UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
Guilherme Lopes do Lago
Hidrogéis termo e pH-responsivos baseados em queratina e PNIPAAm
CAMPINAS
2017
Guilherme Lopes do Lago
Hidrogéis termo e pH-responsivos baseados em queratina e PNIPAAm
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Físico-Química.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Isabel Felisberti
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO GUILHERME LOPES DO LAGO, E ORIENTADA
PELA PROFA. DRA. MARIA ISABEL FELISBERTI.
CAMPINAS
2017
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química Camila Barleta Fullin - CRB 8462
Lago, Guilherme Lopes do,
L137h LagHidrogéis termo e pH-responsivos baseados em queratina e PNIPAAm / Guilherme Lopes do Lago. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
LagOrientador: Maria Isabel Felisberti.
LagDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Lag1. Hidrogel. 2. Queratinas. 3. Poli(N-isopropilacrilamida). 4. Materiais inteligentes. I. Felisberti, Maria Isabel, 1959-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Thermo and pH-responsive hydrogels based on keratin and
PNIPAAm Palavras-chave em inglês: Hydrogel Keratins Poly(N-isopropylacrylamide) Smart materials
Área de concentração: Físico-Química
Titulação: Mestre em Química na área de Físico-Química Banca examinadora:
Maria Isabel Felisberti [Orientador] Edvaldo Sabadini
Eliana Aparecida de Rezende Duek
Data de defesa: 28-11-2017
Programa de Pós-Graduação: Química
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Isabel Felisberti (Orientadora)
Profa. Dra. Eliana Aparecida de Rezende Duek (PUC-SP)
Prof. Dr. Edvaldo Sabadini (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da
Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno
GUILHERME LOPES DO LAGO, aprovada pela
Comissão Julgadora em 28 de novembro de 2017.
A meus queridos pais que, desde criança, me ensinaram que a educação é o mais valioso tesouro.
Agradecimentos
Após este período não poderia deixar de agradecer algumas pessoas fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho.
- À professora Bel pela orientação. Sem sua atenção, comprometimento e paciência o desenvolvimento deste trabalho não seria possível. Sempre vou me lembrar como exemplo de professor, orientador e profissional.
- À Mariana pelo apoio constante, pela preocupação e principalmente por fazer meus dias mais doces.
- À minha família, meus pais e irmã que sempre incentivaram meus estudos e acreditaram em mim.
- Ao Instituto de Química e à Unicamp, pelo comprometimento na formação de cientistas no Brasil.
- Ao grupo Solvay que entende a necessidade da formação de cientistas no país e me incentivou para que eu chegasse até aqui. Aqui incluo agradecimentos especiais à Alcidinéa Pereira e Greice Macarovscha por cederem seu tempo e ajudarem no desenvolvimento deste trabalho.
- Aos meus amigos que me apoiaram nesta jornada, tanto em bate-papos científicos quanto não científicos. Sempre bom tê-los por perto.
RESUMO
Híbridos baseados em queratina hidrolisada e funcionalizada com grupos vinílicos e poli(N-Isopropilacrilamida) (PNIPAAm) foram preparados por polimerização radicalar em solução aquosa. A queratina hidrolisada foi previamente funcionalizada com grupos vinílicos, resultantes da reação entre os grupos ácido carboxílicos pendentes na cadeia proteica com o 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido (graus de funcionalização de 50%, 75% e 100%). A polimerização do NIPAAm em presença da queratina funcionalizada, atuando como reticulante, foi conduzida a 60°C por 24 horas, utilizando persulfato de amônia (APS) como iniciador radicalar. Alternativamente empregou-se o sistema ácido ascórbico (AAs) e H2O2 como iniciador e, neste caso, a polimerização foi conduzida a temperatura de 25°C por 24 horas. Os híbridos produzidos a partir das duas rotas de síntese, séria HT e LT, respectivamente, apresentaram alta capacidade de sorção de água em solução, gerando hidrogéis porosos.
A polimerização a 60°C resultou em separação de fases devido ao comportamento LCST de solução de PNIPAAm, acarretando em uma menor incorporação da queratina aos híbridos. Os híbridos PNIPAAm/queratina, após lavagem com água e secagem, foram caracterizados com respeito à composição e propriedades térmicas. O intumescimento dos híbridos em água destilada e em soluções aquosa a diferentes pH’s resultou em hidrogéis com capacidade de intumescimento dependente da temperatura e do pH (termo e pH-responsivos). A temperatura crítica (LCST) para os hidrogéis se manteve na faixa de temperatura entre 30°C – 35°C, similar à soluções aquosas do PNIPAAm. O intumescimento máximo foi a pH 4,75, devido ao balanço de cargas dos grupos amina e ácido carboxílico na rede polimérica. Os hidrogéis apresentaram comportamento viscoelástico, suportando pressão em torno de 3500 Pa. Também apresentaram capacidade de adsorção de íons Cu2+, sendo que os híbridos produzidos a partir de queratinas com menor grau de funcionalização apresentaram maior capacidade de adsorver cátions Cu2+.
ABSTRACT
Hybrids based on hydrolyzed with vinyl groups functionalized keratin and poly(N-Isopropylacrylamide) (PNIPAAm) were synthetized by radicalar polymerization in aqueous solutions. Hydrolyzed keratin was previously functionalized with vinyl groups, resulting from the reaction of the carboxylic acid groups pendent of the protein chain with 4-vinyl-1-cyclohexene 1,2-epoxyde (degrees of functionalization of 50%, 75% and 100%). NIPAAm was polymerized in presence of different amount of functionalized keratin as crosslinker and ammonium persulfate as initiator at 60°C and 24 hours. Alternatively ascorbic acid and H2O2 system was used as radical initiator system, and the polymerization was conducted at room temperature for 24 hours. The hybrids produced by these two routes of synthesis, HT and LT series, respectively, presented high water absorption capacity in solution leading porous hydrogels.
The polymerization at 60°C resulted in phase separation due to LCST behavior of PNIPAAm solutions, leading to a smaller incorporation of keratin to the hybrids of the HT series. The PNIPAAm/keratin hybrids, after washing with water and drying, were characterized regarding its composition and thermal properties. The swelling of the hybrids in distillated water and in aqueous solutions of different pH’s resulted in hydrogels with high swelling capacity sensitive to temperature and pH (thermo and pH sensitive). The critical temperature (LCST) of the hydrogels was in the range of temperature between 30°C – 35°C, similar to aqueous solutions of PNIPAAm. The maximum swelling was at pH = 4,75, due to the balance of charges of amine and carboxylic acid groups in the polymer network. The hydrogels showed viscoelastic behavior, supporting a maximum pressure of approximately 3500 Pa. The hydrogels also showed to be capable to adsorb Cu2+ cations, being this capacity higher for hydrogels produced using keratin with lower functionalization degree.
