Santo André - Novembro de 2010
Aula 11
Genomas
procariontes
2º parte
BC-1606
Microbiologia
Prof . Antônio Sérgio Kimus Braz
Transferência genética :
Passagem do DNA de um organismo para outro:
Transferência Horizontal
Transferência vertical
Envolve transferência de DNA
para organismo diferentes,
processo não envolve reprodução
Envolve transferência de DNA
para organismo descendentes
Transferência vertical
Qualquer novidade genética provocada
Transferência Horizontal
O DNA passa para células vizinhas
Podendo ser até espécies diferentes...
Transferência Horizontal
Transferência vertical
Transferência vertical
Para que isso aconteça é
necessário a duplicação
do DNA cromossomal
Duplicação do DNA
Caracteristicas:
=> Replicação semi-conservativa
=> Simétrica
=> Bidirecional
=> semi-conservativa
Duplicação do DNA
Tem ínicio na origem de replicação: oriC;
envolve cerca a de 20 proteínas:
> DnaA :
desnatura o DNA na origem em conjunto com outras proteínas;> Helicase:
auxilia a abertura da helice do DNA> SSB :
proteinas que se ligam a DNA fita simples, estabilidade..> DNA primase :
criação de olionucleotideos iniciadores> topoisomerase IV :
separa as duas moléculas filhas> Spo0J:
envolvida na segregação , se liga a oriC e move para os polos a origem de replicação durante a divisão celular.Replicação do DNA
-DNA se duplica antes da divisão celular -Replicação
Semiconservativa => cada cadeia parental serve como molde para síntese da cadeia complementar
Geralmente simétrica => quando circular, o cromossomo permanece circular durante toda replicação
Bidirecional => ocorre em ambas as direções a partir de uma única origem de replicação
Semi-descontínua => uma vez que o sentido de polimerização da DNA pol é unico
Simetrica e bidirecional E semi-descontinua
Fita com polimerização continua E outra Fita não continua
Na fita de polimerização descontinua
RNA primers (10nts)
Replissomo
topoisomerases
helicase
Proteínas
SSB
DNA polimerases
Primase
Proteínas presentes na forquilha de Replicação de
E.coli
SSB Liga a fita simples de DNA
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA DNA Polimerase III Sintese da fita nova
DNA Polimerase I Preenche as lacunas e excisa os primers DNA Ligase Liga os fragmentos
DNA girase Superenrolamento
A helicase é uma enzima que quebra as ligações em ponte de hidrogênio entre as bases purinas ou pirimidicas de ambas as cadias de DNA, fazendo com que estas se separem. Esta enzima move-se ao longo da cadeia dupla de DNA utilizando energia da hidrólise de ATP para separar as duas cadeias da molécula.
Origem de replicação
-oriC (sequência de bases rica em pares A+T)
-Reconhecida por proteínas que iniciam o complexo de duplicação
Replissomo = complexo de mais de 20 proteínas diferentes
que atuam no processo de replicação
Replicação do DNA
Término da replicação=
terC
Separação das moléculas catalizada Pela enzima topoisomerase IVEndonuclease que cliva as Cadeias de DNA liberando-as
Segregação ou partição dos cromossomos
-Extremamente eficiente
-Detalhes do mecanismo não são conhecidos
-Estudos em E. coli, Bacillus subtilis e Caulobacter crescentus
-Não foi encontrado aparato como aparelho mitótico
Segregação ou partição
-Em Bacillus subtilis= proteína Spo OJ interage com sequências
próximas a região OriC
Movimento dos nucleóides acoplado a duplicação do DNA
Spo 0J = pode desempenhar papel do movimento dos nucleóides para os pólos da célula
DNA extracromossômico ou plasmídeo
Plasmídeo
-Molécula de DNA de fita dupla -Geralmente circular
-Tamanho variável= 2 a 200 kb
-Número de plasmídeos por célula varia (em geral plasmídeos maiores em menor número e menores em maior número de cópias)
-É estável e se mantém em estado autônomo na célula
-Duplicação semiconservativa e independente da duplicação do DNA cromossômico
>Pode passar para clulas filhas (transferencia vertical)
>Ou passar para células vizinhas (transferencia horizontal)
-Origem de replicação= OriV
-Proteínas envolvidas na duplicação
-Proteína Rep= codificada por genes do plasmídeo -Proteínas codificadas por genes cromossomais
-Replicação pode ser:
-Simétrica bidirecional -Simétrica unidirecional -Assimétrica unidirecional
-circulo rolante (na maioria dos plasmideos de gram +)
Plasmídeo
São elementos egoístas (selfish) antes de tudo.
