Métodos de preparação e caracterização de sistemas fármaco-HPßCD-lipossomas furtivos

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUÍMICA CURSO SUPERIOR DE LICENCIATURA EM QUÍMICA

WESLLEY ALVES DE SOUZA

Métodos de preparação e caracterização de

sistemas fármaco-HPβCD-lipossomas furtivos

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

LONDRINA 2018

WESLLEY ALVES DE SOUZA

Métodos de preparação e caracterização de

sistemas fármaco-HPβCD-lipossomas furtivos

Trabalho de Conclusão de Curso de graduação, apresentado à disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso 2 do Curso de Licenciatura em Química da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR,câmpus Londrina, como requisito parcial para obtenção do título de Licenciado em Química.

Orientador: Prof. Dr. Luís Fernando Cabeça

LONDRINA 2018

TERMO DE APROVAÇÃO

Métodos de preparação e caracterização de

sistemas fármaco-HPβCD-lipossomas furtivos

WESLLEY ALVES DE SOUZA

Este Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) foi apresentado em 06/07/2018 como requisito parcial para a obtenção do título de Licenciatura em Química. O candidato foi arguido pela Banca Examinadora composta pelos professores abaixo assinados. Após deliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho aprovado.

______________________________ Professor Orientador

Prof. Dr. Luis Fernando Cabeça

______________________________ Membro titular

Prof. Dr. Renato Márcio Ribeiro Viana

______________________________ Membro titular

Prof. Dr. Janksyn Bertozzi

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar agradeço a Deus pela vida e me capacitou a chegar onde estou. A minha mãe pelo exemplo de vitória, e que me ensinou a ser uma pessoa melhor a cada dia onde sempre me apoiou a concluir a graduação. Obrigado Mãe.

Agradeço a minha namorada Kawani C. Gomes que em todos os momentos me incentivou a jamais desistir dos meus objetivos, e que sempre acreditou em meu potencial. Obrigado meu amor.

Ao Prof. Dr. Luiz Fernando Cabeça onde auxiliou a construir meus conhecimentos, pelo excelente papel desempenhado como orientador, e com certeza um grande amigo. Muito obrigado Professor!

Aos amigos que me deram força durante a graduação.

Agradeço a todos os professores do curso, que foram tão importantes na minha carreira acadêmica.

RESUMO

SOUZA, Weslley Alves de. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO

DE SISTEMAS FÁRMACO- HPβCD - LIPOSSOMAS FURTIVOS. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso II (Curso de Licenciatura em Química). Universidade Tecnológica Federal do Paraná-UTFPR. Londrina, Paraná.

Pesquisadores do mundo todo vêm estudando os sistemas de liberação controlada de fármacos, por oferecerem muitas vantagens quando comparados aos sistemas convencionais de administração com fármacos na forma livre. Os lipossomas assim como as ciclodextrinas são uns dos melhores sistemas carreadores e liberadores de fármacos, pois são biocompatíveis, melhoram a biodisponibilidade do fármaco, limitam os efeitos secundários tóxicos e também promovem uma maior absorção do que os correspondentes ativos livres aumentando a ação do fármaco. O 2-hidroxipropil--ciclodextrina (HP-β-CD) é um dos carreadores de fármacos (F) pertencentes à classe dos oligossacarídeos cíclicos. Por sua vez, estes compostos apresentam uma cavidade interna hidrofóbica e seu exterior hidrofílico, com capacidade de solubilizar-se em meio aquoso bem como, encapsular em sua cavidade interna moléculas hidrofóbicas. Já os Lipossomas Furtivos (LF) são vesículas formadas por fosfolipídios, formando estruturas com um compartimento aquoso e por bicamada lipídica. Também utilizados como carreadores de fármacos lipofílicos e hidrofóbico. Entretanto, os fármacos incorporados nos lipossomas podem ser ainda liberados o que acaba por limitar o uso do sistema. A encapsulação do complexo Fármaco/HP-β-CD em LF pode contornar as desvantagens de cada sistema individualmente de forma a obter o melhor sistema de liberação controlada de fármaco possível. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo testar métodos de preparação de sistemas binários (F/HP-β-CD): liofilização; preparação do complexo em fase aquosa e co-evaporação em termos de eficiência de complexação e constante de associação. Também serão utilizados três métodos para a preparação do complexo ternário (F/HP-β-CD em LF), sendo elas: desidratação-reidratação; método de preparação por injeção de etanol e método por hidratação do filme lipídico em seguida quantificar ambos complexos em termos de eficiência de complexação, utilizando a espectrofotometria Ultravioleta e Visível (UV-Vis).

Palavras-chave: Sistemas binários; Sistemas ternários; Lipossomas Furtivos; Espectrofotometria Ultravioleta e Visível (UV-Vis).

ABSTRACT

SOUZA, Weslley Alves de. METHODS OF PREPARATION AND CHARACTERIZATION PHARMACO SYSTEMS - HPβCD-STEALTH LIPOSOMES. 2018. Completion work of Course II (Course of Degree in Chemistry). Federal Technological University of Paraná-UTFPR. Londrina, Paraná.

Researchers from around the world have been studying controlled drug delivery systems as they offer many advantages over conventional free drug delivery systems. Liposomes as well as cyclodextrins are one of the best carrier and drug delivery systems as they are biocompatible, improve the bioavailability of the drug, limit toxic side effects and also promote greater absorption than the corresponding free actives enhancing drug action. 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin (HP-β-CD) is one of the drug carriers belonging to the class of cyclic oligosaccharides. In turn, these compounds have a hydrophobic internal cavity and its hydrophilic exterior, in aqueous medium as well as, encapsulate in its inner cavity hydrophobic molecules. Furtive Liposomes (LF) are vesicles formed by phospholipids, forming structures with an aqueous compartment and lipid bilayer. Also used as carriers of lipophilic and hydrophobic drugs. However, the drugs incorporated into the liposomes can still be released which ultimately limits the use of the system. Encapsulation of the Drug / HP-β-CD complex in LF can bypass the disadvantages of each system individually in order to obtain the best possible controlled drug delivery system. In this way, the present work aims to test methods of preparation of binary systems (Drug / HP-β-CD): freeze-drying; preparation of the complex in aqueous phase and co-evaporation in terms of complexation efficiency and association constant. Three methods for the preparation of the ternary complex (F / HP-β-CD in LF) will also be used, being: dehydration-rehydration; method of preparation by injection of ethanol and method by hydration of the lipid film, then quantify both complexes in terms of complexation efficiency using UV and Vis (UV-Vis) spectrophotometry.