Lista de Figuras
Figura 1: Classificação dos hidrogéis...18 Figura 2: Classificação dos smart hydrogels quanto à sua resposta a estímulos externos..19 Figura 3: Comportamento de hidrogéis termorresponsivos com a temperatura...21 Figura 4: Representação bidimensional da estrutura da queratina...23 Figura 5: Metodologias de hidrólise da queratina. Sulfitólise, hidrólise oxidativa e hidrólise seguida de reação com agentes de proteção das sulfidrilas...25 Figura 6: Reticulação das cadeias proteicas com éteres de diglicidila...26 Figura 7. Condições de polimerização empregadas na síntese dos híbridos...29 Figura 8: Condições de polimerização empregadas na síntese dos hidrogéis através das duas metodologias utilizadas...23 Figura 9: Representação da estrutura química da queratina, os radicais R representam os resíduos dos aminoácidos com carga neutra, R’ os resíduos dos aminoácidos com grupos funcionais ácidos carboxílicos e R’’ os resíduos dos aminoácidos com grupos funcionais amina...34 Figura 10: Cromatograma (GPC) obtido para a queratina bruta...35 Figura 11: Funcionalização da queratina com o 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido através do resíduo do aminoácido ácido aspártico (Asp)...36 Figura 12: Espectros de FTIR da queratina antes (a) a após funcionalização de 50 (b), 75 (c) e 100 (d) mol% de seus grupos funcionais ácido carboxílico...38 Figura 13: Curvas de (A) TGA e (B) DTG da queratina antes (a - verde) após funcionalização de 50 (b - azul), 75 (c - vermelho) e 100 (d - preto) mol% de seus grupos funcionais ácido carboxílico...40 Figura 14: Curvas de (A) primeiro aquecimento, (B) resfriamento e (C) segundo aquecimento para a queratina bruta...41 Figura 15: Curvas de DSC da queratina após funcionalização de (a) 50, (b) 75 e (c) 100 mol% de seus grupos funcionais ácido carboxílico de (A) primeiro aquecimento, (B) resfriamento e (C) segundo aquecimento...42 Figura 16: Oxi-redução do persulfato de amônio resultando em radicais livres...43 Figura 17: (A) Meio reacional inicial – solução aquosa de queratina e PNIPAAm a 10% de sólidos – a 25°C e (B) após adição de APS e aquecimento a 60°C por aproximadamente 3 horas...44 Figura 18: Formação de radicais livres entre o sistema H2O2/Ácido Ascórbico...44
Figura 19: Razão molar (RM) AAs/NIPAAm versus Razão molar H2O2/NIPAAm empregada na polimerização do sistema PNIPAAm/queratina. A região destacada pelo círculo em vermelho representa as condições que resultaram em géis...45 Figura 20: Formação da rede híbrida reticulada entre queratina e PNIPAAm a partir da reação de polimerização...46 Figura 21: Fotografias dos hidrogéis (A) LT (100) – 20% e (B) HT (100) – 20% logo após etapa de síntese...49 Figura 22: Espectros de FTIR obtidos para as redes híbridas secas das séries (A) HT 10%, (B) LT 10%, (C) HT 20% e (D) LT 20%. Hidrogéis preparados com queratinas (a) 50%, (b) 75% e (c) 100% funcionalizadas...50 Figura 23: Espectros de FTIR obtidos para (a) PNIPAAm, (b) híbrido LT (100) – 20% e (c) queratina 100% funcionalizada...51 Figura 24: Curvas de TGA obtidas para os híbridos preparados com 10% de queratina funcionalizada. Curva de (A) 35 – 700°C e zoom entre (A) 200 – 415°C e (C) 400 – 600°C...53 Figura 25: Curvas de TGA obtidas para os híbridos preparados com 10% de queratina funcionalizada. Curva de (A) 35 – 700°C e zoom entre (B) 200 – 415°C e (C) 400 – 600°C...54 Figura 26: Curvas de DTG obtidas para híbridos preparados com 10% de queratina funcionalizada...55 Figura 27: Curvas de DTG obtidas para híbridos preparados com 20% de queratina funcionalizada...55 Figura 28: Curvas de DSC dos híbridos. (A) 1° aquecimento, (B) resfriamento e (C) 2° aquecimento. (a) HT (50) – 10%, (b) HT (75) – 10%, (c) HT (100) – 10%, (d) LT (50) – 10%, (e) LT (75) – 10% e (f) LT (100) – 10%...56 Figura 29: Curvas de DSC dos híbridos. (A) 1° aquecimento, (B) resfriamento e (C) 2° aquecimento. (a) HT (50) – 20%, (b) HT (75) – 20%, (c) HT (100) – 20%, (d) LT (50) – 20%, (e) LT (75) – 20% e (f) LT (100) – 20%...57 Figura 30: Coeficientes de intumescimento vs. temperatura para a série (A) HT 10%, (B) LT 10%, (C) HT 20% e (D) LT 20%. Hidrogéis preparados com queratina (▲) 50%, (●) 75% e (■) 100% funcionalizada...60 Figura 31: Fotografias do hidrogel “HT (50) – 20%” na temperatura de (A) 5°C e (B) 45°C...61 Figura 32: Coeficiente de intumescimento em água a 25°C para os híbridos da série (■) HT – 10%, (●) HT – 20%, (▲) LT – 10% e (▼) LT – 20% ...62
Figura 33: Representação de uma rede polimérica real com: presença de ciclos intracadeias no reticulante macromolecular (destacado em verde), ciclos intercadeias no reticulante macromolecular (destacado em preto), entrelaçamento físico entre a cadeia do polímero e do reticulante macromolecular (destacado em azul) e reticulação regular entre uma cadeia de polímero e uma cadeia do reticulante macromolecular (destacado em vermelho). Adaptado da referência 102...63
Figura 34: Coeficientes de intumescimento vs. pH a 25°C para a série HT 10% (A), LT 10% (B), HT 20% (C) e LT 20% (D). Hidrogéis preparados com queratina (■) 50%, (●) 75% e (▲) 100% funcionalizada...66 Figura 35: Coeficientes de intumescimento vs. Iônica para solução de eletrólitos pH = 7,2 (Ι = 0,2M) e água destilada (Ι < 0,01) a 25°C para a série HT 10% (A), LT 10% (B), HT 20% (C) e LT 20% (D). Hidrogéis preparados com queratina (■) 50%, (●) 75% e (▲) 100% funcionalizada...67 Figura 36: Curva de tensão (PA) versus deformação específica (e) obtidas nos ensaios de compressão. (a) LT (100) – 20%, (b) HT (75) – 20%, (c) LT (75) – 20% e (d) HT (100) – 20%...68 Figura 37: (A) Módulo de Young e (B) σmax em função da concentração de nós de reticulação...71 Figura 38: Coeficiente de partição de íons Cu2+ nos hidrogéis em função da concentração de queratina...74 Figura 39: Micrografia de MEV obtidas para os materiais resultantes da liofilização dos materiais (A) LT (100) – 20% e (B) HT (100) – 20%. Ampliação de 4000x...75
Lista de Tabelas
Tabela 1: Distribuição dos resíduos da queratina provenientes de diferentes fontes (% molar)...23 Tabela 2: Composição, condições de síntese de nomenclatura adotada para os hidrogéis...30 Tabela 3: Índices de acidez, amina e sulfidrila e massas molares da queratina bruta...34 Tabela 4: Número de grupos funcionais ácido carboxílico por cadeia proteica e distância entre os pontos de reticulação das queratinas após funcionalização...36 Tabela 5: Resultado das análises termogravimétricas e de DSC para as queratinas bruta e funcionalizadas...43 Tabela 6: Teores de Queratina, % de incorporação e concentração de pontos de reticulação...48 Tabela 7: Resultados das análises de DSC e TGA dos híbridos...58 Tabela 8: Módulo de Young, % recuperação da dimensão inicial após ciclo de deformação (R), tensão máxima suportada pelo hidrogel e ciclo em que cada um se rompeu...70 Tabela 9. Resultados dos ensaios de adsorção de cátions metálicos pelos hidrogéis...73
Lista de Abreviaturas e Siglas
AAS: ácido ascórbico APS: persulfato de amônia Asp: ácido aspártico
Đm: dispersidade
DNTB: ácido (5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico)) DSC: calorimetria diferencial de varredura DTG: derivada da curva de TGA
FTIR: espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier GPC: cromatografia por permeação em gel
HEMA: 2-hidroxietilmetacrilato HT: high temperature
ICP-OES: espectroscopia por emissão óptica K: coeficiente de partição
LCST: Lower Critical Solution Temperature LT: low temperature
MEV: microscopia eletrônica de varredura MMA: metacrilato de metila
Mn: massa molar média numérica Mw: massa molar média mássica NIPAAm: N-Isopropilacrilamida NVP: N-vinil-2-pirrolidona PA 6: poliamida 6
PAA: poli(ácido acrílico)
PDEAEMA: poli(metacrilato de dietilaminoetila) PDMAEMA: poli(metacrilato de dimetilaminoetila) PEG: polietileno glicol
PEO-PPO-PEO: poli(etileno oxido-propileno oxido-etileno oxido) PMMA: poli(metacrilato de metila)
PNIPAAm: poli(N-isopropilacrilamida) PNVIBA: poli(N-vinilisobutilamida) PP: polipropileno
PVME: poli(vinil metil éter) q: coeficiente de intumescimento
R: recuperação da altura inicial do hidrogel após ciclo de compressão – descompressão no ensaio de TMA
RM: razão molar
σmax: tensão máxima necessária para romper o hidrogel durante compressão na análise de TMA
Tg: temperatura de transição vítrea TGA: análise termogravimétrica TMA: análise termomecânica
Sumário 1. Introdução...17 1.1 Hidrogéis...17 1.2 Smart Hydrogels...18 1.3 PNIPAAm...21 1.4 Queratina...22 1.5 Objetivos...26 1.6 Estratégia Adotada...26 2. Parte Experimental...27 2.1 Materiais...27
2.2 Funcionalização e Caracterização da Queratina... 27
2.2.1 Caracterização da Queratina Bruta... 27
2.2.2 Funcionalização...28
2.2.3 Caracterização da Queratina Funcionalizada...28
2.3 Preparação e Caracterização dos Hidrogéis Híbridos... 29
2.3.1 Preparação...29
2.3.2 Caracterização dos Híbridos de Queratina e PNIPAAm...30
2.3.3 Caracterização dos Hidrogéis de Queratina e PNIPAAm...31
3. Resultados e Discussão...33
3.1 Caracterização da Queratina Bruta...33
3.2 Funcionalização da Queratina...35
3.3 Caracterização da Queratina Funcionalizada...37
3.3.1 FTIR...37
3.3.2 Propriedades Térmicas (DSC e TGA) ...38
3.4 Hidrogéis Híbridos...43
3.4.1 Preparação dos Hidrogéis...43
3.4.2 Caracterização dos Híbridos...46
3.4.2.1 Incorporação da Queratina...46
3.4.2.2 FTIR...49
3.4.2.3 Propriedades Térmicas (DSC e TGA) ...51
3.4.3.1 Intumescimento vs. Temperatura...59
3.4.3.2 Intumescimento vs. pH...64
3.4.3.3 Propriedades Mecânicas (TMA) ...68
3.4.3.4 Adsorção de Metais...71
3.4.3.5 Microscopia Eletrônica de Varredura...74
4. Conclusão...76
5. Referências...78
6. Anexos...88
6.1 Anexo A – Dados de Titulação Potenciométrica – Queratina e Híbridos...88
1. Introdução
1.1 Hidrogéis
Hidrogéis foram definidos, ao longo dos anos, de diferentes maneiras por pesquisadores, sendo a definição mais comum a de que um hidrogel é uma rede polimérica reticulada resultante da reação entre um ou mais monômeros e capaz de sorver grandes quantidades de água [1]. Outra definição normalmente utilizada é de que um hidrogel é um material polimérico que apresenta habilidade de sorver e reter uma fração significante de água em sua estrutura, entretanto não é solúvel neste solvente [1]. Estes materiais mantém sua integridade tridimensional através de ligações cruzadas ou reticulações (crosslinking) entre as cadeias poliméricas, sendo que os nós de reticulação podem ser químicos, por meio da formação de ligações covalentes, ou físicos, por meio de interações como ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals [2]. A quantidade de água que poder ser absorvida por um hidrogel está relacionada com a presença de alguns grupos hidrofílicos, tais como COOH, OH, CONH2, CONH e SO3H, ligados à cadeia carbônica do polímero [2].
