UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
NADYA SOARES DE MACEDO ADAMOV
ESTUDO MOLECULAR DE PACIENTES COM NEUROPATIA AUDITIVA
CAMPINAS 2017
NADYA SOARES DE MACEDO ADAMOV
ESTUDO MOLECULAR DE PACIENTES COM NEUROPATIA AUDITIVA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências Médicas, na área de Genética Médica.
ORIENTADOR: Profa. Dra Edi Lúcia Sartorato
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNA NADYA SOARES DE MACEDO ADAMOV
E ORIENTADO PELO Profa. Dra. EDI LÚCIA SARTORATO
CAMPINAS 2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
NADYA SOARES DE MACEDO ADAMOVORIENTADOR: PROF(A). DR(A). EDI LÚCIA SARTORATO
MEMBROS:
1. PROF(A). DR.(A) EDI LÚCIA SARTORATO
2. PROF(A). DR.(A) MARCELO LIMA RIBEIRO
3. PROF(A). DR.(A) CLÁUDIA VIANNA MAURER MORELLI
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
“Viver é enfrentar um problema atrás do outro. O modo como você o encara é que faz a diferença.”
Ao meu querido e amado Avô Victor, que sempre enfrentou a vida com coragem e sabedoria.
AGRADECIMENTOS
Á minha querida orientadora Dra. Edi Lúcia Sartorato, por me aceitar no seu grupo de pesquisa, pela confiança em me dar esse projeto, por todos os conselhos. Por todo esse tempo que tem contribuído para o meu crescimento profissional. Por toda a sabedoria e conhecimento compartilhado com seus alunos. Obrigada por tudo, sou eternamente grata. Aos meus amados pais, que sempre estiveram ao meu lado nos momentos mais difíceis e nos momentos mais bonitos. Por todas as horas que me ouviram, por todos os conselhos, abraços e colos. Obrigada por me ajudarem a conquistar mais essa vitória. Sei que tudo o que eu sou hoje é graças à vocês e toda a educação que ensinaram a mim. Por sempre acreditar no meu potencial. Dedico esta conquista a vocês, que são minha base e meu alicerce. Amo vocês.
Ao meu amado namorado Victor, por sempre estar lá quando eu mais precisava, pelos abraços calados que diziam muitas coisas, pelos conselhos, pelas traduções (rsrsrs), pelo amor que emana de você. Obrigada por todos os momentos de alegria e risadas intermináveis. Quando eu crescer quero ter a sua serenidade e paciência. Obrigada por ser a melhor pessoa que eu podia querer ao meu lado. Amo você.
A minha linda e amada Vózinha, que sempre com grande sabedoria e simplicidade, me ensinou coisas valiosíssimas que levarei comigo para sempre. Por ser minha segunda mãe, por me educar, por me dar amor e conselhos, por todos os almoços em sua casa e tarde que passava com ela e meu querido Avô (in memorian). Enfim, por cuidarem de mim todos esses anos. Amo a senhora.
A professora Dra Maricilda por todos os almoços, histórias e sabedoria compartilhada. Muito obrigada.
Aos melhores colegas de laboratório Genética Humana-CBMEG e parceiros que eu podia pedir: Sueli, Lílian Rodrigues de Lima, Carolina Svidinicki, Alessandra Staffocker Priscila Zonzini por toda a ajuda, Fábio Arrojo por me ajudar sempre que precisei, Jhonathan, Taís Nitsch Mazzola, Giselle Bianco, Rogério Alves (Batata), Caroline Conti, Juliane Pitante, Matheus Tonetti, Pamela, minha amiga querida Priscila Jacob, meu amigo
do coração Paulo Maurício Miranda, minha queridas amigas e conselheiras Mara e Helena.
Á minha banca avaliadora, Dr Marcelo e Dra Cláudia Morelli, por terem aceitado gentilmente participar da defesa.
As minhas queridas amigas Natália, Tati Sayuri e Amanda, por todos os desabafos e momentos que me ouviram, pelos momentos de comilança e amor. Amo vocês Negas. Aos pacientes sem os quais esse trabalho não poderia ser realizado.
Aos professores e funcionários do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG).
Às agencias financiadoras Capes, CNPq e FAPESP, pela bolsa e auxílios concedidos. A todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 16
1.1 OSISTEMAAUDITIVO 16
1.2 PERDAAUDITIVA 18
1.2.1 CLASSIFICAÇÃO DAS PERDAS AUDITIVAS 19
1.2.2 ETIOLOGIA DAS PERDAS AUDITIVAS 20
1.3 GENÉTICADASPERDASAUDITIVAS 21
1.3.1 PERDA AUDITIVA NÃO-SINDRÔMICA DE HERANÇA AUTOSSÔMICA DOMINANTE 23 1.3.2 PERDA AUDITIVA NÃO-SINDRÔMICA DE HERANÇA AUTOSSÔMICA RECESSIVA 24
Gene GJB2 24
Gene GJB6 25
Gene SLC26A4 26
Gene OTOF 27
Gene PJVK / DFNB59 29
1.4 PERDAAUDITIVADEHERANÇAMATERNA 29
1.5 NEUROPATIAAUDITIVA 30 1.6 JUSTIFICATIVADOTRABALHO 32 2 OBJETIVOS 34 2.1 OBJETIVO GERAL 34 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 34 3 MATERIAIS E MÉTODOS 35 3.1 CASUÍSTICA 35 3.2 ESTUDOMOLECULAR 35
3.2.1 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO DE SANGUE PERIFÉRICO 35 3.2.2 TRIAGEM DE MUTAÇÕES NOS PRINCIPAIS GENES ENVOLVIDOS NA SURDEZ NÃO-SINDRÔMICA 37
Rastreamento da mutação c.35delG no gene GJB2 37
Rastreamento de mutações no gene GJB2 por sequenciamento automático 37 Rastreamento da mutação IVS1+1G>A no gene GJB2 40 3.2.2.4. Rastreamento das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6
41 Rastreamento da mutação m.1555A>G no gene mitocondrial MTRNR1 42
3.3 DETECÇÃODEMUTAÇÕESNOGENEDAOTOFERLINA(OTOF) 43
3.3.1 TRIAGEM DA MUTAÇÃO P.Q829X 43
3.3.2 RASTREAMENTO DE MUTAÇÕES NO GENE OTOF 44
3.3.3 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR 45
3.3.5 ANÁLISE DAS SEQUENCIAS OBTIDAS 46
3.4 DETECÇÃODEMUTAÇÕESNOGENEPJVK(DFNB59) 46
3.4.1 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR 47
3.4.2 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO 47
3.4.3 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS OBTIDAS 47
3.5 PAINELDECAPTURAPARANEXT-GENERATIONSEQUENCING 48
4 RESULTADOS 50
4.1 PACIENTES 50
4.2 TRIAGEM DAS PRINCIPAIS ALTERAÇÕES MOLECULARES ENVOLVIDAS COM A SURDEZ 51
N= ALELO NORMAL 52
4.3 RASTREAMENTO DO GENE OTOF 52
4.4 RASTREAMENTO DO GENE PJVK(DFNB59) 56
5 DISCUSSÃO 57
6 CONCLUSÃO 63
7 REFERÊNCIAS 64
RESUMO