Keywords: Binary systems; Ternary systems; Furtive Liposomes; Ultraviolet and Visible Spectrophotometry (UV-Vis).

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação Esquemática da Liberação Controlada de Fármaco em

Lipossomas. ... 16

Figura 2: Moléculas de lipídios A) fosfatidilcolina, B) fosfatidilserinas e C) fosfatidilgliceróis. ... 16

Figura 3: Lipossoma Convencional (A), Lipossoma Furtivo (B). ... 17

Figura 4:A) Estrutura das principais ciclodextrinas naturais, α, β e γ. B) Estrutura tronco cônica das CDs e suas hidroxilas primárias e secundárias voltadas para o exterior dos anéis. ... 18

Figura 5:Representação Esquemática do sistema Binário (Fármaco em Ciclodextrina). ... 19

Figura 6: Molécula de 2-hidroxipropil-b-ciclodextrina. ... 20

Figura 7: Formaçãodo complexo Ternário (Fármaco em Ciclodextrinas encapsulado em Lipossoma Furtivo). ... 21

Figura 8: Método por Co-Evaporação. ... 22

Figura 9: Método por complexo em fase aquosa ... 22

Figura 10: Método por Liofilização. ... 23

Figura 11: Método por Hidratação de filme lipidico ... 24

Figura 12: Método por Injeção de etanol. ... 24

Figura 13: Método por desidratação-reidratação ... 25

Figura 14: Curva de padronização da RVC. ... 30

Figura 15: Curva de calibração da ropivacaína. ... 30

Figura 16: Diagrama de solubilidade de fase para RVC com aumento da concentração de HPBCD, determinada a temperatura ambiente. ... 32

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Absorbância em 263 nm adquirida para diferentes métodos de preparação de binário e suas rescpectivas concentrações. ... 31 Tabela 2: Dados de absorbância de RVC para amostras de binário: concentração de HP-β-CD 2, 4, 8, 16, 30 mM com excesso de RVC. ... 31 Tabela 3: Valores da concentração de RVC solubilizada para cada concentração de HP-β-CD ... 32 Tabela 4: Valores de absorbância e da concentração de RVC em solução binária. . 34 Tabela 5: Valores de absorbância da RVC diluida em 3 ml de solução tampão fosfato e suas concentrações finais. ... 35 Tabela 6: Valores para a concentração de RVC encapsulado em lipossimas furtivos, e suas eficiências de complexação. ... 35

LISTA DE ABREVIATURAS

F/HP-β-CD- Fármaco em 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina

F/HP-β-CD/LF - Fármaco em 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina em Lipossomas Furtivos GUV -Vesícula Unilamelar Gigante

HP-β-CD - 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina LF - Lipossomas Furtivos

LUV - Vesícula Unilamelar Grande MLV - Vesícula Multilamelar

MUV - Vesícula Multivisicular PEG - Polietilenoglicól

RVC –Ropivacaína

SUV - Vesícula Unilamelar Pequena UV-Vis - Ultravioleta e Visível

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 11 2 OBJETIVOS ... 12 2.1 OBJETIVOGERAL ... 12 2.2 OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 12 3 JUSTIFICATIVA ... 13 4 REFERENCIAL TEÓRICO ... 14

4.1 SISTEMASDELIBERAÇÃODEFÁRMACOS ... 14

4.2 LIPOSSOMAS ... 15

4.2.1 Lipossomas Furtivos. ... 16

4.3 CICLODEXTRINAS ... 17

4.4 COMPLEXO DO FÁRMACO EM HP--CICLODEXTRINA ENCAPSULADO EMLIPOSSOMAFURTIVO(F/HP--CD/LF) ... 20

4.5 MÉTODOSDEPREPARAÇÃODOSISTEMABINÁRIO(F/HP--CD) ... 21

4.6 MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DO SISTEMA TERNÁRIO (F/ HP- -CD/LF)... ... 23

5 MATERIAIS E MÉTODOS ... 25

5.1 MATERIAISEMESTUDOS ... 25

5.2 MÉTODOLOGIA ... 25

5.2.1 Preparação do Complexo Binário (F/HP--CD)... 25

5.2.2 Preparação do Complexo Ternário (RVC: HP--CD: LF)... 28

6 RESULTADOS ... 29

6.1 CURVA DE CALIBRAÇÃO DA ROPIVACAÍNA. ... 29

6.2 DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE COMPLEXAÇÃO PARA O SISTEMA TERNÁRIO (RVC:HP--CD:LF) ... 34

7 CONCLUSÃO ... 35

1 INTRODUÇÃO

Ciclodextrinas CDs são oligossacarídeos cíclicos constituídos por unidades de glucopinose. CDs são utilizados para formação de sistemas de complexação com moléculas hidrofílicas. A principal habilidade das CDs é aumentar a solubilidade do fármaco para o aumento da sua biodisponibilidade. CDs embora apresentem habilidade de formar complexos e melhorar sua biodisponibilidade, também acabam melhorando a farmacocinética do fármaco.

Destacando também os lipossomas e lipossomas furtivos como carreadores de fármacos, pode-se defini-los como vesículas formadas por fosfolipídios, formando estruturas com um compartimento aquoso e bicamada lipídica. Eles são utilizados como carreadores de fármacos lipofílicos ou hidrofóbico.

A união de ambos os sistemas de liberação, ou seja, encapsulação do complexo fármaco/CD em lipossomas pode contornar as desvantagens de cada sistema individualmente e também podendo aumentar o tempo de duração do fármaco na corrente sanguínea como também dimuindo sua toxicidade.

Para isso, buscam-se métodos de preparações que visam a melhorar a eficiência de cada sistema. Assim o presente trabalho testara três métodos de preparação para o complexo binário fármaco/HP-β-CD: liofilização; preparação do complexo em fase aquosa e co-evaporação. Também serão utilizados três métodos para a formação do complexo ternário fármaco/CD/lipossomas: desidratação-reidratação; método de preparação por Injeção de etanol e método por hidratação do filme lipídico.