Após o desenvolvimento dos primeiros hidrogéis sintéticos por Wichterle e Lim em 1954 [3], estes materiais passaram a ser utilizados em produtos de higiene [4], na agricultura [5]
, em sistemas de drug delivery [4, 6], no desenvolvimento de elastômeros super absorventes [7], como neve artificial [4], como aditivos no mercado alimentício [8], em aplicações biomédicas, tais como engenharia de tecidos [9 – 11], etc. Devido a esta vasta gama de aplicações, estes materiais têm sido alvo de crescente interesse nas últimas décadas [1].
Para a preparação de um hidrogel são necessários monômeros(s), iniciador de polimerização e agente(s) de reticulação. A polimerização, para a produção destes materiais, pode ser em bulk, em solução, em suspensão, por irradiação ou mesmo através de enxertamento de monômeros hidrofílicos em algum suporte. Em geral, após a etapa de polimerização o material é extensivamente lavado, para a retirada de monômeros não reagidos, iniciadores de polimerização e outros possíveis aditivos que não tenham sido incorporados à matriz polimérica [1].
Quanto à classificação, os hidrogéis podem ser classificados com base em vários critérios. Por exemplo, os hidrogéis podem ser classificados com respeito à biodegradabilidade, à natureza da reticulação, ao método de preparação, às propriedades físicas, à carga iônica e à sua fonte (naturais, sintéticos ou híbridos) [2]. Na Figura 1 está apresentado um diagrama de classificação de hidrogéis proposto por Alpesh Patel e Kibret Mequanint [2].
Figura 1. Classificação dos Hidrogéis, adaptado da referência 2.
1.2 Smart Hydrogels
Os hidrogéis classificados como smart hydrogels ou hidrogéis inteligentes são passíveis de alterações acentuadas e abruptas na capacidade de intumescimento, na estrutura da rede polimérica, na permeabilidade e nas propriedades mecânicas em resposta alterações no ambiente em que o hidrogel se encontra [2].
Estes hidrogéis podem apresentar alterações em suas propriedades ou ser responsivo à estímulos externos tais, como variação de pH, temperatura, pressão, campos elétricos e magnéticos, luz, concentração de enzimas, etc. A classificação dos smart
hydrogels, proposta por Alpesh Patel e Kibret Mequanint [2] está apresentada na Figura 2.
Figura 2. Classificação dos smart hydrogels quanto à sua resposta a estímulos externos, adaptado da referência 2.
Os hidrogéis sensíveis ao pH apresentam, em sua cadeia carbônica, grupos iônicos que podem aceitar e/ou doar prótons em resposta à variação do pH do meio [12]. Em pH’s próximos ao pKa ou pKb destes grupos iônicos ocorre uma grande variação no volume do hidrogel. Esta variação de volume deve-se, em parte, à repulsão eletrostática, no caso de geração de cargas, entre os grupos ionizados, e ao aumento da pressão osmótica favorecendo o intumescimento [2]. Os hidrogéis responsivos ao pH podem ser aniônicos ou catiônicos, sendo que os aniônicos apresentam grupos como ácido carboxílico ou ácido sulfônico ligados à cadeia carbônica [13 – 17], e a desprotonação irá ocorrer quando o pH do meio for superior ao pKa do ácido, levando à ionização destes grupos e consequentemente
a um aumento na capacidade de intumescimento do hidrogel [2]. Já os hidrogéis catiônicos apresentam em sua cadeia carbônica grupos funcionais amina [18], e a ionização ocorre em pH’s inferiores ao pKb destes grupos funcionais [2]. Dois fatores majoritários controlam o grau de intumescimento desta classe de hidrogéis. O primeiro está relacionado à estrutura do polímero, como carga iônica, concentração e pKa ou pKb dos grupos ionizáveis, grau de ionização, densidade de reticulação e hidrofilicidade e/ou hidrofobicidade. O segundo fator está relacionado ao meio em que o hidrogel está inserido: pH, força iônica e natureza do contra íon [19]. Na literatura há relatos de hidrogéis sensíveis ao pH baseados em poli(ácido vinil sulfônico) [20], poli(ácido acrílico) (PAA) [21, 22], poli(metacrilato de dietilaminoetila) (PDEAEMA) [23] e poli(metacrilato de dimetilaminoetila) (PDMAEMA) [24, 25].
Os hidrogéis sensíveis à temperatura podem apresentar resposta positiva ou negativa com a temperatura, sendo que os mesmos são classificados desta maneira. Hidrogéis com resposta positiva ao aumento de temperatura apresentam uma transição de fases caracterizada por uma temperatura crítica superior de solução (upper critical solution
temperature, UCST, em inglês). Hidrogéis do tipo UCST se contraem quando resfriados a
temperaturas menores que sua temperatura crítica, diminuindo sua capacidade de intumescimento [2]. Já os hidrogéis com resposta negativa ao aumento de temperatura são os que apresentam temperatura crítica inferior de solução (lower critical solution
temperature, LCST). Hidrogéis do tipo LCST se contraem quando aquecidos acima de sua
temperatura crítica, diminuindo sua capacidade de intumescimento [2]. A temperatura crítica de hidrogel pode ser modulada através de sua copolimerização com monômeros polares, levando ao aumento da temperatura crítica, ou apolares, levando à diminuição da temperatura crítica [2]. A adição de monômeros hidrofílicos ou hidrofóbicos por enxertia na cadeia polimérica não leva a alteração na temperatura crítica [26].
As moléculas de água no interior de um hidrogel formam ligações de hidrogênio com os grupos polares do polímero e se organizam ao redor dos grupos hidrofóbicos, sendo que na temperatura crítica as interações por ligações de hidrogênio entre o polímero e a água se tornam menos favoráveis que a interação água-água e polímero-polímero, levando a uma rápida desidratação do sistema com a liberação da água do hidrogel. Este fenômeno resulta em um grande ganho de entropia e causa a contração da estrutura polimérica [26, 27]. A Figura 3 ilustra o comportamento dos hidrogéis termorresponsivos com a temperatura.
Figura 3. Comportamento de hidrogéis termorresponsivos com a temperatura.
Alguns hidrogéis sensíveis à variações de temperatura são baseados em metilcelulose [28], hidroxipropil metilcelulose [29], quitosana [30], N-isopropil acrilamida e seus copolímeros [31 – 33], poli(vinil metil éter) (PVME) [34], poli(N-vinilisobutilamida) (PNVIBA) [35], poli(etileno oxido-propileno oxido-etileno oxido) (PEO-PPO-PEO) [36], dentre outros.
1.3 Poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm)
O PNIPAAm e seus copolímeros vem sendo estudados há décadas devido ao seu comportamento térmico em meio aquoso, sendo provavelmente o membro mais popular da classe de polímeros que apresenta resposta negativa com a temperatura (comportamento do tipo LCST) [38]. A primeira citação deste polímero na literatura data de 1956 [38]. A transição sol-gel ocorre abruptamente na faixa de temperatura entre 30 e 35°C [38].
