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Avaliação do efeito anticonvulsivante do geraniol e do complexo de inclusão geraniol:β-ciclodextrina em camundongos

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Academic year: 2021

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. LÍVIA CRISTINA RODRIGUES FERREIRA LINS. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTICONVULSIVANTE DO GERANIOL E DO COMPLEXO DE INCLUSÃO GERANIOL:βCICLODEXTRINA EM CAMUNDONGOS. ARACAJU-SE 2013.

(2) LÍVIA CRISTINA RODRIGUES FERREIRA LINS. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTICONVULSIVANTE DO GERANIOL E DO. COMPLEXO DE INCLUSÃO GERANIOL:β-CICLODEXTRINA EM CAMUNDONGOS. 2013.

(3) LÍVIA CRISTINA RODRIGUES FERREIRA LINS. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTICONVULSIVANTE DO GERANIOL E DO COMPLEXO DE INCLUSÃO GERANIOL:βCICLODEXTRINA EM CAMUNDONGOS. Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Murilo Marchioro. ARACAJU-SE 2013.

(4) FICHA CATALOGRÁFICA DA BIBLIOTECA.

(5) LÍVIA CRISTINA RODRIGUES FERREIRA LINS. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTICONVULSIVANTE DO GERANIOL E DO COMPLEXO DE INCLUSÃO GERANIOL:βCICLODEXTRINA EM CAMUNDONGOS Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.. Aprovada em: _____/_____/_____ BANCA EXAMINADORA ________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Murilo Marchioro ________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Júnior(UFS) ________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dra. Carlúcia Ithamar (UEPB) PARECER -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

(6) DEDICATÓRIA. Dedico este trabalho a minha avó materna, Elvira (Vovó Eva), exemplo de dignidade e amor ( in memoriam). Aos meus pais, Luiza e Cícero, razão de minha existência. Em especial, a minha mãe, exemplo de mulher e pessoa, minha amiga e companheira em todo o tempo, meu estímulo de vida..

(7) AGRADECIMENTOS. Agradeço primeiramente a Deus, por me guiar nesta jornada, por me dar forças para que eu pudesse enfrentar todos os desafios e sabedoria para buscar soluções. Por todas as oportunidades que concedeu ao longo da minha vida. Ao meu orientador, Prof. Dr. Murilo Marchioro, por ter me concedido esta oportunidade. Obrigada pela confiança, paciência, dedicação e ensinamentos. Obrigada por permitir concluir esta etapa da minha vida e por continuar me guiando na busca de mais um sonho. A Profa Dra Flávia Teixeira, pelos ensinamentos e atenção que sempre me proporcionou nos momentos que a solicitei. Ao Prof. Dr. Waldecy de Lucca Jr, que me recebeu em seu laboratório com muita atenção e passou um pouco do seu conhecimento, sempre com muita paciência e dedicação. Obrigada pela ajuda. A Profª. Drª. Doralúcia Araújo e a Profª. Drª Carlúcia Ithamar do Departamento de Fisioterapia da UEPB, pelas oportunidades e ensinamentos passados durante a graduação e por me incentivarem a buscar a realização deste sonho. A Profª. Cleópatra Campos, pela amizade e carinho que sempre compartilhou comigo, pela ajuda e apoio em um dos momentos mais decisivos para minha vida. Aos meus pais, Luiza e Cícero, meu estímulo para lutar e vencer na vida. Obrigada por sempre estarem ao meu lado em todos os momentos da minha vida. Ao meu namorado, Tiago Tenório, pelo amor e amizade, por todas as palavras de incentivo e apoio, pelo companheirismo durante esta jornada, que apesar da distância física, esteve sempre comigo em sentimento durante estes anos. A minha madrinha Sebastiana, por ter sempre acreditado em mim e me incentivado nos momentos mais difíceis. A Maria das Neves, pela amizade e ensinamentos de vida, pelas palavras de apoio nos momentos de angústia. A Renan, Camila e Rosana, pela amizade, apoio e sentimentos compartilhados nesta etapa de nossas vidas. Aos colegas do Laboratório de Neurofisiologia: Márcia, Matheus, Monique, Ithamar, Ariel, Izabela e Hugo, pela amizade e ajuda prestadas no decorrer do mestrado..

(8) Ao Sr. Oswaldo pelos cuidados com os animais. A Capes, pelo incentivo científico e concessão da bolsa de estudos. Enfim, a todos que me ajudaram de forma direta ou indireta a concluir este trabalho, meu sincero OBRIGADA!.

(9) “Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.” Charles Chaplin.

(10) RESUMO. LINS, L.C.R.F.Avaliação do efeito anticonvulsivante do geraniol e do complexo de inclusão geraniol: -ciclodextrina em camundongos. Dissertação de Mestrado, Núcleo de Pós Graduação em Medicina, Mestrado em Ciências da Saúde- MPGME/UFS, 53 p, 2012. O Geraniol (GR) é um álcool monoterpeno acíclico encontrado em óleos essenciais de várias plantas aromáticas utilizadas pela medicina popular brasileira para o tratamento da epilepsia. Contudo não há estudos na literatura abordando os efeitos do GR sobre o Sistema Nervoso Central(SNC), especialmente seu potencial efeito anticonvulsivante. Este estudo buscou investigar o efeito anticonvulsivante do GR e do complexo de inclusão GR: -ciclodextrina (GR: -CD) em modelos animais de convulsão induzidos por pentilenotetrazol(PTZ) ou estricnina(EST). Inicialmente, camundongos Swiss machos foram pré-tratados, agudamente, com GR ou GR: -CD nas doses de 50, 100 e 200mg/kg, i.p., 30 minutos antes da aministração do PTZ. A latência para a primeira convulsão e a frequência de convulsões e morte foram observados durante 15 minutos após o estímulo convulsivante. Os resultados mostraram que o pré-tratamento com GR na dose de β00mg/kg e com GR: -ciclodextrina nas doses de 100 e 200mg/kg aumentaram significativamente a latência para a primeira convulsão e reduziram a porcentagem dos animais que convulsionaram. Os procedimentos foram repetidos no modelo de convulsão induzido por EST, porém apenas os efeitos do prétratamento com GR foram avaliados e não foram observados efeitos significativos do GR neste modelo. Os resultados demonstram que o GR possui um efeito anticonvulsivante, possivelmente mediado por mecanismos gabaérgicos, e que a encapsulação do GR em -CD potencializou este efeito, provavelmente pelo aumento da biodisponibilidade do GR.. Descritores: ciclodextrina; efeito anticonvulsivante; epilepsia; geraniol; monoterpeno..

(11) ABSTRACT. LINS, L.C.R.F. Evaluation of anticonvulsant effect of geraniol and inclusion complex geraniol: -cyclodextrin in mice. Dissertação de Mestrado, Núcleo de Pós Graduação em Medicina, Mestrado em Ciências da Saúde- MPGME/UFS, 53 p , 2012. Geraniol (GR) is an acyclic monoterpene alcohol component of essential oils of several aromatic plants used by Brazilian folk medicine for the treatment of epilepsy. However, there are no studies in literature that report effects of GR on Central Nervous System, specifically its potential anticonvulsant effect. The aim of this study was to investigate the anticonvulsant effect of GR and of inclusion complex GR: -cyclodextrin (GR: -CD) in animal models of epilepsy induced by Pentilenotetrazole (PTZ) or Strychnine (STR). Initially, mice Swiss male were pretreated, acutely, with GR or GR: -CD at doses of 50, 100 or 200mg/kg, i. p., 30 minutes before of PTZ administration. The latency of first convulsion and the frequency of convulsion and death were observed for a period of 15 minutes after the administration of convulsant stimuli. The results showed that pre-treatment with GR at dose of 200mg/kg and with GR: -CD at doses of 100 and 200mg/kg significantly increased the latency of first convulsion and reduced the frequency of animals that convulsed. The procedures were repeated in STR-induced convulsion model, however only the effects of pretreatment with GR were evaluated and no significant effect of GR were observed in this model. The results indicate that GR has an anticonvulsant effect, possibly mediated by GABAergic mechanisms, and the encapsulation of GR in -CD improved this effect, probably by increase of bioavailability of GR. Key-words: anticonvulsant effect; cyclodextrin; epilepsy; geraniol; monoterpene..

