montadas na incubadora enquanto é realizado o processamento do sêmen. Para o processamento do sêmen pode-se utilizar o método de Percoll e o método de Lavagem. O método de Lavagem é usado somente para sêmen convencional enquanto o método de Percoll pode ser usado para ambos.

10 Quando o transporte dos oócitos era feito no tubo de transporte, eram aspirados 200 μL do meio de maturação no fundo dos tubos, não deixando a ponteira da pipeta tocar no fundo do tubo, e após era depositado na placa de seleção de 90mm, comparando a quantidade de oócitos com a planilha de campo e registrado no formulário “ficha de aspiração” o valor real de oócitos existente. Os oócitos eram depositados em meios de maturação, não ultrapassando 30 oócitos por gota. Na tampa das placas, era identificado o número da(s) doadora(s), do touro e a data da FIV. Na figura 2 está representado a preparação e identificação das placas. Posteriormente a placa era devolvida a incubadora com ambiente de 38 – 39 ºC e 4,5 a 5,5% de CO2, com atmosfera gasosa controlada e ar e umidade saturados, onde permanecerá de 22 a 26 horas em maturação.

3.2.4 Preparação do sêmen

As células espermáticas, como ocorre em condições fisiológicas, devem alcançar a sua capacidade fecundante, para isso, devem ser submetidas a um processo de preparação in vitro com o objetivo de iniciar a sua capacitação e desencadear a sua reação acrossômica. A preparação dos espermatozoides é a escolha dos com morfologia normal, motilidade adequada e integridade de DNA (PALMA, 2008).

O sêmen utilizado pelo laboratório para a fecundação dos oócitos era comercial. A palheta do sêmen escolhida para a fecundação era descongelada 10 segundos no ar e após em banho-maria a uma temperatura de 35°C por 30 segundos. O descongelamento era realizado de forma cuidadosa para evitar que não houvesse nenhum tipo de alteração no sêmen que prejudicasse o processo de fecundação dos oócitos. Após o processo de descongelamento, a palheta era seca com papel toalha e o conteúdo era depositado em um tubo do tipo eppendorf. No laboratório os eppendorf eram destacados com o nome do touro e escrito de cores diferentes para cada touro, prevenindo o erro de usar o sêmen diferente do escolhido para o acasalamento, o mesmo está demostrado na figura 3.

3.2.4.1 Método de Percoll – sêmen convencional

Em um eppendorf de 2 mL montava-se primeiro 500 μL do Percoll superior (Percoll 45%), constituído de 250 μL de Percoll 90% e 250 μL de meio TL-sêmen, para uma dose de 0,25 mL de sêmen. Cuidadosamente adiciona 500 μL do Percoll baixo (Percoll 90%) no fundo do eppendorf formando assim um gradiente de Percoll. Com o gradiente de Percoll montado, o sêmen era

descongelado a 37º C por 30 segundos e colocado lentamente no gradiente de Percoll. Era realizado duas centrifugações, a primeira centrifugação a 9.000 rpm por 5 minutos e posteriormente deve ser retirado o sobrenadante e adicionado 1 mL de meio FIV, realizando assim a segunda centrifugação a 5.000 rpm por 3 minutos. Após a segunda centrifugação era retirado o pelet formado e colocado em epperndorf de 0,5ml, posteriormente era fecundado as gotas com no mínimo 3μL/gota avaliando os espermatozoides na própria gota, adicionando mais sêmen, se necessário.

3.2.4.2 Método de Percoll – sêmen sexado

A aplicação de sêmen sexado em um programa de produção in vitro de embriões melhora a eficiência produtiva e dá um maior valor agregado as terneiras produzidas (PALMA, 2008).

Em um eppendorf de 2 mL monta-se primeiro 400 μL do Percoll superior (Percoll 45%), constituído de 100 μL de Percoll 90% e 300 μL de TL-sêmen, para uma dose de sêmen. Cuidadosamente adiciona 400 μL do Percoll baixo (Percoll 90%), constituído de 350 μL de Percoll 90% e 50 μL de TL-sêmen. Com o gradiente de Percoll montado, o sêmen deve ser descongelado a 37º C por 30 segundos e colocado lentamente no gradiente de Percoll. É realizada a primeira centrifugação a 10.000 rpm por 5 minutos e posteriormente deve ser retirado o sobrenadante e adicionado 1 mL de meio FIV, realizando assim a segunda centrifugação a 4.000 rpm por 3 minutos. Após a segunda centrifugação deve-se retirar o pelet formado e não deve diluí-lo. Deve-se fecundar a gota com 10 μL do pelet, avaliando os espermatozóides na própria gota, adicionando mais sêmen se necessário.

