I
Nicole Yolanda Ferreira
ANÁLISE BIOMECÂNICA, MORFOLÓGICA, E DA
RESPOSTA NOCICEPTIVA EM MODELO ANIMAL
DE MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO I
São Paulo
2018
Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Campus São Paulo como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências
II
Nicole Yolanda Ferreira
ANÁLISE BIOMECÂNICA, MORFOLÓGICA, E DA
RESPOSTA NOCICEPTIVA EM MODELO ANIMAL DE
MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO I
Orientadora: Profa. Dra. Vânia D’Almeida
Co-orientadora: Dra. Vanessa Gonçalves Pereira
São Paulo
2018
Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Campus São Paulo - como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências
III Ferreira, Nicole Yolanda
Análise biomecânica, morfológica e da resposta nociceptiva em modelo animal de Mucopolissacaridose tipo I. / Nicole Yolanda Ferreira – São Paulo, 2018.
xvi, 43f
Dissertação (mestrado): Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Biomechanical, morphological, and nociceptive response analysis in Mucopolysaccharidosis type I mice.
1. Mucopolissacaridose tipo I/ 2. Tecido ósseo/ 3. Teste de flexão de três pontos/ 4. Placa quente.
IV
Universidade Federal De São Paulo
Departamento de Psicobiologia
Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo
Chefe do Departamento de Psicobiologia: Prof. Dr. José Carlos Fernandes Galduroz
Coordenadora do Curso de Pós-Graduação: Profa. Dra. Débora Cristina Hipólide
V
Nicole Yolanda Ferreira
ANÁLISE BIOMECÂNICA, MORFOLÓGICA, E DA RESPOSTA
NOCICEPTIVA EM MODELO ANIMAL DE MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO I
Presidente da Banca: Profa. Dra. Vânia D’Almeida
BANCA EXAMINADORA
TITULARES:
1. Prof. Dr. Fábio Dupart 2. Prof. Dr. Guilherme Baldo 3. Prof. Dr. Odair Aguiar Junior
SUPLENTE:
VI
À Profa. Dra. Carla Cristina Medalha, sempre gentil, bem-humorada e inspiradora.
VII AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora, Vânia, por ser inspiração desde o início da minha jornada acadêmica e por ter me despertado o interesse pela Ciência, guiando meus passos neste meio com tamanha paciência e dedicação. Obrigada por todos os valiosos ensinamentos, e, acima de tudo, por ter sido mais do que mentora e ter me acolhido com muito carinho e de tantas maneiras nesses anos todos. Não há meio de descrever como sua humanidade, compreensão, e generosidade comigo me ajudaram a continuar. Serei eterna e infinitamente grata.
À querida equipe do LEIM (Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo, UNIFESP), agradeço pelo carinho, constante apoio, e paciência ao dividirem comigo seu conhecimento. Os bons momentos proporcionados pela convivência com pessoas tão especiais sempre farão parte da linda impressão que todos deixaram na minha existência.
Agradeço à Cinthia pelas ótimas conversas, pelo aprendizado, e por sua imensa boa vontade e ajuda durante todo este processo. Obrigada por acreditar tanto em mim e por deixar um pedacinho de si em tudo o que faz. Você é muito especial.
À Vanessa (bichinha) e Nessa, agradeço pelo suporte e auxílio imprescindíveis para a conclusão desta etapa. Obrigada por serem sempre tão solícitas, compreensivas, e pacientes com minhas limitações.
À Profa. Dra. Débora Hipólide, agradeço por me conceder a oportunidade de continuar este processo, e por ter conversado comigo de maneira franca e empática em um momento tão delicado.
Agradeço à Karina pela amizade, que começou de forma despretensiosa e hoje tem um lugar enorme em meu coração. Obrigada por se preocupar e cuidar de mim mesmo quando eu não estou vendo, por dividir comigo tanto a pipoca quanto os medos e anseios, e por ser maravilhosa em todos os sentidos. Quando crescer, quero ser igual a você.
Agradeço à Ananda pela convivência gostosa, pela amizade e pelo constante cuidado comigo. Obrigada por me acolher com carinho desde o início e por compartilhar tanto da pessoa linda que você é.
VIII
À minha família e amigos, especialmente meus irmãos, minha mãe, Leandro, Douglas, Aline e Wal, agradeço o apoio, incentivo, conselhos, risadas, e tantas outras coisas incríveis que cada um de vocês traz. Obrigada por não me deixarem esquecer do meu potencial, por não duvidarem de mim por um segundo sequer, e por estarem presentes no bom, no ruim, e no mais ou menos.
Agradeço à minha amiga Nat pelos anos de amizade e por ser tamanha fonte de inspiração. Obrigada por se fazer presente mesmo estando longe, por torcer tanto por mim, e por me motivar de maneira sempre afetuosa e ao mesmo tempo realista.
Agradeço a meu amado Jürgen por ter segurado minha mão tão incansável e amorosamente nos últimos anos, zelando pelo meu bem e doando tanto de si para me ver ir mais longe. Você e Rocco são meu lar, meu refúgio, meu combustível, e o que vocês fazem por mim vai além do que eu sei expressar. Obrigada por tudo, e especialmente por tornar a jornada mais leve, feliz e iluminada.
Pelo apoio financeiro, agradeço ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, e à AFIP (Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa).
