Síntese e avaliação das atividades antimicrobiana e anti-T.Cruzi de derivados nitroariltiossemicarbazônicos

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. SÍNTESE E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTI-T.CRUZI DE DERIVADOS NITROARILTIOSSEMICARBAZÔNICOS. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. DYEGO REVORÊDO DE CARVALHO SILVA. RECIFE, PE, BRASIL 2010.

(2) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. SÍNTESE E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTI-T.CRUZI DE DERIVADOS NITROARILTIOSSEMICARBAZÔNICOS. por. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva. Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da UFPE, como requisito parcial para obtenção do grau em MESTRE em Ciências Farmacêuticas.. Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani. RECIFE-PE, BRASIL 2010. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(3) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. Silva, Dyego Revorêdo de Carvalho Síntese e avaliação das atividades antimicrobiana e anti-T.Cruzi de derivados nitroariltiossemicarbazônicos / Dyego Revorêdo de Carvalho Silva. – Recife: O Autor, 2010. 159 folhas: il., fig,, esquemas. ; 30 cm. Orientador: Dalci José Brondani. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010. Inclui bibliografia e anexos. 1. Tiossemicarbazonas. 2. Chagas. 3. Atividade Antimicrobiana. 4. Atividade Anti-T.Cruzi. 5. Nitrocompostos. I. Brondani, Dalci José.. 615.31. CDU (20.ed.). II.Título.. UFPE CCS2011-193. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(4) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS LABSINFA – LABORATÓRIO DE PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE FÁRMACOS. Recife, 02 de dezembro de 2010. Defesa de Dissertação de Mestrado defendida e APROVADA por decisão unânime, em 02 de dezembro de 2010 e cuja Banca Examinadora foi constituída pelos seguintes professores.. PRESIDENTE ORIENTADOR E EXAMINADOR INTERNO: Prof. Dr. Dalci José Brondani (Deptº de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE Assinatura: SEGUNDO EXAMINADOR INTERNO: Profa. Dra. Janete Magali de Araújo ( Deptº de Antibióticos da Universidade de Pernambuco – UFPE) Assinatura: PRIMEIRO EXAMINADOR EXTERNO: Profa. Dra. Ivani Malvestiti ( Deptº de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE) Assinatura:. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(5) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins. VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva. PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado. DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. José Tadeu Pinheiro. CHEFFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Dalci José Brondani. COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto. VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Profa. Dra. Beate Saegesser Santos. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(6) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. DEDICATÓRIA. À minha mãe Rosely, uma verdadeira batalhadora, pela dedicação e amor, pois sem isso não seria o que sou hoje; Ao meu pai Marconi (in memorian), pelo exemplo de respeito, caráter, sinceridade e dignidade; Ao meu irmão por todo companheirismo prestados nas horas que precisei; À minha namorada por todo amor, atenção e dedicação durante essa etapa da minha vida.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(7) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. “Quem sabe concentrar-se numa coisa e insistir nela como único objetivo, obtém, ao fim e ao cabo, a capacidade de fazer qualquer coisa” Mahatma Gandhi. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(8) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. AGRADECIMENTOS  A Deus, por me proporcionar vida e saúde, pois essas são os dois maiores presentes que um ser humano pode receber.  Ao meu orientador Prof. Dr. Dalci José Brondani pelos ensinamentos, paciência e ajuda de uma forma geral, além da amizade construída durantes esses anos.  Aos meus pais, Marconi e Rosely por tudo que aprendi durante a vida, pelo apoio e compreensão, além de carinho, amor e dedicação, me auxiliando a superar todas as dificuldades e conquistar meus sonhos. As reclamações nas horas pertinentes também foram importantes. Vocês são os alicerces do meu crescimento.  Ao meu irmão Thyago por todos os momentos de descontração vividos, como também pelos ensinamentos de determinação e superação.  A minha namorada Priscila por todo amor, dedicação, compreensão, respeito, atenção e principalmente paciência, com os meus aperreios, e motivação para continuar vencendo as etapas que a vida oferece.  Aos meus familiares, em especial os mais próximos que sempre estiveram presentes em todas as etapas da minha vida.  Aos amigos de Laboratório e agregados: Wan, Victor, Lucas Oliveira, Lecílio, Márcia, Andrea, Daura, Leilane, Jannyeres, Elany, Gevânio, Lucas Coelho, Suellen, Luiz Carlos, Danniel, Eraldo, Janessa e Tarcilla pela amizade construída nesse tempo, que tenho certeza que vai durar muito tempo.  Aos Doutorandos Marcos Veríssimo e Diogo Lúcio por todas as dúvidas sanadas, que não foram poucas, e também por ensinar vários ―macetes laboratoriais‖ que facilitaram muito a realização das tarefas.  A todos os professores que fazem parte do PPGCF por compartilharem conosco seus vastos conhecimentos, mostrando-me uma nova visão das coisas.  Aos todos os funcionários do DCFar, em especial Iguaci, Fátima, Conceição e Margareth.  À FACEPE, pela concessão do auxílio financeiro durante esses dois anos, possibilitando a realização do projeto.  Aos meus familiares, em especial os mais próximos que sempre estiveram presentes em todas as etapas da minha vida. Obrigado por todo momento compartilhado, de. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(9) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. apoio e força.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(10) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. SUMÁRIO. LISTA DE FIGURAS................................................................................................. XII LISTA DE ESQUEMAS............................................................................................. VX. LISTA DE TABELAS................................................................................................. XVIII. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................ XIX RESUMO..................................................................................................................... XXI. ABSTRACT................................................................................................................ XXII. CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E OBJETIVOS............................................................................................................... 23. I- 1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 24. I- 2. REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................... 26. I- 2.1 DOENÇA DE CHAGAS........................................................................... 26. I- 2.1.1 Generalidades da doença de Chagas................................................. 26. I- 2.1.2 Epidemiologia .................................................................................. 28. I- 2.1.3 Ciclo Biológico................................................................................. 29. I- 2.1.4 Transmissão...................................................................................... 31. I- 2.1.5 Manifestações clínicas .................................................................... 33. I- 2.1.6. Tratamento e novos alvos terapêuticos............................................ 35. I- 2.2 QUÍMICA DAS TIOSSEMICARBAZONAS........................................ 41. I- 2.2.1 Tiossemicarbazonas- Aspectos Químicos......................................... 41. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(11) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. I- 2.2.2 Síntese de tiossemicarbazonas.......................................................... 42. I- 2.2.3 Tiossemicarbazonas e seus metais complexos.................................. 