(12) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. CDs- ciclodextrinas DAEs- drogas antiepilépticas DMAPP- dimetilalil difosfato DZP- diazepam DXP- via da deoxyxylulose phosphat EST- estricnina Fig. - figura GABA- ácido gama-amino-butírico GPP- pirofosfato de geranil GR- Geraniol ILAE- International League against Epilepsy i.p. – via intraperitoneal IPP- isopentenil difosfato OE- Óleo essencial OECw- Óleo essencial de Cymbopogon winterianus OEOb- Óleo essencial de Ocimum basilicum OEs- Óleos Essenciais PIC- picrotoxina PTZ- pentilenotetrazol rpm- rotações por minuto SNC- Sistema Nervoso Central VAM- via do ácido mevalônico WHO- World Health Organization.

(13) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Unidade de isopreno ........................................................................................... 22 Figura 2. Formação de monoterpenos a partir do GPP ...................................................... 23 Figura 3. Estrutura química do geraniol ............................................................................. 24 Figura 4. Estrutura tronco-cônica das ciclodextrinas ......................................................... 27 Figura 5. Associação entre CD e a molécula hóspede ....................................................... 27 para formar o complexo de inclusão Figura 6. Estrutura química da α,. e -CDs ..................................................................... 29. Figura 7. Camundongo Swiss albino .................................................................................. 32 Figura 8. Administração de drogas via intraperitoneal ...................................................... 34 Figura 9. Efeitos do GR sobre a latência para as convulsões .............................................. 38 induzidas por PTZ Figura 10. Efeitos do complexo de inclusão GR: -CD ..................................................... 39 sobre a latência para as convulsões induzidas por PTZ Figura 11. Efeitos do GR sobre a latência das .................................................................... 40 convulsões induzidas por EST.

(14) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Principais modelos animais de epilepsia ..................................................................... 21 Tabela 2. Efeitos do GR sobre a incidência de convulsões ......................................................... 37 induzidas por PTZ Tabela 3. Efeitos do complexo de inclusão GR: -CD ................................................................. 38 sobre a incidência de convulsões induzidas por PTZ Tabela 4. Efeitos do GR sobre a incidência de ............................................................................ 40 convulsões induzidas por EST.

(15) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 13 2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 15 2.1. Considerações gerais sobre a Epilepsia ....................................................................... 15 2.1.1 Modelos animais de Epilepsia ................................................................................... 19 2.2 Óleos essenciais com atividade anticonvulsivante ....................................................... 21 2.3 Monoterpenos com atividade anticonvulsivante ........................................................... 23 2.3.1 Geraniol ...................................................................................................................... 24 2.4 Ciclodextrinas ................................................................................................................ 26 β.4.1 -Ciclodextrina ........................................................................................................... 29 3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 31 4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 32 5 RESULTADOS ............................................................................................................... 37 6 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 41 7 CONCLUSÃO ................................................................................................................ 44 8 PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 45 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 46 ANEXO A- Declaração do CEPA .................................................................................... 53 ANEXO B- Comprovante de submissão .......................................................................... 54 do artigo científico.

(16) 13. 1 INTRODUÇÃO. A epilepsia é um distúrbio neurológico grave, considerado uma das condições patológicas mais sérias e prevalentes do mundo. Acomete 1% da população mundial, o que equivale a aproximadamente 50 milhões de pessoas, entre homens e mulheres do todas as faixas etárias e grupos étnicos (WHO, 2005). No Brasil, estima-se que cerca de 1 milhão de pessoas são afetadas por epilepsia, das quais 380 mil não tem tratamento adequado (NORONHA et al, 2007). A epilepsia é definida como uma tendência para a ocorrência de crises epilépticas espontâneas e recorrentes, resultantes de uma atividade elétrica neuronal excessiva e anormal. As crises epilépticas podem ser caracterizados por alterações dos níveis de consciência, distúrbios autonômicos, movimentos involuntários anormais, alterações cognitivas e distúrbios do comportamento (FISHER, 2005). Estes sintomas, muitas vezes, provocam impactos negativos na vida dos indivíduos acometidos por epilepsia, provocando uma diminuição da sua qualidade de vida e exclusão social. Estudos demonstram que o risco de desenvolvimento e a prevalência de muitas doenças psiquiátricas e somáticas são maiores em indivíduos com epilepsia. Estima-se que a mortalidade global destes indivíduos é duas ou três vezes superior à da população geral (FERREIRA; TABOSA e SILVA, 2009; GAITATZIS et al, 2004). Atualmente, os mecanismos envolvidos na fisiopatologia das crises epilépticas ainda não estão claros e a epilepsia permanece sem cura. Por isso, as estratégias farmacológicas convencionais são direcionadas para reduzir a frequência ou inibir a propagação das crises epilépticas. As drogas antiepliepticas (DAEs) atuais apresentam limitada eficácia e frequentemente causam efeitos adversos, o que compromete a adesão dos pacientes ao tratamento. Aproximadamente 30% dos pacientes epilépticos não conseguem controlar suas crises com as drogas clinicamente disponíveis (LOSCHER, 2002; WAHAB, 2010). Por se tratar de uma doença crônica de alta prevalência e incidência, o tratamento da epilpsia resulta em altos custos econômicos, diretos e indiretos, fato que se torna preocupante em países em desenvolvimento, onde os recursos para a saúde são limitados (BEGLEY; BEGHI, 2002). Nos últimos anos, o maior objetivo das pesquisas relacionadas à epilepsia tem sido desenvolver novas DAEs com maior eficácia e menor toxicidade que as drogas atualmente disponíveis, e que tenham menor custo econômico. Sendo assim, tem-se observado um grande.

(17) 14. interesse dos pesquisadores nos aspectos químicos e farmacológicos de compostos extraídos de plantas medicinais, especialmente das plantas aromáticas, as quais apresentam várias atividades farmacológicas sobre o Sistema Nervoso Central (SNC). Estas atividades são atribuídas, geralmente, aos Óleos Essenciais (OEs) e/ou seus constituintes químicos, principalmente aos monoterpenos que. representam os compostos predominantes na. constituição destes óleos (ALMEIDA et al., 2011). Os monoterpenos são compostos encontrados em diversas espécies de plantas aromáticas utilizadas pela medicina popular para o tratamento de muitas patologias que acometem o SNC, tais como ansiedade, depressão e epilepsia. Estudos pré-clínicos têm demonstrado a atividade anticonvulsivante de vários monoterpenos (PASSOS et al, 2009). O Geraniol é um álcool monoterpeno presente na composição de OEs de várias plantas aromáticas utilizadas pela medicina popular brasileira para o tratamento da epilepsia. No entanto, até o momento, não há estudos na literatura descrevendo os efeitos do GR sobre o SNC, especialmente demonstrando sua possível ação anticonvulsivante. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar o possível efeito anticonvulsivante do Geraniol em modelos animais de convulsão e avaliar se a sua encapsulação em -ciclodextrina alterava este efeito, baseando-se no fato que o geraniol é uma molécula pouco solúvel em água e as ciclodextrinas são utilizadas para aumentar a solubilidade de moléculas hidrofóbicas. Estudos comportamentais e farmacológicos deste tipo permitirão identificar uma ação central do GR e fornecerão informações que podem contribuir para o desenvolvimento de uma nova droga capaz de reduzir ou inibir os principais sintomas da epilepsia..