IX
Perhaps there is a life here
Of not being afraid of your own heart beating Do not be afraid of your own heart beating Look at very small things with your eyes & stay warm
Nothing outside can cure you but everything's outside
X SUMÁRIO BANCA EXAMINADORA ... V DEDICATÓRIA ... VI AGRADECIMENTOS ... VII EPÍGRAFE ... IX SUMÁRIO ... X LISTA DE FIGURAS ... XII LISTA DE ABREVIATURAS ... XIII RESUMO ... XV
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. Erros Inatos do Metabolismo ... 1
1.2. Doenças de Depósito Lisossômico ... 2
1.3. Mucopolissacaridoses ... 3
1.3.1. Mucopolissacaridose tipo I ... 4
1.3.2. Modelo animal de Mucopolissacaridose tipo I ... 6
1.4. Justificativa ... 7 2. OBJETIVOS ... 8 2.1. Objetivos gerais ... 8 2.2. Objetivos específicos ... 8 3. METODOLOGIA ... 9 3.1. Modelo animal ... 9 3.2. Genotipagem ... 10
3.3. Placa quente (hot plate test) ... 11
XI
3.5. Teste de flexão de três pontos (3-point bending test) ... 13
3.6. Análise morfológica ... 15
3.7. Análise estatística ... 17
4. RESULTADOS ... 19
4.1. Placa quente (hot plate test) ... 19
4.2. Comprimento dos fêmures ... 20
4.3. Teste de flexão de três pontos (3-point bending test) ... 21
4.4. Análise morfológica ... 25 5. DISCUSSÃO ... 29 6. CONCLUSÃO ... 35 REFERÊNCIAS ... 36 7. ANEXOS ... 41 7.1. Anexo A ... 41 ABSTRACT ... 42
XII LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Genotipagem ... 11
Figura 2. Placa quente ... 12
Figura 3. Fêmures de animais Idua +/+ e Idua -/- aos 3 meses de idade ... 13
Figura 4. Aparelho de teste universal Instron ... 14
Figura 5. Corte histológico da epífise proximal do fêmur de um animal Idua +/+ aos 3 meses de idade, corado com hematoxilina-eosina ... 17
Figura 6. Tempo de resposta ao estímulo nociceptivo térmico ... 19
Figura 7. Comprimento em centímetros dos fêmures ... 20
Figura 8. Carga máxima e Força de fratura ... 22
Figura 9. Módulo de elasticidade ... 23
Figura 10. Tenacidade e Resiliência ... 24
Figura 11. Cortes histológicos da cabeça do fêmur corados com hematoxilina-eosina ... 26
Figura 12. Cortes histológicos da cartilagem articular da cabeça do fêmur corados com hematoxilina-eosina ... 27
Figura 13. Cortes histológicos da cabeça do fêmur corados com picro-sírius ... 28
XIII LISTA DE ABREVIATURAS
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
CREIM – Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo
EDTA – Ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético)
EIM – Erros Inatos do Metabolismo
GAG – Glicosaminoglicano
HE – Hematoxicilina-eosina
IDUA – α-L-iduronidase
Idua – gene codicador da a enzima α-L-iduronidase em camundongos
Idua -/- – Genótipo homozigoto recessivo para o gene Idua
Idua +/- – Genótipo heterozigoto para o gene Idua
Idua +/+ – Genótipo homozigoto dominante para o gene Idua
J – Joule
KN – Quilonewton
MPa – Mega Pascal
MPS – Mucopolissacaridose
MPS I – Mucopolissacaridose tipo I
XIV NaOH – Hidróxido de sódio
PBS – Phosphate-buffered saline (tampão fosfato-salino)
PCR – Polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
TRE – Terapia de reposição enzimática
Tris-HCl – Tris hidrocloreto
UCLA – Universidade da California, Los Angeles
UFGRS – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
XV RESUMO
A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é um distúrbio metabólico causado pela deficiência da enzima lisossômica α-L-iduronidase (IDUA), resultando no acúmulo de glicosaminoglicanos (GAG) nos compartimentos lisossômicos de diferentes tipos celulares. Sinais e sintomas em pacientes com MPS I variam grandemente, podendo estes apresentarem comprometimento tanto osteomuscular quanto neurológico. O modelo animal de MPS I permite a realização de diferentes testes, possibilitando a melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos da doença e suas consequentes manifestações clínicas.
Objetivo: O objetivo deste estudo foi analisar os aspectos mecânicos e morfológicos do tecido ósseo, bem como a resposta nociceptiva em modelo animal de MPS I.
Métodos: Foram realizados os testes de placa quente (hot plate test), flexão de três pontos (three-point bending test), e análise histológica em camundongos da linhagem C57BL/6, nocautes para o gene codificador da enzima α-L-iduronidase (Idua -/-), e camundongos selvagens (Idua +/+). Os testes foram realizados em animais machos e fêmeas de 3 e 6 meses de idade, e os resultados obtidos para cada protocolo experimental foram comparados entre os respectivos grupos.
Resultados e conclusões: Fêmures dos animais Idua -/- aos 3 meses de idade se mostraram significativamente menores e menos resistentes ao estímulo de fratura quando comparados àqueles dos animais Idua +/+ com a mesma idade. Ainda aos 3 meses, os fêmures dos animais Idua -/- apresentaram alterações importantes na morfologia da cartilagem articular, na deposição de colágeno tipos I e III, e na arquitetura do tecido ósseo trabecular. Porém, aos 6 meses de idade, fêmures dos animais Idua -/- apresentaram maior resistência quando comparados aos dos animais controle. Tais resultados sugerem que as anormalidades observadas na matriz óssea e na cartilagem articular de animais Idua -/- aos 3 meses de idade resultam na
XVI
diminuição de flexibilidade do tecido, tornando-o mais suscetível a fraturas. Em contrapartida, os resultados obtidos para o tecido ósseo dos animais Idua -/- aos 6 meses de idade sugerem que estes se tornam mais resistentes com a progressão da doença. Não se observou diferença na resposta nociceptiva dos animais de ambos os grupos nas faixas etárias estudadas.
Palavras-chaves: Mucopolissacaridose tipo I, modelo animal, tecido ósseo, teste de flexão de três pontos, placa quente.
1 1. INTRODUÇÃO
1.1. Erros Inatos do Metabolismo
Os Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são distúrbios genéticos causados por um defeito enzimático ou de transporte que leva ao bloqueio de uma via metabólica. Atualmente, há cerca de 500 EIM identificados, sendo que estes correspondem a aproximadamente 10% de todos os distúrbios genéticos monogênicos conhecidos. Embora na totalidade a incidência estimada dos EIM seja de 1:1.000 nascidos vivos, estes distúrbios são considerados raros quando observados isoladamente (Neufeld, 2001).
Os EIM podem ser classificados em quatro grupos, sendo estes os que compreendem distúrbios causados por defeito na síntese de moléculas; os de defeito no armazenamento, degradação e secreção de moléculas complexas; os de defeito no transporte; e os de defeito no metabolismo intermediário (Schwartz et al., 2001).
Os EIM causados por defeitos no armazenamento, degradação e secreção de moléculas complexas incluem o subgrupo das Doenças de Depósito Lisossômico (DDL), cujos sintomas são progressivos, permanentes e não dependem da alimentação ou de outros eventos ocasionais e externos (Neufeld, 2001).
2 1.2. Doenças de Depósito Lisossômico
Os lisossomos são organelas que contêm em seu interior uma série de enzimas que catabolizam proteínas, ácidos nucléicos, lipídios, sulfatos, fosfatos e carboidratos complexos. Cada enzima lisossômica participa de uma via de degradação de macromoléculas, transformando-as em moléculas menores que poderão ser reutilizadas ou eliminadas pela célula. Quando há defeito na ação de uma determinada enzima lisossômica, em seu co-ativador, nos transportadores de membrana, ou no tráfego intracelular de vesículas, ocorre o bloqueio metabólico da via de degradação destas macromoléculas, o que causa o acúmulo de produtos metabólicos parcialmente degradados nos lisossomos (Wilcox, 2004). Esse acúmulo se manifesta clinicamente através do aumento da massa dos tecidos e órgãos acometidos (Nussbaum et al., 2008). Às doenças que apresentam tais sintomas, dá-se o nome de Doenças de Depósito Lisossômico (DDL).