Zúccari et al. (2008) relatam que a técnica do gradiente de Percoll® demonstra-se eficaz na seleção espermática e, além disso, resulta em frações límpidas com espermatozóides de elevada motilidade, não gera lesões na cromatina, elimina leucócitos e proporciona uma boa recuperação de gametas, mesmo em amostras com baixas concentrações espermáticas. Os autores concluem que a passagem dos espermatozóides pelo gradiente de Percoll® demonstrou-se eficaz na seleção espermática, proporcionando uma maior população de espermatozoides móveis, com membranas plasmática e acrossomal íntegras, não causando alterações na condensação da cromatina nuclear.

3.2.4.3 Método de Lavagem

O método é utilizado exclusivamente para sêmen convencional. Em um tubo tipo falcon de 15 mL é adicionado o sêmen em 2 mL de TL-sêmen, homogeneizando-os. É realizada a

12 primeira centrifugação a 600 rpm por 5 minutos, posteriormente retira o sobrenadante e adiciona 2 mL de meio FIV e realiza a segunda centrifugação a 600 rpm por 5 minutos. O pelet formado é retirado e diluído (1:1) em meio FIV e inicia-se a fecundação com 3 μL/gota, avaliando o sêmen na própria gora, adicionando mais se necessário. Na figura 4 está representado o preparo dos materiais para a lavagem do sêmen.

A fecundação resume os eventos iniciados pela penetração do espermatozoide pelas camadas celulares e acelulares que rodeiam o oócito e culmina com a formação de prónucleos (PALMA, 2008). O processo de fecundação oocitária envolve eventos bioquímicos, na qual se inicia com o processo de capacitação espermática, aumento da sua motilidade, reconhecimento dos receptores da zona pelúcida do oócito, reação acrossômica, ligação da membrana plasmática do oócito, e por último incorpora-se ao citoplasma.

Após a fecundação das gotas, as placas de FIV ficam 24 horas até a realização do cultivo (CIV).

O período de co-cultivo (espermatozoide e oócito) era realizado por um período de 18 a 22 horas, em temperatura e atmosfera controladas, sob as mesmas condições da MIV, corroborando com Mello et al. (2016) onde o mesmo ressalva que o período de co-cultivo é realizado por um período de 18-22 horas em temperatura de 39°C e atmosfera com 5% de CO2 em ar e umidade saturada.

3.2.5 Cultivo in vitro

O cultivo é realizado 24 horas após a FIV. Primeiramente deve-se montar as placas de CIV com gotas de 100 μL (a quantidade de gotas varia de acordo com a quantidade de estruturas, tendo até 35 estruturas por gota e até 5 gotas por placa) de meio SOF® e 4 mL de óleo mineral, e deixá-las juntamente com os meios que serão usados durante uma hora na incubadora para que se estabilizem. A composição das diferentes formulações empregadas no cultivo é relativamente simples embora o preço dos meios não reflita isso. Basicamente se trata de uma solução salina suplementada com um componente de energia (piruvato, glicose ou lactose) e alguma fonte proteica (soro ou albumina sérica bovina) (PALMA, 2008).

O cultivo é considerado o dia 1 (D1) do procedimento. Ainda nas placas de FIV deve-se tentar desnudar ao máximo os possíveis zigotos, pois as células que permanecem competem com os com os zigotos pelos nutrientes, podendo não fornecer a quantidade de nutrientes necessários para o completo desenvolvimento dos zigotos. Depois de desnudados os zigotos são lavados em 3 gotas de 100 μL, sendo a primeira de TL-sêmen, a segunda metade de TL-sêmen metade de

meio SOF e a terceira de meio SOF. Deve-se atentar para pegar o mínimo de meio possível para passar de uma gota para outra. Na figura 5 esta a demonstração de uma técnica realizando o cultivo.