(18) 15. 2 REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 Considerações gerais sobre a Epilepsia O termo epilepsia deriva do grego epilambaneim, que significa ser tomado, ser possuído. Os relatos mais antigos de epilepsia são observadas em um texto médico conhecido como Sakikku (Todas as doenças), encontrado na Babilônia e escrito há mais de 3.000 anos. Os babilônicos acreditavam que as crises epilépticas eram provocadas pela invasão do corpo por demônios, sendo a epilepsia associada a uma doença espiritual (KINNIER WILSON; REYNOLD, 1990). Relatos sobre crises epilépticas são observados no Papiro de Smith, documento escrito por volta de 1.700 a.C no Egito Antigo. Manuscritos mais recentes, como os textos bíblicos também citam a ocorrência de manifestações semelhantes a crises convulsivas, geralmente associadas à possessão demoníaca (GOLDENBERG, 2010; SILVA; CAVALHEIRO, 2004). Atualmente, ainda existem crenças e mitos na sociedade de que a epilepsia é derivada de uma possessão demoníaca e este pensamento tem contribuido para o aumento do estigmatização dos pacientes epilépticos, excluindo estes indivíduos e seus familiares da sociedade (MIN; SANDER, 2003). O conceito de epilepsia como uma desordem neurológica foi definido por Hipócrates por volta de 400 anos a.C., o qual afirmou que a epilepsia não tinha origem sobrenatural, mas era um distúrbio do cérebro, com possível origem hereditária (MOREIRA, 2004). Segundo a International League against Epilepsy (ILAE), a epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por uma predisposição do cérebro a gerar crises epilépticas e pelas conseqüências neurobiológicas, cognitivas, psicossociais e sociais da condição. Não é uma doença única mas uma variedade de desordens decorrentes de uma disfunção da atividade elétrica do cérebro que podem resultar de diferentes causas (FISHER, 2005). A epilepsia afeta aproximadamente 50 milhões de pessoas em todo o mundo, o equivalente a 1% da população mundial. Sua prevalência na populaçaõ em geral é estimada entre 5 e 10 casos por 1.000 pessoas. Aproximadamente 80% dos indivíduos acometidos por esta patologia estão nos países em desenvolvimento, onde em algumas áreas 80 a 90% dos individuos não recebem nenhum tipo de tratamento (BELL; SANDER, 2001; WHO, 2005)..

(19) 16. A incidência global da epilepsia é de aproximadamente 50 casos por 100.000 pessoas por ano nos países desenvolvidos, enquanto que nos países em desenvolvimento varia de 100 a 190 casos por 100.000 pessoas por ano. A incidência é maior em pessoas com menos de 2 anos de idade e naquelas com mais de 65 anos (BELL; SANDER, 2001; GOLDENBERG, 2010). Nas últimas décadas, tem-se observado nos países industrializados uma diminuição da incidência de epilepsia nas crianças e um aumento simultâneo nos idosos. As causas para estas mudanças ainda não são totalmente esclarecidas. No entanto, a redução da incidência nas crianças pode ser explicada pela adoção de estilos de vida mais saudáveis pelas gestantes, melhora dos serviços pré-natais e dos programas de imunização o que leva a uma redução dos fatores de risco associados a lesões SNC. Nos idosos, o aumento da incidência pode estar relacionado ao aumento da sobrevivência após doenças cerebrovasculares, consideradas o fator de risco mais comum para epilepsia em pessoas com mais de 60 anos de idade (SANDER, 2003) No Brasil, poucos estudos epidemiológicos sobre a epilepsia foram desenvolvidos. É definido como epilepsia ativa, a ocorrência de pelo menos uma crise epiléptica durante os dois anos anteriores à pesquisa, e epilepsia inativa quando o indivíduo permance livre de crises durante este período. Em 1986, Marino e colaboradores realizaram um estudo na cidade de São Paulo, onde verificaram uma taxa de prevalência de epilepsia de 11,9/1000, não tendo sido diferenciados as formas de epilepsia ativa e inativa. Fernandes e colaboradores (1992) encontraram uma prevalência de 16,5/1000 para epilepsia ativa e 20,3/1000 para epilepsia inativa em Porto Alegre. No estudo realizado por Borges e seus colaboradores (2004) na cidade de São José do Rio Preto, a prevalência de epilepsia foi de 18,6/1000, sendo de 8,2/1000 para a epilepsia ativa. A prevalência de epilepsia observada no Brasil é semelhante com a de outros países da América Latina, tais como a Bolívia que apresentou uma prevalência estimada em 12,3/1000 (NICOLETTI et al, 2005) e o Equador com prevalência entre 12,2 e 19,5/1000 (PLACENCIA et al, 1992). De acordo com o Ministério da Saúde, a epilepsia está entre as principais causas de hospitalização no Brasil, e foi responsável por mais de 40 mil hospitalizações por ano no início da década de 90. Doenças parasitárias como a neurocisticercose, lesões cerebrais perinatais e tramautismo craniano estão entre os principais fatores de risco que levam a epilepsia (LI et al, 2007)..

(20) 17. A disfunção neurológica aguda da epilepsia é denominada de crise epiléptica, a qual é resultante de uma atividade elétrica anormal excessiva e hiperssincrônica de neurônios no cérebro que está associada a um desequilíbrio entre eventos excitatórios e inibitórios, movido em direção à excitação. A crise epiléptica pode manifestar-se através de alterações sensoriais, motoras, vegetativas, emocionais ou cognitivas, o que vai depender da área cerebral envolvida (COMISSION, 1989; FISHER, 2005; GOLDENBERG, 2010). No entanto, o evento mais dramático de alguns tipos de epilepsia é a convulsão, que consiste em um episódio de contração muscular anormal e excessiva, usualmente bilateral, que pode. ser mantida ou interrompida, e está associado à atividade hiperssincrônica e. repetitiva de um grupo de neurônios localizados no cérebro (BLUME et al, 2001). Em 1981, a ILAE propôs uma classificação para as epilepsias baseada nas características clínicas e eletroencefalográficas (EEG) de suas crises epilépticas. Esta classificação dividiu as crises em três grupos: parcial (focal), generalizada e não classificável (COMISSION, 1981). As crises parciais tem início em apenas um hemisfério cerebral, e são divididas em parcial simples ( sem alteração da consciência ou memória), parcial complexa (com alteração da consciência e memória) e generalizada secundária (iniciam como crise parcial e evolui para crise generalizada) (FISHER, 2010). As crises epilépticas generalizadas atingem os dois hemisférios cerebrais simultaneamente e são divididas em crises de ausência (Petit Mal), tônica, clônica, mioclonica, atonica e tonico-clônica(Grand Mal) (COMISSION, 1981). Crises de ausência consistem em breves episódios de comprometimento da consciência, que duram cerca de 10 a 30 segundos, acompanhados por alterações motoras discretas como tremores palpebrais. Crises tônicas caracterizam-se por uma contração muscular mantida por alguns segundos que pode estar ou não acompanhada por perda da consciência. Crises clonicas são caracterizadas pela ocorrência de contração muscular seguida de relaxamento, originando abalos musculares sucessivos. As crises mioclônicas consistem em contrações muculares súbitas muitos breves que se assemelham a choques. As crises atonicas são caracterizadas por perda ou redução súbita do tônus mucular postural. E as crises tonico-clônica iniciam com perda súbita de consciência e atividade tônica seguido de atividade clônica dos membros (FISHER, 2010; YACUBIAN, 2002). Uma crise epiléptica pertence ao grupo das crises não classificáveis quando uma descrição adequada não é disponível (COMISSION, 1981)..