São elementos facultativos ou acessórios (presença na célula não é essencial)
Plasmídeo
Podem conferir às células características fenotípicas adicionais
-Fertilidade: capacidade de se conjugar -Produção de bacteriocinas
-Resistência a drogas e íons de metais pesados -Resistência a radiação UV
-Utilização de carbohidratos
-Degradação de hidrocarbonetos -Produção de antibióticos
-Produção de fimbrias de adesão a tecidos e outras superfícies -Produção de enterotoxinas
-Produção de hemolisinas -Fixação de nitrogênio
Variabilidade genética nas
populações de procariotos
Variabilidade genética é importante para evolução
-Aparecimento de características fenotípicas novas
-Aumento da biodiversidade
Maior vantagem dos organismos em ambientes diferentes
Variabilidade em procariotos
Mutação
Alguns plasmideos incluem um sistema de
vicio ou sistema possegragacional de morte
"postsegregational killing system (PSK)"
Mutação
Mudanças na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA
Substituição, deleção ou inserção de nucleotídeos
Produzem alelos variantes de um gene
Na maioria dos casos podem produzir mudança na
sequência de aminoácidos da proteína
Tautomerismo
-Erros no processo de duplicação do DNA
- tautomerismo
-Danos químicos e fisicos ao material genético
- Recombinações
Ex: (Alterações por elementos de transposição
Inserção de vírus , etc..)
Substituições de nucleotídeos
Incorporação de nucleotídeo diferente durante a replicação do DNA
Tipos de mutação que podem ocorrer em um gene
Substituição de bases
Mutações que alteram a sequência de leitura das bases
(frameshifts)
fenilalan ina leucina tirosina stop histidina glutamin a asparagi na ácido aspártic o ácido glutâmic o leucina valina treonina alanina serina prolina glicina arginina arginina serina cisteína lisina stop triptofa no metioni na isoleucin a
Substituição de bases
Frequentemente mutações de ponto (substituição de um nucleotídeo por outro)
Transições= purina por purina
(mais comuns) pirimidina por pirimidina
Transversões= purina por pirimidina
Purinas (A G) (dois aneis) x Pirimidinas (C T) (um anel)
Transição x Transversão
Muito mais freqüente mutações do tipo transição do que transversão
é mais fácil para enzimas de correção de DNA identificarem pareamentos estranhos como como purina com purina ou pirimidina com pirimidina. Uma vez que o esperado é purina com pirimidina
Transição:
mutação que muda uma purina → purina
ou
pirimidina → pirimidinas
Transversão:
mutação que muda uma purina → pirimidina ou pirimidina → purina Importante em modelos de Importante em modelos de evolução molecular evolução molecular
Mutações silenciosas: códons sinônimos (código
genético degenerado);
Mutações missense (sentido alterado)
Mutações nonsense (sem sentido)
Substituição de bases
Mutação de ponto silenciosa
Mutação missense (sentido alterado)
Mutação nonsense (sem sentido)
Mutações que alteram a sequência de leitura das bases
(frameshifts)
A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A Quadro de leitura +1 Quadro de leitura +2 Quadro de leitura +3 Quadro de leitura -1 Quadro de leitura -3 Quadro de leitura -2 A C G C A G A T A T C A G C T A Fita de DNAMutações que alteram a sequência de leitura das bases
(frameshifts)
Inserção
Mutações espontâneas x mutações induzidas
Mutações espontâneas
=
Ocorrem sem participação de agente externoGeralmente causadas por: -Erros na DNA polimerase
(raras=10-6 a 10-11 por ciclo de duplicação= em determinado sítio)
-Danos ao DNA a partir de hidrólise e desaminação
(mais comum= desaminação espontânea da citosina gerando o uracil)
-tautomerismo
-Elementos de transposição
Mutações induzidas
=
Ocorrem devido a ação de agentes externos-Radiação UV
Elementos de transposição
-Encontrados sempre associados a uma molécula de DNA e nunca de forma livre
-Apresentam geralmente terminais com repetições invertidas cujo tamanho varia de 8 a 48 pb
10 Gy de radiação ionizante é suficiente para matar um humano 60 Gy é suficiente para matar cultura de bactérias E. Coli
5.000 Gy não causam perda de viabilidade em D. radiodurans ,
15.000 Gy D. radiodurans mantém ainda 37 % de viabilidade (1500 x mais que um humano) Hoje conhecemos outras bactérias e archaea com capacidade semelhante... ( e até um fungo) Além disso essa bactéria agüenta temperaturas elevadas, condições químicas adversas … Provavelmente é o ser vivo mais resistente da terra !!!