A LCST de soluções aquosa deste polímero pode ser modulada por copolimerização do NIPAAm com outros monômeros [2]. Há relatos na literatura da copolimerização do NIPAAm com monômeros hidrofóbicos, levando à diminuição da temperatura crítica do mesmo [39], assim como há relatos que a temperatura crítica é aumentada através da copolimerização do NIPAAm com monômeros hidrofílicos [40]. A possibilidade de modulação da LCST deste polímero e o fato da mesma ser próxima da temperatura fisiológica torna-o um material de grande potencial para aplicações biomédicas [2], sendo que na literatura há relatos de aplicações de hidrogéis deste polímero em sistemas de drug delivery [41 – 45], no campo de engenharia de tecidos [46, 47], além de outras aplicações, também na área
biomédica [48]. Os hidrogéis baseados neste polímero também são objeto de pesquisas fundamentais [38].
Alguns estudos recentes visam o desenvolvimento de hidrogéis biodegradáveis baseados em copolímeros de NIPAAm, visto que o próprio não apresenta esta propriedade [46]. Há relatos na literatura da introdução de segmentos biodegradáveis na cadeia polimérica pela copolimerização do NIPAAm com o 5,6-benzo-2-metileno-1,3-dioxepano, resultando em um copolímero sujas soluções apresentaram LCST menor que a do PNIPAAm, devido à característica hidrofóbica do benzometilenodioxepano. O copolímero também se mostrou sendo biodegradável, com os produtos de degradação atóxicos para células [50]. Outro exemplo de hidrogel biodegradável baseado em NIPAAm foi sintetizado a partir da copolimerização de metacrilato de polilactídeo, ácido acrílico e NIPAAm. O copolímero resultante se mostrou biodegradável e adequado para aplicações como liberação de proteínas [51].
Também é foco de estudos recentes, especialmente para aplicações como drug
delivery, o desenvolvimento de hidrogéis de PNIPAAm que sejam sensíveis tanto à variação
de temperatura quanto a de pH, visto que as propriedades como intumescimento e liberação controlada de fármacos podem ser sensíveis aos diferentes pH’s das várias regiões do corpo humano [42, 46, 51, 52]. Há relatos na literatura do desenvolvimento de hidrogéis copoliméricos de PNIPAAm e poli(ácido acrílico) (PAA): soluções aquosas resultaram em géis em temperatura fisiológica e pH menor que 5,5, não sendo observada a formação de gel em pH = 7,4 na mesma temperatura. Já a copolimerização de NIPAAm, ácido acrílico e acrilato de butila resultou em um copolímero cuja soluções aquosa gelificou e resultou em um hidrogel a pH = 6 em temperaturas de até 21°C. Uma das possíveis aplicações deste hidrogel é sua utilização para liberação de fármacos em locais com pH’s tipicamente baixos, como próximo de feridas, e subsequente eliminação através da dissolução do gel em pH fisiológico [41].
1.4 Queratina
Queratinas formam uma família de proteínas estruturais, que são classificadas como queratinas rígidas (hard keratin) ou queratinas macias (soft keratin), dependendo de sua fonte [53]. As queratinas rígidas são encontradas abundantemente nas unhas, cascos, chifres, penas e pelos de mamíferos e aves [53, 54], enquanto as queratinas macias são encontradas em tecidos epiteliais [53].
As queratinas apresentam um alto teor de enxofre (3 – 4% em massa) [54], devido à grande quantidade de resíduos de cisteína em sua composição (7 a 20% do total dos
aminoácidos que a compõe) [55], o que torna o seu descarte difícil, visto que a combustão não é eficiente e ainda há a geração de poluentes derivados de enxofre [54]. Na Figura 4 está apresentada uma representação bidimensional da estrutura da queratina. Na Tabela 1 estão apresentados a porcentagem molar de resíduos de queratina provenientes de diferentes fontes (cabelo, penas de galinha ou lã) [53, 56, 57].
Figura 4. Representação bidimensional da estrutura da queratina. Os grupos R’ representam os resíduos do aminoácido cisteína, enquanto os grupos R representam os
resíduos dos demais aminoácidos.
Tabela 1. Distribuição dos resíduos da queratina provenientes de diferentes fontes (% molar).
Resíduo % de resíduos (molar)
Cabelo [53] Lã [56] Penas [57] Ácido Aspártico 7,6 7,0 5,1 Ácido Glutâmico 11,6 12,8 7,5 Serina 11,7 10,7 12,8 Glicina 6,6 8,0 11,9 Histidina 1,1 0,9 0,4 Arginina 4,9 6,9 4,4 Treonina 6,9 5,8 4,2 Alanina 5,2 5,2 5,8 Prolina 9,6 6,4 11,0 Tirosina 1,2 3,3 1,6 Valina 6,2 5,8 8,5 Metionina 2,5 0,4 1,3 Cisteína 10,0 11,4 9,1 Isoleucina 3,1 3,1 4,7 Leucina 7,1 6,8 7,7 Fenilalanina 1,9 2,1 3,7 Lisina 3,0 3,4 0,5
Atualmente milhões de toneladas/ano de penas de galinhas são geradas [55], sendo a queratina o componente principal deste resíduo (> 90%) [58]. Sendo assim torna-se importante o desenvolvimento de aplicações para estes resíduos. Uma utilização de resíduos de penas pela indústria avícola é o processamento destas penas em ração animal, entretanto o produto gerado além de apresentar baixo valor nutritivo, com pequenas quantidades de aminoácidos essenciais, tem baixo valor agregado [59].
Para o desenvolvimento de aplicações mais nobres desta proteína faz-se necessário o tratamento químico e/ou enzimático com a mesma. A queratina apresenta uma alta estabilidade estrutural devido às interações intermoleculares entre os aminoácidos polares e apolares, já que sua sequência de aminoácidos é composta por 60% de aminoácidos apolares e 40% de aminoácidos polares [60, 61], e também baixa solubilidade em água devido à presença de pontes de dissulfeto entre os resíduos de cisteína [59 – 61]. Procedimentos utilizados para a quebra da estrutura da queratina e consequentemente sua solubilização em água consistem na quebra das ligações de dissulfeto, seguida de oxidação ou redução das sulfidrilas. Alguns procedimentos descritos na literatura para a hidrólise (extração) da queratina são a sulfitólise, no qual é utilizado o sulfito para a hidrólise das ligações S-S, levando à formação de sulfocisteína (sais de Bunte) [62 – 64]; a oxidação das ligações S-S, levando à formação de óxidos de cistina e/ou ácido cisteico [65] ou mesmo quebra das ligações S-S seguida de reação com alguma substância que reaja com as sulfidrilas, evitando que os resíduos de cisteína reajam entre si levando à reticulação (formação de cistina) [66]. As reações e produtos envolvidos nestes processos estão ilustrados na Figura 5. Este processo de extração da queratina é comumente denominado hidrólise e o produto deste processo é denominado queratina hidrolisada.
Figura 5. Metodologias de hidrólise da queratina descritas na literatura. (A): sulfitólise; (B): hidrólise oxidativa e (C): hidrólise seguida de reação com agentes de proteção das
sulfidrilas. Adaptado das referências 62 – 66.
Algumas aplicações da queratina hidrolisada relatados na literatura são o seu emprego no desenvolvimento de materiais híbridos para a absorção de petróleo [66], de blendas com poliamida 6 (PA 6) para adsorção de íons metálicos [68], de materiais híbridos para utilização em engenharia de tecido [69], como carga orgânica em compósitos poliméricos com poli(metacrilato de metila) (PMMA) e polipropileno (PP) [70, 56] e na produção de hidrogéis híbridos (queratina/polímero) utilizando álcool vinílicos como monômero sintético [71] ou somente a base de queratina [53, 72 – 75].
Uma metodologia descrita na literatura [76] para a produção de hidrogéis híbridos partindo-se de proteínas é a reticulação das mesmas empregando-se éteres de diglicidila. A reação de reticulação consiste na abertura dos anéis epóxi com ácido carboxílicos, em meio ácido, ou por aminas, em meio básico, presentes nos aminoácidos, tal como ilustrado na Figura 6.
Figura 6. Reticulação das cadeias proteicas com éteres de diglicidila. Adaptado da referência 76.
Uma possibilidade de síntese de hidrogéis híbridos entre polímeros sintéticos (vinílicos ou acrílicos) e queratina é a funcionalização da mesma com grupos vinílicos. Para tanto emprega-se um agente de funcionalização que possua em sua estrutura grupos vinílicos e um anel epóxi, tornando, desta maneira, a proteína passível de polimerização radicalar. A aplicação de queratina em hidrogéis híbridos é particularmente importante e desperta interesse, pois a queratina hidrolisada é biodegradável [73, 77, 78] e pode transferir esta propriedade à materiais que não apresentam esta propriedade, tal como o PNIPAAm [46].