A perda auditiva é dos distúrbios sensoriais humanos mais comum, afetando o desenvolvimento infantil, a integração social e a qualidade de vida dos pacientes. A neuropatia auditiva é um tipo de perda auditiva neurossensorial que consiste na alteração na condução do estímulo auditivo por acometimento das células ciliadas internas, do nervo auditivo ou das sinapses entre eles. É caracterizada pela ausência ou alteração das ondas no exame de potenciais evocados auditivos de tronco encefálico, com presença de emissões otoacústicas e/ou microfonismo coclear. Foram mapeados 4 loci relacionados à neuropatia auditiva não-sindrômica: DFNB9 (gene OTOF) e DFNB59 (gene PJVK), associados ao padrão de herança autossômico recessivo; AUNA1 (DIAPH3), autossômico dominante; e AUNX1, ligado ao cromossomo X. Além disso, mutações no gene da conexina 26 (GJB2) também já foram relacionadas à doença. Mutações no gene OTOF desempenham papel significativo, sendo que até o momento já foram identificadas mais de 100 mutações patogênicas em indivíduos com surdez não-sindrômica, em populações de origens variadas, com destaque para a mutação p.Q829X que foi encontrada em cerca de 3% dos casos de surdez na população espanhola. A identificação de alterações genéticas responsáveis pela neuropatia auditiva é um dos desafios que contribui para a compreensão das bases moleculares dos diferentes fenótipos da perda auditiva. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi pesquisar alterações moleculares em pacientes com diagnóstico clínico de neuropatia auditiva em uma amostra de pacientes brasileiros. Foram pesquisadas alterações genéticas em 15 pacientes, entretanto, a mutação p.Q829X no gene da otoferlina não foi identificada em nenhum dos casos. A mutação c.35delG no gene GJB2 foi encontrada em homozigose em três casos e em dois casos em heterozigose e a alteração IVS1+1g>a foi encontrada em heterozigose. Não se pode afirmar, se essas alterações no gene da conexina 26 estariam realmente associadas com a neuropatia auditiva nesses casos, ou se as emissões otoacústicas observadas nesses pacientes representam apenas atividade residual de células ciliadas externas que permaneceram vivas. No entanto, acredita-se que algumas mutações no gene GJB2 podem causar alterações nas células ciliadas internas e terminações nervosas das células ciliadas. Adicionalmente, foram rastreadas mutações no gene OTOF através do sequenciamento completo dos 48 éxons e da região 3’ UTR. Foram encontradas alterações patogênicas através da técnica OTO-CGH array, sendo elas p.I1573T, p.W718X e p.D1709Efs*54. Apesar de existirem estudos moleculares relacionados à neuropatia auditiva em diferentes populações, é necessária uma maior investigação para estabelecer o envolvimento de alterações genéticas com a etiologia da neuropatia auditiva em indivíduos brasileiros. No gene PJVK foram encontradas alterações silenciosas e nenhuma alteração patogênica foi encontrada nesse gene, esse resultado está de acordo com os achados da literatura.
ABSTRACT
Hearing loss is one of the most common human sensory disorders, affecting child development, social integration and quality of life of patients. Auditory neuropathy is a type of sensorineural hearing loss that consists of alteration in the conduction of the auditory stimulus due to involvement of the inner hair cells, the auditory nerve or the synapses between them. It is characterized by the absence or alteration of the waves in the auditory brainstem auditory evoked potentials, with presence of otoacoustic emissions and / or cochlear microphonism. Four loci related to non-syndromic auditory neuropathy were mapped: DFNB9 (OTOF gene) and DFNB59 (PJVK gene), associated with the autosomal recessive inheritance pattern; AUNA1 (DIAPH3), autosomal dominant; And AUNX1, bound to the X chromosome. In addition, mutations in the connexin 26 (GJB2) gene have also been related to the disease. Mutations in the OTOF gene play a significant role, and up to now more than 100 pathogenic mutations have been identified in individuals with non-syndromic deafness in populations of different origins, especially the mutation p.Q829X that was found in about 3 % Of deafness cases in the Spanish population. The identification of genetic alterations responsible for auditory neuropathy is one of the challenges that contributes to the understanding of the molecular basis of the different phenotypes of hearing loss. Thus, the objective of the present study was to investigate molecular alterations in patients with clinical diagnosis of auditory neuropathy in a sample of Brazilian patients. Genetic alterations were investigated in 15 patients; however, the mutation p.Q829X in the otoferlin gene was not identified in any of the cases. The c.35delG mutation in the GJB2 gene was found in homozygous in three cases and in two cases in heterozygosis and the IVS1 + 1g> a alteration was found in heterozygosity. It cannot be stated whether these changes in the connexin 26 gene would actually be associated with auditory neuropathy in these cases, or whether the otoacoustic emissions observed in these patients represent only residual activity of outer hair cells that remained alive. However, it is believed that some mutations in the GJB2 gene can cause changes in the inner hair cells and nerve endings of the hair cells. In addition, mutations in the OTOF gene were screened by complete sequencing of the 48 exons and the 3 'UTR region. Pathogenic alterations were found through the OTO-CGH array technique, being p.I1573T, p.W718X and p.D1709Efs * 54. Although there are molecular studies related to auditory neuropathy in different populations, more research is needed to establish the involvement of genetic alterations with the etiology of auditory neuropathy in Brazilian individuals. In the PJVK gene, silent alterations were found and no pathogenic alteration was found in this gene, this result is in agreement with the literature findings.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Esquema do sistema auditivo evidenciando as principais partes da orelha
externa, média e interna. (Modificado de: <http://imgkid.com/outer-ear-diagram.shtml>. Acesso em Jan/2015).