(21) 18. As crises epilépticas parciais representam aproximadamente 60% de todas as epilepsias, as crises parciais complexas representam 40% e as parciais simples os 20% restantes. A epilepsia do lobo temporal é o tipo de mais comum de epilepsia focal que atinge os adultos, sendo responsável por 40% de todos os tipos de epilepsia nesta população, podendo se manisfestar como parcial complexa ou parcial simples. As crises generalizadas representam aproximadamente 40% de todas as epilepsias, 20% são crises tonico-clônicas, 10% crises de ausência e os outros tipos correspondem aos 10% restantes (FISHER, 2010; LOSCHER, 1998; TEIXEIRA; SALGADO, 2004). As epilepsias podem ser classificadas em três categorias de acordo com sua etiologia: sintomática, idiopática e criptogênica. A epilepsia é do tipo sintomática quando resulta de uma lesão cerebral identificada; idiopática quando a causa não é conhecida, geralmente associada a fatores genéticos; e criptogência quando suspeita-se da causa mas esta não é identificada através dos exames clínico e complementares disponíveis (COMISSION, 1989). A identificação do tipo específico da crise epiléptica é muito importante, porque os mecanismos envolvidos na sua gênese variam entre os diferentes tipos de crise, e esta classificação permite focar a abordagem de diagnóstico em uma fator etiológico particular. Desta forma, uma classificação correta do tipo de crise permite a seleção da terapia medicamentosa adequada, além de fornecer informações essenciais para o prognóstico do paciente (GOLDENBERG,2010; PERUCCA, 2005). Apesar dos avanços na pesquisa sobre os aspectos da etiologia e fisiopatologia da epilepsia, ainda não se conhece os mecanismos específicos que produzem as crises epilépticas. Na ausência do conhecimento destes mecanismos, o tratamento farmacológico para a epilepsia está voltado para o controle dos sintomas, ou seja, a prevenção ou supressão das crises epilépticas (LOSCHER, 2002). A administração crônica de drogas antiepilépticas ou anticonvulsivantes (DAEs) ainda é o tratamento de escolha para a epilepsia. Atualmente, existem vários tipos DAEs, incluindo as drogas de primeira geração (fenitoína, carbamazepina, fenobarbital , ácido valpróico e diazepam) e as de segunda geração (lamotrigina, vigabatrina, gabapentina, topiramato e levetiracetam). As DAEs de primeira geração produzem mais efeitos adversos quando comparadas as drogas de segunda geração, no entanto, estas últimas são mais caras que as primeiras, o que limita o seu uso pela população com baixo poder econômico (GOLDENBERG, 2010; WAHAB, 2010). Os principais objetivos da terapia com DAEs são: eliminar ou reduzir ao máximo as crises epilépticas, evitar os efeitos adversos associados ao tratamento a longo-prazo, ajudar os.

(22) 19. pacientes a manter ou restabelecer suas atividades psicossociais e vocacionais, e proporcionar-lhes um estilo de vida normal (GOLDEMBERG, 2010). Embora os mecanismos de ação das diversas DAEs não estejam totalmente elucidados, a maioria das drogas clinicamente eficazes atuam através dos seguintes mecanismos: bloqueio dos canais de sódio dependentes de voltagem, aumento da neurotransmissão inibitória mediada pelo GABA ou redução da neurotransmissão excitatória mediada pelo glutamato (PERUCCA, 2005). Infelizmente, as DAEs atualmente disponíveis apresentam eficácia limitada e o seu uso acarreta um risco aproximado de 30% para o desenvolvimento de efeitos adversos após o início do tratamento. Frequentemente produzem efeitos adversos tais como sedação, fadiga, ataxia, problemas cognitivos, hepatoxicidade, teratogênese, pancreatite e distúrbios psiquiátricos, os quais são uma barreira para o tratamento da epilepsia, pois consistem em um dos principais motivos que levam os pacientes a abandonarem a terapia medicamentosa (GOLDEMBERG, 2010; WAHAB, 2010). Além dos efeitos adversos, muitas pessoas acometidas por epilepsia enfrentam também o fenômeno da farmacorresistência e são refratários as DAEs. Pelo menos 30% dos pacientes não tem controle de suas crises apesar de uma terapia medicamentosa adequada. A probabilidade de recorrência das crises epilépticas pode variar entre os pacientes e depende do tipo de crise e da existência de outras patologias associadas (LOSCHER; SCHIMIDT, 2002; WAHAB, 2010). Desta forma, estudos tem sido conduzidos com o objetivo de desenvolver novas drogas com alta eficácia anticonvulsivante, menor toxicidade e melhor segurança, capazes de proporcionar uma melhor qualidade de vida as pessoas acometidas por epilepsia (LOSCHER, 2002). Nos últimos anos, tem se observado um aumento do número de estudos que utilizam modelos animais de convulsão na busca de novos compostos com potencial efeito anticonvulsivante.. 2.1.1 Modelos animais de Epilepsia e Convulsão A avaliação do potencial anticonvulsivante de um composto não pode ser realizado diretamente na clínica. A descoberta e o desenvolvimento de novas drogas dependem muito dos estudos pré-clínicos que utilizam modelos animais para avaliar a eficácia e a segurança das drogas antes de testá-la em humanos (FISHER, 1989; LOSCHER, 2011)..

(23) 20. A maioria dos modelos animais utilizados na investigação da epilepsia são modelos de convulsão em vez de modelos de epilepsia. Isto pode ser explicado pelo fato que a epilepsia é caracterizada por crises epilépticas espontâneas e recorrentes, e alguns testes induzem apenas uma crise convulsiva aguda após a aplicação de um estímulo químico ou elétrico em animais normais não-epilépticos, portanto não podem representar um modelo de epilepsia. Por outro lado, existem modelos verdadeiros de epilepsia, os quais utilizam animais geneticamente modificados com crises epilépticas espontaneas e recorrentes, que reproduzem alterações mais estreitamente relacionadas a epilepsia humana do que os modelos que induzem apenas uma crise aguda. Estes modelos experimentais podem resultar em crises convulsivas agudas ou crises convulsivas recorrentes, sendo classificados em modelos agudos e crônicos, respectivamente (LOSCHER, 2011). O melhor modelo experimental é aquele capaz de reproduzir com fidelidade o fenêomeno a ser estudado. Um modelo animal é considerado ideal para se estudar a epilepsia quando o mesmo representa características fenomenológicas e patofisiológicas semelhantes a epilepsia humana, isto é, demonstrar presença de atividade epileptiforme nos registros eletroencefalográficos e reproduzir clinicamente uma atividade semelhante àquelas observadas durante uma crise epiléptica humana (MELLO et al, 1986). Os modelos animais de epilepsia e de convulsão tem contribuido bastante para o conhecimento dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da epilepsia bem como para o desenvolvimento de novas DAEs. Com exceção dos brometos e do fenobarbital, os efeitos anticonvulsivantes de todas as DAEs de primeira e segunda geração foram determinados inicialmente em modelos animais. Atualmente, estes modelos ainda são o pré-requisito mais importante para a pesquisa pré-clínica e o desenvolvimento de novas DAEs (LOSCHER, 2002). A descoberta de novas DAEs exige uma triagem de um grande número de compostos, desta forma, os modelos animais devem ser de fácil execução, com tempo e custos mínimos, e devem apresentar uma previsão da atividade clínica (LOSCHER, 2011). Conhecendo a heterogeineidade da epilepsia humana, a complexidade dos fenótipos das crises epilépticas e dos mecanismos envolvidos, supõe-se que apenas um modelo é insuficiente para a investigação do potencial terapêutico de uma DAE. Desta forma, podemos supor a explicação para a variedade de modelos experimentais utilizados para estudar tal fenômeno (SMITH et al, 2007). Diante de tal variedade, a escolha do modelo a ser utilizado depende dos objetivos da pesquisa. Na tabela 1, estão descritos alguns dos modelos experimentais e suas relações com os tipos de epilepsia humana..

(24) 21. Tabela 1. Principais modelos animais de epilepsia. MODELO EXPERIMENTAL. TIPO DE EPILEPSIA. SITUAÇÃO. Estricnina (1900). Crises com foco cortical. Agudo. Pentilenotetrazol (1960). Pequeno mal e crises generalizadas. Agudo. Picrotoxina (1960). Epilepsias do lobo temporal. Agudo e crônico. Bicuculina (1970). Epilepsia de longa duração. Agudo e crônico. Pilocarpina (1983). Epilepsia do lobo temporal. Agudo e Crônico. Eletrochoque (1870). Epilepsia focal. Agudo. Abrasamento (1969). Crises parciais e generalizadas, pequeno mal e auras. Agudo e crônico. Crise audiogênica em camundongo (1924). Crises tônico-clônicas. Agudo. Fotossensibilidade genética (1966). Crises centro-encefálicas. Agudo. Estimulação química. Estimulação elétrica. Modelos genéticos. Entre parênteses, o ano em que o modelo foi desenvolvido. Fonte: Adaptado de Queiroz et al (2002) e Turski et al (1983).. 2.2 Óleos essenciais com atividade anticonvulsivante O desenvolvimento de novas drogas é caro e arriscado, por isso, pesquisadores e a indústria farmacêutica tem buscado na natureza compostos com potencial terapêutico. O Brasil é um país com uma imensa biodiversidade e com uma localização geográfica privilegiada, e constitui um importante celeiro para a busca de novas substâncias de interesse biológico (PINTO et al, 2002). Diversas plantas são reconhecidas por atuarem sobre o SNC e tem sido utilizadas pelos humanos desde os tempo primitivos para o tratamento e cura de doenças que acometem o SNC. A história das plantas medicinais utilizadas para tratar as convulsões é coincidente com a história da medicina bem como com a própria história da civilização. As plantas com atividade anticonvulsivante são aquelas capazes de controlar as convulsões decorrentes de várias condições, inclusive da epilepsia ( CARLINI, 2003; CHAUHAN et al, 1988)..