1.5 Objetivos
O objetivo deste trabalho é a síntese e a caracterização de hidrogéis híbridos responsivos à variações de temperatura e pH, baseados em PNIPAAm e queratina hidrolisada.
1.6 Estratégia Adotada
Para o desenvolvimento do projeto foram realizadas as seguintes etapas:
- Funcionalização da queratina com o 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epóxido; - Polimerização do NIPAAm em presença de queratina modificada; - Caracterização dos híbridos;
- Caracterização dos hidrogéis.
2. Parte Experimental
2.1 Materiais
Queratina hidrolisada em solução aquosa a 20% de sólidos foi fornecida pela Croda (queratina obtida da hidrólise de penas de galinha). Os solventes utilizados foram água destilada e acetona PA, obtida da Synth Chemicals. O 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido, o NIPAAm e a solução de Cu2+ na concentração de 1000 mg/Kg foram obtidos da
Sigma-Aldrich. Perssulfato de amônia (APS), ácido ascórbico (AAs) peróxido de hidrogênio (H2O2), H3PO4, ácido acético glacial, acetato de sódio, NaHCO3 e Na2CO3 foram obtidos da Synth
Chemicals. K2HPO4 e KH2PO4 foram obtidos da Lafan Química Fina. Os reagentes foram utilizados sem purificação prévia.
A queratina bruta foi caracterizada após ser liofilizada.
2.2 Funcionalização e Caracterização da Queratina
2.2.1 Caracterização da Queratina Bruta
O espectro de infravermelho (FTIR) da queratina em pó foi obtido no espectrofotômetro Agilent modelo Cary 630 no modo reflectância total atenuada (ATR) com resolução de 4 cm-1 e número de varreduras igual a 16.
A dosagem de grupos sulfidrila (SH) foi realizada utilizando um espectrofotômetro Varian modelo Cary 100 Scan, monitorando-se a absorbância em 430 nm das soluções de queratina e de padrões de cisteína (utilizados para construção de curva de calibração) após reação da queratina e dos padrões de cisteína com o reagente de Ellman – DNTB ((ácido (5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico))) [66].
Os teores de ácidos carboxílicos e aminas na queratina bruta foram determinados por titulação potenciométrica, utilizando um titulador potencimétrico da Metrohm, modelo 682. Cerca de 2 gramas de queratina foram solubilizadas em solução aquosa ácida contendo excesso de ácido clorídrico (HCl) para a protonação de todos os grupos carboxílicos e amínicos da queratina. A solução resultante foi titulada com solução de NaOH 0,1 M.
A massa molar da queratina bruta foi determinada por cromatografia de permeação em gel (gel permeation chromatography, GPC), utilizando um cromatógrafo Viscotec GPCmax VE 2001, detector de índice de refração e padrões de polietilenoglicol (PEG) de diferentes massas molares. O eluente utilizado nas análises foi uma solução aquosa de NaNO3 na concentração 0,05M, filtrada previamente em filtro de celulose (0,45 µm). A
coluna utilizada foi a SB-806M HQ. A vazão do eluente foi de 1,0 ml/min. A temperatura da análise foi 35°C.
Os ensaios de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados utilizando um DSC 1, Mettler Toledo, seguindo o seguinte programa de análise: aquecimento de 25°C a 180 °C, isoterma a 180°C por 5 minutos, resfriamento de 180°C a – 40°C e segundo aquecimento de – 40°C a 180°C. As taxas de aquecimento e de resfriamento foram 20°C/min e os experimentos foram realizados em sob fluxo de nitrogênio, a 50 ml/min.
As análises termogravimétricas (TGA) foram realizadas utilizando um TGA/DSC 1, Mettler Toledo, na faixa de temperatura de 25°C a 900°C, taxa de aquecimento de 10°C/min, sob atmosfera de nitrogênio em um fluxo de 25 ml/min.
2.2.2 Funcionalização
Aproximadamente 1 g de queratina previamente liofilizada foi dissolvida em 10 ml de água destilada em balões de fundo redondo de 50 ml. À solução resultante adicionou-se o agente de funcionalização, o 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido, para a funcionalização/modificação de 50, 75 e 100% dos grupos ácido carboxílico da queratina com grupos vinílicos. A reação de funcionalização foi conduzida em frasco fechado a 60°C por 24 horas e sob agitação magnética. Então, a solução reacional foi transferida gota a gota para um béquer com aproximadamente 100 ml de acetona sob forte agitação, sendo observada a precipitação da queratina funcionalizada. Após 24 horas de repouso, o sobrenadante foi drenado e o sólido foi ressuspendido e decantado em acetona por três vezes, sempre trocando o sobrenadante. Então a acetona foi drenada e os sólidos foram secos sob vácuo a 60°C por 24 horas, obtendo-se a queratina funcionalizada na forma de pó.
2.2.3 Caracterização da Queratina Funcionalizada
As queratinas com diferentes graus de funcionalização foram caracterizadas por FTIR, DSC, e TGA, empregando-se as metodologias descritas para a queratina bruta.
2.3 Preparação e Caracterização dos híbridos e respetivos hidrogéis baseados em PNIPAAm/queratina
2.3.1 Preparação
Os híbridos de PNIPAAm e queratina hidrolisada foram preparados utilizando duas metodologias, resultando em duas séries de materiais: HT (high temperature) e LT (low
temperature). Em ambas, os híbridos foram sintetizados em solução aquosa ou solução
tampão de K2HPO4 e KH2PO4 (concentração de 0,01M, pH = 7,2) de NIPAAm e queratina funcionalizada (razão mássica NIPAAm: queratina funcionalizada de 90:10 ou 80:20) e concentração de sólidos de 10% em massa. Às soluções resultantes foram adicionados os iniciadores de polimerização [perssulfato de amônia - APS - para polimerização a 60°C (série HT) e H2O2 e AAs para polimerização a 25°C (série LT)] e a reação foi mantida a 60°C ou 25°C, dependendo da metodologia empregada, por 24 horas. Após a polimerização, os híbridos foram submetidos à extração de monômeros e oligômeros solúveis com água, a qual foi trocada diariamente no período de uma semana. As condições de polimerização estão esquematizadas na Figura 7.
Para se estabelecer a razão molar de H2O2/NIPAAm e AAs/NIPAAm adotada na síntese dos hidrogéis híbridos variou-se esta razão molar de 0,01 a 0,30 para a polimerização de NIPAAm em presença de 10% de queratina com grau de modificação de 50%.
Na Tabela 2 estão apresentadas as condições de síntese empregadas e a nomenclatura adotada para os híbridos. A sigla HT (high temperature) identifica os hidrogéis sintetizados a 60°C e a sigla LT (low temperature) identifica os hidrogéis sintetizados a 25°C. O numeral entre parênteses, após as siglas HT ou LT, indica o grau de funcionalização da queratina utilizada e o último termo da identificação, expresso em porcentagem, representa a fração mássica de queratina no total de sólidos empregados na síntese dos híbridos. Por exemplo, o híbrido “HT (50) – 10%” foi sintetizado na temperatura de 60°C, empregando-se queratina com 50% de seus grupos ácido carboxílico modificados por grupos vinílicos e teor de queratina no total de sólidos igual a 10% (em massa).
Tabela 2. Composição, condições de síntese de nomenclatura adotada para os hidrogéis. Híbrido/Hidrogel Razão Mássica
NIPAAm: Queratina T (°C) Funcionalização Queratina (%) APS* (% massa) H2O2/NIPAAm (mol/mol) AAs/NIPAAm (mol/mol) HT (50) – 10% 90:10 60 50 5 - - HT (75) – 10% 90:10 60 75 5 - - HT (100) – 10% 90:10 60 100 5 - - HT (50) – 20% 80:20 60 50 5 - - HT (75) – 20% 80:20 60 75 5 - - HT (100) – 20% 80:20 60 100 5 - - LT (50) – 10% 90:10 25 50 - 0,3 0,3 LT (75) – 10% 90:10 25 75 - 0,3 0,3 LT (100) – 10% 90:10 25 100 - 0,3 0,3 LT (50) – 20% 80:20 25 50 - 0,3 0,3 LT (75) – 20% 80:20 25 75 - 0,3 0,3 LT (100) – 20% 80:20 25 100 - 0,3 0,3
* porcentagem sobre a massa de sólidos (queratina + NIPAAm) adicionados à formulação.
2.3.2 Caracterização dos híbridos de queratina/PNIPAAm
Os híbridos resultantes da polimerização de NIPAAm e queratina funcionalizada após lavagem exaustiva com água destilada foram secos sob vácuo a 60°C por 24 horas. Os híbridos queratina/PNIPAAm foram analisados por FTIR seguindo a mesma metodologia aplicada para as queratinas brutas e funcionalizadas (item 2.2.1).