52. I- 2.3 TIOSSEMICARBAZONAS E SUAS APLICAÇÕES FARMACOLÓGICAS........................................................................................ 57. I- 2.3.1 Atividade antiviral........................................................................... 57 I- 2.3.2 Atividade Antibacteriana.................................................................. 59. I- 2.3.3 Atividade Antifúngica...................................................................... 60. I- 2.3.4 Atividade Antitumoral...................................................................... 61. I- 2.3.5 Atividade antiprotozoária.................................................................. 62. I- 2.3.6 Atividade antichagásica.................................................................... 64. I- 3. OBJETIVOS...................................................................................................... 68 I- 3.1 Objetivo Geral............................................................................................. 68. I- 3.2 Objetivos Específicos................................................................................. 68. CAPÍTULO II: OBTENÇÃO DOS DERIVADOS NITROARILTIOSSEMICARBAZÔNICOS........................................................................ 69. II- 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 70. II- 2. METODOLOGIA ............................................................................................ 70 II- 2.1 Procedimento Geral de Obtenção dos Aril-aldeídos Nitrados................... 70. II- 2.2 Procedimento Geral de Obtenção das Nitro-Aril tiossemicarbazonas........ 71. II- 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 73. CAPÍTULO III: AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS.................... 89. III- 1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 90. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(12) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. III- 2. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA .............................................................. 90. III- 2.1 Metodologia.............................................................................................. 90 III- 2.1.1 Método da difusão em discos de papel........................................... 90. III-2.1.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e Concentração Mínima Bacteriostática (CMB)............................................. 93. III- 2.2 Resultados e discussão.............................................................................. 93 III-. 3.. ATIVIDADE. ANTICHAGÁSICA. E. AVALIAÇÃO. DA. CITOTOXICIDADE.................................................................................................. 96 III- 3.1 Metodologia.............................................................................................. 96 III- 3.1.1 Ensaio de citotoxicidade dos compostos em células esplênicas..... 96 III- 3.1.2 Avaliação da atividade dos compostos frente ao T. cruzi................ 97. III- 3.2 Resultados e discussão.............................................................................. 97. CAPÍTULO IV: CONCLUSÕES E PERPESCTIVAS........................................... 106. IV-. 1. CONCLUSÕES........................................................................................... 107. IV-. 2. PERPESCTIVAS ........................................................................................ 108. CAPÍTULO V: PARTE EXPERIMENTAL. 109. V- 1. PARTE EXPERIMENTAL............................................................................... 110. V- 1.1 Materiais e Métodos................................................................................... 110 V- 1.1.1Cromatografias.................................................................................. 110 V- 1.1.2 Pontos de Fusão................................................................................ 110. V- 1.1.3 Espectroscopias de IV, RMN 1H e RMN 13C................................ 110. V- 1.1.4 Equipamentos................................................................................... 110. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(13) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. V- 1.1.5 Reagentes e solventes....................................................................... 111. V- 1.2. Procedimentos Experimentais............................................................ 111 V- 1.2.1 Síntese e Caracterização estrutural......................................... 111 V- 1.2.2 Avaliação da Atividade Antibacteriana................................... 125. V- 1.2.2.1 Metodologia............................................................. 125 V- 1.2.3 Avalização da atividade anti- T.cruzi....................................... 126. V- 1.2.3.1 Metodologia............................................................. 126 V- 1.2.4 Obtenção de células esplênicas de camundongos isogênicos e Ensaio de Citotoxicidade.................................................................... 126. V- 1.2.4.1 Metodologia............................................................. 126 Referências Bibliográficas......................................................................................... 128 ANEXOS...................................................................................................................... 142. ANEXO A: Espectros de IV dos derivados obtidos………………………………. 143. ANEXO B: Espectros RMN 1H................................................................................. 149. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(14) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Número de novos medicamentos desenvolvidos entre os anos de 1975 e 2004................................................................................................................................ 24. Figura 2: Estrutura química do Benznidazol................................................................ 25. Figura 3. Barbeiro (Triatoma infestans): inseto transmissor da doença de Chagas........ 27. Figura 4: Fatores predisponentes para o aparecimento da doença de Chagas: casas de pau-a-pique...................................................................................................................... 27. Figura 5: Estimativa da população global afetada pelo Trypanosoma cruzi, 2009........ 29. Figura 6: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi – A: Fibras musculares cardíacas infestadas pela forma amastigota; B: Forma epimastigota e C: Forma tripomastigota.................................................................................................................. 30. Figura 7: Ciclo biológico da doença de Chagas............................................................ 31. Figura 8: A: Sinal de Romaña; B: chagoma de inoculação........................................... 33. Figura 9: Coração de pacientes que desenvolveram doença de Chagas e morreram por: (A) morte súbita, (B) megacólon ou mega-esôfago e (C) insuficiência cardíaca congestiva....................................................................................................................... 34. Figura 10: Subestruturas químicas fundamentais de nitrocompostos empregados em terapêutica...................................................................................................................... 36. Figura 11: Estrutura molecular da nitrofurazona.......................................................... 36. Figura 12: Fármacos utilizados na terapia antichagásica.............................................. 37. Figura 13: Estrutura química das tiossemicarbazonas................................................... 40. Figura 14: Representação das conformações das tiossemicarbazonas........................... 41. Figura 15: Representação dos estereoisômeros E e Z das Tiossemicarbazonas............. 42. Figura 16: Representação das duas formas tautoméricas das TSCs................................ 52. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(15) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. Figura 17: Estruturas químicas dos compostos sintetizados por Teitz et al., 1994........ 