Após as três lavagens as estruturas (prováveis zigotos) são passadas para a placa CIV, previamente preparada com duas horas de antecedência para a estabilização do meio, contendo 200 µL de meio de SOF® suplementado com piruvato e SFB. Decorridas 24 horas (com tolerância de 2 horas para mais ou para menos) do processo de co-cultivo entre oócitos e espermatozóides, dava-se início ao processo de cultivo in vitro dos embriões, onde os prováveis zigotos eram retirados do meio de FIV e submetidos a repetidas pipetagens com posterior lavagem das estruturas em gotas de meio de cultivo para que ocorresse a remoção das células do cumulus oophorus e a retirada dos espermatozoides que ainda pudessem estar aderidos a zona pelúcida do oócito. Este mesmo processo é realizado por Sirard e Coenen (2006), onde antes da transferência dos prováveis zigotos para a placa de cultivo, os oócitos devem ser separados das células do cumulus oophorus através da realização de sucessivas pipetagens e posteriormente lavados com o meio de cultivo, com o intuito de evitar a transferência das células do cumulus para o meio utilizado para o desenvolvimento embrionário.

Nesta etapa, durante o estágio, era preconizado que as gotas fossem cobertas com óleo mineral para auxiliar na estabilização do pH e evitar que houvesse evaporação do meio. Recomendava-se que todo este processo fosse realizado o mais breve possível, para que não houvesse mudanças de temperatura e no pH da gota. Os zigotos permaneciam na estufa de cultivo por sete dias, em temperatura e atmosfera controlada, sob as mesmas condições da MIV.

3.2.6 Feeding

O feeding consistia na troca de 50% do meio de cultivo, com o objetivo de renovação do meio e também para o fornecimento de quantidade uniforme de nutrientes durante todo o período de cultivo para os prováveis zigotos. Este processo era efetuado no dia em que se procedia a avaliação da clivagem (dia 3) e no dia de avaliação das mórulas (dia 5) após o início do cultivo in vitro.

Os feedings são realizados no dia 3 (D3) e no dia 5 (D5). No primeiro feeding (D3) retiram-se 50 μL de meio da gota de cultivo e adicionam-retiram-se 50 μL de meio SOF. Neste mesmo dia são contadas as clivagens dos zigotos. No segundo feeding (D5) retiram-se 50 μL de meio da gota e adicionam-se 50 μL de meio SOF segundo feeding. O SOF segundo feeding se difere do SOF principalmente pela quantidade de glicose, que no primeiro é maior. Isso se explica pelo gasto das

14 reservas energéticas do embrião no início do processo e pela necessidade de energia presente no meio quando suas reservas já estão se esgotando. No SOF segundo feeding há ainda um componente que diminui a gordura do embrião agindo assim como crioprotetor, independente se o embrião será vitrificado ou não.

O feeding inclui as primeiras clivagens, ativação do genoma embrionário com o embrião com 8 a 16 células, compactação da mórula no dia 5 (D5) do desenvolvimento, a formação de blastocisto no dia 6-7 do desenvolvimento, a partir do qual há a diferenciação de dois tipos celulares, o trofoectoderma e a massa celular interna. No cultivo de embriões, geralmente, a atmosfera gasosa utilizada é de 5% de CO2, 5% de O2, 90% de N2 e umidade saturada a 39ºC. 3.2.7 Meio de Cultivo C4

O C4 é outro meio que se cultiva os embriões, a partir do D0 até o D7 os embriões vão ser cultivados nesse meio, este cronograma esta demonstrado na figura 6 representando o Protocolo 2 – C4. Durante esse período de tempo eles vão sofrer procedimento, mas não vão sair da gota de C4. O C5 é o procedimento onde se conta a clivagem desses embriões e se adiciona dois complementos que servem para dar uma estimulada maior no embrião, são eles, complemento 1 e 2, compostos de sérum replacement e dextrose respectivamente. O C5 é realizado no D4 do cultivo de embriões.

O meio C4 possui como diferencial a ausência de soro fetal bovino (SFB), esse, é utilizado pelo laboratório afim de reduzir os problemas de má formação embrionária que pode ocorrer quando é utilizado o meio SOF que tem em sua composição o SFB.

Na figura 6 está demostrado uma linha do tempo para a utilização do meio C4 na PIV. Os demais procedimentos da PIV se repetem neste meio. Após esse procedimento os oócitos retornavam para a incubadora em atmosfera gasosa de 5% de CO2, 5% de O2, 90% de N2 e umidade saturada a 39ºC.

