SemniárioI.I-Guião

Introdução

 Apresentar o trabalho começando por ler o título do artigo e referindo os autores

 Apoptosis versus cornification

 Porquê esta distinção?  Não são ambos morte celular?

 Porque será que na apoptose as células são eliminadas de imediato e na cornificação permanecem?

 Será que os mecanismos são diferentes?

Apoptose

Slide 1 - Processo de morte celular programada – demora apenas algumas horas.

Por sinalização interna ou externa, é desencadeada uma cascata de reacções, dando-se

a desintegração do citosqueleto e invólucro nuclear, a formação dos corpos

apoptóticos, o cessar da função dos organelos

Dois dos exemplos da importância da morte celular programada para o organismo humano, neste caso, na epiderme, são o ciclo de desenvolvimento e involução do folículo piloso e a morte programada de células da epiderme por danos no DNA.

As células da epiderme são as únicas do organismo directamente expostas à radiação UV, que danifica o DNA; processos apoptóticos em células com danos irreversíveis são essenciais na prevenção da proliferação de células cancerosas

Slide 2 – Via extrínseca – Sinal que vem do exterior, que activa receptores; formação do complexo DISC (Death Inducing Signaling Complex); Clivagem do Bid, membro da familia Bcl2 – migra para a membrana externa da mitocondria e induz libertação do citocromo C -> Activação do apoptossoma – APOPTOSE

Via intrínseca: Sinal vem do interior, danos no DNA. Estabiliza p53 (muito importante); activação do PUMA e NOXA, activa a Bax/Bak, que migram para a membrana mitocondrial externa, induzindo a libertação do citocromo c por um mecanismo ainda desconhecido - APOPTOSE

Slide 3 - Ao nível nuclear dá-se a clivagem dos cromossomas e consequente inviabilização do material genético Degradação do material genético é incompleta; clivagem do DNA internucleossomal por uma DNAse (CAD) activada por caspase. Assim, existem fragmentos nucleares nos corpos apoptóticos;

Slide 4 – Se se formam corpos apoptóticos, estrutura de suporte da célula, e que lhe dá a forma – o citoesqueleto - é destruida, com desintegração dos desmossomas e adesões focais, e a célula solta-se das células vizinhas e da matriz.

A ROCKI, da familia ROCKs – Rho-cinases - (previamente activada pela caspase 3), que se pensa ser um interveniente importante para o membrane blebbing e formação dos corpos apoptóticos

Slide 5 - A fase final do processo apoptótico consiste na fagocitose dos corpos apoptóticos por macrófagos. Este processo implica que a célula fagocítica reconheça a célula apoptótica; para tal, desde cedo no processo apoptótico, a célula expõe na membrana uma molécula de sinalização – a fosfatidilserina. (A rápida remoção dos restos celulares evita danos às células vizinhas e permite a reciclagem dos componentes celulares)

E na Cornificação??

Cornificação: processo de morte celular que ocorre na epiderme em que os corpos celulares não são eliminados porque desempenham uma função específica barreira celular

Citoesqueleto

 Foi visto que durante a apoptose se dá o desmantelamento do citoesqueleto nas células individuais

 Sabemos que o estrato córneo é uma barreira unificada  citoesqueleto tem que sofrer reorganização  formação de uma camada de células achatadas ligadas entre si que envolvem várias camadas celulares

 Redes de filamentos queratina e de actina associam-se a estruturas de adesão (desmossomas e adesões focais que vão ligar as células entre si)

 Os filamentos de queratina (maior componente do citoesqueleto dos queratinócitos) não é clivada  mantém integridade estrutural

 ROCK1 também é muito importante aqui - responsável por estabelecer a arquitectura organizada das actinas numa fase inicial (aqui não é clivada pela caspase-3, logo para ROCK1 induzir apoptose tem que estar em meio apoptótico)

 Já o ROCK2 é responsável pelo bloqueio do ciclo celular e expressão de marcadores de diferenciação final

 Complexo Rock – regulação equilíbrio entre diferenciação/proliferação

Transglutaminases

 Estas células são especiais têm um invólucro cornificado (filagrina, involucrina, lípidos) que constitui a barreira hídrica do corpo

 O que contribui para a sua formação?