As DDL são autossômicas recessivas, exceto pela doença de Fabry e pela Mucopolissacaridose tipo II, que são ligadas ao cromossomo X (Wilcox, 2004), e podem ser classificadas de acordo com o tipo de substrato acumulado. As Mucopolissacaridoses, por exemplo, são caracterizadas por defeitos na ação de enzimas que participam da degradação de glicosaminoglicanos, causando o acúmulo destes substratos no interior dos lisossomos (Futerman, 2004).
O acúmulo de substratos é a causa primária das DDL, mas a grande variação de manifestações clínicas sugere que outras vias bioquímicas e/ou celulares secundárias estejam envolvidas na fisiopatologia destas doenças
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(Futerman, 2004; Clarke, 2011). Tal hipótese pode ser corroborada pelo fato de que diversas DDL apresentam acúmulo de metabólitos que não estão diretamente relacionados à enzima deficiente (Walkley, 2009).
1.3. Mucopolissacaridoses
As Mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de DDL causadas pela deficiência de enzimas lisossômicas que participam da degradação de glicosaminoglicanos (GAG). A deficiência de tais enzimas causa o acúmulo desses substratos no lisossomo, o que acarreta diversas complicações celulares e teciduais. Os fragmentos de GAG gerados por vias alternativas são excretados em grandes quantidades na urina (Neufeld, 2001), no sangue e no líquido cefalorraquidiano (Muenzer, 2011).
As MPS são doenças de herança autossômica recessiva, exceto pela Mucopolissacaridose tipo II, cuja herança é recessiva ligada ao cromossomo X. Há diversos tipos de MPS conhecidos, sendo cada uma delas classificada de acordo com a deficiência de uma ou mais enzimas lisossômicas (Neufeld, 2001).
Muitas das manifestações clínicas são semelhantes nos tipos de MPS, porém em graus diferentes. Os sintomas observados na síndrome são de curso crônico e progressivo, e de envolvimento multissistêmico, sendo as manifestações mais comumente observadas organomegalia, disostose múltipla, hepatoesplenomegalia, mão em garra e face grosseira; audição, visão, vias respiratórias, funções cardiovasculares, e mobilidade articular também podem apresentar comprometimento. Em alguns tipos de MPS há
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déficit cognitivo, enquanto que em outros tal manifestação não é observada (Muenzer, 2004; Neufeld, 2001).
Das manifestações clínicas envolvendo o sistema musculo-esquelético, as mais comumente observadas são anormalidades no crescimento ósseo e baixa estatura, rigidez ou hipermobilidade articular, desvios no alinhamento da coluna vertebral, contraturas musculares, síndrome do túnel do carpo, dedos em gatilho, e hipoplasia dentária. Assim como os sintomas que afetam os outros sistemas, a gravidade do comprometimento osteomuscular observado nas MPSs pode variar de acordo com fatores como idade, tipo de MPS, variabilidade fenotípica, e início do tratamento (Morishita, 2011; Clarke, 2014; Pérez-López, 2017).
O tratamento mais comum para este tipo de DDL consiste basicamente em cuidar dos sintomas, porém mais recentemente algumas delas (MPS tipos I, II, IV, VI e VII) vem sendo tratadas por infusão intravenosa periódica de doses da enzima deficiente, sintetizada em laboratório (Neufeld, 2006). A este tratamento, dá-se o nome de Terapia de Reposição Enzimática (TRE).
1.3.1. Mucopolissacaridose tipo I
A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma DDL de herança autossômica recessiva caracterizada pela deficiência da enzima α-L-iduronidase (IDUA), responsável pela degradação dos GAG heparam sulfato e dermatam sulfato (Muenzer, 2004).
A MPS I é classificada em três subformas de acordo com a severidade dos sintomas apresentados. São elas: Síndrome de Hurler (forma grave),
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Síndrome Hurler-Scheie (forma intermediária) e Síndrome de Scheie (forma atenuada). Embora muito utilizada, esta classificação não é absolutamente apropriada, uma vez que existe sobreposição de sintomas entre os grupos dentro da mesma subforma (Pastores, 2008).
Os pacientes com MPS I, forma grave (Síndrome de Hurler), apresentam evolução progressiva e multissistêmica, com baixa expectativa de vida. As complicações mais frequentemente observadas são deformidades ósseas, infecções auriculares e nasais, hérnias umbilicais e inguinais, opacificação das córneas, hepatoesplenomegalia, cardiomiopatia, desaceleração no crescimento em estatura logo nos primeiros estágios da infância, e macroglossia. Normalmente, o diagnóstico pode ser feito entre o 4º e o 18º mês após o nascimento, pois neste período a manifestação dos sintomas se torna mais evidente (Muenzer, 2004; Neufeld, 2001). Nas outras duas subformas de MPS I tais sintomas podem se apresentar mais atenuados.
O comprometimento do sistema osteomuscular em pacientes com MPS I representa um grande impacto em sua qualidade de vida, uma vez que pode prejudicar a mobilidade e causar dor. Baixa estatura, escoliose, displasia de quadril, artropatia, rigidez articular e contraturas são as complicações mais comumente observadas nesta subforma da síndrome (Clarke, 2014).
Já foram descritas mais de 100 mutações (Pereira, 2011) no gene IDUA e, apesar dessas diferentes mutações codificarem enzimas com atividades residuais variáveis, ainda não é possível prever a gravidade e progressão da MPS I com base na mutação, o que indica que a ampla variedade dos fenótipos observados pode estar relacionada a eventos secundários à alteração enzimática. Além disso, acredita-se que apenas o acúmulo de GAG
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não seria suficiente para explicar as alterações multissistêmicas observadas (Yamagishi et al., 1996; Clarke, 2011).
1.3.2. Modelo animal de Mucopolissacaridose tipo I
O modelo murino de MPS I foi desenvolvido em 1997 a partir da modificação do gene Idua pela inserção do gene da neomicina sulfato transferase em células tronco embrionárias (Clarke et al., 1997; Ohmi et al., 2003). A avaliação clínica e patológica dos camundongos mostrou o desenvolvimento de uma doença lisossômica multissistêmica, excreção de GAG urinário elevada e alguns sintomas análogos ao fenótipo Hurler em humanos, como disostose múltipla precoce, dismorfia craniofacial e aumento na espessura dos dígitos. Tipicamente, estes sintomas começam a aparecer 4 semanas após o nascimento dos animais, são progressivos e se tornam mais evidentes após as 15 semanas vida (Azevedo, 2004).