3.2.8 Previsão

A previsão é quantos embriões estimava-se que seriam produzidos. A previsão de quantos embriões serão transferidos para as vacas receptoras era feita no D6. Após este procedimento o proprietário era comunicado, sabendo assim quantas receptoras ele necessitará. No caso de a previsão ser inferior aos embriões que se desenvolverão, e o produtor não ter a quantidade de receptoras necessárias os embriões excedentes eram vitrificados, e caso não haja embriões

suficiente para a quantidade que o proprietário deseja, havia a possibilidade de desvitrificação do banco de embriões que cada cliente possuía na empresa.

3.2.9 Envase para transferência direta

Após sete dias (D7), os embriões são classificados segundo o seu estádio de desenvolvimento e a sua qualidade, observando a integridade da zona pelúcida, o aspecto morfológico celular, número e grau de compactação das células ou se apresentavam células degeneradas. No laboratório da IVB para envase do embrião na palheta, adotava-se duas bolhas de ar de cada lado do embrião, essas bolhas têm como função evitar que o embrião entre em contato com o algodão ou com o lacre da palheta e seja perdido. O esquema de como era feito o envase esta demostrado na figura 7. O lacre era devidamente identificado conforme a ficha de campo que vai para a propriedade contendo nome e RG da doadora, nome e RG do touro, embrião convencional ou sexado.

O envase ocorre horas antes de o veterinário que irá realizar a transferência de embrião se deslocar para propriedade. Os embriões eram envasados em palhetas de 0,5 mL em meio H-SOF e lacrados com lacradores de palheta próprios. O meio H-SOF é semelhante ao meio SOF, porém, acrescido de uma substância, hepes, que age como tampão, permitindo que a palheta com o embrião fique sem a presença de gás e possa ser transportado na transportadora de embrião até a propriedade sem alterar a integridade do mesmo. Na figura 8 estão representadas as palhetas de embrião sendo colocado na transportadora para a realização da TE.

3.2.10 Transferência de Embrião (TE)

A transferência de embrião consiste em depositar o embrião produzido in vitro após o procedimento de OPU e PIV no terço médio final do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo, realizada pelo método transcervical. A transferência de embrião deve ser feita no dia 7 (D7), ou seja, 7 dias após a FIV (D0), onde os embriões a serem transferidos devem estar na fase de blastocisto inicial e expandido. Os embriões que estiverem na fase de blastocisto em eclosão também são transferidos quando há mais receptoras do que embriões.

O procedimento de transferência de embriões não foi acompanhada durante o estágio curricular supervisionado.

16 3.2.11 Envase e Criopreservação

Atualmente, dois métodos são utilizados para a criopreservação de embriões: congelamento lento ou clássico e vitrificação. O congelamento clássico tem a vantagem de usar baixas concentrações de crioprotetores, entretanto permite a formação de cristais de gelo (efeito solução), que, em maior ou menor escala, resultarão em lesões às membranas e organelas. A queda da temperatura é controlada mantendo-se uma curva constante até a atingir a temperatura de -32°C, quando as palhetas contendo os embriões são mergulhadas no nitrogênio líquido (DODE et al, 2013). Os embriões alcançam seu equilíbrio osmótico antes de começar a diminuição da temperatura e o mantém durante o resfriamento, este, é realizado lentamente permitindo os embriões se contrair e ceder água, em resposta ao incremento gradual da concentração da solução extracelular. Esta desidratação ocorre pelo agente crioprotetor, que são substâncias de baixo peso molecular que podem penetrar no embrião através da membrana plasmática. Cada crioprotetor tem um mecanismo próprio de ação, seus efeitos geralmente são estabilizar as membranas celulares, produzir a saída de água intracelular e reduzir a concentração de eletrólitos do meio extracelular (CABODEVILA e TERUEL, 2008).

Na vitrificação se utilizam altas concentrações de crioprotetores, os quais formam uma solução viscosa que, durante o resfriamento, faz com que a água da célula se solidifique em estado vítreo, sem a formação de cristais de gelo (VAJTA e NAGY, 2006 apud DODE et al, 2013). Entretanto, a toxicidade dos crioprotetores é tanta, que as células só podem ser expostas a essa solução por um período muito curto de tempo e/ou um volume mínimo de solução (Vajta et al., 1998 apud DODE et al, 2013).