58. Figura 18: Estrutura química do composto 3 sintetizado por Finkielsztein, 2008...... 58. Figura 19: Estrutura química dos compostos sintetizados por Khan et al., 2007........... 59. Figura 20: Representação geral dos compostos sintetizados por Guzel et al., 2008 que obtiveram melhor atividade...................................................................................... 60. Figura 21: Estruturas químicas das TSCs com atividade antifúngica segundo Opletalová et al., 2008..................................................................................................... 61. Figura 22: Pró- fármaco sintetizado a partir do 3-AP..................................................... 62. Figura 23: Estrutura química dos compostos sintetizados por Dilovic et al., 2008 com melhores atividades.................................................................................................. 62. Figura 24 Estrutura química dos compostos sintetizados por Bhart, 2002..................... 63. Figura 25: Estruturas químicas dos compostos sintetizados por Abid e grupo, 2000.... 63. Figura 26: Estrutura química do protótipo antimalárico segundo Duan & Zhang, 2010.................................................................................................................................. 64 Figura 27: Mecanismo de inibição da TCC por derivados aril-tiossemicarbazônicos proposta por Du et al., 2002............................................................................................. 65 Figura 28: Compostos sugeridos como inibidores da TCC segundo Chiyanzu et al., 2003.................................................................................................................................. 65. Figura 29: Estrutura Química dos compostos sintetizados por Aguirre e grupo, 2004.. 66. Figura 30: Estrutura química do composto que apresentou melhor atividade antichagásica segundo Fujii e colaboradores 2005.......................................................... 66 Figura 31: Estrutura química dos compostos sintetizados por Siles e grupo, 2006........ 67. Figura 32: Espectro de RMN 1H do composto 2b........................................................... 80. Figura 33: Espectro de RMN 13C do composto 2b......................................................... 81. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(16) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. Figura 34: Espectro de RMN 1H do composto 2d.......................................................... 82. Figura 35: Espectro de RMN 1H do composto 2g. ......................................................... 83. Figura 36: Espectro de RMN 1H do composto 2i. ......................................................... 84. Figura 37: Espectro de IV do composto 2b. ................................................................... 85. Figura 38: Espectro de IV do composto 2j. .................................................................... 86. Figura 39: Espectro de RMN 1H do composto 2j. ......................................................... 87 Figura 40: Estrutura química dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos 92 sintetizados....................................................................................................................... Figura 41: Mecanismo de ação das tiossemicarbazonas proposto por Du e colaboradores (2002)........................................................................................................ 99. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(17) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. LISTA DE ESQUEMAS. Esquema 1: Rota de obtenção de tiossemicarbazonas a partir de tiossemicarbazidas...... 43. Esquema 2: esquema da síntese do 1-ciclohexilideno-N (1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol3-ilideno) tiossemicarbazona.............................................................................................. 43. Esquema 3: Rota sintética de bis-[N(4)-tiossemicarbazonas] a partir do 1-fenilglioxal.. 44. Esquema 4: Reação global da isatina com N-[4-(4‘-clorofenil) tiazol-2-il] tiossemicarbazida, produzindo tiossemicarbazona............................................................. 44. Esquema 5: Rota sintética de tiossemicarbazonas a partir de aldeídos naturais ((3R)(+) citronelal...................................................................................................................... Esquema. 6:. Rota. sintética. de. novas. tiossemicarbazonas. a. partir. 45. de. ferrocenilchalconas............................................................................................................. 45. Esquema 7: Rota de síntese de metil-piruvatos tiossemicarbazonas................................. 45. Esquema. 8:. Rota. de. síntese. do. composto. pirazinaformamida. N(4)- 46. metiltiossemicarbazona..................................................................................................... Esquema 9: Rota de síntese do derivado tiossemicarbazônico da 3-(5-nitrofurfuril) acroleína.............................................................................................................................. 46. Esquema 10: Rota de síntese do composto 1,3-difenil-4-(4‘-fluro)benzal-5-pirazolona4-etil tiossemicarbazona (DP4FBP–ETSC)..................................................... 47. Esquema 11: Rota de síntese de várias α-silil-substituidas tiossemicarbazonas............... 47. Esquema 12: Rota de síntese de uma série de 1-metil-2,6-diarilpiperidina-4-ona tiossemicarbazonas............................................................................................................. 48 Esquema 13: Rota de síntese do composto (5-Bromobenzofuran-2-il)(3-metil-3mesitilciclobutil) cetona tiossemicarbazona....................................................................... 48. Esquema 14: Rota de síntese de tiossemicarbazonas oriundas de derivados do. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(18) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. salicilaldeído....................................................................................................................... 49. Esquema 15: Rota de síntese de tiossemicarbazonas a partir de hidrazinas..................... 49 Esquema 16: Rota de síntese de bis-tiossemicarbazonas a partir do 3,5´diacetil-1,2,4triazol.................................................................................................................................. 49. Esquema 17: Rota de síntese de tiossemicarbazonas esteroidais...................................... 50. Esquema 18: Rota de síntese uma série de 2-etoxi-3-metoxi-benzaldeído tiossemicarbazonas............................................................................................................. 50 Esquema 19: Rota de síntese novas 1-indanona-tiossemicarbazonas.. 51. Esquema 20: Rota de síntese do (E)-2-(2,4-dihidroxi-benzilideno) tiossemicarbazona, com rendimento de 87%..................................................................................................... 51. Esquema 21: Rota de síntese do (E)-2-[(1H-indol-3-il) metileno] tiossemicarbazona com rendimento de 67%.................................................................................................... Esquema. 22:. Rota. de. síntese. de. 51. 2,4-diaril-3-azobiciclo[3.3.1]nonano-9-ona. tiossemicarbazonas............................................................................................................. 52 Esquema 23: Rota sintética de complexos Pt/TSC segundo Horton & Varela................. 53 Esquema 24: Rota de síntese de complexos Oxovanádio/TSC......................................... 54. Esquema 25: Rota de síntese de complexos de Rênio/TSC.............................................. 54. Esquema 26: Rota de síntese de complexos de Pd II segundo Shailendra........................ 55. Esquema 27: Rota de síntese de complexos de Ni II/ TSC............................................... 55. Esquema 28: Rota de síntese de complexos de Pd segundo Kostas................................. 56. Esquema 29: Rota de síntese de complexos de Mo/TSC segundo Vrdoljak..................... 