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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho tem como objetivo testar diferentes métodos de preparação de sistemas fármaco em 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (F/HP-β-CD) e fármaco/HP-β-CD encapsulado em lipossomas furtivos (LF). Após este processo, quantificar o complexo (F/HP-β-CD) e o lipossoma furtivo, utilizando como ferramenta a espectrofotometria Ultravioleta e Visível (UV/Vis). O fármaco utilizado para o processo de encapsulamento será a ropivacaina (RVC)

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Preparar o complexo de inclusão RVC em 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, (RVC/HP-β-CD), utilizando os métodos de co-evaporação, preparação complexa em fase aquosae liofilização.

 Preparar a estrutura dos lipossomas com membrana modificada (lipossomas furtivos) através do uso de lipídeos de fosfatidilcolina de ovo (EPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)]-2000 (DSPE-PEC-2000) e colesterol;

 Preparar do complexo ternário entre RVC/HP-β-CD e lipossomas furtivos (RVC/HP-β-CD/LF) utilizando os métodos de filme lipídico, desidratação-rehidratação e injeção etanólica.

 Quantificação de cada sistema através da técnica de espectrofotometria Ultravioleta e Visível (UVvis) para determinar eficiência de complexação e constante de associação.

3 JUSTIFICATIVA

Pesquisadores do mundo todo vêm estudando os sistemas de liberação controlada de fármacos, tal estudos se deve, por oferecerem muitas vantagens quando comparados aos sistemas convencionais de administração com fármacos na forma livre (KONING et al., 2002).

Os lipossomas assim como as ciclodextrinas são uns dos melhores sistemas carreadores e liberadores de fármacos, pois são biocompatíveis, melhoram a biodisponibilidade do fármaco, limitam os efeitos secundários tóxicos e também promovem uma maior absorção do que os correspondentes ativos livres aumentando a ação do fármaco (ALLEM et al., 2013).

Lipossomas com superfície de membrana modificada da origem aos lipossomas furtivos, tal modificação auxilia a melhorar o tempo de circulação na corrente sanguínea (BOERMAN et al., 2000), pois os lipossomas furtivos apresentam um tempo de vida na corrente sanguínea maior do que os lipossomas convencionais.

Para obtenção de sistemas fármaco/HP--CD em lipossomas furtivos para liberação de fármacos é fundamental o uso de métodos de preparação eficientes quanto à eficiência de encapsulação e cinética de liberação. Para tanto, diferentes métodos de preparação serão testados e avaliados.

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4 REFERENCIAL TEÓRICO

4.1 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS

O termo “fármaco” engloba neste contexto todos compostos bioativos administrados com intuito terapêutico, desde moléculas de baixo peso molecular a proteínas e a material genético (COIMBRA, 2010). Entre as diversas formas de administração de fármacos, a via oral é a mais utilizada e, entre as várias formas farmacêuticas de administração oral, os comprimidos são os mais empregados (AULTON, 2005).

Os comprimidos que se destinam à administração oral apresentam diferentes objetivos, como dissolução na boca, ingestão e desagregação no estômago ou no intestino (PRISTA et al., 2002; ANSEL et al., 2000). Esta forma farmacêutica inclui algumas vantagens, dente as principais estão: boa precisão de dosagem, maior estabilidade física, química e microbiológica em relação às demais formas farmacêuticas, principalmente as líquidas. Também apresentam facilidade de manuseio, tecnologia de obtenção relativamente simples, boa apresentação e fácil aceitação (AULTON, 2005; PRISTA et al., 2002).

A principal desvantagem dos comprimidos como forma farmacêutica está relacionada à biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água ou de baixa taxa de absorção. Adicionalmente, alguns fármacos podem causar efeitos de irritação local ou, ainda, causar danos na mucosa gastrintestinal (AULTON, 2005).

As formas farmacêuticas convencionais apresentam algumas limitações, tais como: impossibilidade de manter constante a concentração do fármaco nos locais de ação flutuações inevitáveis das concentrações de fármaco no plasma no estado de equilíbrio e, para fármacos com tempo de meia-vida biológica curta, necessidade de doses frequentes para manter as concentrações plasmáticas no estado de equilíbrio e dentro da faixa terapêutica (AULTON, 2005).

Para tanto, busca-se alternativas para tornar o uso de medicamentos mais seguros, com ação mais prolongada, mais regular, mais localizada, diminuição da toxicidade e efeitos secundários sem que se diminua a eficácia terapêutica (AIACHE; DEVISSAGUET; GUYOT-HERMANN, 1982). Nesse ínterim, a necessidade do desenvolvimento de preparações de liberação controlada de fármacos (Figura 1).

Os sistemas de liberação de fármacos (Drugs delivery system) apresenta grandes vantagens quando comparadas com outros sistemas convencionais, pois permite aperfeiçoar a liberação de um fármaco até seu local de ação, dentre outras vantagens estão: a maior eficácia terapêutica; redução da toxicidade e maior tempo do fármaco na circulação; menor número de dose, o que implica numa maior segurança na administração; aumento da estabilidade do fármaco; o direcionamento a alvos específicos; e a capacidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas como lipofílicas (FELICE et al., 2014).

Nesse sentido, o uso da tecnologia de encapsulamento de ativos (medicamentos, vacinas, perfumes, corantes, etc.) dentro de nanoestrutura esta atraindo muita atenção na química, biologia, medicina farmacológica e na comunidade nanotecnologia (YANG et al., 2013 e ZUCKER et al., 2009). Hoje são conhecidos muitos sistemas carreadores como as ciclodextrinas, os calixarenos, lipossomas e lipossomas furtivos (LIU et al., 2004).

4.2 LIPOSSOMAS

Os lipossomas podem ser definidos como, vesículas esféricas microscópicas, constituídas de uma ou várias bicamadas lipídicas (LOPES; OLIVEIRA, 2000; SANTOS; CASTANHO, 2002; ARAÚJO et al., 2003; FRÉZARD et al., 2005; BATISTA et al., 2007; KLÜPPEL et al., 2007; CABEÇA et al., 2008; DIMER et al., 2013; ANCHIÊTA-JÚNIOR, et al., 2014).