 Transglutaminases (catalisam ligações entre proteínas) I, III, V

 Transglutaminase I (de membrana)  lado interno da membrana, crosslink proteico inicial

 Transglutaminase III e V (de citoplasma)  montagem do invólucro numa fase mais tardia do processo

Integrinas-β1

 Na apoptose as células podem dissociar-se do seu meio envolvente (anoikis)

 Essa associação costuma ser feita pelas Integrinas-β1

 Quando ficam desocupadas  sinal apoptótico

 Cornificação  migração camadas suprabasais  também há integrinas-β1 desocupadas

 Porque não há apoptose?  mecanismos anti-apoptóticos dos queratinócitos

Núcleo

 na cornificação, o núcleo é completamente degradado - ao microscópio óptico, é evidente a

não são detectados fragmentos de DNA nos corneócitos1

 não se conhecem bem as vias conducentes à destruição do núcleo na cornificação

 mostrou-se apenas que:

 desquamina, protease expressa na zona de transição entre os estratos granuloso e

córneo, degrada a matriz nuclear de núcleos isolados  DNA mais susceptível à actividade DNAse

 ainda não foi identificada a DNAse interveniente na cornificação

Factores de Transcrição

Família da P53

Para manter a viabilidade, as células decidem que genes transcrever ou não, sendo os factores de transcrição os mediadores deste processo. Como tal, a epiderme não é uma excepção!

 A família p53 é uma conhecida família de factores de transcrição, dos quais o p53 e o p63 são membros.

 O p53 é o mais bem caracterizado, comportando-se como um gene supressor de tumor. Como gene supressor de tumor é responsável por manter a integridade genómia da célula.

 Para verificar a importância de do p63 na queratinização foram feitas experiências que evidenciaram que ratinhos mutantes para o p63 apresentam malformações ao nível dos membros e da pele, bem como a falta de folículos pilosos e de dentes.

 Na realidade, ratinhos mutantes para p63 não possuem nenhum queratinócito.  Conclusões: a p63 tem papel crucial no desenvolvimento da epiderme.

Foram, igualmente, feitas experiências para determinar qual o papel do p53

 Foi feita uma experiência onde em ratinhos mutantes para os dois genes de p53 (p53-/-), observou-se que o número de células apoptóticas após exposição UV era apenas 20% dos ratinhos wild-type.

 Na ausência ou na inactivação do referido factor de transcrição (p53), a quantidade de células com DNA danifica que destinadas à apoptose é menor, o que faz com que uma menor quantidade de células danificadas sejam destruídas.

 Verificou-se também que os ratinhos mutados apresentavam um desenvolvimento normal, e o seu processo de formação da epiderme não era prejudicada

 Conclusões: O factor de transcrição p53 tem um importante papel na apoptose induzida por UVB. Por activar a apoptose, o p53 protege o organismo contra a acumulação de células defeituosas que poderiam vir a evoluir para células cancerígenas. Mas não interfere na diferenciação

1 _{Não há evidência de DNA laddering e raramente se observam células TUNEL-positivas (estes métodos detectam}

Conclusão geral: os membros da família dos factores de transcrição p53 desempenham

papéis fundamentais na transdução dos sinais que conduzem à apoptose e diferenciação de queratinócitos. Na sinalização apoptótica, é principalmente o p53 que está implicado, não tendo um papel óbvio na diferenciação epidérmica, enquanto que, a diferenciação dos queratinócitos a actividade da p63 tem um papel crucial.

Família NF-Kb

Também se foi estudar a família dos NF-kB

Inibiu-se o NF-kB  morte prematura dos queratinócitos

NF-kB MUITO IMPORTANTE na inibição da apoptose em queratinócitos  também

actua como regulador positivo da progressão do ciclo celular  consequente

diferenciação

Mitocôndria

 na apoptose, há actuação das Bcl-2 que levam à libertação do citocromo c da mitocôndria

 é interessante verificar que na epiderme, apesar de a maior parte das células não entrar em

apoptose, há expressão de proteínas da família Bcl-2 e há libertação do citocromo c

 várias investigações tiveram como objecto de estudo esta aparente contradição: nos

queratinócitos, que, para cumprirem a sua função, não devem sofrer apoptose, verificam-se processos relacionadas com a apoptose

 Bcl-2 tem membros pró e anti-apoptóticos (Bcl-2 e Bcl-XL)

 A imagem mostra a análise imunohistoquímica do padrão de expressão Bcl-XL na pele

humana:

 intensa coloração dos queratinócitos das camadas mais superficiais = maior expressão