56. Esquema 30: Rota de Nitração dos Aril-aldeídos em presença de CHCl3........................ 71. Esquema 31: Rota de Nitração dos Aril-aldeídos em presença de H2SO4........................ 71. Esquema 32: Rota de obtenção das Nitro-Aril tiossemicarbazonas.................................. 72. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(19) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. Esquema 33. Rota geral de síntese da bis-tiossemicarbazona 2g e 2l............................... 73. Esquema 34: Mecanismo de condensação de compostos carbonilados com a tiossemicarbazida................................................................................................................ 78. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(20) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Principais efeitos colaterais observados na terapia específica da Doença de Chagas.............................................................................................................................. 39. Tabela 2: Estruturas químicas dos derivados 2a-2l e suas respectivas nomenclaturas... 74. Tabela 3: As principais bandas de absorção dos grupos inerentes as moléculas sintetizadas....................................................................................................................... 79. Tabela 4: Valores das ZMI dos compostos testados, em mm......................................... 94. Tabela 5: Valores da Concentração Mínima Inibitória e Concentração Mínima Bactericida para os compostos 2c e 2h frente às cepas avaliadas em µg/mL………….. 96. Tabela 6: Atividade anti-T. cruzi dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos............ 98. Tabela 7: Citotoxicidade dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos........................ 103. Tabela 8: Relação IC50 X Citotoxicidade........................................................................ 105. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(21) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. TSC:. Tiossemicarbazona. Bdz-. Benznidazol. Nfx :. Nifurtimox. TCC-. Cruzáina do T. Cruzi. TR-. Tripanotiona Redutase. DCT-. Doença de Chagas Transfusional. HIV:. Human Imunodeficiency virus (Vírus da Imunodeficiência Humana). DCA:. Doença de Chagas aguda. IC:. Insuficiência Cardíaca. ACTH:. Hormônio Adrenocorticotrófico. NO2:. Grupo nitro. DNA:. Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxiribonucléico). RMN –. Ressonância Magnética nuclear. CCD:. Cromatografia em camada delgada. EtOH:. Álcool etílico. MeOH:. Metanol. p-TsOH:. Ácido para-tolueno sulfônico. EtOAc:. Acetato de etila. Acac:. Acetil-acetonato. DMSO:. Dimetil sulfóxido. t-BuOK:. Tert-butóxido de Potássio. CMI:. Concentração mínima inibitória. CMB:. Concentração mínima Bacteriostática. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(22) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. IV:. Infra-vermelho. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(23) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. RESUMO. A doença de Chagas apresenta-se como um dos maiores problemas de Saúde Pública em países da América Latina, chamados países endêmicos. Estima-se que 18 a 20 milhões de pessoas estejam infectadas e que outros 100 milhões vivam em áreas de risco de contaminação. No Brasil, apenas o benznidazol (Bdz) está disponível para o tratamento da doença, e apesar de seu uso clínico, este fármaco apresenta efeitos colaterais severos, sendo ativo apenas na fase aguda da doença. Neste contexto, faz-se necessário de novas substâncias com potencial atividade anti-Tcruzi. Dentre os alvos biológicos considerados como mais promissores no combate a doença de Chagas, encontram-se enzima Cruzaína ou cruzipaína do T. cruzi (TCC) e a tripanotiona redutase (TR). As tiossemicarbazonas, grupo de moléculas com amplo perfil farmacológico, vêm sendo relatadas na literatura como potentes inibidores da TCC, principalmente as aril-tiossemicarbazonas. Nitrocompostos também tem sido descritos como potentes inibidores irreversíveis da TR em condições anaeróbicas. Focando-se nessas características, neste trabalho sintetizamos uma série de onze derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos e avaliamos seu potencial antimicrobiano e anti- T. cruzi, assim como as suas toxicidades. Estes derivados (2a-2l) foram sintetizados a partir de aril-aldeídos previamente nitrados e tiossemicarbazida, substituida ou não, em etanol sob temperatura ambiente, acrescidas de quantidades catalíticas de HCl. A elucidação estrutural foi realizada através da análise dos dados espectroscópicos de RMN 1H,. 13. C e IV. Em referência as. atividades biológicas, os testes antimicrobianos foram realizados in vitro, frente aos da coleção do Departamento de Antibióticos da UFPE, onde se mediram as ZMI, CMB e CMI. A atividade anti- T. cruzi foi avaliada com parasitos das cepas Y, frente à forma evolutiva epimastigota. Para determinar o efeito antiproliferativo para T. cruzi, o ensaio colorimétrico MTT (metil tiazol tetrazólio) foi empregado, obtendo os valores de IC50 em μg/mL. A citotóxicidade foi avaliada em células esplênicas de camundongos utilizando-se o método de incorporação da timidina tritiada, sendo os valores obtidos em μg/mL. Dos onze derivados sintetizados e avaliados, o 2c, 2h e 2i obtiveram os melhores resultados nos testes antimicrobianos, com merecido destaque para o 2h. Este também se mostrou ativo nos testes anti- T. cruzi, sendo mais potente que o Bdz e possuindo a mesma citotoxicidade, sendo considerado um possível protótipo na terapêutica da Deonça de Chagas. Palavras-Chave: Tiossemicarbazonas, Doença de Chagas, Atividade antimicrobiana, Atividade antiT.Cruzi, Nitrocompostos.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(24) Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos. ABSTRACT. Chagas disease presents itself as a major public health problems in Latin America, called endemic countries. It is estimated that 18 to 20 million people are infected and another 100 million live in areas at risk of contamination. In Brazil, only benznidazole (Bdz) is available for the treatment of disease, and although its clinical use, this drug has severe side effects, being active only during acute illness. In this context, it is necessary to new substances with potential anti-Tcruzi activity. Among the biological targets deemed most promising in the fight against Chagas disease, there are cruzain enzyme, cruzipain of T. cruzi (TCC) and trypanothione reductase (TR). The thiosemicarbazones, group of molecules with broad pharmacological profile, have been reported in the literature as potent inhibitors of TCC, especially aryl thiosemicarbazones. Nitrocompounds also has been described as potent irreversible inhibitors of TR under anaerobic conditions. Focusing on these features, in this work we synthesized a series of eleven nitro-aryl thiosemicarbazones derivatives and we evaluated their potential antimicrobial and anti-T cruzi, as well as their toxicities. These derivatives (2a-2l) were synthesized from aryl aldehydes previously nitrated and. the. Thiosemicarbazones substituted or not, in ethanol at room temperature, together with catalytic amounts of HCl. Structural elucidation was performed by analysis of spectroscopic data of 1H, 13C and IV. With reference to the biological activities, antimicrobial tests were performed in vitro, against to the collection of the Antibiotics Department of UFPE, where he measured the ZMI, CMB and CMI. Anti-T. cruzi activity was performed with parasites from the Y strains, against to the evolving form called epimastigote. To determine the antiproliferative effect of T. cruzi, the MTT colorimetric assay (methyl thiazole tetrazolium) was used, obtaining the IC50 values in μg/mL. Cytotoxicity was evaluated in spleen cells of mice using the method of incorporation of tritiated thymidine, and the values obtained in μg/mL. Of the eleven derivatives synthesized and evaluated, 2c, 2h and 2i showed the best results in antimicrobial testing, with deserved attention for 2h. This last one was also active in testing anti-T. cruzi, being more potent than the BDZ and having the same cytotoxicity, therefore it can be considered a possible prototype in the treatment of Chagas Disease.. Keywords: Thiosemicarbazones, Chagas disease, Antimicrobial activity, anti- T.Cruzi activity, nitrocompounds.