Uma aplicação das vesículas lipossomais se baseia no ecapsulamento de fármacos (PAULA et al., 1996; PINTO et al., 2000; FRACETO et al., 2002; CEREDA et al., 2004; UHRIKOVA et al., 2004), aumentando o tempo de meia-vida dos fármaco in vivo (GRANT et al., 2001; GRANT, 2002), prolongando o efeito de atividade e reduzindo os efeitos colaterais.

Além disso, os lipossomas têm a capacidade de proteger o fármaco encapsulado da degradação ou diluição. Quando alcançam os tecidos alvos podem liberar grande concentração do produto, com isso acaba aumentando a eficácia do tratamento (Figura 1). Também apresentam baixa toxicidade, são biodegradáveis, modificam as propriedades farmacocinéticas, o tempo de circulação na corrente

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sanguínea e o metabolismo do fármaco encapsulada (SANTOS et al., 2002; GONIOTAKI et al., 2004; PUGLIA et al., 2004).

Figura 1: Representação Esquemática da Liberação Controlada de Fármaco em Lipossomas.

Fonte: Adaptada de What is a Liposome (You Tube)

Por apresentarem grande estabilidade frente a variações de pH ou da concentração de sal no meio, as fosfatidilcolinas de ovo (EPC) são as mais utilizadas em estudos de formulação de lipossomas (BATISTA et al., 2007). Outros lipídeos mais utilizados nas formulações de lipossomas são os que se aproximam de uma forma cilíndrica como as fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas e fosfatidilgliceróis (Figura 2).

Figura 2: Moléculas de lipídios A) fosfatidilcolina, B) fosfatidilserinas e C) fosfatidilgliceróis.

Fonte: Adaptada de Cabeça (2009). 4.2.1 Lipossomas furtivos.

Um dos maiores pré-requisitos para a utilização de lipossomas como carreadores de fármacos in vivo é que eles devem circular e reter o fármaco por tempo suficiente para alcançar o sítio efetivo. Como solução deste problema os lipidios podem ser modificados incluindo determinadas moléculas em sua camada exterior (modificando sua superfície) de forma a evitar sua eliminação pelo sistema retículo-endotelial (LOPES; OLIVEIRA, 2000). Por sua vez, estes lipossomas convencionais passam então a ser denominados de lipossomas de longa circulação ou simplesmente de lipossomas furtivos (LF) (Figura 3) (SANTOS; CASTANHO, 2002; ANCHIÊTA-JÚNIOR, et al., 2014).

Um dos principais componentes utilizados para preparar lipídeos furtivos é o uso de polímeros hidrofílicos, em especial os polietilenoglicóis (PEG) (BATISTA, et al., 2007; KLÜPPEL, et al., 2007). O PEG é um polímero biologicamente inerte muito utilizado em carreadores farmacológicos para criar um obstáculo estério e/ou uma camada hidrofílica superficial ao redor dos lipossomas, de forma a protegê-los contra as proteínas plasmáticas do corpo (LOPES; OLIVEIRA, 2000; ANCHIÊTA-JÚNIOR, et al., 2014). Esta camada hidrofílica superficial aumenta o tempo de circulação dos lipossomas bloqueando o processo de reconhecimento molecular e a captura pelas células do sistema fagocitário mononuclear (ANCHIÊTA-JÚNIOR, et al., 2014), principalmente as células de Kupffer no fígado (BATISTA, et al., 2007).

Figura 3: Lipossoma Convencional (A), Lipossoma Furtivo (B).

Fonte: Adaptada de Liposomal technology-YouTube.

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As Ciclodextrinas (CD) são um dos carreadores de fármacos mais utilizados, pertencentes à classe dos oligossacarídeos cíclicos de seis ou mais unidades de glicopiranose unidas por ligações α-1,4. Esta classe de oligossacarídeos é capaz de formar complexos de inclusão com várias moléculas orgânicas denominadas de moléculas hóspedes (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007).

Constituem uma nova classe de excipientes farmacêuticos compostas por unidades de D-(+)-glucopiranose, que unidas originam estruturas cíclicas tronco-cônicas (CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007; ALVES et al., 2012) sendo denominadas de α-ciclodextrinas (α-CD), β-ciclodextrinas (β-CD) e γ-ciclodextrinas (γ-CD) (Figura 4), respectivamente.

Figura 4: A) Estrutura das principais ciclodextrinas naturais, α, β e γ.

Fonte: http://www.jotdown.es

Por sua vez, estes compostos apresentam uma cavidade interna hidrofóbica e seu exterior hidrofílico, com capacidade de solubilizar-se em meio aquoso bem como, encapsular em sua cavidade interna moléculas hidrofóbicas (ARAÚJO et al., 2003; CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO 2007; FRACETO et al., 2007; VENTURINI et al., 2008; LYRAet al., 2010).

Estudos feitos apontam que maior parte dos fármacos quando em solução aquosa apresentam alguma degradação, podendo perder sua eficiência e até mesmo tornando tóxico, frequentemente, a atividade terapêutica é prejudicada pela instabilidade do fármaco (LOFTSSON; BREWSTER, 1996).Uma das maneiras de melhorar a solubilidade do fármaco em água é sua inclusão em CDs, além do mais, contribui para a redução da toxicidade local e/ou sistêmica, protegendo contra a degradação, promovendo um prolongamento da ação do fármaco (ARAÚJO et al., 2003; CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO 2007; LYRA, et al., 2010).

Figura 5: Representação Esquemática do sistema Binário (Fármaco em Ciclodextrina).

Fonte: Adpatada de Unochapecó.

Em especial, os complexos formados por -ciclodextrinas (-CD) são importantes como sistemas liberadores de fármacos devido à melhora na solubilidade aquosa, estabilidade química e biodisponibilidade (UEKAMA, 2004) sendo, portanto bons carreadores quando injetados intravenosamente.