O teor de queratina nos híbridos foi determinado por titulação de acordo com a seguinte metodologia: aproximadamente 250 mg dos híbridos previamente secos foram
intumescidos em solução de HCl (C1 = 0,01 mol/L) por 24 horas. Após este período foram coletadas alíquotas de 25 mL da solução em equilíbrio com o gel intumescido e tituladas com solução de NaOH (C = 0,01 mol/L) para a determinação de suas concentrações (C2). O teor de queratina foi calculado a partir da diferença entre a concentração da solução de HCl usada para intumescimento (C1) e a concentração da mesma solução após o intumescimento dos híbridos (C2) e conhecendo-se o índice de alcalinidade da queratina original (Tabela 3).
As análises de DSC dos híbridos foram realizadas em equipamento DSC 2910, TA
Instruments, empregando-se o seguinte programa de análise: aquecimento de 25°C a
200°C, isoterma a 200°C por 5 minutos, resfriamento de 200°C a 0°C, isoterma a 0°C por 5 minutos e segundo aquecimento de 0°C a 200°C, sendo todas as etapas realizadas à taxa de 20°C/min, sob atmosfera de argônio (fluxo de 50 mL/min).
As análises termogravimétricas dos híbridos foram realizadas no equipamento TGA 2050 da TA Instruments, na faixa de temperatura de 25°C até 800°C, taxa de aquecimento de 10°C/min e atmosfera de argônio (fluxo de 50 ml/min).
2.3.2 Caracterização dos hidrogéis de queratina/PNIPAAm
Os híbridos de PNIPAAm/queratina, após extração e secagem, foram pesados e intumescimento em água, gerando hidrogéis. A nomenclatura adotada para os hidrogéis é a mesma dos respectivos híbridos (Tabela 2).
Aproximadamente 150 mg de cada hidrogel previamente intumescido à 5°C foram submetidos a isotermas em diferentes temperaturas na faixa de 5 a 45°C, em um banho termostático Julabo, modelo F12, variando-se a temperatura em 5°C a cada 24 horas. Após 24 horas em cada temperatura, os hidrogéis foram retirados da água, secos superficialmente com papel absorvente, e pesados (m Int). Estes ensaios foram realizados
em triplicata. Após atingir a temperatura de 45°C os hidrogéis foram pesados, secos em estufa a vácuo a 60°C por 24 horas e pesados novamente (m seco). O coeficiente de intumescimento (q) foi calculado de acordo com a equação 1.
𝑞𝑞 = 100 ∗ �𝑚𝑚𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼
𝑚𝑚𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠� (Equação 1)
O coeficiente de intumescimento dos hidrogéis em função do pH também foi determinado na temperatura de 25°C. Amostras dos híbridos secos foram adicionadas a soluções tampão com pH de 2,1 (concentração = 0,1 mol/L de H3PO4 e KH2PO4), 4,75 (concentração = 0,1 mol/L de Ácido Acético Glacial e Acetato de Sódio), 7,2 (concentração
= 0,1 mol/L de KH2PO4 e K2HPO4) e 10,2 (concentração = 0,1 mol/L de NaHCO3 e Na2CO3). Após 24 horas a 25°C em banho termostático Julabo, modelo F12, os hidrogéis foram retirados das soluções, secos superficialmente com papel absorvente, e pesados. Então, foram secos em estufa a vácuo a 60°C por 24 horas e pesados novamente. Estes ensaios foram realizados em triplicata. O coeficiente de intumescimento (q) foi calculado de acordo com a equação 1.
Hidrogéis na forma de botão, com dimensões médias de 6 mm de diâmetro e 3 mm de altura, e intumescidos a 25°C foram submetidos a ensaios de compressão em um Analisador Termomecânico – TMA 2940 da TA Instruments. Os hidrogéis foram submetidos a ciclos de compressão-descompressão à taxa de força constante (0,05 N min-1) e carga máxima (força máxima) variando gradativamente segundo o programa de análise:
I) Equilíbrio em 25 °C;
II) Rampa de força de 0 N → 0,1 N e de 0,1 N → 0 N à taxa de 0,05 N min -1; III) Incremento na força máxima de 0,1 N;
IV) Repetição da etapa ii até força máxima seja igual a 1 N.
Para a análise morfológica os hidrogéis previamente intumescidos em solução aquosa com 1% (V/V) de dimetilsulfóxido foram cortados na forma de cubos com bisturi, congelados com N2 líquido e liofilizados no liofilizador K-105, da Liotop. As amostras liofilizadas foram metalizadas com irídio em um metalizador Bal-Tec MD 020 (Balzers) e então analisadas Microscópio Eletrônico de Varredura QUANTA 250 FEG (FEI), operando a 7 kV.
Aproximadamente 5 mg de híbridos secos foram adicionados à frascos contendo 5 mL de solução aquosa de Cu2+ ao 30 mg/Kg (solução de CuNO3). Após 72 horas a 25°C em um banho termostático Julabo, os hidrogéis foram então retirados das soluções e o teor de Cu2+ das soluções foi quantificado por espectroscopia de emissão óptica (ICP-OES) modelo 720 ES, da Varian, após calibração do espectrômetro com soluções padrões de Cu2+ a concentrações de 5, 10, 20, 30 e 50 mg/Kg. O teor de Cu2+ da solução virgem (sem adição de hidrogel) também foi determinado e o teor de Cu2+ capturado por cada hidrogel foi calculado como mg Cu2+/g de hidrogel.
3. Resultados e Discussão
3.1 Caracterização da Queratina Bruta
Na Tabela 3 encontram-se as principais características da queratina empregada na síntese dos híbridos.
O índice de sulfidrila para a queratina hidrolisada empregada neste trabalho é de 19 µmol/g, valor inferior ao descrito na literatura, de aproximadamente 720 µmol de resíduos de cisteína por grama de queratina (neste caso, queratina extraída de penas de galinha) [66]. Esta propriedade da queratina é importante porque, diferentemente das demais proteínas estruturais, esta apresenta uma grande quantidade de resíduos de cisteína em sua composição (7 a 20% do total dos aminoácidos que a compõe) [55], e a presença de sulfidrilas livres de resíduos destes aminoácidos pode levar à reticulação das cadeias proteicas através da formação de pontes de dissulfeto, alterando assim as propriedades da mesma. O baixo índice de sulfidrilas livres para a queratina deve-se, provavelmente, à hidrolise realizada para a extração da mesma. A maioria dos procedimentos para tal consistem na quebra das ligações de dissulfeto, seguida de oxidação ou redução das sulfidrilas. Alguns procedimentos normalmente utilizados são a sulfitólise, na qual é utilizado o sulfito para a hidrólise das ligações S-S, levando à formação de sulfocisteína (sais de Bunte) [62 – 64]; e a oxidação das ligações S-S, levando à formação de óxidos de cistina e/ou ácido cisteico [65]. Também pode ser utilizado algum composto que reaja com as sulfidrilas, tais como o iodoacetamida, evitando que os resíduos de cisteína reajam entre si e resultem em reticulação, levando à formação de cistina [66].
Os grupos amina e ácido carboxílico estão presentes nos grupos laterais dos aminoácidos que constituem as cadeias proteicas e também nas extremidades destas cadeias, conforme ilustrado na estrutura da queratina apresentada na Figura 9. A quantidade destes grupos funcionais (expressa em índices na Tabela 3) é importante, visto que o agente de funcionalização (4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido) reage com estes grupos funcionais e torna a queratina passível de polimerização radicalar (em meio ácido o agente de funcionalização reage com o grupo funcional ácido carboxílico e em meio básico reage com o grupo funcional amina) [76]. A razão molar entre os grupos ácidos ou aminas e o 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido determina o grau de modificação da queratina. Os dados referentes à titulação para quantificação dos grupos amino e grupos ácido carboxílico na queratina estão apresentados no Anexo A.
Tabela 3. Índices de acidez, amina e sulfidrila e massas molares da queratina bruta. Amostra Grupo carboxílico
(mmol/g) Grupo amino (mmol/g) S-H (µmol/g) Mn (Da) Mw (Da) Đm Queratina 1,913 1,213 19 1827 2506 1,37
Figura 9. Representação da estrutura química da queratina, os radicais R representam os resíduos dos aminoácidos com carga neutra, R’ os resíduos dos aminoácidos com grupos funcionais ácidos carboxílicos e R’’ os resíduos dos aminoácidos com grupos funcionais
amina.
A massa molar média numérica (Mn) e a dispersidade (Đm) para a queratina são 1827 Da e 1,37, respectivamente. Entretanto os cromatogramas de GPC, apresentados na Figura 10, mostram múltiplos picos, indicando que a queratina hidrolisada é constituída por famílias de cadeias com massas molares distintas. Os valores de massas molares apresentados na Tabela 3 referem-se somente à análise do pico a menor volume de retenção, visto que os demais picos estão associados a massas molares inferiores a 1.000 g/mol, com respeito à massa molar de padrões de polietilenoglicol (PEG) utilizados para a construção da curva de calibração.