Figura 2. Representação de um audiograma mostrando a relação entre o volume
(em Decibéis) e a frequência das ondas sonoras (em Hertz). As diferentes cores indicam os graus de perda auditiva.
Figura 3. Representação ilustrativa da estrutura da otoferlina (isoforma longa),
evidenciando os seis domínios C2 (C2A-C2F). N: região N- terminal. TM: domínio transmembrânico. C: região C-terminal.
Figura 4.Esquema representativo da estrutura dos éxons e íntrons do gene da
otoferlina (topo), destacando as regiões genômicas compreendidas entre os éxons 18-22 nas diferentes isoformas, em humanos e camundongos (abaixo). As regiões codificantes dos éxons estão representadas por retângulos pretos e as regiões não traduzidas estão representadas em branco (Adaptado de: Yasunaga et al., 2000).
Figura 5. Ciclos utilizados na amplificação do gene GJB2.
Figura 6. Ciclos de amplificação para posterior sequenciamento do gene GJB2. Figura 7. Ciclos de amplificação para o estudo da mutação IVS1+1G>A.
Figura 8. Ciclos de amplificação para o estudo das deleções del(GJB6-D13S1830)
e del(GJB6-D13S1854).
Figura 9. Ciclos de amplificação para o estudo da mutação mitocondrial
m.1555A>G.
Figura 10. Representação esquemática do protocolo de preparação das amostras utilizando o HaloPlexTM Target Enrichment System
Figura 11. Resultados do sequenciamento para confirmação da mutação no éxon 39 do gene OTOF. A: Análise do DNA do pai do paciente
Figura 12. Heredograma da Família 3 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. wt: wild type (alelo normal).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fatores ambientais e genéticos envolvidos na perda auditiva
(Modificado de Russo, 2000)
Tabela 2: Genes relacionados à perda auditiva autossômica dominante (Baseado
em Hereditary Hearing Loss Homepage <http://hereditaryhearingloss.org> e Hilgert et al., 2009a)
Tabela 4. Sequências dos primers utilizados para a amplificação do gene GJB2 e
tamanho dos fragmentos gerados.
Tabela 5. Sequências dos primers utilizados na triagem das deleções
del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) e tamanho dos fragmentos gerados.
Tabela 6. Sequências dos primers utilizados no rastreamento de mutações no gene
OTOF
Tabela 7. Sequências dos primers utilizados no rastreamento de mutações no gene
PJVK
Tabela 8. Dados clínicos dos pacientes envolvidos no estudo.
Tabela 9. Resultados obtidos no rastreamento das principais alterações
moleculares associadas à perda auditiva de origem genética.
Tabela 10. Resumo das alterações exônicas encontradas no gene OTOF.
Tabela 11. Resumo das alterações intrônicas identificadas até o momento no gene
OTOF.
Tabela 12. Resumo das alterações exônicas encontradas no gene PJVK. Tabela 13. Resumo das alterações intrônicas encontradas no gene PJVK.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
aCGH Array Comparative Genomic Hybridization
cnLOH Regiões em homozigose sem variação no número de cópias CNV Copy number variation (variação do número de cópias) cm Centímetro
DFN Locus de surdez não-sindrômica
DFNA Locus de surdez não-sindrômica autossômica dominante DFNB Locus de surdez não-sindrômica autossômica recessiva
DGV Database of Genomic Variants (Banco de dados de variantes genômicas) DNA Ácido desoxirribonucleico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético FDA Food and Drug Administration FISH Hibridação in situ por Fluorescência GJ Ggap junctions
h Hora
kb Kilobases
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes M Massa molar
Mb Megabase
MS Mass Spectrometry (Espectometria de massa)
NGS Next-generation sequencing (sequenciamento de nova geração) ng Nanograma
OMS Organização Mundial de Saúde pb Par de base
PCR Polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) pH Potencial de hidrogênio iônico
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição)
rpm Rotações por minuto
SNPs Single-Nucleotide Polymorphism (Polimorfismo de nucleotídeo único) SNSAR Surdez sensorioneural não sindrômica autossômica recessiva
1
INTRODUÇÃO
1.1 O SISTEMA AUDITIVO
O sistema auditivo é um dos mais complexos e sofisticados do nosso organismo, sendo responsável por captar as ondas sonoras e dar início ao processo de percepção e interpretação do som. A estrutura responsável pela audição é a orelha humana, um órgão capaz de traduzir precisamente as diferentes frequências e intensidades do som ao mesmo tempo que transfere as informações que foram coletadas para o cérebro e nos permite identificar a distância e direção do som emitido(1) (2).
A orelha dos mamíferos é composta pela orelha externa, média e interna (Figura 1). A orelha externa é formada pelo pavilhão auricular e canal auditivo, sendo a função do pavilhão auricular captar e direcionar as ondas sonoras para o canal auditivo. Já o canal auditivo externo tem a função de transmitir os sons para a membrana timpânica e proteger a orelha média e interna, além de servir de câmara de ressonância ampliando algumas frequências de sons. A extremidade externa do canal auditivo está aberta, enquanto a extremidade interior está fechada pela membrana timpânica, que o separa da orelha média. A orelha externa conduz as ondas sonoras do ambiente para a orelha interna, passando pela orelha média. As ondas sonoras são captadas pelo pavilhão auricular da orelha externa e conduzidas pelo canal auditivo até a membrana timpânica (2).
Figura 1. Esquema do sistema auditivo evidenciando as principais partes da orelha externa, média e interna. (Modificado de: <http://imgkid.com/outer-ear-diagram.shtml).