O desenvolvimento destes modelos animais de MPS I auxilia e facilita o estudo de diversas características da síndrome por permitir a avaliação de parâmetros de interesse em diversos tecidos biológicos não acessíveis em humanos. Tais avaliações possibilitam a realização de estudos que contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos fisiopatológicos e da origem das alterações observadas na MPS I, o que pode guiar pesquisas em busca de novas estratégias terapêuticas.
Em estudo realizado por Pereira et al. (2010), utilizando o modelo animal de MPS I, observou-se que os animais apresentavam alterações na homeostase de Ca2+ e H+ nos lisossomos, o que pode ser um fator contribuinte
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para o acúmulo secundário de outras moléculas na MPS I. Além disso, os animais nocaute apresentaram alterações na permeabilidade da membrana lisossômica, que em conjunto com as alterações da homeostase de íons, possivelmente contribuem para o dano e morte celular observados na MPS I (Pereira et al., 2010).
Sabendo-se da importância da homeostase de Ca2+ para as funções
celulares e do papel deste íon na condução do impulso nervoso e na constituição da matriz óssea, pode-se hipotetizar que as alterações observadas tenham repercussão também nas propriedades mecânicas e morfológicas do tecido ósseo, assim como na condução do estímulo nociceptivo.
1.4. Justificativa
Os pacientes portadores das MPSs apresentam grande variedade de manifestações clínicas que vão do comprometimento osteomuscular ao neurológico. Porém, os mecanismos através dos quais tais alterações são causadas ainda não são inteiramente compreendidos. A relação entre o genótipo e fenótipo também não está bem estabelecida, porém é possível que a grande variabilidade na gravidade dos sintomas da doença se deva a alterações secundárias do metabolismo celular. Portanto, faz-se importante a tentativa de compreender melhor os mecanismos da doença para que futuramente se possa elaborar estratégias terapêuticas mais eficientes.
8 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Avaliar a resposta nociceptiva, assim como os aspectos mecânicos e morfológicos do tecido ósseo em animais controle e com MPS I.
2.2. Objetivos específicos
Analisar o tempo de latência da resposta nociceptiva ao estímulo térmico através do teste da placa quente (hot plate test);
Verificar se há diferença no comprimento de ossos longos entre os grupos;
Acessar as propriedades mecânicas da matriz óssea frente a um estímulo de fratura através do teste de flexão de três pontos (three-point bending test);
Avaliar os aspectos morfológicos do tecido ósseo através de técnica rotineira de coloração com Hematoxilina-Eosina;
Avaliar a deposição de colágeno no tecido ósseo e cartilaginoso através de técnica de coloração com Picro-Sirius e microscopia de luz polarizada.
9 3. METODOLOGIA
3.1. Modelo animal
O modelo animal utilizado neste estudo é o descrito por Ohmi et al. (2003), constituído por camundongos da linhagem C57BL/6, selvagens (Idua +/+) e nocautes para o gene codificador da enzima α-L-iduronidase (Idua -/-). O estabelecimento da colônia de animais na Universidade Federal de São Paulo foi possível graças à gentil colaboração da Dra. Elizabeth Neufeld (UCLA) e Profa. Dra. Nance Beyer Nardy (UFRGS), que cederam três casais de camundongos para este fim.
Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Psicobiologia da UNIFESP com umidade e temperatura controladas, num ciclo claro/escuro de 12 horas, e com alimento e água ad libitum.
Machos e fêmeas heterozigotos (Idua +/-) foram submetidos ao cruzamento para a manutenção da colônia e obtenção do número necessário de animais. Após o desmame (a partir do 30º dia de vida), um pequeno fragmento das orelhas de cada camundongo proveniente destes cruzamentos foi coletado utilizando-se um cortador circular específico. Os fragmentos coletados foram usados para a identificação e genotipagem destes animais, com o fim de determinar a quais grupos os mesmos pertenciam (Idua +/+ ou Idua -/-).
Uma vez genotipados, camundongos machos e fêmeas de ambos os grupos, com idades de 3 e 6 meses foram utilizados nos experimentos
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descritos adiante. Todos os animais foram eutanasiados por decapitação ao atingirem as idades de interesse e passarem pelo teste da placa quente.
As condições de cuidado, manutenção e eutanásia dos animais foram previamente aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (CEP – UNIFESP), sob o número 122164 (Anexo A).
3.2. Genotipagem
Os fragmentos obtidos das orelhas dos camundongos foram utilizados para a extração de amostras de DNA, seguindo-se o protocolo de Truett et al., 2000. As amostras foram submersas em solução de NaOH (25mM) e EDTA (0,2mM), e em seguida foram aquecidas a 98°C por uma hora. Após esse período, foram resfriadas até que atingissem a temperatura de 15°C, para então serem adicionadas a uma solução de Tris-HCl (40mM, pH 5,5). Depois, foram centrifugadas por 3 minutos a 1073g, e armazenadas a temperatura de -20°C para posterior análise por PCR.
A genotipagem foi realizada por meio da amplificação de um fragmento do gene Idua por PCR, utilizando-se os primers GAGACTTGGAATGAACCAGAC (sense, 3' → 5’) e ATAGGGGTATCCTTGAACTC (antisense, 5' → 3’), como descrito por Baldo et al. em 2012. Em seguida, o produto da reação foi visualizado em gel de agarose (2%), como pode ser observado na Figura 1.
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Figura 1. Genotipagem. Exemplo de bandas resultantes da reação por PCR. Animal homozigoto normal (Idua +/+), heterozigoto (Idua +/-), e homozigoto mutado (Idua -/-), respectivamente.
3.3. Placa quente (hot plate test)
O teste da placa quente (hot plate test) foi utilizado para medir a latência da resposta nociceptiva a um estímulo térmico em animais selvagens e nocautes para o gene Idua. Os animais foram colocados individualmente sobre um aparato contendo uma placa de metal a temperatura de 53ºC (Ugo Basile, Biological Research Apparatus Company, Itália). Para que os animais se mantivessem na superfície aquecida durante todo o teste, um cilindro de acrílico foi posicionado sob a placa (Figura 2). Um timer era iniciado no momento em que o animal estivesse com as quatro patas apoiadas simultaneamente sobre a placa, registrando em segundos o tempo para que este exibisse a primeira reação ao estímulo térmico, como lamber uma das patas ou saltar. Imediatamente após ter exibido qualquer um dos comportamentos citados, o timer era pausado e o animal prontamente retirado da placa.