No entanto, as -CD apresentam solubilidade aquosa limitada e a formação de complexos com compostos lipofílicos geralmente resulta em precipitação dos complexos sólidos, com isso, uma vez que sua solubilidade é baixa pode levar à uma precipitação de microcristais nos rins (CARVALHO, 2007). Outra consequência, que pode comprometer a função renal, é a complexação da -CD com o colesterol. Como forma de solucionar esses efeitos adversos, modificações foram feitas na estrutura química das -CD, originando derivados mais solúveis como a 2-hidroxipropil--ciclodextrina (HP--CD) (RAJEWSKI; STELLA, 1996; DAVIS; BREWSTER, 2004) (Figura 6)

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Figura 6: Molécula de 2-hidroxipropil-b-ciclodextrina.

Fonte: glycomatrix

Estudos feitos com a HP--CD indicam sua toxicidade ‘in vivo’ é tolerada pela maioria das espécies, bem como apresenta a vantagem de ter a solubilidade aumentada e toxicidade menor em relação à -CD (CARVALHO, 2007). Pesquisas realizadas indicam que a HP--CD, não induzem toxicidade renal, sendo eliminados mais rapidamente em maiores quantidades do que a -CD (CARVALHO, 2007).

Complexos formados por fármaco e HP--CD quando presentes na corrente sanguínea uma rápida dissociação do fármaco ocorre, quer por diluição ou por deslocamento do mesmo por outros componentes do sangue. Desta forma, as ciclodextrinas aumentam a disponibilidade e a fase cinética do fármaco (MCCORMACK et al., 1998).

Para tanto, utiliza-se a complexação de agentes terapêuticos em sistemas ternários como fármaco-ciclodextrina-lipossoma (MCCORMACK et al., 1996; LOUKAS et al., 1998; MCCORMACK et al., 1998; FATOUROS et al., 2001; HAGIWARA et al., 2006; MAESTRELLI et al., 2006; PIEL et al., 2006) como forma de contornar tais desvantagens.

4.4 COMPLEXO DO FÁRMACO EMHP-β-CICLODEXTRINA ENCAPSULADO EM LIPOSSOMA FURTIVO (F/HP-β-CD/LF)

Ensaios de liberação in vitro mostraram liberação mais prolongada para o sistema RVC/HP-β-CD/LF (figura 7), comparado ao fármaco encapsulado somente em lipossomas.

Fatouros et al. (2001) por estudos mostraram que a principal eficácia/característica de um sistema de duplo carreamento é que o fármaco em ciclodextrina encapsulado em lipossoma possui a habilidade de complexar-se, em altas quantidades, com as moléculas da ciclodextrina.

Além disso, as ciclodextrinas são muito importantes para elevar da solubilidade do fármaco, já os lipossomas com a função de proteção e prolongamento do tempo de meia vida do fármaco. Desta forma, o lipossoma agiria como uma espécie de ‘’reservatório’’ (PIEL et al., 2006). Estudos demonstraram ainda que o sistema ternário tem a característica de aumentar a eficácia terapêutica do fármaco (BRAGAGNI et al., 2010).

Figura 7: Formaçãodo complexo Ternário (Fármaco em Ciclodextrinas encapsulado em Lipossoma Furtivo).

Fonte: Autoria Própria.

Entretanto, para se obter um sistema de liberação de fármaco eficiente é necessário que os métodos de preparação sejam estudados. Muitos métodos são usados para obter os complexos de inclusão de F/HP-β-CD, entre ele podemos destacar os seguintes métodos: co-evaporação, preparação complexa em fase aquosa e liofilização. Para o sistema ternário, pode-se destacar os métodos: filme lipídico, desidratação-reidratação e injeção de etanol (UEKAMA et al, 1998; MARTINS, 2003; SHIMP et al, 2005)

4.5 MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DO SISTEMA BINÁRIO (F/HP--CD)

• Co-evaporação, também conhecido como método de evaporação do solvente, sendo o método mais utilizado em escala laboratorial, onde tal procedimento envolve

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a mistura do fármaco na fase orgânica e uma solução aquosa de HP--CD sob agitação para ocorrer à dispersão. Para remover o fármaco não dissolvido, a suspensão resultante é centrifugada a 10 000 rpm (ZHOU etal., 2013; ZHU et al.,2012) ou seguida por evaporação do solvente sob vácuo até a massa seca obtida (MAESTRELLI et al., 2005, 2006, 2010). O sólido é ressuspenso em solução aquosa ou tampão (Figura 8).

Figura 8: Método por Co-Evaporação.

Fonte: Adptada de Ghariba et al., 2015.

• Preparação do complexo em fase aquosa: nesse procedimento o HP--CD é dissolvido numa solução tampão ph 7,4 (DHULE et al., 2012; FATOUROS et al., 2001; GILLET et al., 2009; PIEL et al., 2006) em seguida o fármaco é então adicionado. O complexo de inclusão em solução tampão é formado após agitação da mistura durante um período específico de tempo a uma temperatura específica (DHULE et al., 2012; FATOUROS et al., 2001; PIEL et al., 2006) (Figura 9).

Figura 9: Método por complexo em fase aquosa

• Liofilização: este método consiste num prévio congelamento da solução seguida por secagem rápida a pressões reduzidas, a fim de eliminar o solvente dos sistemas em solução. O fármaco e o HP--CD a proporção molar 2:1 são dissolvidos em etanol ou água respectivamente (CAVALCANTI et al., 2011) ou ambos na fase aquosa (CHEN et al., 2007). A solução otida é agitada durante um tempo específico a uma determinada temperatura e depois filtrada (CHEN et al., 2007; SKALKO et al., 1996), em seguida, congelada e liofilizada sob pressão reduzida (CAVALCANTI et al., 2011; CHEN et al. , 2007; SKALKO et al., 1996) (Figura 10).

Figura 10: Método por Liofilização.

Fonte: Adaptada de Ghariba et al., 2015.

4.6 MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DO SISTEMA TERNÁRIO (F/ HP--CD/LF)

• Hidratação de filme lipidico (Figura 11): Vesículas de lipossomas multilamelares são obtidos por dissolução do lípido com uma quantidade mínima de solvente orgânico (clorofórmio), que é então removido sob pressão reduzida, obtendo uma película fina seca. Finalmente, o filme é hidratado por solução aquosa contendo CD /fármaco sob agitação (MAESTRELLI et al., 2005; PIEL et al., 2006). O fármaco a ser encapsulado pode estar presente tanto na camada lipídica quanto no meio de aquoso. Devido à alta concentração lipídica, uma percentualidade alta de volume é encapsulada e, portanto, uma alta eficiência de encapsulação do fármaco é obtida (GREGORIADIS et al., 1990; CASALS et al., 1996).