A orelha média é composta por três ossículos articulados entre si, martelo, bigorna e estribo, que servem como um elo entre o tímpano e a janela oval da orelha interna. Estes três pequenos ossos funcionam como alavancas, aumentando a força das vibrações mecânicas, agindo como amplificadores das vibrações das ondas sonoras. Já a orelha interna contém os órgãos sensoriais que nos permitem ouvir e que controlam o nosso equilíbrio e orientação espacial. Essas estruturas são: a cóclea, responsável pela percepção do som (processamento da informação auditiva), e o vestíbulo, sensível a gravidade e aceleração. Na orelha interna, as vibrações sonoras são transformadas em sinais elétricos que são conduzidos para o cérebro(2)(3).
A cóclea, presente na orelha interna, é o principal órgão responsável pela audição e é constituído por um canal ósseo-membranoso que apresenta a forma de caracol (helicoidal) rodeado pelo osso temporal. Esse canal é dividido em três compartimentos preenchidos por fluidos: as escalas média, vestibular e timpânica. A escala média é uma cavidade cheia de endolinfa, localizada entre a escala vestibular e timpânica, cavidades preenchidas por perilinfa, está apresenta alta concentração de sódio e baixa concentração de potássio, enquanto a endolinfa apresenta baixa concentração de sódio e alta concentração de potássio, se assemelhando com fluidos intracelulares(2). Na escala média está localizado o órgão de Corti, ou órgão Espiral, que é a porção sensorial propriamente dita do sistema auditivo. Esse órgão, situado na membrana basilar, é constituído por células de suporte e células sensoriais especializadas, denominadas células ciliadas, estas, apresentam uma disposição altamente organizada: uma fila formada por células ciliadas internas e três filas formadas por células ciliadas externas. A porção apical das células ciliadas contém projeções especializadas ricas em actina, denominadas estereocílios. Uma membrana acelular, chamada membrana tectória, cobre o epitélio de células ciliadas. As células ciliadas internas são capazes de transformar a energia mecânica em um sinal elétrico, que é o princípio básico da audição(3).Quando o som é captado, fluidos se movem pela escala média e vibram a membrana basilar e a membrana tectória. As vibrações provocam a deflexão dos estereocílios, permitindo o influxo de íons potássio por meio da abertura de canais que despolarizam a membrana das células ciliadas internas. Essa despolarização provoca a liberação de vesículas contendo neurotransmissores nas células ciliadas internas ou externas, que desencadeiam o impulso nervoso. Esses impulsos elétricos são transmitidos ao nervo auditivo, que leva a informação ao cérebro, onde são interpretados.
1.2 PERDA AUDITIVA
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), os termos deficiência u perda auditiva referem-se à perda a perda parcial ou completa da capacidade auditiva. E o termo surdez refere-se à perda total da audição de uma ou em ambas as orelhas (4).Porém neste trabalho, os termos surdez, perda auditiva e deficiência auditiva serão adotados para se referir a qualquer comprometimento do sistema auditivo significante, independente da etiologia, tipo, grau ou frequência. Essa mesma terminologia pode não se aplicar para outros profissionais, como por exemplo, otorrinolaringologistas e fonoaudiólogos. Entretanto, em publicações científicas relacionadas à genética, esses termos são os mais empregados, já que muitas vezes perdas auditivas que apresentam a mesma etiologia genética podem exibir manifestações bastante variáveis.
Sabe-se que pelo menos 360 milhões de pessoas (328 milhões de adultos e 32 milhões de crianças) do mundo inteiro apresentam perda auditiva bilateral moderada à profunda, o correspondente a 5,3% da população mundial e que essa estatística aumenta ainda mais na população idosa. Aproximadamente um terço das pessoas com mais de 65 anos de idade são acometidas por algum tipo de deficiência auditiva (4). Dados estatísticos internacionais mostram que 1 em cada 1000 recém-nascidos sofre de perda auditiva profunda, e outro apresentará alguma deficiência auditiva antes da idade adulta (5) (6). No Brasil, a frequência estimada é 4 a cada 1000 nascimentos(7). Essa frequência pode variar dependendo da amostra e da região estudada, podendo a surdez estar presente em 2 a 7 para cada 1000 recém-nascidos (7)(8). A prevalência da perda auditiva aumenta com a idade. Mais de 25% da população com 65 anos de idade e cerca de 50% com mais de 80, sofrem de diferentes graus de perda auditiva relacionada à idade, também conhecida como presbiacusia (3). Sabe-se que 1,7% das crianças apresentam perda auditiva moderada a profunda, em adultos com idade maior de 15 anos, este número está ao redor de 7%, e em adultos com mais de 65 anos, a prevalência aumenta para quase um a cada 3 indivíduos. Cerca de 80% da população com perda auditiva vive em países de média e baixa renda, onde há maior prevalência dos fatores ambientais como causa do distúrbio.
A perda auditiva (PA) gera muitas consequências na vida de uma pessoais e sociais para o indivíduo. No Brasil, 80 a 90% das crianças com deficiência auditiva não
completam o ensino fundamental e apenas 5% dos alunos com surdez profunda atingem níveis educacionais semelhantes ao das pessoas sem qualquer deficiência (8).
1.2.1 Classificação das perdas auditivas
Figura 2. Representação de um audiograma mostrando a relação entre o volume (em Decibéis) e a frequência das ondas sonoras (em Hertz). As diferentes cores indicam os graus de perda auditiva. <Http://www.fairview.org/healthlibrary/Article/83640>
A perda auditiva pode ser classificada de várias maneiras de acordo com: a idade de início (pré-lingual ou pós-lingual); o tipo (neurossensorial, condutiva ou mista); a etiologia (genética ou ambiental, e sindrômica ou não-sindrômica); a gravidade (leve, moderada, severa ou profunda); e a lateralidade (bilateral ou unilateral). Essa classificação pode auxiliar na determinação de sua causa e também na condução de testes genéticos, pois alguns genes são propensos a causar perda auditiva com um padrão já conhecido, por exemplo idade de início e gravidade. Baseada na região afetada da orelha, a perda auditiva pode ser do tipo condutiva, quando for causada por problemas na orelha média e/ou externa; neurossensorial quando for causada por problemas na orelha interna e/ou nervo coclear; e mista quando for causada por uma combinação de ambos componentes condutivos e neurossensoriais (9).