Para os camundongos que não responderam ao estímulo térmico, foi utilizado um período de latência máxima de 60 segundos, após o qual o animal
Idua +/- Idua -/-
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era retirado da placa quente, independentemente de apresentar ou não as reações descritas (Sternberg et al., 2005).
A cada utilização, a placa foi limpa com gaze e álcool 70% antes que uma nova análise fosse iniciada. Após a limpeza, quando necessário, aguardava-se que a placa voltasse a se estabilizar na temperatura de 53°C para que então se realizasse o próximo teste.
Figura 2. Placa quente (Ugo Basile, Biological Research Apparatus Company, Itália).
3.4. Comprimento dos fêmures
Após cuidadosa dissecção e limpeza dos fêmures, estes foram medidos em centímetros utilizando-se uma régua comum. Os pontos de referência utilizados para se obter as medidas das amostras foram aqueles de maior distância entre as epífises proximal e distal dos fêmures, como pode ser observado na Figura 3.
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Figura 3. Fêmures de animais Idua +/+ e Idua -/-, respectivamente, com 3 meses de idade. Pontos mais distantes entre as epífises proximal e distal do fêmur utilizados para determinar o comprimento em centímetros das amostras (setas).
3.5. Teste de flexão de três pontos (three-point bending test)
O teste de flexão de três pontos (three-point bending test), realizado em um aparelho de teste universal Instron (São Francisco, CA, modelo 4444, célula de carga 1KN), foi utilizado para avaliar as propriedades mecânicas do tecido ósseo de animais selvagens e nocautes com 3 e 6 meses de idade.
Após a eutanásia dos animais, ambos os fêmures foram coletados através de técnica cirúrgica simples, utilizando-se lâmina e bisturi. O tecido ósseo foi separado do tecido muscular até que as amostras estivessem limpas e com a menor quantidade possível de resíduos de tecidos adjacentes. Uma vez limpas, as peças foram armazenas em PBS, a -80°C.
Idua -/- Idua +/+
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Para a realização do teste, as amostras coletadas foram descongeladas à temperatura ambiente por aproximadamente 12 horas, e em seguida foram limpas com papel absorvente até que estivessem completamente secas. Os fêmures foram então posicionados em um suporte de metal em formato de “U”, desenvolvido especialmente para este fim, com distância de 1cm entre os braços de suporte para garantir apoio duplo nas diáfises ósseas, evitando assim o deslizamento da amostra durante a execução do teste (Figura 4). A célula de carga do aparelho foi posicionada perpendicularmente no ponto central de cada osso, e em seguida a força de flexão foi aplicada a uma deformação constante de 0,5cm/min até que ocorresse a fratura.
Figura 4. Aparelho de teste universal Instron (São Francisco, CA, modelo 4444, célula de carga 1KN). Célula de carga (seta) e suporte de metal (cabeça de seta).
A partir da curva de deformação dada pelo aparelho, foram obtidas as seguintes variáveis: carga máxima (N), força de fratura (N), módulo de elasticidade (MPa), tenacidade (J), e resiliência (J). Estes parâmetros refletem as propriedades mecânicas do tecido ósseo, como a combinação característica
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entre rigidez e elasticidade, fornecendo, portanto, informações sobre a qualidade da matriz óssea.
Individualmente, as variáveis obtidas referem-se a aspectos específicos do tecido ósseo. A variável carga máxima (N) refere-se a máxima tensão suportada pela amostra antes que ocorra fratura; força de fratura (N) se refere a carga necessária para causar fratura; módulo de elasticidade (Mpa) refere-se a capacidade do material de resistir à deformação e retornar a sua forma original quando a força exercida cessa; tenacidade (J) refere-se ao maior estresse suportado pela amostra sem que haja fratura; e resiliência (J) refere-se a maior quantidade de energia absorvida pelo material até refere-seu limite elástico sem que haja deformação permanente (Dalcin, 2007; Bogni, 2013).
Estas análises foram realizadas com a colaboraçãoo da Profa. Dra. Carla Christina Medalha (Universidade Federal de São Paulo, Campus Baixada Santista).
3.6. Análise morfológica
Para a análise morfológica foram utilizados fêmures de animais selvagens e nocautes com 3 meses de idade. Após coletados, os fêmures que não foram destinados ao teste de flexão foram armazenados em formol tamponado (10%) por 72 horas, e em seguida lavados em água corrente por 12 horas. Feita a lavagem, iniciou-se o processo de descalcificação das amostras, no qual o tecido ósseo foi imerso em solução desmineralizadora de EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) 0,5M tamponada em pH básico (7,0-7,4). Durante esta fase, as amostras permaneceram em frascos contendo solução
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de EDTA, que foi trocada a cada 48 horas para manter o processo de descalcificação em seu potencial máximo. A descalcificação teve duração máxima de 12 semanas, sendo dependente de confirmação através de teste com solução de oxalato de amônia a 5%).
Após a confirmação da descalcificação, as epífises proximais dos fêmures foram seccionadas e desidratadas em solução crescente de alcoóis (do 70% ao absoluto), diafanizadas em xilol e incluídas em Paraplast®, para que posteriormente se obtivesse secções tangenciais da epífise proximal do fêmur.
Foram realizados cortes em micrótomo (RM2125 RTS, Leica®, Germany) com espessura de 5µm, tendo estes sido dispostos em lâminas de vidro. Em seguida, foi realizado o processo de desparafinação para que se desse início às técnicas de coloração histológica.
Para a análise morfológica do tecido ósseo foi utilizada a técnica rotineira de coloração com Hematoxilina-Eosina (HE), tendo como propósito evidenciar os aspectos gerais da epífise proximal do fêmur dos animais de ambos os grupos, com ênfase na avaliação da cartilagem articular (Figura 5). As secções também foram coradas pelo método de Picro-Sirius para a análise das fibras colágenas dos tipos I e III, tendo estas sido avaliadas sob luz polarizada.
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Figura 5. Epífise proximal do fêmur de um animal selvagem (Idua +/+). Cartilagem articular da cabeça do fêmur (seta) e colo da cabeça do fêmur (cabeça de seta). Hematoxilina-Eosina. Barra=500µm.
Os espécimes foram analisados qualitativamente e comparados entre os grupos. As imagens foram capturadas com uma câmera Axiocam acoplada a um microscópio de luz (Axio Observer.D1 Zeiss®, Germany).