(25) 22. O grupo das plantas aromáticas destaca-se entre as plantas medicinais e são amplamente estudadas devido a seu grande potencial terapêutico, inclusive pelo seu potencial anticonvulsivante. O uso farmacológico destas plantas são atribuídos principalmente a presença de OEs, os quais consistem em uma mistura complexa de compostos naturais voláteis, formados pelo metabolismo secundário de plantas aromáticas, que podem ser extraídos de várias partes da planta. São caracterizados por um forte odor e conhecidos por suas propriedades terapêuticas (ALMEIDA et al 2003, 2011; BAKKALI et al 2008). Algumas plantas aromáticas tem sido utilizadas pela medicina popular para o tratamento da epilepsia e isto tem conduzido o desenvolvimento de vários estudos farmacológicos que buscam avaliar a propriedade anticonvulsivante dos seus OEs (ALMEIDA et al, 2011). Estudos pré-clínicos demonstraram que os OEs de Laurus nobilis (SAYYAH et al, 2002), Ocimum basilicum (OLIVEIRA et al, 2009), Myristica fragrans (WAHAB et al, 2009), Cymbopogon citratus (BLANCO et al, 2009; SILVA et al, 2010), Cymbopogon winterianus (QUINTANS-JÚNIOR et al, 2008; SILVA et al, 2010), Bunium. persicum. (MANDEGARY et al, 2012) exibiram atividade anticonvulsivante em diferentes modelos animais de epilepsia. O efeito anticonvulsivante dos OEs pode ser atribuído a variedade dos compostos químicos que os constituem, principalmente aos terpenos, seus constituintes majoritários (ALMEIDA et al, 2011). Os terpenos são substâncias derivadas de unidades de isopreno (C5), uma molécula de hidrocarboneto simples (Fig.1). O termo “terpeno” refere-se geralmente a uma substância composta apenas de hidrogênio e carbono, enquanto que o termo “terpenóide” refere-se ao terpeno que foi modificado, por exemplo, pela adição de oxigênio. Os terpenos são classificados de acordo com a quantidade de unidades de isopreno (C5)n que os compõe em: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20) e triterpernos (C30) ( ZWENGER; BASU, 2008).. Figura 1. Unidade de isopreno Fonte: Dewick, 2002.

(26) 23. Na medicina popular, plantas contendo derivados terpênicos têm sido usadas devido a suas propriedades sedativas, ansiolíticas e anticonvulsivantes. Os OEs extraídos destas plantas são constituídos basicamente de monoterpenos, o que nos sugere que seus efeitos farmacológicos podem ser atribuídos principalmente a esta classe de terpenos (SOUZA et al, 2006).. 2.3 Monoterpenos com atividade anticonvulsivante Monoterpenos (C10) são substâncias compostas por duas unidades de isopreno. A biossíntese dos monoterpenos deriva da combinação de dimetilalil difosfato (DMAPP) e isopentenil difosfato (IPP), via enzima prenil transferase, formando uma molécula de pirofosfato de geranil (GPP). A DMAPP e IPP são as unidades de isopreno bioquimicamente ativas e podem ser derivadas de duas vias, da via do ácido mevalônico - VAM ou da via deoxyxylulose phosphate – DXP (DEWICK, 2002). O GPP uma vez formado, pode sofrer. modificações em sua estrutura e originar vários monoterpenos com cadeia linear encontrados nos OEs (Fig.2) , sendo então considerado como precursor dos monoterpenos (DEWICK, 2002).. Geranial (óleo de limão). Citronelal (óleo de citronela). Citronelol (óleo de rosa). Geraniol (óleo de gerânio). Figura 2. Formação de monoterpenos a partir do GPP. Fonte: Dewick, 2002..

(27) 24. Os monoterpenos representam aproximadamente 90% das moléculas que constituem os OEs e possuem uma grande variedade estrutural, compreendendo compostos de diferentes funções como hidrocarbonetos, alcóois, aldeídos ou estérs (BAKKALI et al, 2008). Os monoterpenos apresentam várias atividades farmacológicas sobre o SNC, tais como ansiolítica, antinociceptiva, sedativa e anticonvulsivante (PASSOS et al, 2009). Nos últimos anos, estudos pré-clínicos, utilizando diferentes modelos animais de epilepsia, têm demonstrado a atividade anticonvulsivante de vários monoterpenos: o linalol (ELISABETSKY et al, 1995), citronelol (SOUSA et al, 2006), (+)-carvona (SOUSA et al, β007), α, -epoxy-carvona (ALMEIDA et al, 2008) , citronelal (MELO et al, 2011), carvacrol, borneol e citral (QUINTANS-JÚNIOR et al, 2010) . Estes resultados demonstram que os monoterpenos podem ser moléculas candidatas para serem utilizadas no desenvolvimento de novas DAEs.. 2.3.1 Geraniol O geraniol (GR) é um álcool monoterpeno acíclico (Fig.3), com fórmula molecular C10H18O, também conhecido como. 3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol. É derivado do GPP. (Fig.2), cuja biossíntese pode ser realizada através da VAM ou DXP (CHEN; VILJOEN, 2010).. Figura 3.Estrutura química do geraniol. Fonte: Dewick, 2002.. O GR é um monoterpeno constituinte dos OEs de várias plantas, dentre as quais podem ser citadas Cymbopogon winterianus (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008; SILVA et al., 2010), Cymbopogon martinii (SCHERER et al, 2009), Ocimum basilicum (OLIVEIRA et al, 2009) e Rosa damascena (RAKHSHANDAH; HOSSEINI, 2006)..

(28) 25. O GR aparece como um óleo amarelo pálido, insolúvel em água e solúvel na maior parte dos solventes orgânicos. Está presente nas flores de muitas espécies e em tecidos vegetativos de muitas ervas, frequentemente co-existindo com o geranial e o neral, que são produtos de sua oxidação (CHEN; VILJOEN, 2010). Apresenta um odor agradável de rosa, o que justifica seu amplo uso na preparação de perfumes, shampoos, sabonetes, bem como na preparação de produtos não-cosméticos como detergentes e produtos de limpeza (LAPCZYNSKI et al, 2008). Além de sua utilização na preparação de fragrâncias, estudos tem demonstrado que o GR exibe várias propriedades farmacológicas e bioquímicas. Pesquisas tem evidenciado que o GR é um eficaz repelente de insetos e um potente agente antimicrobiano, além de exercer atividades anti-oxidante, anti-inflamatória e atividade antitumoral em alguns modelos animais de cancer (pancreas, fígado, melanoma, cólon). Também é utilizado como potencializador natural para melhorar a penetração na pele do diclofenaco de sódio, 5-fluorouracil e da sulfadiazina (CHEN; VILJOEN, 2010). Efeitos cardiovasculares também são atribuídos ao GR. Um estudo de Menezes e colaboradores (2010) evidenciou um efeito cardiovascular do OE de Cymbopogon winterianus (OECw), cuja análise cromatográfica demonstrou a presença de 40,6% de GR.. Quando administrado por via intravenosa, o OECw induziu um efeito hipotensor associado a um efeito de vasorrelaxamento que não foi alterado pela administração de L-NAME e indometacina. Estes resultados estão de acordo com o estudo de Azarmi e colaboradores (2009), no qual foi investigado o efeito vascular do GR na artéria aorta isolada de ratos e observou-se um efeito relaxante que não foi alterado pela administração de L-NAME e indometacina, sugerindo uma atividade relaxante independente dos mediadores do endotélio. Até o momento, não há estudos na literatura relatando os efeitos do GR sobre o SNC, porém alguns trabalhos tem demonstrado que OEs que apresentam o GR como um dos seus principais constituintes exercem atividade sobre este sistema, incluindo a atividade anticonvulsivante. Um estudo realizado com o OE extraído das folhas do Ocimum basilicum(OEOb) identificou o GR (12,95%) como um dos principais constituintes do óleo. Os resultados demonstraram que administração i.p. aguda deste OE promoveu um aumento do tempo de sono induzido pelo tiopental sódico e da latência das convulsões induzidas por PTZ e PIC, mas não pela EST. Portanto, estes dados sugerem que o OECb, que contem GR, possui propriedade depressiva sobre o SNC e efeito anticonvulsivante em roedores (OLIVEIRA et al., 2009)..