4 CONCLUSÃO

A PIV é uma ferramenta que acelera o melhoramento genético em rebanhos de alo valor e encurtar o intervalo entre gerações, facilitando as observações comparativas entre os produtos dos diferentes acasalamentos e promovendo uma rápida seleção dos animais mais produtivos. A sua aplicação chave está na utilização de fêmeas a partir dos seis meses de idade, gestantes até o terceiro mês, em período pós-parto, vacas com subfertilidade adquirida e vacas senis poderem ser utilizadas como doadoras de oócitos. Quando associada com a OPU tem-se a vantagem da não utilização de hormônios para a recuperação de oócitos, aumentando desta forma a vida reprodutiva das doadoras e reduzindo o intervalo de produção dos embriões.

A otimização da técnica envolve a produção tanto de embriões de boa qualidade, pois a eficiência baixa pode ser em decorrência da qualidade inferior dos embriões produzidos in vitro em comparação aos in vivo, quanto em números cada vez mais expressivos e a diminuição de problemas de operação, isso certamente contribuirá para o decréscimo do custo operacional da PIV, que ainda é alto em decorrência dos materiais e equipamentos utilizados, o que possibilitará a difusão dessa técnica visando o aumento da produtividade.

18 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CABODEVILA, J. TERUEL, M. Criopreservação de embriões bovinos. In: PALMA, A.G. Biotecnología de la reprodución. Mar del Plata: el autor, 2008. edição 2

DODE, M.A.M. et al. Criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, v.37, n.2, p.145-150, abr-jun 2013

LIMA, J. M. P. et al. Progresso metodológico e sua influência na produção in vitro de embriões bovinos no Brasil. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 38, n. 3, p. 135140, 2014.

MALEKI, E.M. et al. Effects of Crocin Supplementation during In Vitro Maturation of Mouse Oocytes on Glutathione Synthesis ond Cytopasmic Maturation. International Journal of Fertility and Sterility, v.10, n.1, Apr-Jun 2016, Pag 53-61, 2015.

MARTINS, C.F. O impacto da transferência de embriões e da fecundação in vitro na produção de bovinos no Brasil, 2010.

MELLO, R. R. C. et al. Produção in vitro (PIV) de embriões em bovinos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 40, n. 2, p. 58-64, 2016.

NEVES, J. P.; MIRANDA, K. L.; TORTORELLA, R. D. Progresso científico em reprodução na primeira década do século XXI. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, p. 414-421, 2010.

PALMA, A.G. Producción in vitro de embriones bovinos. In: Biotecnología de la reprodución ed. 2. p. 699. Mar del Plata: el autor, 2008.

SANTOS, J.F.D. et al. A produção In Vitro de embriões bovinos no Brasil. XI SEZUS Semana Academica do Curso de Zootecnia. Universidade Estadual de Goiás. 2017.

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ZÚCCARI, C. E. S. N. et al. Seleção em gradientes de Percoll® sobre os parâmetros

espermáticos do sêmen bovino congelado. Revista Brasileira de Saúde e Produção animal, v. 9, n. 2, p. 358-366, 2008.

20 6. CONCLUSÃO

O Estágio Curricular Obrigatório é uma ferramenta de extrema importância que proporcionou uma aproximação entre o estudante e o mercado de trabalho, a oportunidade de colocar em prática a teoria estudada durante a faculdade e fazer contato com profissionais da área.

Durante o estágio na In vitro Brasil consegui colocar em prática técnicas já estudadas durante a faculdade e conhecer o mercado de trabalho que a produção in vitro de embriões está inserido. Tive a oportunidade de conhecer técnicos de extrema qualidade e fazer contatos com profissionais de excelência.

Protocolo 1 – SOF

Figura 1 – Linha do tempo das etapas da FIV com o meio SOF (Protocolo 1). Fonte: In Vitro Brasil

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Figura 3 – Eppendorfs preparados e identificados com o nome do touro. Fonte: In Vitro Brasil

Figura 5 – Cultivo sendo realizado após 24 horas da FIV Fonte: In Vitro Brasil

Protocolo 2 – c4

Figura 6 – Linha do tempo das etapas da FIV com o meio C4 (Protocolo 2). Fonte: In Vitro Brasil

Figura 7 – Esquema da palheta de envase de embriões. Fonte: In Vitro Brasil

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