As análises descritas neste tópico foram realizadas com a colaboraçãoo da Profa. Dra. Flávia de Oliveira (Universidade Federal de São Paulo, Campus Baixada Santista).
3.7. Análise estatística
Os resultados obtidos para o comprimento dos fêmures e para as propriedades biomecânicas dos animais de 3 e 6 meses de idade dos grupos
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Idua +/+ e Idua -/- foram comparados separadamente através do teste de Mann-Whitney.
O teste de Kruskal Wallis foi utilizado para comparar os resultados obtidos no teste da placa quente para os grupos de animais de ambas as idades de interesse. Para todas as análises quantitativas, adotou-se o nível de significância de p<0,05
A análise morfológica dos fêmures de animais com 3 meses de idade de ambos os grupos foi realizada de forma qualitativa.
19 4. RESULTADOS
4.1. Placa quente (hot plate test)
A Figura 6 mostra os resultados obtidos para o teste de placa quente. Nenhum dos grupos apresentou diferença estatisticamente significativa no tempo de latência da resposta nociceptiva ao estímulo térmico quando comparados uns com os outros (p=0,1070).
Figura 6. Tempo de resposta ao estímulo nociceptivo térmico (s) dos animais dos grupos Idua +/+ e Idua -/- aos 3 e 6 meses de idade (3m e 6m), respectivamente. Linhas indicam as médias. n = 4 – 10 animais por grupo.
20 4.2. Comprimento dos fêmures
Os fêmures coletados dos camundongos de 3 e 6 meses de idade, dos grupos Idua +/+ e Idua -/-, foram medidos em centímetros e os resultados desta análise podem ser vistos na Figura 7.
Aos 3 meses de idade, os fêmures dos animais do grupo Idua -/- se mostraram menores em relação aos do grupo Idua +/+ (1,4cm ± 0,063, e 1,52cm ± 0,075, respectivamente). No entanto, aos 6 meses de idade essa diferença não foi observada.
Figura 7. Comprimento dos fêmures (cm), dos animais dos grupos Idua +/+ e Idua -/- aos 3 e 6 meses de idade (3m e 6m), respectivamente. Linhas indicam as médias. n = 5 – 9 animais por grupo. *p<0,05.
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4.3. Teste de flexão de três pontos (three-point bending test)
A Figura 8 (A e B) mostra os resultados obtidos para as variáveis carga máxima (N) e força de fratura (N), respectivamente. Os fêmures dos animais de 3 meses de idade pertencentes ao grupo Idua -/- apresentaram valores menores da variável carga máxima quando comparados aos animais do grupo Idua +/+ com a mesma idade (13,23N ± 2,57, e 18,53N ± 1,73, respectivamente; p=0,0159). Aos 6 meses de idade, esta diferença não foi observada, no entanto, o grupo Idua -/- apresentou grande variabilidade para este parâmetro (Figura 8A).
Para a variável força de fratura (N), observou-se diferença estatisticamente significativa apenas entre os animais com 6 meses de idade dos grupos Idua +/+ e Idua -/- (10,33N ± 2,34, e 5,79N ± 2,34, respectivamente; p<0.0001), como mostra a Figura 8B.
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Figura 8. Valores de (A) carga máxima e (B) força de fratura dos grupos Idua +/+ e Idua -/- aos 3 e 6 meses de idade (3m e 6m), respectivamente. Juntos, estes parâmetros refletem a resistência do tecido ósseo. Linhas indicam as médias. n = 3 – 13 animais por grupo. *p<0,05.
Os resultados para a variável módulo de elasticidade (MPa) podem ser observados na Figura 9. Aos 3 meses de idade, animais do grupo Idua -/- apresentaram menos elasticidade quando comparados aos animais do grupo Idua +/+ (0,042MPa ± 0,006, e 0,054MPa ± 0,006, respectivamente; p=0,0019).
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Para este mesmo parâmetro não houve diferença estatisticamente significativa entre os animais de 6 meses de ambos os grupos (Figura 9).
Figura 9. Valores de módulo de elasticidade (MPa) referente aos grupos Idua +/+ e Idua -/- aos 3 e 6 meses de idade (3m e 6m), respectivamente. Linhas indicam as médias. n = 9 – 12 animais por grupo. *p<0,05.
Os resultados para os parâmetros tenacidade (J) e resiliência (J) não apresentaram diferença estatisticamente significativa entre nenhum dos grupos, como mostra a Figura 10 (A e B, respectivamente).
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Figura 10. Valores de (A) tenacidade e (B) resiliência dos grupos Idua +/+ e Idua -/- aos 3 e 6 meses de idade (3m e 6m), respectivamente. Linhas indicam as médias. n = 3 – 10 animais por grupo.
25 4.4. Análise morfológica
A análise dos aspectos morfológicos da cartilagem articular e do osso subcondral das epífises proximais dos fêmures (grupos Idua +/+ e Idua -/-, aos 3 meses de idade) foi realizada através dos cortes histológicos, como pode-se observar na Figura 11.
Os animais do grupo Idua +/+ apresentaram configuração celular homogênea e com transição linear para a região de osso subcondral (Figura 11A). Já a transição das células entre a cartilagem articular e o osso subcondral dos animais Idua -/- é irregular quando comparada a dos animais selvagens com a mesma idade (Figura 11B). Observou-se ainda diminuição da quantidade de osso trabecular no colo da cabeça do fêmur no grupo Idua -/-, o que representa evidências de maior reabsorção trabecular.
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Figura 11. Cabeça do fêmur de um animal Idua +/+ (A) e Idua -/- (B), ambos aos 3 meses de idade.Cartilagem articular (**) com transição linear para a camada de osso subcondral em A (setas pequenas) e irregular em B. Diminuição da quantidade de osso trabecular em B (*). Hematoxilina-eosina. Barra = 200µm; n = 4 animais por grupo.
Em uma análise mais detalhada da cartilagem articular, foi possível identificar nos animais Idua +/+ (Figura 12A) as camadas articular, pré-condroblástica, hipertrófica e de osso subcondral. Nos animais Idua -/- (Figura 12B) pode-se observar uma desorganização destas camadas, bem como pouca distinção entre as mesmas; as camadas condroblástica e hipertrófica
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apresentaram-se aumentadas e com grande elevação da celularidade. Ainda, a camada de osso subcondral apresentou-se delgada nos animais Idua -/- quando comparada à do grupo Idua +/+.