Muita redundância no DNA
Transposons ..
Elementos genéticos moveis ...
Elementos gen
Transposons
éticos moveis ...
Elementos de transponíveis :
> Sequencias de inserção (IS)
> Transposons (Tn)
Elementos de transposição podem transpor-se:
-de uma posição para outra dentro de uma mesma molécula de DNA (transposição intramolecular)
-Ou para outra molécula de DNA diferente (transposição intermolecular)
-Transposição é frequentemente associada de duplicação da sequência de nucleotídeos do sítio alvo (sequência duplicada= 2 a 14 pb)
-Maioria dos elementos de transposição apresenta transposição múltipla randômica= inserção de forma aleatória
Classes mais frequentes de elementos
de transposição dem procariotos
Sequências de Inserção ou elemensto IS
(Sigla IS seguida de número: IS1, IS2, IS3…)Transposons
Designados pela sigla Tn acompanhada de um número em itálicoTn1, Tn2
Sequências de Inserção ou elemensto IS
(Insertion sequence = IS)
-Encontradas em cromossomos, plasmídeos ou DNA de fagos -Geralmente menores que 2 Kb
-Só possuem genes relacionados com o processo de transposição= transposase
IS são elementos simples compostos de 700-1500 pb
IS Element
Length
(bp)
Inverted
Repeats
Target
Site size
No. of copies in
E. coli
chromoso
me
F plas
mid
IS1
768
20/23
9
5 - 8
IS2
1327
32/41
5
5
1
IS3
1258
39/39
3
5
2
IS4
1426
16/18
11, 12 or
14
1 or 2
IS5
1195
15/16
4
abundant
IS10 R
1329
17/22
9
Transposons
-Encontrados frequentemente em plasmídeos, mas podem estar integrados no DNA cromossômico ou DNA de fagos
-Geralmente maiores que 2 Kb
-Possuem outros genes além dos genes envolvidos com o processo de transposição
-Resistência a drogas é o fenótipo mais frequentemente associado aos transposons
[
24-40
]
5000 bp
-Transposons simples são elementos similares a sequências IS
-Contém segmentos de DNA flanqueados por sequências repetidas invertidas.
-No entanto o segmento de DNA codifica mais de um produto gênico
Transpo
son
Antibiotic or other resistance
marker
Length
(bp)
Inverted
Repeat
Tn1
ampicillin
4957
Tn3
ampicillin
4957
38 bp
Tn501
Hg resistance
8200
38 bp
Tn7
trimethoprim, spectinomycin &
streptomycin
14000
30 bp
gamma-delta
6000
35 bp
-Tranposons compostos são segmentos de DNA flanqueados por
IS elementos nas extremidades.
-Somente um elemento IS possui transposase
-Elemento IS pode estar:
• mesma direção (repetições diretas)
• ou em direções opostas (repetições invertidas)
Transposon composto
Transposon composto
Repetições diretas
Transposon
Antibiotic or other resistance
marker
Length
(bp)
Inverted
Repeat
Tn5
kanamycin
5700
IS50
Tn9
chloramphenicol
2638
IS1
Tn10
tetracycline
9300
IS10
Mecanismos de transposição
Transposição conservativa (não replicativa)
Transposon deixa o sítio aonde está inserido e
é inserido em uma nova região do cromossoma (sítio alvo)
Transposição duplicativa
Transposição conservativa
(não replicativa)
Elementos de transposição como
agentes mutagênicos
-Quando introduzidos na célula o número de cópias de transposons pode aumentar pelos mecanismos de transposição
Fixação do elemento na célula
Transferência para outros microrganimos
Eventos de transposição põe em risco a sobrevivência da célula Responsáveis por 5 a 15% da mutações espontânceas que ocorrem no genoma de procariotos
Mutações causadas por inserção de transposons
-Transposons podem ser inseridos dentro de sequências codificadoras de genes, de sequências reguladoras (ex: promotor)
-Transposons podem ser inseridos dentro de sequências
Devido a esta capacidade muitos transposons são usados
em laboratório para mutações no genoma de microrganismos
Mecanismos de transferência de DNA entre procariotos
Troca de material genético entre bactérias contribui para variabilidade
Geralmente resultante da recombinação de sequências homólogas (mediada pelo sistema de recombinação Rec)
-Bactérias recebem DNA exógeno
-Formação de merozigotos (diplóides parciais) -Recombinação
Tipos de Mecanismos de transferência genética horizontal
em procariotos :
Transformação
Conjugação
Transdução
Transformação
DNA livre (oriundo de uma célula doadora= geralmente morta
e lisada), integra-se no genoma de uma célula receptora
Gram-positiva Gram-negativa