De acordo com o início da perda auditiva, esta pode ser classificada como pré-lingual, se estiver presente ao nascimento ou antes da aquisição da linguagem, ou como pós-lingual, quando se manifesta após a aquisição da linguagem (9). A surdez pode ainda ser definida de acordo com o seu grau, como leve (de 26 a 40 dB), moderada (de 41 a 70
dB), severa (de 71 a 90 dB) ou profunda (acima de 90 dB). A avaliação é feita por meio dos limiares tonais nas frequências que variam de 0,5 a 4 kHz, que são essenciais para o entendimento da fala (Figura 2). Outro critério é quanto à lateralidade, sendo chamada de bilateral quando as duas orelhas são afetadas, e de unilateral quando a deficiência auditiva está presente em apenas um dos lados (10).
1.2.2 Etiologia das perdas auditivas
A perda auditiva pode ser causada por fatores ambientais ou genéticos. Dentre os fatores ambientais inclui-se a exposição frequente a ruído de alta intensidade, o uso de drogas ototóxicas, infecções, entre outros (Tabela 1). Quanto aos fatores genéticos, mutações em diferentes genes ou em elementos regulatórios que estão envolvidos no desenvolvimento adequado, na estrutura e na função da orelha podem levar a diferentes graus de perda auditiva(3). Em países desenvolvidos, 60% dos casos de surdez congênita são genéticos, 30% adquiridos e 10% de etiologia idiopática, ou seja, de causa desconhecida (11).
Nos países em desenvolvimento, ainda há maior prevalência dos fatores ambientais como causa das perdas auditivas. As infecções pré-natais como rubéola, meningite, toxoplasmose, citomegalovirose, sífilis, herpes simples, entre outras, são as principais causas de perda auditiva infantil identificável. Os fatores perinatais, como ventilação mecânica, hipóxia e hiperbilirrubinemia, também contribuem para a etiologia das perdas auditivas, sendo que com o aumento da sobrevida de neonatos de riscos e prematuros, a frequência aumentou nos últimos anos. Das doenças infecciosas pós-natais, a otite média crônica é a principal causa de perda auditiva infantil, porém outras doenças infecciosas como meningite, sarampo, caxumba também desempenham um papel importante na etiologia das perdas auditivas (Davis et al., 2003). Outras causas comuns incluem: exposição frequente a ruídos intensos, lesões na cabeça e orelha, envelhecimento e uso de drogas ototóxicas (4).
Tabela 1. Fatores ambientais e genéticos envolvidos na perda auditiva (Modificado de Russo, 2000)
Em países desenvolvidos 1 em cada 1000 crianças nasce com perda auditiva, sendo 60% dos casos de surdez congênita de origem genética, 30% adquiridos e 10% de causa desconhecida (7) (11). Estes valores são diferentes no Brasil, onde aproximadamente 50% das perdas auditivas têm como causa principal os fatores ambientais. Um estudo realizado por Nóbrega e colaboradores (2005), com 519 crianças e adolescentes brasileiros, mostrou que as principais causas de deficiência auditiva encontradas foram: ambientais (49,7%), causa desconhecida (36,6%) e genéticas (13,6%). Entre os fatores ambientais, a rubéola congênita foi o mais frequente (12,9%). Foram encontraram resultados semelhantes em um estudo realizado com 162 crianças e adolescentes. As causas ambientais representaram 50% dos casos, seguido por causas idiopáticas (32%) e genéticas (18%). Entre os fatores ambientais, a meningite foi o mais frequente (15%) (7).
1.3 GENÉTICA DAS PERDAS AUDITIVAS
O progresso das pesquisas relacionadas à perda auditiva genética tem provocado um significativo avanço na identificação das causas da surdez. Os avanços na biologia
molecular, genômica e proteômica tem contribuído para elucidar a complexa rede de genes envolvidos no mecanismo da audição, que é o primeiro passo para a implementação de uma terapia eficiente para a perda auditiva.
Estima-se que cerca de 300 a 500 genes (1% do genoma humano) estejam envolvidos no mecanismo da audição. Este grande número de genes é explicado pela complexidade fisiológica da audição (Finsterer & Fellinger, 2005). As funções das proteínas codificadas por estes genes são diversificadas, podem ser proteínas componentes de matriz extracelular, proteínas de gap junctions e de adesão, canais de íons, transportadoras, proteínas de superfície celular, receptores, assim como proteínas de citoesqueleto. Além disso outros genes codificam fatores de transcrição, RNAt, RNAr (10,12,13).
Dos casos de perda auditiva de origem genética, 70% deles ocorrem de forma isolada, sendo chamada de perda auditiva não-sindrômica (NSHL, do inglês Non-Syndromic hearing Loss), onde o indivíduo apresenta perda auditiva como único sintoma clínico. Já os 30% restantes, representam as Perdas Auditivas Sindrômicas (SHL, do inglês Syndromic Hearing Loss), sendo estas associadas a outros sintomas ou anomalias além da perda auditiva, como malformações, problemas de visão, entre outros(14). Mais de 400 síndromes já foram descritas nas quais a surdez é uma das manifestações clínicas. As perdas auditivas sindrômicas representam cerca de 30% das perdas auditivas de origem genética e podem apresentar todos os tipos de herança. A Síndrome de Waardenburg é o tipo mais comum de perda auditiva sindrômica de herança autossômica dominante, seguida pela Síndrome de Branchio-Oto-Renal e de Stickler. Quanto à perda auditiva sindrômica de herança autossômica recessiva, a Síndrome de Usher é a mais comum, seguida pela Síndrome de Pendred e Síndrome de Jervell & Lange-Nielsen(14,15).
Um dos maiores empecilhos na localização de genes envolvidos na perda auditiva é a dificuldade de acesso à cóclea e às demais estruturas da orelha interna. A construção de um banco de cDNA de material coclear fetal possibilitou o endereçamento de genes candidatos por abordagem tecido-específica(16,17). Além da quantidade de genes descritos, outro fator que aumenta a complexidade genética da perda auditiva é que um mesmo gene pode apresentar mutações que resultam em diferentes padrões de herança, dominante ou recessivo, ou ainda estar envolvido tanto com surdez sindrômica quanto não-sindrômica (12).