Figura 12. Cartilagem articular da cabeça femoral de animais Idua +/+ (A) e animais Idua -/- (B), aos 3 meses de idade. Camadas celulares observadas: camada articular (a); camada pré-condroblástica (p); camada pré-condroblástica (c); camada hipertrófica (h); e camada de osso subcondral (s). Em B pode-se observar desorganização e aumento da celularidade nas camadas condroblástica e hipertrófica neste grupo. Hematoxilina-eosina. Barra = 100µm.
O colágeno presente na cartilagem articular dos fêmures foi analisado sob luz polarizada após coloração com Picro-Sirius. Foi possível identificar os tipos de fibras colágenas através da seleção de tonalidades alaranjadas ou amareladas (colágeno tipo I) e esverdeadas (colágeno tipo III).
A cartilagem articular da cabeça do fêmur apresentou aspecto em forma de malha em ambos os grupos, como pode ser visto nos diferentes recortes da Figura 13. A identificação do tipo de colágeno nas amostras do grupo Idua +/+ foi característica de uma mistura de fibras tipo I e tipo III no osso subcondral, enquanto que a malha presente na cartilagem articular apresentou
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predoninância de colágeno tipo III (Figura 13A). Já nos animais Idua -/-, observou-se predominância de fibras colágenas tipo I tanto no osso subcondral quanto na cartilagem articular (Figura 13D).
Figura 13. Cabeça femoral de animais Idua +/+ (A e B) e Idua -/- (C e D), aos 3 meses de idade. Em A, osso subcondral apresentando colágeno tipo I e III; em B (detalhe pontilhado ampliado), malha de colágeno predominantemente tipo III da cartilagem articular de animais Idua +/+. Em C, osso subcondral de animais Idua -/- apresentando colágeno tipo I; em D (detalhe pontilhado destacado), malha de colágeno predominantemente tipo I. Picro-sírius sob luz polarizada. A e C, barra = 200µm; B e D, barra = 50µm.
29 5. DISCUSSÃO
Pacientes com MPS I apresentam anormalidades na formação e crescimento ósseo, o que causa problemas osteomusculares importantes, como baixa estatura e diminuição da amplitude de movimento. Existem estudos caracterizando a histopatologia da MPS I (Clarke, 2011; Oliveira et al., 2013), no entanto, a correlação entre as alterações morfológicas e biomecânicas observadas na doença ainda não foi estabelecida.
Embora alterações neurológicas sejam frequentemente observadas em diferentes tipos de MPS, os resultados obtidos para o teste da placa quente sugerem que não há, ao menos nas idades de interesse estudadas, alterações da condução do estímulo doloroso provocado pelo calor.
Em relação à histopatologia das comorbidades musculoesqueléticas apresentadas pelos pacientes com MPS I, estudos anteriores mostraram que tais anormalidades são causadas por problemas no processo de remodelação óssea, pela desorganização na ossificação endocondral e intramembranosa, e pela infiltração de GAGs em ligamentos, tendões, cápsulas articulares, e outros tecidos (Gatto et al., 2012; Rowan et al., 2013). O acúmulo de tais moléculas nesses tecidos causa rigidez articular, contraturas musculares, e diminuição na amplitude de movimento
Assim como em pacientes com MPS I, alterações no crescimento linear de ossos longos e em seu formato foram observadas nos resultados da análise morfológica dos fêmures de camundongos nocaute para o gene Idua. Os animais do grupo Idua -/- tinham fêmures menores quando comparados com os do grupo Idua +/+ aos 3 meses de idade (Figura 7), o que significa que a
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progressão das comorbidades musculoesqueléticas no modelo animal é similar à observada em humanos com a doença. No entanto, não houve diferença no comprimento dos fêmures dos animais com 6 meses de idade, o que pode indicar que a taxa de crescimento ósseo em animais Idua +/+ possivelmente é menor dos 3 aos 6 meses quando comparados com animais Idua -/-. Indivíduos adultos com MPS I, podem apresentar estaturas que variam de baixa a normal, dependendo da gravidade da doença, o que novamente se correlaciona com a variabilidade dos dados observada nos dois grupos Idua -/-. Em contrapartida, também é possível que o número limitado de amostras no grupo Idua -/- tenha mascarado a diminuição na taxa de crescimento ósseo em relação ao grupo Idua +/+.
Referente aos resultados obtidos no teste de flexão de três pontos, foi obsevado que os fêmures dos animais de 3 meses do grupo Idua -/- apresentaram valores mais baixos para as variáveis carga máxima e elasticidade em relação aos animais da mesma idade do grupo Idua +/+. Este resultado sugere que nesta idade os fêmures de animais Idua -/- são menos resistentes e flexíveis do que os dos animais Idua +/+, o que teoricamente os tornam mais suscetíveis a fraturas. No entanto, apesar deste dado sugerir que o tecido ósseo é menos resistente, variáveis como tenacidade e resiliência não apresentaram difenças estatisticamente significativas quando comparadas entre si.
Similarmente aos achados referentes à matriz óssea de camundongos do grupo Idua -/- com 3 meses de idade, Chiaro et al. (2013) demonstrou que no modelo canino de MPS I, animais nesta idade também apresentam redução
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na quantidade de osso trabecular, assim como uma conversão tardia do tecido cartilaginoso em tecido ósseo, o que pode aumentar o risco de fraturas.
No teste de flexão de três pontos, somente para a variável força de fratura observou-se diferença estatiscamente significante em ambos os grupos de animais com 6 meses de idade, tendo o grupo Idua -/- apresentado valores mais altos para tal variável (Figura 8B). Embora não haja diferença estatística nos valores de carga máxima para os animais de 6 meses, é importante observar que o grupo Idua -/- apresentou uma média mais alta em comparação aos animais do grupo Idua +/+. A ausência de relevância estatística para os resultados obtidos neste parâmetro pode ter ocorrido devido à grande variabilidade dos dados dentro do mesmo grupo.
Em conjunto, os resultados obtidos sugerem que aos 6 meses de idade os fêmures dos animais Idua -/- podem ser mais resistentes do que aqueles dos animais Idua +/+. Os resultados obtidos para as variáveis elasticidade, tenacidade, e resiliência não corroboram com tais achados, mesmo tendo apresentado médias mais altas no grupo Idua -/-.
Na literatura atual, não há estudos publicados que sugiram que pacientes com MPS I apresentem menos lesões por fratura em relação a indivíduos saudáveis, porém, o acompanhamento dos pacientes no ambulatório do CREIM (Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo, UNIFESP) permite observar que estes têm poucos relatos de fraturas (Martins, comunicação pessoal). Isto pode ser justificado por uma maior dificuldade de mobilidade destes pacientes, o que, portanto, diminuiria o risco de quedas e fraturas, porém esta observação também corrobora nossos achados com os animais Idua -/- aos 6 meses de idade.