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(25) 23. CAPÍTULO I. INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E OBJETIVOS. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(26) 24. 1. INTRODUÇÃO. Todo ano morrem mais de um milhão de pessoas em todo mundo vítimas de doenças intituladas negligenciadas. As opções de tratamento para estas patologias, quando disponíveis, são ineficazes e ultrapassadas, causando uma série de efeitos colaterais, além de não promoverem a cura definitiva. As doenças tropicais são os principais representantes das doenças negligenciadas, atingindo em sua grande maioria, pessoas muito pobres, distribuídas pelos países com baixo nível de desenvolvimento sócio-econômico. Levando-se em consideração que as pessoas afetadas por essas doenças não representam um mercado lucrativo para atrair investimentos necessários para a pesquisa e o desenvolvimento de novos medicamentos, essas doenças vêm sendo progressivamente marginalizadas por decisões dos responsáveis pelos programas de pesquisa, tanto no setor privado, quanto no setor público. Como podemos observar na Figura 1, entre 1975 e 2004, apenas 21 medicamentos foram registrados para doenças tropicais e tuberculose, ainda que estas doenças constituam mais de 11% da carga global de doença. Durante o mesmo período, 1.535 medicamentos foram registrados para outras doenças1.. Figura 1: Número de novos medicamentos desenvolvidos entre os anos de 1975 e 2004.. Por sua grande difusão, pela gravidade das manifestações que pode apresentar e pela complexidade de sua profilaxia, a doença de Chagas, causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, apresenta-se como uma doença extremamente negligenciada, representando grave e alarmante problema sanitário2. Mesmo após mais de 100 anos da sua descoberta pelo pesquisador Carlos Chagas, o tratamento específico anti- T. Cruzi permanece inapropriado e irresoluto, permitindo apenas efeitos supressivos, podendo diminuir a parasitemia no curso do tratamento, não garantindo a cura definitiva3.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(27) 25. O único fármaco atualmente disponível para a quimioterapia antichagásica no Brasil é o Benznidazol (N-benzil-2-nitroimidazol-1-acetamida, Bdz, Figura 2), agindo através da redução do seu grupo nitro e formação de ligações covalentes com macromoléculas do T. cruzi 4. É eficaz na fase aguda da doença, com excelentes taxas de cura na fase inicial da doença, e na infecção congênita. No entanto, é ineficaz no estágio crônico da doença e está associada com efeitos colaterais severos, os quais podem resultar na interrupção do tratamento5. Até o ano de 2007, somente uma única formulação farmacêutica do Bdz (comprimidos de liberação imediata na dose de 100 mg) estava disponível no mercado, o que tornava não indicado o tratamento para crianças (no qual a dose recomendada é de 25 mg por dia) e para idosos, que em alguns casos tem dificuldade em deglutir, exemplificando mais uma característica agravante desta monoterapia5. Tendo em vista todo esse panorama que define a terapêutica da doença de Chagas como algo ineficaz, ultrapassado e inapropriado, têm-se cada vez mais intensificada a necessidade de recorrer a novas alternativas terapêuticas para a obtenção de fármacos mais seguros, ativos e com alvos biológicos mais específicos, principalmente para a fase crônica da doença.. O. N N. N. NO2. H. Benznidazol Figura 2: Estrutura química do Benznidazol.. As tiossemicarbazonas apresentam um amplo perfil farmacológico e constituem uma classe importante de compostos cujas propriedades têm sido extensivamente estudadas na Química Medicinal. Para o desenvolvimento de fármacos antichagásicos, as pesquisas estão sendo focadas para a inibição da enzima Cruzaína ou cruzipaína do T. cruzi (TCC)7 e a Tripanotiona redutase (TR)8. A porção tiossemicarbazona presente em alguns compostos descritos na literatura, mostra-se como um grupo farmacofórico que apresentam potencial atividade inibitória da TCC. 9,10. , principalmente aril-tiossemicarbazonas, descritos desde 2002. como potentes agentes tripanocidas e de baixa citotoxicidade11.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(28) 26. Segundo Du e colaboradores (2002), a interação tiossemicarbazona-TCC, acontece via ataque covalente do resíduo Cys25 da TCC em direção ao carbono da tiocarbonila e transferência de um próton do resíduo His159, formando um derivado tetraédrico. Em estudos de ―docking‖ realizados em 2006 e 2007, Leite e colaboradores, comprovaram a afinidade das aril-tiossemicarbazonas. com. a. TCC,. revelando. a. capacidade. inibitória. que. as. tiossemicarbazonas possuem. Tendo em vista todos esses estudos que demonstram e comprovam a atividade das tiossemicarbazonas, em especial aril-tiossemicarbazonas, como potentes armas na terapêutica contra o T. cruzi, nesse trabalho decidimos aliar essa notável característica com a conhecida atividade do grupamento nitro como parasitóforo, presente no Bdz, através do planejamento e síntese de novos derivados nitro-ariltiossemicarbazônicos, os quais possam apresentar real atividade contra o T. cruzi, principalmente no estágio crônico da doença.. I- 2. REVISÃO DA LITERATURA. II- 2.1 DOENÇA DE CHAGAS. II- 2.1.1 Generalidades da doença de Chagas. A doença de Chagas constitui-se, pela sua vasta distribuição, altos índices de prevalência e gravidade de evolução, um dos maiores problemas de Saúde Pública em países do cone sul das Américas12,13. Estima-se que sejam de 18 a 20 milhões os indivíduos infectados nessa região e que outros 100 milhões vivam em áreas de risco de contaminação14. Esta enfermidade foi descoberta e descrita pelo grande cientista Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas em Abril de 1909, sendo seu agente etiológico, o protozoário Trypanosoma cruzi, por ele assim nomeado em homenagem a Oswaldo Cruz, e o inseto vetor, um triatomíneo conhecido popularmente como barbeiro (Figura 3) pelo hábito de picar o rosto de suas vítimas, descobertos previamente no final de 190815.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(29) 27. Figura 3. Barbeiro (Triatoma infestans): inseto transmissor da doença de Chagas.. O parasita possui um complexo ciclo biológico passando por hospedeiros vertebrados e invertebrados, e apresenta diferentes formas evolutivas subdivididas em flageladas (epimastigota e tripomastigota) e aflagelada (amastigota). A doença é um exemplo típico de uma injúria resultante das alterações produzidas pelo ser humano ao meio ambiente. O protozoário responsável pela parasitose vivia restrito à situação silvestre, circulando entre mamíferos do ambiente natural através do inseto vetor ou, também, por via oral através da ingestão de vetores e mamíferos infectados. O homem se fez incluir no ciclo epidemiológico da doença, oferecendo ao vetor hemíptero vivendas rurais de péssima qualidade (Figura 4), as chamadas casas de pau-a-pique16.. Figura 4: Fatores predisponentes para o aparecimento da doença de Chagas. As formas mais importantes de transmissão da doença de Chagas ainda são as vetoriais, seja via lesão resultante da picada, seja por mucosa ocular ou oral. Contudo, apresenta também grande importância epidemiológica a transmissão transfusional e a congênita. Mais recentemente, houve surtos de transmissão por meio da via oral, devido ingestão de alimentos contaminados.