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Figura 11: Método por Hidratação de filme lipidico

Fonte: Adaptada de Ghariba et al., 2015

• Injeção de etanol (Figura 12): os fosfolípidos são dissolvidos em etanol e a fase orgânica resultante é injetada em um fase aquosa contendo o complexo binário F/CD sob agitação magnética. Após o agitação, o etanol é removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida (SKALKO et al., 1996).

Figura 12: Método por Injeção de etanol.

Fonte: Adaptada de Ghariba et al., 2015.

• Desidratação-reidratação (Figura 13): os fosfolípidos são dissolvidos em um solvente orgânico, que é então completamente evaporado em um evaporador rotativo para formar uma película lipídica fina e depois hidratada com uma fase aquosa (CHEN et al., 2007; FATOUROS et al., 2001) contendo complexos CD/ fármaco. As vesículas formadas são liofilizadas e depois são re-hidratadas com

solução de NaCl para manter a osmolaridade (CHEN et al., 2007; FATOUROS et al., 2001).

Figura 13: Método por desidratação-reidratação

Fonte: Adaptada de Ghariba et al., 2015.

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 MATERIAIS EM ESTUDOS

Para o desenvolvimento do projeto, os presentes reagentes foram adquiridos via recursos do Projeto Universal CNPq. O fármaco Ropivacaína (RVC) e a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina foram adquiridos da Sigma Aldrich, amostras de fosfatidilcolina de ovo (EPC), colesterol e o polímero 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)]-2000 (DSPE-PEG-2000) foram adquiridos da Avast Lipids.

5.2 MÉTODOLOGIA

5.2.1 Preparação do Complexo Binário (F/HP--CD) 5.2.1.1 Co-evaporação.

Foi preparada em um béquer uma solução de RVC (10 mM) em 1 mL de etanol. Em seguida a solução orgânica de RVC foi adicionada a uma solução (5mL) de tampão fosfato (pH 7,4) de HP--CD (5 mM). A mistura foi deixada sob agitação

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por aproximadamente 48 horas, para obter a dispersão molecular. Em seguida, a suspensão foi agitada por mais 1 hora a uma temperatura de 60°C. E por fim, o solvente foi evaporado em rotaevaporador até obter uma massa seca. O material seco foi ressuspenso em água destilada, posteriormente foi filtrado (millexfilter, Millipore, USA com poro de 0,45 µm) onde seguiu para quantificação em UV-vis. O processo de filtração em millexfilter, Millipore, USA com poro de 0,45 µm, tem como grande importância a separação do fármaco encapsulado e o fármaco na forma livre. Levando em consideração, que a concentração do fármaco na forma livre será quantificada e pela diferença da concentração inicial, será determinada a concentração de fármaco encapsulado em HP--CD.

5.2.1.2 Preparação do complexo em fase aquosa

Uma mistura HP--CD (5 mM) e RVC (10 mM) em 5 mL de solução tampão (pH 7,4) foi preparada. Em seguida, foi deixada sob agitação por 48 horas. Posteriormente, o complexo foi filtrado em membrana (millexfilter, Millipore, USA com poro de 0,45 µm) e por fim, quantificado em UV-vis.

5.2.1.3 Liofilização.

RVC (10 mM) e HP--CD HP--CD (5 mM) foram dissolvidos em 5mL de solução tampão fosfato (pH 7,4). A solução resultante foi agitada por 48 horas a temperatura ambiente, filtrada, congelada e liofilizada sob pressão reduzida até obter-se um complexo de inclusão. O material liofilizado foi hidratado com 5 mL de água destilada e seguido para quantificação.

5.2.1.4 Determinação da eficiência de complexação (EC) e constante de associação (Ka) do complexo binário.

Para verificar qual método de prepararção do binário foi o de maior rendimento em termos de solubilização da RVC com formação de complexo com HP--CD foi utilizado a eficiênica de encapsulação (EC). Esse valor pode ser determinado utilizando as equações abaixo. (LOFTSSON; MASSON e SIGURJONSDOTTIR., 1999).

𝐸𝐶 =

1−𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒 Eq. 01

𝐸𝐶 =

[𝐶𝐷] Eq.02

Onde ‘slope’ é a inclinação da reta, [HPCD ∶ F] é a concentração da ropivacaina na solução (RVC livre e RVC complexada com o HP--CD) e [CD] é a concentração da ciclodextrina usada. Já O EC pode ser usado para calcular a razão HP-β-CD: RVC, conforme a equação 03

HP



CD ∶ RVC = 1: (1 +

𝐸𝐶

) Eq.03

Depois de verificado o melhor método de preparação do sistema binário, foi realizado o estudo de solubilidade de fase. Os complexos formados entre a RVC e a HP-β-CD foram preparados em solução tampão fosfato de sódio (pH 7,4), variando as concentrações de HP-β-CD de 2; 4; 8; 16 e 30 mM com concentrações de RVC em excesso. As soluções foram deixadas em agitação por 48 horas em agitador magnético. As amostras foram filtradas em membrana de policarbonato (millex filter, Millipore, USA com poro de 0,45 µm) e levadas para análise por espectrofotometria de UV-vis, com varredura de 200 a 400nm (Spectrometer Lambda 25). Os maiores sinais de absorbância foram registrados em 263nm, partindo desse princípio foi possível determinar as concentrações de RVC na presença de HP--CD.

Posteriormente, foi possível determinar a constante de associação (Ka) a partir do ‘slope’ da porção linear do diagrama da fase solúvel de acordo com a equação 04:

𝐾𝑎 =

𝑆₀(1−𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒) Eq 04.

28

5.2.2 Preparação do Complexo Ternário (RVC: HP--CD: LF)

Para o preparo do sistema ternário será utilizado o metodo de preparação do sistema binário com maior eficiência de encapsulação.