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Como visto em outros estudos (Clarke, 2011; Oliveira et al., 2013), as estruturas trabeculares ósseas apresentam alterações importantes nos modelos animais de MPS I, tendo estas também sido observadas neste estudo. A análise morfológica dos fêmures foi realizada apenas em animais Idua -/- e Idua +/+ aos 3 meses de idade, tendo o grupo de animais nocaute apresentado alterações significativas nas camadas de osso subcondral, celularidade aumentada, e transição irregular entre o tecido subcondral e a cartilagem articular, além de menor quantidade de osso trabecular no colo femoral, o que indica alta taxa de reabsorção trabecular óssea.
Como pode ser observado na Figura 13, os fêmures dos animais do grupo Idua -/- apresentaram predominância de fibras colágenas do tipo I, que são, normalmente, associadas a uma baixa elasticidade/flexibilidade, garantindo mais rigidez ao tecido. De fato, aos três meses de idade, o tecido ósseo dos animais Idua -/- se mostraram menos flexíveis no teste de flexão de três pontos, enquanto que amostras de animais com 6 meses de idade deste mesmo grupo suportaram cargas mais elevadas antes que ocorresse fratura. Isto sugere que, sendo de característica mais rígida e mais predominantes em animais Idua -/- aos 3 meses, fibras de colágeno tipo I são capazes de tornar o tecido ósseo dos mesmos mais resistentes à medida que a doença progride. Entretanto, é importante analisar a deposição de colágeno nestes animais em diferentes idades, para que se compreenda melhor como a progressão da MPS I afeta as propriedades biomecânicas do tecido ósseo.
Sendo o colágeno tipo I associado a tecidos fibróticos (Rosenberg et al., 2012), a predominância deste tipo de fibra na cartilagem articular de animais Idua -/- pode ser refexo da resposta inflamatória desencadeada pelo acúmulo
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de GAG característico da sídrome (Opoka-Winiarska et al., 2013; Simonaro et al., 2001; Simonaro et al., 2008).
Gatto et al. (2012), demonstrou que células multipotentes da medula óssea apresentam menor capacidade de se de diferenciarem em osteoclastos em modelos animais de MPS I, o que pode afetar as propriedades de elasticidade e rigidez do tecido ósseo. Além disso, o acúmulo do GAG pode ser tóxico para os tecidos articular e ósseo, causando então uma resposta inflamatória que desencadeia a apoptose de condrócitos (Clarke, 2011; Gatto et al., 2012; Morishita e Petty, 2011). Anormalidades ósseas causadas pelos fatores anteriormente mencionados podem também ser influenciadas por forças mecânicas exercidas de maneira inadequada devido a deformidades do tecido ósseo observadas na síndrome (Kim et al., 2015; Morishita e Petty, 2011).
Sendo a MPS I uma doença crônica e de curso progressivo, os modelos animais da síndrome apresentam danos teciduais mais aparentes um determinado período de tempo após o início do acúmulo de GAG. Outros estudos sugerem que as comorbidades ósseas estão melhores estabelecidas nos modelos murinos de MPS I dezessete semanas após o seu nascimento (Kim et al., 2015; Rowan et al., 2013).
É importante observar que para alguns dos parâmetros avaliados neste estudo, o número de amostras pode ter impacto na ausência de diferença estatística significativa.
Segundo Clarke (2008), é mais bem-sucedida e vantajosa uma abordagem ampla e que leve em consideração a importância de conhecer melhor os mecanismos fisiopatológicos da doença, ao invés de uma
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abordagem com foco exclusivo em seus sintomas. Esse tipo de abordagem ajuda o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que podem realmente promover um impacto positivo na qualidade de vida dos pacientes. Neste sentido, este estudo representa mais uma tentativa de expandir o conhecimento acerca da MPS I, de maneira a auxiliar futuramente no desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficientes.
35 6. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que as anormalidades claramente observadas no tecido ósseo e cartilaginoso de animais Idua -/- aos 3 meses tornaram os fêmures destes animais menos flexíveis e, portanto, mais susceptíveis a fraturas, enquanto que aos 6 meses de idade, os animais do mesmo grupo apresentaram maior resistência a forças exercidas sobre os mesmos, indicando que estes se tornam mais resistentes com o aumento da idade.
Apesar de pacientes com MPS I apresentarem, em alguns casos, alterações neurológicas, os dados obtidos neste trabalho sugerem que não há diferença na condução nervosa do estímulo doloroso aos 3 e 6 meses de idade no modelo murino de MPS I.
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41 7. ANEXOS
42 ABSTRACT
Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of inborn errors of metabolism (IEM), in which specific lysosomal enzymes that participate of glycosaminoglycan (GAG) degradation are deficient or inactive. Musculoskeletal impairment is an important component of the morbidity related to the disease, once it causes a major impact in patients’ health and life quality. Characteristics such as decreased enzyme activity and lysosomal storage in different types of cells are observed in MPS I murine models, making them an important and reliable tool for better understanding the pathogenic mechanisms of the disease. Despite all existing evidence regarding musculoskeletal alterations in MPS I, it is still unclear how these influence bone matrix quality and its biomechanical properties.
Objective: Evaluate the nociceptive response to heat in 3 and 6-month old wild type (Idua +/+) and MPS I knockout mice (Idua -/-), as well as bone matrix morphological, biomechanical, and histological properties.
Method: Nociceptive response to heat from 3 and 6-month old wild type (Idua +/+) and MPS I knockout mice (Idua -/-) was evaluated. In addition, morphological, biomechanical, and histological analysis of femurs from the same group of animals were perfomed.
Results and conclusions: No difference was observed in the nociceptive response to heat for all animal groups ang ages. Femurs from 3-month old Idua -/- mice were found to be smaller and less resistant to fracture when compared to their age matched controls. Also, at this age, femurs from 3month old Idua -/- mice presented important alterations in articular cartilage, trabecular bone
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architecture, and collagen types I and III deposition. At 6 months of age, femurs from Idua -/- mice were more resistant to fracture than those from Idua +/+. Our results suggest that the clear abnormalities observed in bone matrix and articular cartilage in 3-month old Idua -/- animals caused bone tissue to be less flexible and more likely to fracture, whereas in 6-month old Idua -/- group the ability to withstand more load before fracturing than wild type animals might suggest that at this age bones become more resistant than at 3 months of age.
Keywords: Mucopolysaccharidosis type I, mice, nociceptive response, biomechanical, bone, collagen.