(29) 26. Em 2008, Quintans-Júnior e colaboradores avaliaram o efeito do OE extraído das folhas Cymbopogon winterianus Jowitt (Poaceae)- OECw sobre o SNC e seu possível efeito anticonvulsivante. A análise fitoquímica do OECw demonstrou que o GR foi o constituinte majoritário, perfazendo uma porcentagem de 40,6% da composição do óleo. Os resultados comportamentais demonstraram que a administração i.p. aguda do OECw promoveu uma atividade depressiva sobre o SNC e foi capaz de aumentar a latência das convulsões induzidas pelo PTZ, PIC e EST, sugerindo uma atividade anticonvulsivante, a qual pode ser mediada por mais de um mecanismo de neurotransmissão, possivelmente mecanismos gabaergicos e glicinérgicos. Em um estudo realizado por Silva e colaboradores (2010), o GR também apareceu como um dos contituintes majoritários do OECw, representando 19,03% da composição do óleo. Os dados deste estudo evidenciaram que a administração i.p. deste OECw resultou em um efeito anticonvulsivante nos modelos de convulsão induzida por PTZ, EST e pilocarpina. Portanto, os resultados destes estudos justificam o uso de infusões de Cymbopogon winterianus pela medicina popular para o tratamento da epilepsia.. 2.4 Ciclodextrinas As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos, compostos por unidades de Dglicopiranose unidas através de ligações glicosídicas α -1,4, que são derivados da degradação do amido através da ação enzimática da ciclodextrina glicosil transferase (CGTase). Esta enzima pode ser produzida pelos microorganismos Bacillus macerans, Bacillus circulans e também pelo Klebsiella pneumoniae (SALTÃO; VEIGA, 2001). As CDs foram descritas primeiramente em 1891 por Villiers e caracterizadas como oligossacarídeos cíclicos por Schandinger em 1904. São moléculas cristalinas, homogêneas, não-higroscóspicas e se caracterizam por uma conformação espacial do tipo tronco-cônica (Fig.4). Os grupos hidroxílicos orientam-se para o exterior do cone conferindo-lhe um caráter externo hidrofílico, onde as hidroxilas secundárias estão posicionadas na extremidade mais larga e as hidroxilas primárias na extremidade mais estreita do cone. A cavidade central da CD apresenta um caráter hidrofóbico devido a presença de esqueletos de carbono e oxigênios etéreos (SALTÃO;VEIGA, 2001; SÁ BARRETO; CUNHA-FILHO, 2008)..

(30) 27. Figura 4: Estrutura tronco-cônica das ciclodextrinas. Fonte: Sá Barreto & Cunha-Filho, 2008. A conformação estrutural das CDs é responsável por sua solubilidade aquosa e pela capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas no interior de sua cavidade. A incorporação de moléculas hóspedes na cavidade da CD, formando um complexo de inclusão, tem sido a base para sua aplicação farmacêutica (DAVIS; BREWSTER, 2004). A CDs são capazes de formar complexo de inclusão com uma grande variedade de compostos, propriedade que depende de alguns fatores. O requisito mínimo é estérico, é necessário que o tamanho e morfologia da molécula hóspede seja compatível com a cavidade da CD, ainda que parcialmente, para que possa se adaptar no interior da cavidade (Fig.5). A polaridade, solubilidade aquosa e capacidade de ionização da molécula hóspede também interferem na formação do complexo (DELL VALLE, 2004; SÁ BARRETO; CUNHAFILHO, 2008).. CD. CD. Molécula hóspede. Molécula hóspede. Complexo de inclusão- 1:1. Complexo de inclusão- 1:2. Figura 5. Associação entre CD e a molécula hóspede para formar o complexo de inclusão. Fonte: Davis & Brewster, 2004..

(31) 28. A forças motrizes que favorecem a formação e aumentam a estabilidade do complexo de inclusão incluem ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas de Vander Walls e interações hidrofóbicas, bem como a liberação de energia resultante da substituição das moléculas de água com elevada entalpia por moléculas hóspedes de menor entalpia (LYRA et al, 2010). A interação da CD com a molécula hóspede altera significativamente algumas propriedades físico-químicas desta última. Estas alterações incluem modificações na reatividade química do substrato, fixação de substâncias muito voláteis, aumento da solubilidade de compostos, estabilização de substâncias sensíveis à luz, calor e oxidação, proteção da degradação de substâncias por microorganismos, entre outras (VENTURINI et al, 2008). Na indústria farmacêutica, as CDs são utilizadas devido a sua capacidade de aumentar a solubilidade aquosa e biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis ou insolúveis em água, melhorar a estabilidade das moléculas hóspedes, prolongar a liberação de substâncias ativas e reduzir a toxicidade de algumas drogas (LOFTSSON ; DUCHÊNE, 2007; RASHED et al, 2008). A inclusão de substâncias tóxicas em CDs pode proteger a mucosa gástrica e reduzir lesões na pele após a administração de substâncias por via oral ou tópica, respectivamente (DELL VALLE, 2004). As CDs funcionam como verdadeiros carreadores, promovendo a liberação de fármacos nas membranas biológicas. As CDs mantêm as moléculas hidrofóbicas da droga em sua cavidade e as entrega para a superfície da membrana biológica onde o complexo é desfeito. A superfície da membrana lipofílica tem baixa afinidade pela superfície hidrofílica das moléculas de CDs e isto faz com que elas permaneçam no exterior da membrana biológica. Portanto, as CDs promovem um aumento da penetração de drogas através das membranas biológicas pelo aumento da disponibilidade destas drogas na superfície da membrana (DEL VALLE, 2004). As CDs naturais mais comuns são as α,. e. -CDs que possuem seis, sete e oito. unidades de D-glicopiranose, respectivamente (Fig.6). A altura da cavidade das CD é a mesma para os três tipos, enquanto que o número de unidades de D-glicopiranose determina o diâmetro interno da cavidade e o volume da CD. Portanto, a α-CD é tipicamente usada para complexar pequenas moléculas com baixo peso molecular (iodo, moléculas alifáticas, pnitrofenol,cloranfenicol, mentol, cânfora), a. -CD para complexar moléculas de tamanho. médio (complexos aromáticos e heterocíclicos) e a -CD para acomodar moléculas grandes como esteróides (DELL VALE, 2004; WOUESSIDJEWE; DUCHÊNE, 1994)..