1.3.1 Perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica dominante
As perdas auditivas não-sindrômicas de herança autossômica dominante geralmente são neurossensoriais, pós-linguais e progressivas. Representam um número significativo de casos de surdez hereditária não-sindrômica, o correspondente à cerca de 20% (15) (18). Já foram mapeados até o momento aproximadamente 50 loci e identificados 33 genes associados a esse padrão de herança (Hereditary Hearing Loss Homepage. <Http://hereditaryhearingloss.org>). Os loci e genes envolvidos com a perda auditiva autossômica dominante estão descritos na tabela a seguir.
Tabela 2: Genes relacionados à perda auditiva autossômica dominante (Baseado em Hereditary Hearing Loss Homepage <http://hereditaryhearingloss.org>).
Nenhum dos genes associados ao padrão de herança dominante está envolvido em um número significativo de casos, ao contrário das perdas auditivas autossômicas recessivas. Entre os genes envolvidos no padrão de herança dominante, são mais comumente relatados nos seguintes genes: TECTA, WFS1, KCNQ4, COCH e GJB2 (19).
Estudos envolvendo os genes associados à surdez autossômica dominante na população brasileira são escassos, sendo ainda necessários mais estudos, para que seja possível a identificação dos principais genes relacionados a esse padrão de herança em nossa população.
1.3.2 Perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica recessiva
A maioria dos casos de perda auditiva hereditária não-sindrômica manifestam-se como formas autossômicas recessivas, com aproximadamente 80% dos casos. As perdas auditivas não-sindrômicas de herança autossômica recessiva geralmente são neurossensoriais, de manifestação pré-lingual, estacionárias, de grau severo a profundo e geralmente atingem todas as frequências(15). Cerca de 60 genes foram identificados em associação a esse padrão de herança (Hereditary Hearing Loss Homepage. <Http://hereditaryhearingloss.org>).
Mutações em alguns genes se apresentam com mais frequência, incluindo a população, sendo que mutações no gene GJB2, que codifica a proteína conexina são a principal causa de surdez genética em diferentes populações.
Gene GJB2
O gene GJB2 que codifica a conexina 26 (Cx26), foi o primeiro gene nuclear associado à perda auditiva não-sindrômica a ser relatado. Mutações nesse gene são as principais causas de perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva, presentes em aproximadamente 80% dos casos(20). Ele está localizado na região cromossômica 13q11-q12, apresenta tamanho de 5.513 pb e é composto por 2 éxons, porém apenas um deles é codificante. Seu RNA mensageiro (RNAm) apresenta 2.250 pb e é traduzido em uma proteína de 226 aminoácidos, a Conexina 26 (21). A conexina 26 pertence à família das conexinas, que são proteínas transmembrânicas importantes na comunicação entre as células, é expressa na cóclea e forma canais que medeiam a passagem de pequenas
moléculas e íons entre membranas celulares, permitindo, por exemplo, a reciclagem de íons potássio nos fluidos cocleares(20). As alterações no gene GJB2 que resultam em mudanças na conformação da conexina 26 acabam por prejudicar não apenas a reciclagem dos íons de potássio na endolinfa coclear, mas também na troca de outros íons e pequenas moléculas.(22) O problema na reciclagem destes íons acaba acarretando o quadro clínico de perda auditiva neurossensorial, decorrente da falta da homeostase iônica da endolinfa, essencial para a audição normal (21). A principal alteração detectada no gene GJB2 corresponde a uma deleção de uma única base denominada c.35delG. Esta é a deleção de uma base nitrogenada guanina em uma sequência de 6 guaninas. A sua localização se dá na posição 35 do gene. A frequência da c.35delG, em algumas populações, chega a 4% (23,24). Na população europeia apresenta frequência maior até mesmo que a mutação causadora da fibrose cística na população dos países do mediterrâneo, a ΔF508 no gene CFTR. Estruturalmente falando, a alteração c.35delG ocorre no primeiro domínio intracitoplasmático (IC1) da Cx26, resultando em na troca do quadro de leitura dos códons (frameshift). Assim, no códon 12, o aminoácido Glicina é trocado por uma Valina, gerando um stop códon, resultando no término da tradução. Com esse término prematuro, é formado um peptídeo não funcional de apenas 12 aminoácidos, ao invés de 226 aminoácidos. No Brasil, a pesquisa dessa mutação em 620 recém-nascidos em uma cidade do interior do Estado de São Paulo revelou a presença de 6 heterozigotos, o que permitiu estimar uma frequência de aproximadamente(25).
Gene GJB6
O gene GJB6 está presente na região cromossômica 13q12 e codifica outra proteína da família das conexinas, denominada Conexina 30 (Cx30). Este gene apresenta 3 éxons, gerando um RNAm de 1.808 pb e uma proteína de 261 aminoácidos. Está localizado a aproximadamente 35 kb do gene GJB2(26).
Estima-se que 10-40% dos indivíduos com mutações no gene GJB2 apresentam a alteração em apenas um dos alelos. Sendo assim, na tentativa de justificar a perda auditiva nestes casos, pesquisadores espanhóis buscaram justificativas no gene GJB6, e detectaram casos de heterozigotos envolvendo os genes GJB2 e GJB6. Duas grandes deleções foram detectadas associadas à heterozigotos para mutação no gene GJB2, sendo elas: a del (GJB6- D13S1830), uma deleção de 342 kb relacionada a 50% dos casos de
heterozigotos para o gene GJB2 e a del(GJB6-D13S1854) de 232 kb de comprimento, com 25% dos casos (27,28).
Ainda não se sabe se estas grandes deleções associadas aos heterozigotos para GJB2 apresentam alto grau de complexidade de herança digênica ou se há a deleção de elementos regulatórios do gene GJB2, gerando a inativação deste(28–30).
De acordo com a literatura, outras alterações e grandes deleções no gene da Cx30 podem existir. Em outro estudo foi descrito o caso de um indivíduo que apresentou uma deleção de 920 kb no lócus DFNB1, removendo tanto o gene GJB6 quanto o GJB2. Em outro estudo, foi identificado uma nova deleção de 131,4 kb que apresenta ponto de quebra a mais de 100 kb dos genes GJB2 e GJB6, que foi encontrada em quatro indivíduos heterozigotos para a mutação c.35delG no gene GJB2.(31). Esta deleção resultou na redução do nível de expressão do RNA mensageiro dos genes próximos, sendo então associada a existência de alguma região regulatória que controle a expressão dos genes responsáveis pela codificação da Cx26 e Cx30. Levando em conta os dados mencionados, a pesquisa das deleções envolvendo o gene GJB6 está indicada principalmente em pacientes com perda auditiva que apresentam uma única mutação no gene GJB2.