ligação ligação passagem para o periplasma transporte e degradação fragmentação transporte e degradaçãoEtapas da transformação
-Formação de célula competente
-Adsorção do DNA as células receptoras
-Penetração do DNA
Formação de célula competente
-
Célula capaz de receber DNA exógeno- Estado transitório em que acontece mudanças significativas no envelope celular= aparecimento de protéinas com funções variadas
Em Gram-positivas
-Organismos mais estudados: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguis e Bacillus subtilis
-Produção de fator de competência que se liga a proteína receptora na membrana e induz síntese de novas proteínas envolvidas no estado de competência (10 a 16 proteínas)
Em Gram-positivas
Adsorção do DNA às células receptoras
-
DNA liberado por células mortas (lise)ou por células vivas (mecanismo de liberação não conhecido)
- Estado transitório em que acontece mudanças significativas no envelope celular= aparecimento de protéinas com funções variadas
Proteína receptora reconhece DNA
Outras proteínas formam estrutura que atravessa a parede celular
(permite acesso do DNA ao receptor)
Nuclease= degrada uma das fitas do DNA
DNA de fita simples passa por poro formado por proteínas envolvidas no transporte Incorporação a partir da Extremidade 3’
Gram positivas
: adsorção e penetração
Proteína de eclipse se associa ao DNA -Impede degradação por nucleases -Impede pareamento de bases
Gram negativas
: adsorção e penetração
Semelhante a gram positivas
No entanto DNA entra no periplasma através de poro na membrana
externa fomado por proteínas secretinas
Integração do DNA
-Recombinação entre DNA exógeno e endógeno
-Deve haver homologia de sequências= pareamento de bases
-Segmento de DNA endógeno será substituído por segmento
exógeno
Transfomação de bactérias
in vitro
-Eletroporação= células de bactéria submetidas a choque elétrico
cria poros na membrana
-Via protoplastos= Protoplastos são células bacterianas sem parede celular
-Esferoplastos= Arqueas desprovidas de camada S ou pseudopeptidoglicana
-Choque térmico= Transformação em presença de CaCl2 a OoC seguida de
Conjugação
-DNA transferido de uma célula a outra por aparato de conjugação -Requer presença de plasmídeo de conjugação nas células doadoras
Plasmídeo F (fertilidade)
-Plasmídeos codificam moléculas ou estruturas presentes na superfície das células doadoras
Genes tra e trb
Etapas da conjugação
Estabelecimento de contato entre células
Diferente em Gram positivas e Gram negativas
-Célula doadora forma pilus sexual
(codificado por plasmídeo conjugativo)
-Pilus se liga a célula receptora:
-Tranferência do DNA -Estabilização de pares
Conjugação em bactérias gram positivas
-Plasmídeos em bactérias gram negativas podem promover conjugação em meio sólido ou líquido
-Mecanismo de conjugação em meio sólido não conhecido
-
Em meio líquido
= conjugação envolve resposta e ferormônios sexuais •Células receptoras secretam ferormônios sexuais• Ferormônio se liga a receptor na célula doadora
•Células doadoras tornam-se aderentes= produção de substância de agregação colisão entre células (ao acaso)
Transferência do DNA
Etapas da conjugação
-Mecanismo mais estudado em gram positivas -Existência de dois complexos proteicos:
Relaxossomo
Gerado na oriT do plasmídeo
Contém proteínas codificadas pelo plasmídeo e pelo DNA cromossomal
Complexo de formação de pares (mpf)
-Enzima relaxase cliva uma ligação fosfodiéster em uma fita do plasmídeo na oriT (origem de transferência)
-Após clivagem relaxase permanece ligada ao DNA na extremidade 5’ -Fita clivada é transferida para célula receptora- extremidade 5’
-Paralelamente ocorre:
-Separação das duas cadeias de DNA no plasmídeo -Duplicação do plasmídeo
Transferência de material cromossômico pode ocorrer
(com menor frequência) Plasmídeo deve estar integrado
Bactérias que possuem plasmídeo Conjugativo integrado
Hfr (high frequency recombination) Alta frquência de recombinação
Transdução
Mecansismo de transferência de genes de bactérias mediado por bacteriófagos (ou fagos)
Bacteriófagos
-Vírus que infectam bactérias -Duas categorias;
Virulentos= lisam a célula
Temperados= integração do fago ao cromossomo bacteriano