(32) 29. Fig.6. Estrutura química da α, e -CDs Fonte: Szejtli, 2004.. 2.4.1 β-Ciclodextrina Entre as três CDs naturais, a -CD é a mais utilizada na indústria farmacêutica para a complexação de várias classes de fármacos. Nos últimos anos, o mercado mundial da -CD tem aumentado e um crescente desenvolvimento de complexos de inclusão entre a -CD e algumas drogas tem sido observado, tornando esta CD um importante excipiente farmacêutico (LOFTSSON; MASSON, 2001; WOUESSIDJEWE; DUCHÊNE, 1994). A -CD é a mais utilizada devido a sua acessibilidade e capacidade de complexação Em geral, a toxicidade da -CD administrada por via oral é quase nula, devido a ausência de sua absorção pelo trato gastrointestinal. Em alguns países, é considerada um excipiente farmacêutico não tóxico para uso oral. Alguns derivados da -CD como a hidroxipropil- CD(HP -CD) e a maltosil- -CD parecem ser susceptíveis para administração parenteral, bem como para a administração oral, devido a ausência de toxicidade observada em estudos com animais (LOFTSSON; MASSON, 2001). Outras propriedades da -CD incluem: sua capacidade de se ligar ao colesterol; é menos irritante que a α-CD após injeção intramuscular; é metabolizada pelas bactérias do cólon e do cecum não sendo metabolizadas no trato intestinal superior; e atualmente é a CD mais comum empregada nas formulações farmacêuticas e, provavelmente, a melhor estudada em humanos (DEL VALLE, 2004). Pesquisadores da Universidade Federal de Sergipe-UFS têm desenvolvido estudos com o objetivo de produzir novas formulações com -CD e substâncias isoladas de plantas medicinais para o tratamento de diferentes patologias. Recentemente, em 2011, o professor.

(33) 30. Dr. Márcio Viana e seus colaboradores aprovaram uma patente sobre Complexos de Inclusão de Geraniol e beta-Ciclodextrina, Método de Obtenção e Atividade Antihipertensiva do Geraniol e Seus Complexos, que tem como objetivo desenvolver uma nova formulação para o tratamento da hipertensão.. Um estudo realizado pelo mesmo grupo, foi recentemente. publicado e descreveu a caracterização físico-química do complexo de inclusão entre -CD e GR (MENEZES et al, 2012). Dados parciais sobre o efeito do complexo de inclusão entre -CD e GR sobre o SNC, foram apresentados no IV Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação Tecnológica e resultou no Prêmio em Desenvolvimento Tecnológico na área da saúde. Sendo assim, podemos observar que os estudos desenvolvidos com a -CD estão proporcionando resultados promissores, que podem em um futuro próximo, contribuir para a produção de novas formulações terapêuticas..

(34) 31. 3 OBJETIVOS. 3.1 Objetivo Geral Contribuir para o conhecimento dos efeitos farmacológicos do GR sobre o SNC, e desta forma, fornecer subsídios científicos para a utilização do GR no desenvolvimento de uma nova droga anticonvulsivante.. 3.2 Objetivos Específicos .  . Investigar o efeito anticonvulsivante do GR em modelos animais de convulsão; Identificar os mecanismos envolvidos na ação do GR sobre o SNC, avaliando a sua ação sobre o sistema gabaérgico; Avaliar se a encapsulação do GR em -ciclodextrina altera o efeito farmacológico deste monoterpeno..

(35) 32. 4 MATERIAL E MÉTODOS. 4.1 Animais Foram utilizados camundongos Swiss machos (Fig.7), pesando entre 25-35g, com 2-3 meses de idade, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os animais foram alojados no Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da UFS, em gaiolas de propileno de tamanho 30cm x 40cm x 17cm com assoalho coberto por serragem, sob condições controladas de luz (fase claro/escuro de 12 horas) e temperatura (22ºC ±2ºC), com livre acesso a comida (Purina) e água, por um período de três dias antes dos procedimentos experimentais.. Figura 7. Camundongo Swiss albino Fonte: http: // pt.photo.com. 4.2 Drogas As drogas utilizadas nos experimentos foram: pentilenotetrazol, estricnina, geraniol 98% (GR, lote 9446LJ-498) e -ciclodextrina compradas na Sigma Chemical Company (St Louis,MO,USA), monoleato de polioxietilenossorbitano (Tween 80) e diazepam(DZP) compradas na Synth (Brasil) e Roche (Brasil), respectivamente..

(36) 33. 4.3 Obtenção e caracterização do complexo de inclusão GR: β-CD A preparação do complexo de inclusão GR: -CD foi realizada no Laboratório de Ensaios Farmacêuticos e Toxicidade - LeFT da UFS, sob supervisão do Professor Doutor Adriano Antunes de Souza Araujo. Foi utilizado o método de suspensão, realizado através da adição de água a um béquer contendo 1.135g de -CD e 154mg de GR, na razão molar 1:1. Esta mistura foi submetida à agitação magnética em 400 rpm, por 36 horas (Quimis Q 261A21,. Brazil). Em seguida, a mistura foi aquecida a 70° C por duas horas no mesmo. dispositivo, transferidas para um almofariz de ágata e secas em um dissecador com pressão reduzida (MENEZES et al, 2012). A comprovação da formação e caracterização do complexo de inclusão GR: -CD foram demonstradas no estudo de Menezes et al (2012) através dos métodos calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria/termogravimetria derivada, análise de Karl Fisher, microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier.. 4.4 Procedimentos Gerais As sessões experimentais foram realizadas entre 8:00 e 13:00 horas. Na noite anterior aos experimentos, os animais foram levados ao Laboratório de Neurofisiologia da UFS, onde permaneceram em jejum, sendo mantida apenas água ad libitum, até o final dos procedimentos. Todos os experimentos foram realizados em um sala. isolada com som. atenuado, controle de temperatura, luminosidade e exaustão de ar, na qual nenhuma outra atividade estava sendo realizada no momento das avaliações comportamentais. Todos os animais foram aclimatados antes dos experimentos e cada animal foi avaliado apenas uma vez. O GR foi dissolvido em solução salina 0,9% e 2 gotas de monoleato de polioxietilenossorbitano (Tween 80® a 0, 2%, Synth, Brasil). O complexo de inclusão GR: -CD foi dissolvido em solução salina 0,9%. O DZP foi utilizado como controle positivo e a solução salina 0,9% (com ou sem Tween 80® a 0, 2%) como controle negativo. Todas as drogas foram administradas por via i.p. a um volume final de 0,1ml/10g de peso corporal do animal (Fig.8)..

(37) 34. Os procedimentos experimentais utilizados seguiram os princípios éticos estabelecidos pelo Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e foram aprovados pelo Comité de Ética em Pesquisa Animal da UFS (CEPA/UFS) sob número de protocolo 84/2011 (Anexo A).. Figura 8. Administração de drogas via intraperitoneal Fonte: http://www.ahwla.org.uk. 4.5 Avaliação da atividade anticonvulsivante 4.5.1 Modelo de convulsão induzida por PTZ O modelo de convulsão induzida por PTZ é um dos modelos mais utilizados na pesquisa por novas DAEs. O PTZ é um agente convulsivante quando administrado por via parenteral. Inicialmente produz convulsões mioclonicas, que se tornam sustentadas e podem evoluir para crises convulsivas tonico-clonicas (FISHER, 1989). O mecanismo de ação do PTZ está associado ao bloqueio seletivo do canal de cloreto ligado ao receptor GABAA, o que impede a neurotransmissão inibitória mediada pelo GABA e resulta em uma atividade elétrica excessiva e consequente convulsão (ABBASI et al, 2012). Neste estudo, o PTZ foi administrado por via i.p. na dose de 60 mg/kg para induzir convulsões em camundongos (QUINTANS-JÚNIOR et al, 2008). Inicialmente, os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos ( 8-12 animais por grupo). O grupo controle negativo recebeu veículo (salina 0,9% com 2 gotas de Tween 80® a 0, 2%), o grupo controle positivo recebeu DZP (2mg/kg), enquanto que os outros grupos receberam GR nas.