Gene SLC26A4
O gene SLC26A4 tem sido apontado como o segundo principal causador de perda auditiva de origem genética. Ele está localizado no cromossomo 7q31.1 e possui 21 éxons, sendo 20 codificantes. A proteína codificada por este gene é a pendrina. Ela é composta de 780 aminoácidos, e é abundantemente expressa na tireóide, orelha interna e rim. Sua função é transportar ânions como iodeto, formiato, nitrato e bicarbonato (Everett et al., 1997; Scott et al., 1999). Estudos revelaram que a perda da secreção de bicarbonato na endolinfa, mediada pela pendrina, leva à acidificação do fluido e inibe a atividade de canais sensíveis a pH, resultando no aumento da concentração do íon cálcio no meio. A baixa concentração de Ca2+ na endolinfa da orelha interna é necessária para a audição normal e para o equilíbrio (32).
Foram descritas até o momento, 480 mutações neste gene (Human Gene Mutation Database. Disponível em: <www.hgmd.org>). Mutações nesse gene se apresentam com padrão de herança autossômico recessivo e podem estar envolvidas nos casos de DFNB4, caracterizada por surdez não-sindrômica associada com o aqueduto vestibular alargado
(AVA), ou nos casos de Síndrome de Pendred (SP), a forma mais comum de surdez sindrômica. Esta síndrome está tipicamente associada a um aumento do volume da glândula tireoide (bócio) e com malformações da orelha interna, que podem variar desde o alargamento do aqueduto vestibular à displasia de Mondini (31).
Gene OTOF
O gene OTOF está localizado no locus DFNB9, na região cromossômica 2p22-23, e codifica a proteína otoferlina (Chaib et al., 1996a; Yasunaga et al., 1999). Apresenta 48 éxons e codifica múltiplas isoformas da proteína, longas e curtas, por splicing alternativo combinado com o uso de vários sítios de iniciação transcricional (figura 4) (33).
A otoferlina é uma proteína citosólica ancorada à membrana por um segmento transmembrânico localizado próximo à região C-terminal. A isoforma longa apresenta 1997 aminoácidos e possui seis domínios C2. Esses domínios têm a capacidade de se ligar a cálcio e fosfolipídeos (Figura 3).
A otoferlina é expressa nas células ciliadas e está envolvida na liberação de vesículas contendo neurotransmissores nas terminações sinápticas das células ciliadas internas (24,33,34). Tem sido proposto que a otoferlina é um sensor-chave de íons cálcio, que está diretamente implicado na exocitose e modulação da fusão de vesículas sinápticas cálcio-dependentes. No entanto, a sua função exata nesse processo ainda não é bem compreendida (24,35).
Figura 3. Representação ilustrativa da estrutura da otoferlina (isoforma longa), evidenciando os seis domínios C2 (C2A-C2F). N: região N- terminal. TM: domínio transmembrânico. C: região C-terminal.
Figura 4. Esquema representativo da estrutura dos éxons e íntrons do gene da otoferlina (topo), destacando as regiões genômicas compreendidas entre os éxons 18-22 nas diferentes isoformas, em humanos e camundongos (abaixo). As regiões codificantes dos éxons estão representadas por retângulos pretos e as regiões não traduzidas estão representadas em branco (Adaptado de: Yasunaga et al., 2000).
Mutações no gene OTOF são responsáveis por um fenótipo bastante homogêneo de surdez não-sindrômica de herança autossômica recessiva (DFNB9), que consiste em perda auditiva pré-lingual, bilateral, severa a profunda, sem associação com malformações na orelha interna. E ainda, muitos indivíduos afetados apresentam neuropatia auditiva, caracterizada por função normal das células ciliadas externas e alteração na condução neural da via auditiva (34,36).
Atualmente já foram reportadas cerca de 110 variantes patogênicas nesse gene (HGMD. <Http://www.hgmd.org>). A maioria dessas mutações é particular, cada uma sendo relatada em apenas uma família. Entretanto, uma exceção notável é a p.Q829X (c.2485C>T), a mutação mais frequente identificada no gene OTOF e a terceira causa mais comum de perda auditiva não-sindrômica de herança autossômica recessiva, na população espanhola (37–39), sendo também identificada em dois franceses, um
mexicano, dois argentinos e em um paciente inglês (36,40,41). Porém, a mutação p.Q829X parece não ser uma causa frequente de surdez na população brasileira(8,42).
Gene PJVK / DFNB59
O gene PJVK também conhecido como DFNB59, está localizado na região 2q31.2. Abrange um total de 9.800 pb de sequência genômica, e é formado por 7 éxons. Este gene codifica uma proteína de 352 aminoácidos, denominada pejvaquina. O PJVK foi o primeiro gene implicado na perda auditiva não-sindrômica devido a um defeito neuronal. Ensaios de microscopia de imunofluorescência detectaram a pejvaquina no corpo celular de neurônios da via auditiva aferente (43). Avaliação audiológica de camundongos com mutações missense no gene DFNB59 indicaram que apenas os neurônios aferentes eram afetados, com manutenção da função das células ciliadas (43). Porém, analisaram outra mutação pontual nos dois alelos do gene e verificaram que havia disfunção tanto dos neurônios do gânglio espiral quanto das células ciliadas, indicando que alelos nulos da pejvaquina inativariam a função em ambas as células(44). Foi sugerido, que as mutações missense do estudo anterior representariam alelos hipomórficos que seletivamente afetariam a função apenas nos neurônios(44).
Já foram identificadas 13 mutações no gene DFNB59, sendo uma mutação em particular, a p.R183W, encontrada em quatro famílias com membros afetados, sendo três famílias iranianas com neuropatia auditiva, e uma família proveniente da Turquia com perda severa a profunda sem sinais de neuropatia auditiva, indicando comprometimento da função das células ciliadas. Essa diferença pode ser explicada por fatores genéticos ou ambientais não identificados que de algum modo atuam na função das células ciliadas (29,43).