5.2.2.1 Método por hidratação do filme lipidico.

Para a preparação dos lipossomas furtivos foram utilizados: fosfatidilcolina de ovo (EPC), colesterol e de DSPE-PEG-2000 a uma razão molar de 54:41:5. Os componentes foram solubilizados em clorofórmio e posteriormente, o solvente foi retirado por evaporação à temperatura ambiente para obtenção de um filme lipídico (HAERI et al., 2013). Em seguida, os lipídeos foram hidratados com solução aquosa contendo o complexo binário de maior eficiência de complexação e agitado em vortex. A mistura foi transferida para um mini-extrusor (Avantimini-extruder) com membrana de policarbonato de 400 nm e centrifugada.

5.2.2.2 Método de preparação por Injeção de etanol.

Neste método foi preparado o filme lipídico como descrito no item 5.2.2.1. Em seguida o filme foi dissolvido em 300µL de etanol e a fase orgânica resultante foi injetada na solução binária de maior eficiência de encapsulação sob agitação magnética durante uma hora. Após o agitação, a mistura foi levada para evaporação em rotaevaporador. Posteriormente, o lipossoma foi inserido em um mini-extrusor (Avantimini-extruder) com membrana de policarbonato de 400 nm.

5.2.2.3 Desidratação-reidratação

Foi preparado o filme lipídico como descrito no item 5.2.2.1. Em seguida o filme lipídico foi hidratado com uma fase aquosa contendo a complexo binário. As vesículas formadas foram congeladas, liofilizadas e depois re-hidratadas com 5mL água destilada. Em seguida, o lipossoma formado foi transferido para um mini-extrusor (Avantimini-extruder) com membrana de policarbonato de 400 nm.

5.2.2.4 Determinação da Eficiência de Complexação para sistemas ternários (RVC:HP--CD:LF)

Para a determinação da eficiência de complexação do sistema ternário, para cada método de preparação uma alíquota de 400 µL de cada complexo ternário foi levada para ultra centrifugação durante um período de 50 min a 13000 rpm (Eppendorf 5452 Minispin ). Uma alíquota de 200 µL do filtrado (quantidade livre de fármaco) de cada amostra foi transferidos para frascos e diluídos em 3000 µL de tampão fosfato de sódio. Posteriormente, a amostra foi quantificada utilizando a técnica de UV-vis. O cálculo para a eficiência de complexação pode ser determinado através da equação 05:

𝐸𝐶_𝑡𝑒𝑟 = [𝑅𝑉𝐶 𝑝𝑒𝑠𝑎𝑑𝑜]−[𝑅𝑉𝐶 𝑛ã𝑜 𝑒𝑛𝑐𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎]

[𝑅𝑉𝐶𝑝𝑒𝑠𝑎𝑑𝑜] 𝑥100% Eq.05

6 RESULTADOS

6.1 Curva de calibração da ropivacaína.

Primeiramente, foi realizada uma curva de calibração do fármaco RVC em solução aquosa pH 7,4 (tampão fosfato). Para tanto, foram utilizadas amostras de RVC, variando suas concentrações de 9,5.10-5_{M a 5,4.10}-4_{M, e em seguida levadas} para análise em espectrofotômetro Uv/vis (Spectrometer Lambda 25). Para todas as amostras foram observados as maiores bandas de absorção em 263 nm, conforme descrito na curva de padronização da RVC (Figura 14).

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Figura 14: Curva de padronização da RVC.

Fonte: Autoria própria (2018).

Foi obtido uma equação da reta através da curva de calibração (absorbância vs concentração), com um coeficiente de correlação (r2_{) igual a 0,99945 (Figura 15).} Figura 15:Curva de calibração da ropivacaína.

Fonte: Autoria própria (2018).

A partir dos valores do coeficiente linear e coeficiente angular da reta pode-se gerar a seguinte equação da reta.

6.2 - Estudo da eficiência de encapsulação do complexo binário RVC/HPBCD e solubilidade de fases.

As amostras do complexo binário, preparadas conforme descritos na parte experimental, foram levados para análise (triplicata) em UV/vis, onde cada amostra forneceu uma absorbância a 263 nm.

Com os valores médios de absorbância obtidos e com o auxílio da equação 02, foi possível definir qual método de preparação do binário apresentou maior concentração de RVC solubilizada ([ ]RVC/SOLU.) (Tabela 01).

Tabela 1: Absorbância em 263 nm adquirida para diferentes métodos de preparação de binário e suas rescpectivas concentrações.

MÉTODOS Absorbância em 263nm Média (Abs) [ ]RVC/SOLU. (M) Abs I Abs II Abs III

Co-evaporação 1,080157 1,031143 1,03569 1,048889 0,00228 Fase-Aquosa 1,891169 1,500781 1,498910 1,630286 0,00374 Lioflização 0,956076 0,920990 0,924119 0,933728 0,00200 Fonte: Autoria própria (2018).

Fazendo uma comparativa entre os métodos utilizados a concentração de RVC solubilizada para o método de fase-aquosa foi de 0,00374M. Isso indica que a maior solubilidade do fármaco foi encontrada para o método de fase aquosa. A partir disso foi possível determinar a eficiência de complexação (EC) e a constante de associação (Ka) para o complexo binário utilizando o método de fase aquosa.

Para o cálculo de EC e Ka foi preparado amostras variando a concentração de HP-β -CD com RVC em excesso (Tabela 02).

Tabela 2: Dados de absorbância de RVC para amostras de binário: concentração de HP-β-CD 2, 4, 8, 16, 30 mM com excesso de RVC.

Concentração de

HP-β-CD (mM) Absorbância RVC em 263nm Média (Abs) Abs I Abs II Abs III

2 0,268154 0,270153 0,268426 0,268911

32

8 0,39971 0,405665 0,399842 0,401739

16 0,51783 0,528703 0,520013 0,522182

30 0,950536 0,964446 0,949332 0,954771

Fonte: Autoria própria (2018).

Através dos valores de absorbância da Tabela 02 e com auxílio da equação 06, foi possível determinar a concentração de RVC solubilizada (Tabela 03).

Tabela 3: Valores da concentração de RVC solubilizada para cada concentração de HP-β-CD

Esse resultado forneceu o gráfico (Figura 16) com r2 _{igual a 0,974, onde lê-se} concentração de RVC no eixo y e concentração de HP-β-CD no eixo x.