(38) 35. doses de 50, 100 ou 200mg/kg, por via i.p. Em seguida, os animais foram recolocados em suas gaiolas de origem e após 30 minutos da administração do GR, DZP ou salina, os animais receberam uma injeção i.p. de PTZ. O mesmo procedimento foi adotado para avaliar o efeito anticonvulsivante do complexo de inclusão GR: -CD. Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (812 animais por grupo), e receberam uma injeção i.p. do complexo de inclusão GR: -CD nas doses de 50, 100 ou 200mg/kg ou salina (controle), 30 minutos antes da administração do PTZ. Logo após a administração do PTZ, os animais foram colocados em caixas individuais e observados durante 15 minutos. A latência para a primeira convulsão, o número de animais que convulsionaram e o número de animais que morreram foram anotados (OLIVEIRA et al, 2009; MELO et al, 2011). A capacidade do GR ou do complexo de inclusão GR: -CD de prevenir ou retardar o início das convulsões foi utilizada como indicador de atividade anticonvulsivante. Camundongos que não apresentaram convulsões tonico-clonicas durante os 15 minutos de observação após a administração do PTZ foram considerados protegidos (VASCONCELOS et al, 2007; QUINTANS-JÚNIOR et al, 2008).. 4.5.2 Modelo de convulsão induzida por EST A EST é um alcalóide natural que atua como antagonista competitivo dos receptores de glicina, resultando em um aumento da excitabilitadade pós-sináptica e da atividade contínua dos neurônios da medula espinhal e tronco encéfálico (WEB; LYNCH , 2007).O modelo de convulsão induzida por EST é um dos modelos animais mais utilizados na investigação do potencial anticonvulsivante de novas drogas e nos fornece informações de que a droga testada possui atividade anticonvulsivante mediada por um mecanismo diferente daquele observado no modelo de convulsão induzido por PTZ (FISHER, 1989). A administração i.p. de EST promove uma redução dos efeitos inibitórios da glicina sobre o SNC e resulta em convulsões intensas que geralmente levam a morte dos animais. Neste estudo, a EST foi administrada i.p. na dose de 3mg/kg para induzir convulsões nos camundongos (OLIVEIRA et al, 2009). Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (6 animais por grupo), nos quais foram pré-tratados com GR nas doses de 50, 100 ou 200mg/kg ou salina (grupo controle) 30 minutos antes da administração i.p. de EST. Após a injeção de EST, eles foram.

(39) 36. colocados em caixas individuais e observados por 15 minutos. A latência para a primeira convulsão, o número de animais que convulsionaram e o número de animais que morreram foram anotados. O número de animais que sobreviveram mais de 10 minutos após a injeção de EST serviu como critério de proteção (QUINTANS-JÚNIOR et al, 2008).. 4.6 Análise estatística Os dados obtidos das latências para a primeira convulsão foram analisados pelo teste de Kolmogorov-Smirnov para distribuição normal e pelo teste de Bartlett para homogeineidade de variâncias. Em seguida, foram avaliados por meio da Análise de Variância (ANOVA) seguido pelo pós teste de Tukey para comparações múltiplas. Os dados foram representados como média ± Erro Padrão da Média(EPM). A incidência (%) de convulsões clônicas ou tônico-clônicas bem como a taxa de mortalidade foram avaliadas pelo Teste Exato de Fisher. A análise estatística dos dados foi realizada pelo software Graph Pad Prism versão 4.0 e diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05..

(40) 37. 5 RESULTADOS. 5.1 Efeitos do GR no modelo de convulsão induzido por PTZ Como pode ser observado na Tabela 2, o PTZ na dose administrada (60mg/kg, i.p.) foi capaz de provocar convulsões em 100% dos animais do grupo controle e o pré-tratamento com o GR na dose de 200 mg/kg reduziu significativamente o número de animais que convulsionaram (p<0,01). A dose de PTZ administrada não foi capaz de promover alterações significativas na porcentagem de mortalidade entre os grupos.. Tabela 2. Efeitos do GR sobre a incidência das convulsões induzidas por PTZ . Tratamento. Dose(mg/kg). (%)Convulsão. (%)Mortalidade. Salina. -. 100. 18. DZP. 2. 0b. 0. GR. 50. 100. 0. GR. 100. 75. 0. GR. 200. 50a. 0. n=8- 12, por grupo Diferença estatisticamente significativas ap<0,01 e bp<0,001(Teste Exato de Fisher) em relação ao grupo controle.. Na figura 9, observamos que o GR na dose de 200mg/kg (i.p.) aumentou significativamente ( 645,2 ± 96,27; q=7,793; p<0.001) a latência para as convulsões tonicoclônicas induzidas por PTZ em comparação com o grupo controle (115,4 ± 13,46), no qual foi administrado apenas o veículo. O pré-tratamento que o DZP-2mg/kg (900±0,0; q=10,37; p<0,001), utilizado como controle positivo, protegeu completamente os animais das convulsões induzidas por PTZ (Tabela 2)..

(41) 38. ***. 900. ***. 800. Latência(s). 700 600 500 400 300 200 100 0 Salina. GR50. GR100. GR200. DZP. Figura 9. Efeitos do GR sobre a latência para a primeira convulsão induzida por PTZ (60mg/kg). Os dados estão expressos como média ± EPM (n=8-12 por grupo). Diferença estatisticamente significativa ***p<0,001 (ANOVA seguido pelo pós teste de Tukey) em relação ao grupo controle.. 5.2 Efeitos do complexo de inclusão GR:β-CD no modelo de convulsão induzido por PTZ Como pode ser observado na Tabela 3, a administração do PTZ (60mg/kg, i.p.) induziu convulsões tonico-clônicas em 100% dos animais do grupo controle. O prétratamento com o complexo de inclusão GR: -CD nas doses de 100mg/kg (p<0,05) e 200mg/kg. (p<0,01). reduziu. significativamente. a. porcentagem. dos. animais. que. convulsionaram. Tabela 3. Efeitos do complexo de inclusão GR: -CD sobre a incidência das convulsões induzidas por PTZ. Tratamento Dose(mg/kg) (%)Convulsão (%)Mortalidade Salina. -. 100. 16.6. DZP. 2. 0a. 0. GR: -CD. 50. 100. 0. GR: -CD. 100. 66,6c. 0. GR: -CD. 200. 50. b. 0. n=8-12, por grupo Diferença estatisticamente significativa ap<0.001,bp<0,01 e cp<0,05 (Teste Exato de Fisher) em relação ao grupo controle..

(42) 39. Na figura 10, observamos um aumento significativo da latência para as convulsões tonico-clônicas induzidas por PTZ quando foi administrado o complexo de inclusão GR: -CD nas doses de 100 ( 477,3±97,92; q=5,344; p<0,01) e 200mg/kg (608,8±97,25; q=7,279; p<0,001) em comparação com o grupo controle, no qual foi administrado apenas salina (113,8±10,52). O DZP-2mg/kg (900±0,0; q=10,34; p<0,001), utilizado como controle positivo, protegeu todos os animais das convulsões induzidas por PTZ (Tabela 3).. ***. 900 800. ***. Latência(s). 700. **. 600 500 400 300 200 100 0. Salina. GR:CD50 GR:CD100GR:CD200. DZP. Figura 10. Efeitos do complexo de inclusão GR: -CD sobre a latência para a primeira convulsão induzida por PTZ (60mg/kg). Os dados estão expressos como média±EPM (n=8-12 por grupo). Diferenças estatisticamente significativas **p<0,01 e ***p<0,001 (ANOVA seguido pelo pós teste de Tukey) em relação ao grupo controle.. 5.3 Efeitos do GR no modelo de convulsão induzida por EST Como pode ser observado na Tabela 4, a administração de EST (3mg/kg, i.p.) induziu convulsões e morte em 100% dos animais do grupo controle. O pré-tratamento com o GR (50, 100 e 200mg/kg, i.p.) não alterou a porcentagem de convulsões e mortalidade, como também não modificou (p>0,05) a latência para a primeira convulsão induzida por EST quando comparado ao grupo controle (Fig.11). Desta forma, pode-se observar que o GR não promoveu resultado significativo no modelo de convulsão induzido por EST..

(43) 40. Tabela 4. Efeitos do GR sobre a incidência das convulsões induzidas por EST. Tratamento. Dose(mg/kg). (%)Convulsão. Mortalidade (%). Salina. -. 100. 100. GR. 50. 100. 100. GR. 100. 100. 100. GR. 200. 100. 100. n=6, por grupo. Latência(s). 200. 100. 0 Saline. GR50. GR100. GR200. Figura 11. Efeitos do GR sobre a latência das convulsões induzidas por EST (3mg/kg Os dados estão expressos como média±EPM (n=6 por grupo)..

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