0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 120 140 160 R es pos ta do D et ec tor ( m V ) Volume de Retenção (ml)
Figura 10. Cromatograma (GPC) para a queratina bruta.
3.2 Funcionalização da Queratina
A Figura 11 ilustra a reação entre a queratina hidrolisada e o agente de funcionalização (4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido) em meio ácido, tornando a queratina passível de reação com monômeros acrílicos ou vinílicos.
Tomando-se como base a massa molar média numérica (Mn) da queratina de 1827 g.mol-1 e o número de grupos ácido carboxílico por cadeia de queratina igual a 3,4 (calculado com base no índice de acidez), estimou-se a massa molar média entre os grupos vinílicos para a queratina após a funcionalização. Esta estimativa equivale a massa molar entre os nós de reticulação, do ponto de vista da queratina, quando esta, após modificação, reage com o NIPAAm. Para esta estimativa assumiu-se que a reação entre os grupos ácidos e o 4-vinil-1-1cicloexeno 1,2-epóxido foi completa e equivalente a 50% molar, 75% molar e 100% molar. Estes dados estão sumarizados na Tabela 4.
Tabela 4. Número de grupos funcionais ácido carboxílico por cadeia proteica e massa molar teórica entre os nós de reticulação das queratinas após funcionalização.
Amostra Número de grupos ácido carboxílico/cadeia proteica antes da funcionalização (a)
Fração molar de grupos ácidos funcionalizados (%) (b) Massa Molar Teórica entre os nós de reticulação (Da) (c) Queratina 3,4 50 1045 75 697 100 523
a = determinado por titulação potenciométrica;
b = valor teórico, considerando que todo agente de funcionalização adicionado à reação foi adicionado à cadeia proteica;
c = estimativa baseada no grau de modificação e na massa molar da queratina.
Figura 11. Funcionalização da queratina com o 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epoxido através do resíduo do aminoácido ácido aspártico (Asp).
3.3 Caracterização da Queratina Funcionalizada
3.3.1 FTIR
Os espectros de absorção no infravermelho da queratina bruta e após funcionalização de 50, 75 e 100% dos grupos funcionais ácido carboxílico estão apresentados na Figura 12. O espectro de FTIR da queratina bruta apresenta bandas características de ligação C-H de alifáticos na região entre 3000 – 2800 cm-1 e a aproximadamente 1450 cm-1 [80]; bandas características de ligação O-H e N-H na região entre 3500 – 3000 cm-1 [80]; bandas I, II e III do grupo funcional amida a aproximadamente 1650, 1540 e 1250 cm-1 (a banda I de amida está relacionada majoritariamente com estiramento da ligação C=O, a banda II está relacionada com deformação de ligação N-H e estiramento de ligação C-H e a banda III é resultado de combinação de estiramento de ligação C-N e deformação de ligação N-H) [63]; e bandas características de ligação CH2-CO a aproximadamente 1400 cm-1 [80]. Estas bandas são características de proteínas. Ainda foram observadas bandas características de ligação S=O de produtos de oxidação da cisteína (monóxido de cisteína, dióxido de cisteína e ácido cisteico) a 1045, 1080 e 1135 cm-1 [81 – 83], demonstrando que esta queratina foi extraída por um processo oxidativo. Comparando os espectros da queratina bruta com as queratinas com diferentes graus de funcionalização é possível observar diferenças espectroscópicas na região entre 1200 – 900 cm-1, conforme destacado na Figura 12. Estas alterações espectroscópicas podem ser referentes à inserção de ligação C-O de ésteres na estrutura da queratina em decorrência da funcionalização. Entretanto não foi observado o aparecimento de bandas a 1640 cm-1 e região entre 990 – 900 cm-1, que são características de ligação C=C e =C-H, respectivamente [80]. O não aparecimento destas bandas pode ser devido à baixa concentração de grupos ácido carboxílico e, consequentemente, de grupos vinila, e também à possível sobreposição da banda de ligação C=C com as bandas I e II de amida da queratina. O desaparecimento de algumas bandas na mesma região (1200 – 900 cm-1) pode ser referente à perda de cadeias proteicas com resíduos de cisteína altamente oxidados durante o processo de lavagem da queratina funcionalizada com acetona após a funcionalização da mesma, visto que bandas intensas referentes à produtos de oxidação da cisteína aparecem nesta região do espectro.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
T
rans
m
itânc
ia(
u.
a.
)
Número de onda (cm-1) a b c dFigura 12. Espectros de FTIR da queratina (a) antes a após funcionalização de (b) 50, (c) 75 e (d) 100 mol% de seus grupos funcionais ácido carboxílico.
3.3.2 Propriedades Térmicas
As curvas termogravimétricas (TGA) e suas derivadas (DTG) para as queratinas funcionalizadas e bruta estão apresentadas na Figura 13. As curvas de TGA e DTG para a queratina bruta apresentam quatro etapas de perda de massa, sendo a primeira, entre 50°C – 130°C, minoritária e atribuída à perda de água (0,9% de umidade). A etapa de perda de massa entre 130°C – 220°C é atribuída à volatilização de oligômeros de queratina, visto que a amostra apresentou uma série de picos referentes à frações de cadeias de baixa massa molar (Figura 10). As perdas de massa entre 220 – 265°C e entre 265°C e 700°C podem ser atribuídas à degradação da estrutura de α-hélice da queratina/quebra de ligações peptídicas e degradação das cadeias proteicas da queratina, respectivamente, conforme relatado na literatura [84 - 86].
A análise das curvas termogravimétricas (Figuras 13A) revela que a temperatura de início de perda de massa da queratina bruta é menor comparativamente às queratinas com diferentes graus de funcionalização. Além disso, há uma tendência de deslocamento das curvas termogravimétricas para temperaturas mais altas com o aumento do grau de funcionalização. Estes resultados reforçam que ocorreram alterações na queratina
submetida à reação de adição com 4-vinil-1-cicloexeno 1,2-epóxido, e também indicam um ganho de estabilidade térmica para as queratinas funcionalizadas. As queratinas funcionalizadas apresentaram três etapas de perda de massa, sendo que a primeira pode ser atribuída à umidade e foi observada entre 50°C – 165°C. A segunda e a terceira etapa de perda de massa foram observadas entre 165°C – 250°C e entre 250°C – 700°C, respectivamente. O resíduo a 700°C também aumentou de aproximadamente 23% na queratina bruta para aproximadamente 33% nas queratinas funcionalizadas. Nas curvas de DTG (Figura 13B) é notória a mudança no perfil de degradação das queratinas funcionalizas frente à queratina bruta.
As curvas de DSC (1° e 2° aquecimento e resfriamento) para a queratina bruta e as queratinas funcionalizadas estão apresentadas nas Figuras 14 e 15, respectivamente. Queratinas hidrolisadas podem apresentar transição vítrea entre 50°C e 130°C, sendo que a temperatura de transição vítrea (Tg) será tanto menor, quanto maior for o teor de água remanescente [79, 87]. Outro evento térmico normalmente observado em análises de DSC de queratinas hidrolisadas é a fusão da porção cristalina (desnaturação) entre 225°C – 250°C, acompanhada de pirólise da mesma [79, 87, 88]. Entretanto, na metodologia utilizada na análise, a queratina foi aquecida até 180°C para evitar sua degradação. A queratina apresentou transição vítrea na faixa de temperatura entre 80°C – 90°C, conforme destacado nas curvas de 1° e 2° aquecimento (Figura 14A, B e C).
Foi observada transição vítrea nas curvas de 1° aquecimento de DSC das queratinas funcionalizadas na faixa de temperatura entre 50 – 70°C, enquanto para a queratina bruta a transição vítrea foi observada entre 80°C e 90°C. Também foi observado nas curvas de primeiro aquecimento das queratinas funcionalizadas, um evento endotérmico entre 80°C – 160°C que pode ser atribuída à evaporação de água (umidade residual) nas queratinas funcionalizadas. Este evento endotérmico é observado em menor intensidade para a queratina com 50% de seus grupos ácidos funcionalizados, provavelmente porque esta amostra apresenta menor umidade que as demais.
Na Tabela 5 estão sumarizados os resultados das análises de TGA e DSC da queratina antes e após a funcionalização.
100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 % M a ssa Temperatura (°C) a b cd 100 200 300 400 500 600 700 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 b D T G ( u. a. ) Temperatura (°C) a b c d
Figura 13. Curvas de (A) TGA e (B) DTG da queratina (a) antes e após funcionalização de (b) 50, (c) 75 e (d) 100 mol% de seus grupos funcionais ácido carboxílico.