Figura 16: Diagrama de solubilidade de fase para RVC com aumento da concentração de HPBCD, determinada a temperatura ambiente.

Fonte: Autoria própria (2018).

Concentração de HP-β-CD (mM) Concentração de RVC (mM) 2 0,336 4 0,447 8 0,668 16 0,969 30 2,05

Segundo a curva de solubilidade da RVC, nota-se que a concentração do fármaco aumentou conforme a concentração de HP-β-CD também aumentava, indicando que o fármaco se tornou mais solúvel após a formação do complexo binário. Através dos dados da curva de solubilidade da figura 16, foi possível determinar a eficiência de complexação (EC) da RVC e o valor de Ka.

A constante de solubilidade do fármaco RVC (Ka) foi determinada a partir da inclinação da parte linear do diagrama de solubilidade de fase de acordo com a equação da reta abaixo e através da equação 04:

RVC = 0,1747 + 0,05994.[HP-β-CD]

Assim, o valor da Ka para o complexo binário foi de 75,9 M-1 _{onde o valor de} S0 = 0.84mM (solubilidade intrínseca do fármaco). Levando em consideração que a solubilidade da RVC foi determinada através da equação da curva de calibração (Figura 15), variando as concentrações de RVC (20, 40 e 80mM) em 5mL de tampão fosfato.

A determinação de Ka entre RVC e HP-β-CD, baseia-se na medição de um índice de variações das propriedades físico-químicas de um composto após a inclusão. Uma importante aplicação farmacêutica de HP-β-CD é aumentar a solubilidade do fármaco em solução aquosa e o aumento da solubilidade do RVC ocorreu em função da concentração de HP-β-CD. O valor encontrado mostra uma interação média entre RVC e HP-β-CD. O valor da constante de associação é usado para comparar a afinidade dos fármacos por derivados de ciclodextrinas. A solubilidade total (St) do fármaco na solução aquosa de ciclodextrina pode ser descrito da seguinte forma:

St = So+

K_a . S_o 1 + Ka . So

. [HPβCD]

O valor da solubilidade total da RVC foi 0,0011M na presença de HP, ou seja um pequeno aumento em comparação com a RVC livre. O resultado não esta de acordo com a literatura, entretanto, o valor Ka determinado é fortemente afetado pelo valor So, que geralmente é muito impreciso para compostos com So < 0.1 mol/L. A eficiência de complexação da RVC em HP-β-CD em solução aquosa,

34

calculada através da equação 01 foi de 0,064 o qual esta de acordo com os trabalhos de Araujo et al. (2008).

De acordo com a equação 03, foi possível determinar a razão RVC: HP-β-CD (1:16), indicando que na complexação 1:1 RVC: HP-β-CD, apenas uma de cada 16 moléculas de HP-β-CD está formando um complexo de inclusão com RVC.

6.2 Determinação da Eficiência de Complexação para o Sistema Ternário (RVC: HP-β-CD: LF)

Os complexos ternários foram preparados utilizando o composto binário de maior eficiência de complexação (método de fase aquosa). Três amostras de complexos binários foram preparadas conforme o item 5.2.1.2 e analisados em triplicata, onde suas absorbâncias foram determinadas a 263 nm, para determinar a concentração de RVC foi utilizada a equação 06, os dados foram estabelecidos conforme tabela 4:

Tabela 4: Valores de absorbância e da concentração de RVC em solução binária.

MÉTODOS Absorbância em 263nm Média (Abs) [ ]0 RVC (M) Abs I Abs II Abs III

Fase-Aquosa I 1,72176 1,71312 1,71312 1,71600 0,00395 Fase-Aquosa II 1,72091 1,70917 1,71647 1,71550 0,00395 Fase-Aquosa III 1,60528 1,60470 1,60732 1,60576 0,00368 Fonte: Autoria própria (2018).

Os complexos binários foram então utilizados nos métodos de preparação de complexos ternários. Para o método de injeção foi utilizado complexo em fase aquosa I, para o método de desidratação-reidratação foi utilizado o complexo em aquosa II e para o método do filme lipídico foi utilizado o complexo em fase-aquosa III. Posteriormente foi seguido o procedimento do item 5.2.2.4, onde as análises de UV-vis forneceram as seguintes absorbâncias a 263 nm, a concentração de RVC livre ([ ]1 RVC) diluída em 3mL de tampão também pode ser determinada

Tabela 5: Valores de absorbância da RVC diluida em 3 ml de solução tampão fosfato e suas concentrações finais.

MÉTODOS Absorbância em 263nm Média (Abs)

[ ]1 RVC (M) Abs I Abs II Abs III

Injeção 0,012513 0,074705 0,132673 0,073297 0,000153

Desidratação-reidratação 0,018015 0,088838 0,120319 0,075724 0,000146 Filme-Lipídico 0,026221 0,026641 0,035257 0,029373 0,000262 Fonte: Autoria própria (2018).

Para determinar a eficiência de complexação para cada método de sistemas ternários foi utilizado à equação 05, os seguintes dados foram obtidos:

Tabela 6: Valores para a concentração de RVC encapsulado em lipossimas furtivos, e suas eficiências de complexação.

Fonte: Autoria própria (2018).

Através dos resultados obtidos para os três métodos de sistemas ternários, pode-se observar que o método de desidratação-reidratação obteve maior eficiência de complexação.

7 CONCLUSÃO

As análises obtidas pelo UV-vis possibilitaram a determinação de parâmetros importantes (eficiência de complexação e constante de associação) para sistema um bom sistema de liberação controlada de fármacos, mediantes os estudos apresentados podem destacar que para um sistema binário a melhor eficiência de

Método [ ]0 RVC (M) [ ]1 RVC (M) [ ] RVC Encapsulado (M) EC % Injeção 0,00395 0,000153 0,0015 38% Desidratação-reidratação 0,00395 0,000146 0,0016 41% Filme Lipídico 0,00368 0,000262 0,0006 15%

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complexação foi para a metodologia utilizada na preparação em fase-aquosa, onde apresentou uma EC igual a 0,064, e seu valor de Ka foi de 75,9 M-1_{. Para os} sistemas ternários a maior eficiência de complexação foi para o método de desidratação-reidratação onde apresentou um EC igual a 41%.

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