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(30) 28. Embora considerada eminentemente rural, atualmente a doença de Chagas representa um problema também para os centros urbanos. Admite-se que dos 3,4 milhões de infectados existentes no Brasil, 60% estejam vivendo no espaço urbano em grandes centros como Grande São Paulo (cerca de 300 mil) e Grande Belo Horizonte (cerca de 100 mil). A doença de Chagas é a terceira mais importante causa mortis entre as doenças infecciosas e parasitárias (13,6%) e o número absoluto de óbitos ainda é muito relevante, chegando a cerca de 6000 por ano. Os estados de Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Bahia, Paraná, Rio Grande do Sul e os da região Nordeste apresentam a mais alta endemicidade no Brasil 17,18. Enquadrando-se no setor das doenças negligenciáveis, a doença de Chagas não representa um mercado lucrativo para atrair investimentos necessários para a pesquisa e o desenvolvimento de novos medicamentos, sendo por este motivo, progressivamente marginalizadas por decisões dos responsáveis pelos programas de pesquisa, tanto no setor privado, quanto no setor público1.. II- 2.1.2 Epidemiologia. Endêmica em 21 países, a doença de chagas afeta atualmente cerca de 18 a 20 milhões de pessoas distribuídas pelo México, Américas Central e do Sul. Globalmente é descrita como a terceira mais importante doença parasitária, sendo responsável por significativos encargos econômicos e de saúde pública na América Latina19. Estimativas informam que essa enfermidade mata aproximadamente 14 mil pessoas por ano nessa região, matando mais do que qualquer outra doença negligenciada, inclusive a malária. Relata-se também que outros 100 milhões de indivíduos vivam em áreas de risco de contaminação14,20. No final da década de setenta, uma alta incidência de casos da doença de Chagas foi observado no Brasil, chegando a cerca de 100 mil novos casos por ano. Hoje se estima que cerca de 3,4 milhões de pessoas estejam infectadas 21,22. Atualmente, casos e surtos podem ser observados em diferentes estados (Bahia, Ceará, Piauí, Santa Catarina, São Paulo), sendo sua maior a freqüência na região da Amazônia Legal, que engloba os estados do Amazonas, Maranhão, Mato Grosso, Amapá, Pará, Tocantins23. Recentes estudos mostraram um crescimento rápido e notável em países fora da América Latina, intitulados países não-endêmicos (Austrália, Canadá, Espanha e E.U.A). Isto se deve ao advento da migração de aproximadamente 15 milhões de pessoas vindas de área conhecidamente endêmicas 24,25.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(31) 29. Figura 5: Estimativa da população global afetada pelo Trypanosoma cruzi, 2009.. Estima-se que nos EUA existam 300.167 pessoas infectadas, sendo este valor aproximadamente seis vezes maior que os casos relatados na Espanha26,27. Na Europa Ocidental, em 2008 foi relatado que o numero total de pessoas infectadas vivendo nesta região é de 25 a 40 mil, tendendo a aumentar 28,29,30,31.. III-. 2.1.3 Ciclo Biológico. O ciclo biológico do T. cruzi é do tipo heteroxênico, passando o parasito por uma fase de multiplicação intracelular no hospedeiro vertebrado (homem e mamíferos pertencentes a sete ordens diferentes) e extracelular no inseto vetor (triatomíneos) 32. Este ciclo compreende três estágios ou formas principais, dotadas de características morfológicas e biológicas distintas. As formas evolutivas envolvidas nesse ciclo são a amastigota, tripomastigota e epimastigota. Os amastigotas possuem formas arredondadas ou ovóides, imóveis, desprovidas de flagelo livre. Agrupam-se em "ninhos" na intimidade de tecidos diversos do hospedeiro vertebrado. Trata-se da forma de multiplicação do parasita no hospedeiro vertebrado e medem de 1,5 a 4 µm de diâmetro. Os tripomastigotas apresentam corpo alongado, com cerca de 20 µm de comprimento. São formas encontradas no sangue dos hospedeiros vertebrados e nas porções terminais do. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(32) 30. intestino dos vetores 33. A forma epimastigota, apresenta cerca de 20 µm de comprimento e trata-se da forma multiplicativa do parasita no intestino do triatomíneo, e é também a forma predominante em cultivo axênico, sendo por isso, mais comumente utilizada em estudos bioquímicos34.. A. B. C. Figura 6: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi – A: Fibras musculares cardíacas infestadas pela forma amastigota; B: Forma epimastigota e C: Forma tripomastigota. Considerando o mecanismo natural de infecção pelo T. Cruzi, os tripomastigotas metacíclicos eliminados nas fezes e urina do vetor, durante ou logo após o repasto sanguíneo, penetram pelo local da picada e interagem com células do sistema mononuclear fagocitário da pele ou mucosas. O parasita tem acesso facilitado ao interior do organismo pelo toque das mãos, já que a picada causa irritação local. Se a picada for próxima dos olhos ou da boca, o parasita pode penetrar diretamente pelas mucosas. Uma vez dentro do organismo, os tripomastigotas entram em uma variedade de células, dentro das quais se transformam em amastigotas. Nesse estágio, os parasitas reproduzem-se por fissão binária35,36,37. A seguir, ocorre a diferenciação dos amastígotas em tripomastigotas, que são liberados da célula hospedeira caindo no interstício. Estes tripomastigotas caem na corrente circulatória, atingem células de qualquer tecido ou órgão para cumprir novo ciclo celular. Por vezes, estes podem ser destruídos por mecanismos imunológicos do hospedeiro ou ainda serem ingeridos por triatomíneos, onde cumprirão seu ciclo extracelular32. No estômago do inseto triatomíneo, a forma tripomastigota transforma-se gradualmente em formas arredondadas, algumas com um longo flagelo colado ao corpo e outras com um curto flagelo, chamadas de esferomastigotas e epimastigotas, respectivamente. Em seguida, os parasitas migram para o intestino, onde se multiplicam como formas epimastigotas, o que pode ser observado cerca de 25 horas após o repasto sanguíneo. Posteriormente migram para a parte mais posterior, atingindo o reto, e transformam-se em tripomastigotas metacíclicos, que são eliminados junto com as fezes e urina do triatomíneo. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(33) 31. fechando assim o ciclo evolutivo do T. Cruzi 37. O ciclo evolutivo do T. Cruzi é demonstrado na Figura 7.. Figura 7: Ciclo biológico da doença de Chagas. I- 2.1.4 Transmissão. A doença de Chagas é transmitida nos países endêmicos principalmente pelo inseto Triatoma infestans, conhecido popularmente como barbeiro25,38,39. Relatos da literatura têm informado que a transmissão vetorial foi significativamente reduzida devido aos esforços de controle, como a Iniciativa do Cone Sul um dos maiores programas de cooperação internacional contra a doença de Chagas, criada em Brasília em julho de 1991. 40,41. Em nove de junho de 2006, durante sua primeira reunião anual, a Comissão da Iniciativa do Cone Sul, declarou formalmente que o Brasil está livre da transmissão da doença de Chagas pelo Triatoma infestans. O Uruguai foi o primeiro país do Cone Sul a conseguir, em 1997, a interrupção da transmissão vetorial42. De 100 milhões de pessoas que se estimava. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(34) 32. estarem em risco de contrair a doença nessa região, 60 milhões vivem agora sem esse risco 43. Levando em consideração este fato, as transfusões de sangue, transplantes de órgãos e as transmissões congênitas começam a representar riscos reais de transmissão da doença de Chagas 29. A Triagem das gestantes para a doença de Chagas durante os cuidados de saúde prénatal, especialmente quando eles nascem em uma área endêmica, tem importante papel para diminuir a incidência da transmissão de mãe para filho, a chamada transmissão congênita25. Este tipo de contaminação ocorre quando existem ninhos de amastígotas na placenta, que podem liberar tripomastigotas, chegando à circulação fetal32. Na América Latina, a doença de Chagas afeta cerca de dois milhões de mulheres em idades férteis, que são susceptíveis de transmiti-la para o seu feto44. Estimativas recentes indicam que na América do Norte, por ano, pelo menos 2.000 recém-nascidos estejam sujeitos a contraí-la45. A transmissão transfusional ganhou relativa importância epidemiológica nas duas últimas décadas, em função da migração de indivíduos infectados para os centros urbanos e da ineficiência no controle das transfusões, nos bancos de sangue23. A Prevalência de sangue para doação infectado por T. Cruzi na Europa e América do Norte varia muito, chegando a 0,62% na Espanha46. Recentemente, E.U.A., Espanha e França implementaram medidas para reduzir o risco transfusional através da seleção dos doadores de sangue e as estratégias de exclusão 31. . Comprovada nos anos 50 no Brasil, estima-se que no início da década de 80 cerca de. 20 mil novos casos de doença de Chagas transfusional (DCT) eram produzidos anualmente. Neste mesmo período, a prevalência média de 7,03% em candidatos à doação de sangue, teve este coeficiente diminuído para 3,18% na década de noventa e atualmente para 0,6% na hemorrede pública e de 0,7% na rede privada. O risco de transmissão transfusional da infecção chagásica no Brasil é 10-15 vezes aquela estimada para a infecção pelo HIV, HBV ou HCV, dependendo da região47. Ainda a nível de Brasil, uma Nota Técnica do Ministério da Saúde divulgada em 2007 revelou que a transmissão via oral vem mostrando alguma relevância, principalmente devido ao surto em Santa Catarina no ano de 2005. Nesse episódio foram identificados 45 casos suspeitos de Doença de Chagas Aguda (DCA) relacionados à ingestão de caldo de cana, 31 com confirmação laboratorial, sendo que cinco pacientes evoluíram para óbito. Nos anos de 2000, 2001 e 2004, ocorreram 57 casos de doença de DCA por. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(35) 33. transmissão oral; no período de 2005 a 2007, esses números somaram 301 casos. No ano de 2006 houve a confirmação de 115 casos de DCA, na região Norte e Nordeste, sendo 94 casos de transmissão via oral, devido ao consumo na maioria dos casos de açaí contaminado. Registrou-se também neste período surto pela ingestão de bacaba e de cana-de-açúcar 48. Em 2008, foram diagnosticados 94 casos de DCA no estado do Pará, dos quais 57 (65%) estavam envolvidos em transmissão oral; 20, no estado do Amapá, todos por provável transmissão oral e 7 no estado do Tocantins, 4 por transmissão oral (80%) e 1 vetorial23.. I- 2.1.5. Manifestações clínicas. A infecção chagásica humana pode se manifestar na forma aguda (sintomática ou assintomática), na forma crônica e indeterminada. Na maioria dos casos, a fase aguda da doença é oligossintomática, principalmente em adultos, não sendo valorizada pelo paciente ou pelo agente de saúde. Esta tem seu início evidenciado através das manifestações locais geradas quando o T. cruzi penetra na conjuntiva ou na pele, denominadas de sinal de Romaña e chagoma de inoculação, respectivamente (Figura 8). Estas lesões aparecem em 50% dos casos agudos dentro de 7-10 dias após a picada do barbeiro, regredindo em um ou dois meses3.. A. B. Figura 8: A: Sinal de Romaña; B: chagoma de inoculação. As manifestações gerais são representadas por febre, mal-estar geral, dor de cabeça, perda do apetite, fraqueza, edema localizado ou generalizado, inchaço de gânglios linfáticos (adenopatia), hepato-esplenomegalia. Em alguns pacientes, principalmente crianças ou indivíduos imunodeficientes, quadros meníngeos graves, alterações no eletrocardiograma e de Insuficiencia Cardíaca podem estar associados, chegando a óbito. É importante ressaltar que a gravidade da infecção depende também de outros fatores, como a virulência do parasito e o tamanho do inóculo 49,50,51. A fase aguda da doença pode durar de um mês a um ano, podendo. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(36) 34. o paciente evoluir para a fase crônica ou indeterminada. Após a fase aguda, os sobreviventes passam por um longo período assintomático, cerca de 10 a 30 anos, sendo esta fase chamada de indeterminada. Caracteriza-se por apresentar positividade de exames sorológicos e/ou parasitológicos, ausência de sintomas e/ou sinais da doença, eletrocardiograma convencional normal e coração, esôfago e cólon radiologicamente normais. Aproximadamente 50% dos pacientes chagásicos que tiveram a fase aguda evoluem para a fase indeterminada, que, apesar de assintomática e de apresentarem lesões muito discretas, pode causar morte súbita de alguns pacientes mais debilitados32. Cerca de um terço dos casos agudos da doença de Chagas alcança para a fase crônica. Esta, em alguns casos, segue imediatamente o período agudo. Em outros, instala-se depois da fase indeterminada, anteriormente descrita12,52. Pacientes nessa fase da doença apresentam manifestações clínicas diversas, afetando de forma irreversível um ou mais órgãos. A cardiopatia chagásica crônica e o aparecimento dos megas (megaesôfago e megacólon, principalmente) representam as formas clínicas de maior gravidade 53,54,55. Na forma cardíaca, o coração mostra-se macroscopicamente aumentado de volume e mais pesado do que o normal, com peso de 550 g em média e hipertrofia das paredes (Figura 9). Dentre os seus principais sintomas enquadram-se arritmias (75.000 casos/ano), insuficiência cardíaca, trombo-embolismo, insônia, congestão visceral e edema dos membros inferiores 32. As manifestações digestivas são representadas principalmente no Brasil e na Argentina pelos megas, onde aparecem alterações morfológicas e funcionais importantes, como, por exemplo, a incoordenação motora (aperistalse, discinesia) caracterizando o megaesôfago e o megacólon.. Figura 9: Coração de pacientes que desenvolveram doença de Chagas e morreram por: (A) morte súbita, (B) megacólon ou mega-esôfago e (C) insuficiência cardíaca congestiva. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(37) 35. No caso do megaesôfago (45.000 casos/ano), observa-se o aumento do diâmetro do órgão e alterações na motilidade, além de sintomas como dores epigástricas, regurgitação, hipertrofia das glândulas salivares, disfagia, pirose, soluço, tosse e sialose. Acomete mais o sexo masculino do que o feminino, sendo mais freqüente na zona rural endêmica. O megacólon (30.000 casos/ano) apresenta como principal característica a obstipação do órgão, podendo durar semanas, e a perfuração levando por vezes à peritonite 32,54, 56.. I- 2.1.6. Tratamento e novos alvos terapêuticos. A doença de Chagas, por sua grande difusão, gravidade das manifestações que pode apresentar e pela complexidade de sua profilaxia, representa grave e alarmante problema sanitário2. Mesmo após mais de 100 anos da sua descoberta, o tratamento específico anti- T. Cruzi permanece inapropriado e irresoluto, permitindo efeitos supressivos, podendo apenas diminuir a parasitemia no curso do tratamento, não garantindo, portanto, a cura definitiva3. Os primeiros compostos desenvolvidos experimentalmente para o tratamento específico da tripanossomíase americana, após a sua descoberta em 1909, foram o atoxyl (arsênico), a tintura de fucsina, o tártaro emético (antimonial pentavalente) e o cloreto de mercúrio. Todos estes compostos se mostraram ineficazes no tratamento proposto, além de exibirem uma alta toxicidade 5,57. Entre os anos de 1936 e 1960 diversos medicamentos foram testados na tentativa de obter-se êxito, porém estes apenas obtiveram resultados negativos ou duvidosos. Dentre os testados destacam-se os derivados de quinoleínas e vários outros antimaláricos, arsenobenzóis e outros arsemicais, fenantridinas, sais de ouro, bismuto, cobre e de zinco, iodeto de sódio, violeta de genciana, aminopterinas, ácido para-aminosalicílico, hidrazida do ácido nicotínico, sulfonamidas, anti-histamínicos, ACTH e cortisona, derivados da estilomicilina, anfotericina B e mais de 30 antibióticos, e alguns nitrofuranos58. Maior atenção foi dada aos nitrocompostos a partir da década de 40 com sua introdução e emprego em terapêutica, período em que milhares de compostos desta classe foram sintetizados e testados frente a diversas doenças, dentre estas a doença de Chagas. 59. .. Estes pareciam ter atividade biológica dependente da presença do grupo nitro ligado à molécula, que resultava basicamente, em mudanças na estabilidade do mesmo, intermediada por interações entre o nitrocomposto e o seu alvo na biofase. Dentre estes nitrocompostos,. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(38) 36. destacam-se os derivados nitrotiofênicos, nitrofurânicos, nitrobenzênicos e nitroimidazólicos (Figura 10).. Derivados Nitrofurânicos. Derivados Nitrotiofênicos. Derivados Nitroimidazólicos. Derivados Nitrobenzênicos. Figura 10: Subestruturas químicas fundamentais de nitrocompostos empregados em terapêutica.. A década de 60 trouxe diversos avanços na terapia da doença de chagas, com mudanças benéficas a nível de direcionamento para o desenvolvimento de novos fármacos eficazes no tratamento anti-chagásico. O primeiro passo foi dado a partir da utilização de um derivado dos nitrofuranos, a Nitrofurazona (5-nitro-2-furaldeído-semicarbazona), em esquema de duração prolongada (53 dias em média) na dose de 100mg/kg/dia, que curava mais de 95% dos camundongos cronicamente infectados. Entretanto, a conclusão final foi de que a Nitrofurazoma poderia ser curativa, mas os pacientes não toleravam os efeitos colaterais nas doses e no tempo necessário para a cura, devido a sua alta toxicidade60.. Figura 11: Estrutura molecular da nitrofurazona. No final da década de 1960 e início de 1970 dois novos nitrocompostos, os quais são utilizados até hoje, surgiram trazendo melhores perspectivas para o tratamento da doença de Chagas, tanto pelo potencial curativo, particularmente para a fase aguda, como também por. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(39) 37. exibirem uma melhor tolerância quando comparados aos anteriores. Essas duas drogas são o nifurtimox. (Nfx),. um. derivado. nitrofurânico:. 3-metil-4-(5´-nitrofurfurilidenoamino). tetrahidro-4H-1, 4-tiazina-1,1-dióxido (Bayer 2502) comercializado como nome de Lampit; e o benznidazol (Bdz), um derivado 2-nitroimidazólico: N-benzyl-2-nitroimidazol acetamida (RO 7-1051), comercializado com o nome de Rochagan® no Brasil e Radanil® na Argentina.. O N. N. NO2. N. NO2. O N. N. SO2. H. Bdz. Nfx. Figura 12: Fármacos utilizados na terapia antichagásica.. A ação destes fármacos é afetada diretamente por algumas condições, como a duração do tratamento, a idade e a distribuição geográfica dos pacientes, entre outros. O grupamento nitro (NO2), considerado como parasitóforo, presente em ambas as moléculas está diretamente relacionado nos seus mecanismos de ação, também contribuindo para a elevada toxicidade apresentada por estas14. O nifurtimox é tripanossomicida contra as formas amastigotas do T. cruzi. Seu mecanismo de ação envolve a redução parcial ao ânion radical seguida por auto-oxidação para regenerar o nitrofurano original e formar o radical ânion superóxido e outras espécies reativas de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio e radical hidroxila. O T. cruzi mostra-se deficiente em mecanismos de detoxificação para metabólitos do oxigênio, particularmente o peróxido de hidrogênio, apresentando assim, mais sensível ao estresse oxidativo do que às células vertebradas 61. A ação do benznidazol não envolve danos oxidativos, e seu mecanismo de ação parece envolver uma diminuição da síntese de proteínas, redução de incorporação dos precursores de RNA e diminuição da incorporação da timidina em DNA62,63. O radical nitro estaria envolvido com seu efeito tripanocida através da formação de ligações covalentes com macromoléculas do T. cruzi 4. A duração media do tratamento é de cerca de sessenta dias, mas quando a doença crônica é reativada como em pacientes imunocomprometidos, este pode durar cinco meses ou. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(40) 38. mais. Apenas em tratamentos de pacientes contaminados acidentalmente, como por exemplo, em um laboratório, a duração da profilaxia é aproximadamente dez dias64. Segundo requerimentos de 1997 da Organização Mundial de Saúde, uma droga para ser considerada ideal no tratamento da doença de Chagas deve possuir algumas características peculiares, que são as seguintes:. 1- Cura parasitológica na fase aguda e crônica da doença; 2- Ser efetiva em uma ou poucas doses; 3- Ser de baixo custo para o paciente; 4- Não possuir efeitos colaterais nem teratogênicos 5- Não requerer internação para o tratamento e; 6- Não induzir resistência.. Por não cumprir vários desses pré-requisitos, principalmente as abordadas nos números 1-4, o Nifurtimox (Lampit®) e o Benznidazol (Rochagan®) mesmo sendo apresentadas como drogas promissoras, não podem ser consideradas drogas ideais para a terapia anti- T. cruzi. Ambas não possuem eficácia considerável na fase crônica da doença e os efeitos colaterais apresentados são o seu inconveniente principal 53,65. Devido a este último fator, desde a década de 1980 apenas o Benznidazol permanece disponível em território nacional. A tabela abaixo mostra os principais efeitos colaterais apresentados por ambas, representando as intensidades por cruzes.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(41) 39. Tabela 1: Principais efeitos colaterais observados na terapia específica da Doença de Chagas.. Sintoma/sinal Anorexia Cefaléia Dermatopatia Excitação psíquica Gastralgia Insônia Náusea Perda de peso Polineuropatia Vômito. Bdz ++ + +++ + + ++ + + ++. Nfx +++ ++ + +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++. Tendo em vista todo esse panorama que define a terapêutica da doença de Chagas como algo ineficaz, ultrapassado e inapropriado, têm-se cada vez mais intensificada a necessidade de recorrer a novas alternativas terapêuticas para a obtenção de fármacos mais seguros, ativos e com alvos biológicos mais específicos, principalmente para a fase crônica da doença. O desenvolvimento deste tipo de fármacos requer um melhor conhecimento do ciclo de vida e do metabolismo do T. cruzi. Vários alvos biológicos têm sido apontados como alvos terapêuticos potenciais para a doença de Chagas, dentre eles destacam-se: enzima tripanotiona redutase, biossíntese de RNA mensageiro, biossíntese de esteróis, transialidase, cruzaína do T. cruzi, possibilitando assim um desenvolvimento racional de fármacos menos tóxicos e mais potentes contra o parasito42. A TR é uma flavoenzima NADPH-dependente e tem sido considerada uma enzima chave no metabolismo oxidativo do parasito. Ocorre exclusivamente em tripanosomatídeos, sendo indicada por este motivo como um dos mais promissores alvos na busca por drogas tripanomicidas10.. Derivados. nitrofurânicos,. como. a. hidroximetilnitrofurazona,. têm. demonstrado produzirem, in vitro, inativação irreversível desta enzima em condições anaeróbicas 66. O T. cruzi requer esteróis específicos para a proliferação e a viabilidade de células em todos os estágios de seu ciclo, sendo este parasito extremamente susceptível a inibidores da biossíntese de esteróis. O principal esterol para o crescimento do T. cruzi é o ergosterol, o que torna, portanto, a via de biossíntese desse lipídeo um alvo atrativo para o desenvolvimento de. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.

(42) 40. fármacos. 67. . Atualmente, as enzimas mais bem estudadas desta cascata metabólica são a. esterol 14-demetilase, lanoesterol sintase, esqualeno epoxidase, esqualeno sintase, D-24(25) esterol metiltransferase, farnesilpirofosfato sintase e a farnesiltransferase14. A TCC é a principal cisteína protease do T. cruzi sendo liberada em todos os estágios do ciclo de vida do parasita, porém entregue em diferentes compartimentos celulares em cada estágio. É a enzima crucial para a atividade proteolítica do T. Cruzi e essencial para a replicação intracelular do parasita, sendo um alvo em potencial para o desenvolvimento de novas drogas tripanomicidas 68. Recentemente tem sido demonstrado que a infecção por este parasito pode ser curada em células de ratos e modelos de cães pelo tratamento com inibição irreversível da cruzaína69. Diversos trabalhos têm descrito a atividade inibitória provocada por diversos grupos de compostos, como por exemplo, N-acilhidrazidas, uréias, tiouréias e tiossemicarbazonas68. As tiossemicarbazonas (Figura 13) apresentam um amplo perfil farmacológico e constituem uma classe importante de compostos cujas propriedades têm sido extensivamente estudadas na Química Medicinal. Dentre estas atividades, destacam-se a antitumoral, antibacteriana, antiviral, antiprotozoária e citotóxica70.. Figura 13: Estrutura química das tiossemicarbazonas. Engajando-se nesta característica de alta versatilidade farmacológica desta classe de compostos, vários pesquisadores têm direcionado seus estudos na síntese de novas tiossemicarbazonas com a intenção de obter moléculas que sirvam como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos antichagásicos. Desde 2002 as aril-tiossemicarbazonas estão sendo descritas como potentes agentes tripanocidas e de baixa citotoxicidade 11.. Dyego Revorêdo de Carvalho Silva.