40 60 80 100 120 140 160 -1,0 -0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 F lux o de C al or ( W .g -1 ) Temperatura (°C) E ndo 0 50 100 150 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 E ndo F lux o de C al or ( W .g -1) Temperatura (°C) 0 50 100 150 200 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 F lux o de C al or ( W .g -1 ) Temperatura (°C) E ndo
Figura 14. Curvas de (A) primeiro aquecimento, (B) resfriamento e (C) segundo aquecimento para a queratina bruta.
A
B
60 80 100 120 140 160 F lux o de C al or ( u. a) Temperatura (°C) a b c E ndo 0 50 100 150 F lux o de C al or ( u. a. ) Temperatura (°C) a b c E ndo 0 50 100 150 F lux o de C al or ( u. a. ) Temperatura (°C) a b c E ndo
Figura 15. Curvas de DSC da queratina após funcionalização de (a) 50, (b) 75 e (c) 100 mol% de seus grupos funcionais ácido carboxílico. (A) Primeiro aquecimento, (B) resfriamento e
(C) segundo aquecimento.
C
Tabela 5. Resultado das análises termogravimétricas e de DSC para as queratinas bruta e funcionalizadas. Grau de Funcionalização Faixa de Temperatura (°C) Perda de massa (%) Resíduo à 700°C (%) Tg (°C) 0 30 – 130 130 – 220 220 – 265 265 – 700 0,9 18,5 12,5 44,3 23,8 80 – 90°C 50% 35 – 165 165 – 250 250 – 700 0,8 15,8 50,7 32,7 50 – 70°C 75% 35 – 165 165 – 250 250 – 700 0,2 5,7 61,6 32,5 50 – 70°C 100% 35 – 165 165 – 250 250 – 700 0,6 5,1 62,1 32,2 50 – 70°C 3.4 Hidrogéis Híbridos
3.4.1 Preparação dos Híbridos
Para a síntese dos híbridos foram adotadas duas metodologias empregando-se temperaturas e iniciadores distintos. A série HT (high temperature) foi preparada a 60°C empregando-se o persulfato de amônia (APS) como iniciador. Este iniciador é comumente empregado em polimerizações radicalares a temperatura de 60°C [89, 90]. A geração de radicais livres envolve uma reação de oxi-redução, conforme ilustra a Figura 16.
Figura 16. Oxi-redução do persulfato de amônio resultando em radicais livres.
A necessidade de realizar a polimerização do sistema NIPAAm/queratina, iniciada pelo APS a 60°C, resultou na separação de fases, caracterizada pela turbidez da solução. A
separação de fases ocorre quando as cadeias de PNIPAAm são formadas, uma vez que soluções aquosas de PNIPAAm apresentam comportamento LCST [38]. Na Figura 17 estão apresentadas fotos da solução de queratina e PNIPAAm a temperatura ambiente, antes da adição do APS e aquecimento (Figura 17A) e após a adição de APS e aquecimento a 60°C (Figura 17B), sendo possível observar a separação de fases de oligômeros de queratina e PNIPAAm do meio reacional.
Figura 17. (A) Meio reacional inicial – solução aquosa de queratina e PNIPAAm a 10% de sólidos e a 25°C e (B) após adição de APS e aquecimento a 60°C por aproximadamente 3
horas.
Para minimizar a separação de fases, a série LT (low temperature) foi preparada a temperatura de 25°C empregando-se o sistema iniciador H2O2/ácido ascórbico (AAs). A formação de radicais livres ocorre via mecanismo de oxi-redução [91, 92], conforme ilustrado na Figura 18.
Figura 18. Formação de radicais livres entre o sistema H2O2/Ácido Ascórbico. Adaptado da referência 19.
O sistema H2O2/AAS foi empregado com sucesso para a polimerização de ésteres vinílicos de carboidratos [a]. No Anexo B encontram-se detalhes sobre a metodologia e os
resultados referentes ao estudo da viabilidade e otimização das condições de polimerização do NIPAAm por este sistema iniciador.
É importante ressaltar que para a síntese dos híbridos queratina/NIPAAm com o sistema de iniciadores H2O2/AAs utilizou-se uma solução tampão de K2HPO4 e KH2PO4 na concentração de 0,01M (pH = 7,2) como solvente da reação. Isto porque foi observada a precipitação da queratina em água logo após a adição do AAs, com a consequência do abaixamento do pH do meio para aproximadamente 3, devido ao ponto isoelétrico da queratina em pH ~ 4. Uma vez corrigido o pH do meio, a polimerização iniciada pelo sistema H2O2/AAS a 25 oC resultou em soluções transparentes, indicando a não separação de fases durante a formação dos híbridos.
Na Figura 19 é apresentado um gráfico de razões molares de AAs/NIPAAm e H2O2/NIPAAm utilizadas no preparo dos híbridos, a partir de soluções aquosas a 10% de sólidos (queratina + NIPAAm). A região demarcada pelo círculo vermelho representa as condições de polimerização que resultaram em géis. Razões molares (RM) de AAs/NIPAAm e H2O2/NIPAAm superiores a 0,2 resultaram em géis, porém estes apresentaram menor estabilidade dimensional para que os géis preparados utilizando razão molar de 0,3. Assim adotou-se esta última condição para o preparo dos híbridos da série LT.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 R M AAs /N IPAAm RM H2O2/NIPAAm
Figura 19. Razão molar (RM) AAs/NIPAAm versus RM H2O2/NIPAAm empregada na polimerização do sistema PNIPAAm/queratina. A região destacada pelo círculo em
3.4.2 Caracterização dos Híbridos Queratina/NIPAAm
A polimerização radicalar da NIPAAm em presença da queratina polifuncionalizada gera uma rede tridimensional, tal como ilustrado na Figura 20.
A concentração de nós de reticulação, apresentada na Tabela 6, refere-se às ligações covalentes formadas entre as duplas ligações da queratina funcionalizada e o NIPAAm. Este parâmetro foi calculado assumindo-se a formação de uma rede tridimensional ideal, onde não ocorreu a formação de defeitos na rede polimérica, tais como formação de ligações covalentes inter e intracadeias [101] envolvendo o reticulante macromolecular, no caso, a queratina.
Figura 20. Rede híbrida de PNIPAAm reticulada com queratina funcionalizada.
3.4.2.1 Incorporação da Queratina
Na Tabela 6 estão apresentados os teores de queratina, determinados por titulação potenciométrica (dados apresentados no Anexo A), e a porcentagem de incorporação da queratina nos híbridos secos (expresso como a razão entre o teor alcançado e o planejado). Também está apresentada a concentração de grupos vinílicos de cada híbrido, esta última calculada a partir do teor de queratina nos híbridos e do grau de funcionalização de cada queratina. Observa-se que os híbridos preparadas a baixa temperatura (série LT) apresentam maior teor de queratina (85% - 90%) que os correspondentes híbridos da série HT (61% - 77%). Para a série HT, o aumento da concentração de queratina de 10% para 20% no meio reacional resultou em diminuição na incorporação da mesma no híbrido. Já para a série LT, a eficiência de incorporação da queratina foi similar para os dois teores empregados no meio reacional (10 e 20% de queratina). Pode-se concluir por estes resultados que à adoção da metodologia de síntese a baixas temperaturas (iniciador
H2O2/AAs) foi mais efetiva para a incorporação de queratina às formulações. Assim, a densidade de reticulação da série LT deve ser maior, o que influenciou as propriedades de intumescimento e mecânicas, dentre outras.
Na Figura 21 estão apresentadas as imagens dos hidrogéis LT (100) – 20% (A) e HT (100) – 20% logo após a síntese, sendo possível observar na superfície do hidrogel da série HT uma grande concentração de pontos alaranjados atribuída a queratina e oligômeros de queratina/PNIPAAm expulsos da massa polimérica, devido à separação de fases.
Tabela 6. Teores de Queratina, % de incorporação e concentração de pontos de reticulação nos híbridos. Série % queratina (a) Grau de Modificação da Queratina
Nomenclatura Teor de Queratina no Híbrido (%) % Incorporação de queratina Concentração de nós de reticulação (mmol/g de híbrido) HT 10 50 HT (50) – 10% 7,7 + 0,3 77 0,074 75 HT (75) – 10% 7,6 + 0,1 76 0,109 100 HT (100) – 10% 7,4 + 0,1 74 0,141 20 50 HT (50) – 20% 12,5 + 0,1 63 0,119 75 HT (75) – 20% 12,8 + 0,2 64 0,184 100 HT (100) – 20% 12,2 + 0,2 61 0,233 LT 10 50 LT (50) – 10% 8,8 + 0,2 88 0,084 75 LT (75) – 10% 8,8 + 0,2 88 0,126 100 LT (100) – 10% 8,6 + 0,3 86 0,164 20 50 LT (50) – 20% 17,9 + 0,3 90 0,171 75 LT (75) – 20% 17,4 + 0,3 87 0,250 100 LT (100) – 20% 16,9 + 0,3 85 0,323