Bcl-XL

 é do balanço entre as actividades anti e pró-apoptóticas destas e doutras proteínas que depende a sobrevivência das células até à sua descamação

 Estudou-se então a importância dos Bcl-2 na diferenciação

 ratinhos knockout para quaisquer membros da família Bcl-2  não há anomalias na

formação da pele  diferenciação dos queratinócitos não deverá envolver a clássica via apoptótica, que é regulada por membros da família Bcl-2

 ratinhos transgénicos com superexpressão Bcl-2  fenótipo cutâneo normal [imagem2] e menos células apoptóticas induzidas por UVB

 gráfico: há menor evidência de apoptose no ratinho transgénico que no controlo, qualquer que seja a energia da radiação

 Conclusão: proteínas da família Bcl-2 são importantes na apoptose dos queratinócitos

(como na de qualquer célula), mas não são necessários à diferenciação dos queratinócitos

 Vimos também que há libertação do citocromo c

 não conduz a um fenótipo apoptótico clássico

 conduz, sim, à activação de factores de transcrição e à expressão genética

 Porquê??

 os níveis de citocromo c devem ser baixos no citosol

 ao longo da diferenciação dos queratinócitos devem produzir-se níveis significativos de proteínas anti-apoptóticas

 NF-kB

 expressão constitutiva de hsp70 e hsp90, ambas heat-shock proteins3

 inibição da formação do apoptossoma

Caspases

Sendo a cornificação um processo que envolve degradação de componentes celulares, são necessárias proteases. Será que são as mesmas que na apoptose?

Caspases são um tipo de proteases

Diferentes caspases são expressas na EPIDERME, mas sem evidência de participar na cornificação

Caspase-3: diferenciação embrionária dos queratinócitos

Caspase-14: única que se expressa na pele e está activa durante a cornificação

Esta experiência que vamos referir é tirada de um artigo de 2009 dos mesmos autores:

Ratinhos deficientes em caspase-14  defeitos no estatro córneo (Aumento da perda de água e sensibilidade UV) CASPASE-14 É NECESSÁRIA AO BOM DESENVOLVIMENTO DO ESTRATO CÓRNEO (não apoptótica)

Catepsina D

2

O estrato basal está intensamente corado devido a métodos de imunolocalização para a proteína Bcl-2

3 _{Proteínas que têm expressão aumentada quando as células são submetidas a elevadas temperaturas ou a outros}

Também se estudaram as catpsinas… decidimos focar a catepsina D, porque

desempenha diferentes papéis na apoptose e na cornificação.

Na apoptose desempenha um duplo papel: pró e anti-apoptótico.

Na cornificação



experiências com ratinhos deficientes em catpsina D defeitos no desenvolvimento do invólucro cornificado  catpsina D importante para activar a transglutaminase 1

Destino final dos Corpos Celulares

 Em contraste com as células apoptóticas, os corneócitos não são fagocitadas por outras células.

 Quando os corneócitos são substituídos pelos queratinócitos diferenciados da camada subjacente, os componentes dos corneodesmossomas ou desmossomas dos corneócitos da camada mais externa são proteoliticamente degradados por proteases que permanecem inactivas até este estágio final da formação da pele.

 Por fim, as células são descamadas para o ambiente.

 A pele também contem células fagocíticas competentes, as células de Langerhans, contudo não fagocitam os queratinócitos…

 Não se sabe, porque ainda não é claro se, na fase terminal de diferenciação, expõe fosfatidilserina na sua superfície (a molécula sinalizadora das células apoptóticas

Conclusões

 Apoptose e cornificação  Homeostasia

 Apoptose  entre outras, eliminação de células mutadas (prevenção de tumores)

 Cornificação  células permanecem e ficam a desempenhar a sua função barreira

 Slide 2 - são ambos processos de morte celular  semelhanças  Alterações núcleo, DNA, citoesqueleto, Actividade proteolítica….

 Mas também têm diferenças  Apoptose células individuais; cornificação conjunto de células; Apoptose células fagocitadas; cornificação células ficam a desempenhar a sua função barreira; e também a maioria das vias moleculares como vimos

 Questões????

Nota: o que se encontra sublinhado a amarelo são informações adicionais que achámos não

ser necessário ser referidas; as notas de rodapé são também informações adicionais, sendo necessário referir apenas o que são as heat-shock proteins