1.4 PERDA AUDITIVA DE HERANÇA MATERNA
As deficiências auditivas causadas por mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) correspondem de 0,5% a 1% de todas as deficiências auditivas de origem genética. Algumas mutações são associadas à perda auditiva não-sindrômica, estando envolvidas em pelo menos 1% dos casos de surdez pré-lingual e em pelo menos 5% dos casos pós-linguais em caucasianos (45).
A primeira mutação a ser associada à surdez não-sindrômica foi a m.1555A>G no gene MTRNR1, descrita em uma grande família árabe-israelense. Essa mutação também
está associada à susceptibilidade à perda auditiva induzida por aminoglicosídeos, devido à semelhança entre a subunidade 12S rRNA humano que apresenta a mutação e seu homólogo, a subunidade 16S do rRNA bacteriano, o alvo destes antibióticos (46,47). A frequência da m.1555A>G foi estimada em 2% na população brasileira (48).
1.5 NEUROPATIA AUDITIVA
A neuropatia auditiva é uma condição que resulta na perda auditiva, a qual consiste na alteração na condução do estímulo auditivo por acometimento das células ciliadas internas, do nervo auditivo ou das sinapses entre eles. É caracterizada pela ausência ou alteração das ondas no exame de potenciais evocados auditivos de tronco encefálico com a presença de emissões otoacústicas e/ou microfonismo coclear (49). No entanto, com a idade, as emissões otoacústicas podem desaparecer, tornando difícil distinguir esta condição como perda auditiva não-sindrômica, o que pode levar a uma frequência subestimada da neuropatia auditiva. É responsável por 7-10% dos casos de surdez em crianças (49), podendo ser causada por uma série de fatores genéticos e ambientais, como hiperbilirrubinemia, prematuridade, anóxia, exposição a drogas ototóxicas, infecções, entre outros. Quanto à etiologia, estima-se que aproximadamente 42% dos casos sejam hereditários, 10% associados a fatores tóxicos, metabólicos, imunológicos e infecciosos (drogas ototóxicas, anóxia, hiperbilirrubinemia, desmielinização, infecções virais), e 48% idiopáticos (49,50).
A neuropatia auditiva pode estar associada a outros distúrbios (sindrômica), fazendo parte dos sinais clínicos de doenças neurodegenerativas sistêmicas, como a Síndrome de Charcot-Marie-Tooth, Ataxia de Friedreich, Neuropatia de Guillan Barrè e doenças mitocondriais, ou constituir um sinal clínico isolado (não-sindrômica) (39). Diante das características peculiares dos pacientes com neuropatia auditiva, o tratamento desses indivíduos é um desafio. Há grande necessidade em conhecer melhor a fisiopatologia dessa doença, e os estudos voltados para avaliação genética e molecular podem oferecer importante colaboração. Na última década, a identificação de genes responsáveis pela neuropatia auditiva teve grande contribuição para o diagnóstico e melhor entendimento dos mecanismos envolvidos com a doença.
O gene OTOF, que codifica a otoferlina, é um dos 40 genes associados à perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva (34). Ele está localizado no locus DFNB9,
na região cromossômica 2p22-23 (Chaib et al., 1996). O gene que contém 48 éxons codifica múltiplas isoformas de proteínas, longas e curtas, por splicing alternativo combinado com o uso de vários sítios de iniciação transcricional (33). A otoferlina é expressa na cóclea, vestíbulo e cérebro (33,34),e está envolvida na exocitose das vesículas sinápticas das células ciliadas internas (24). Mutações no gene OTOF são responsáveis por um fenótipo bastante homogêneo de perda auditiva profunda pré-lingual, sem a associação de malformações na orelha interna. E ainda, muitos indivíduos afetados apresentam neuropatia auditiva (38). Até o momento, foram descritas 43 mutações patogênicas diferentes no gene OTOF em indivíduos com surdez não-sindrômica autossômica recessiva, em populações de origens variadas (39,42).
A maioria dessas mutações é particular, cada uma sendo relatada em apenas uma família. Porém existe uma exceção, a p.Q829X (c.2485C>T), a mutação mais frequente identificada no gene OTOF e a terceira causa mais comum de perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva, na população espanhola (37–39), sendo também identificada em 2 franceses, 1 mexicano, 2 argentinos e em 1 paciente inglês (36,40,41). Com tais parâmetros, é sugerido incluir tal alteração na triagem laboratorial da perda auditiva prélingual (37). Porém, essa alteração não é uma causa frequente de surdez na população brasileira (8,42,51). Em 2004, foi mapeado em uma família americana mais um locus, AUNA1, na região cromossômica 13q21-q24, associado à neuropatia auditiva pós-lingual de herança autossômica dominante, sendo o gene correspondente, DIAPH3, identificado posteriormente(47).
Em 2006, Wang e colaboradores, mapearam um novo locus relacionado à neuropatia auditiva (AUNX1), com padrão herança ligada ao cromossomo X, na região Xq23-q27.3, em uma família chinesa(52). Entretanto o gene correspondente não foi identificado até o momento.
Por sua vez, o gene PJVK (DFNB59) foi associados à neuropatia de herança autossômica recessiva. Este gene está localizado na região cromossômica 2q31.1-q31.3 e codifica a pejvaquina, uma proteína da via auditiva aferente envolvida na sinalização de células ciliadas e neurônios(43).Mutações nesse gene não foram observadas em pacientes brasileiros, mas no gene OTOF diversas mutações diferentes já foram relatadas(42).
Além disso, mutações no gene da conexina 26 (GJB2) também já foram relacionadas à neuropatia auditiva. Recentemente, três estudos diferentes identificaram
casos com neuropatia auditiva dentre indivíduos com perda auditiva que apresentavam mutações no gene GJB2(39,53,54).
1.6 JUSTIFICATIVA DO TRABALHO
A deficiência auditiva sensorioneural é dos defeitos sensoriais, o mais comum. Se apresenta com grande diversidade etiológica, além do fato do ouvido interno ser inacessível a procedimentos diagnósticos discriminantes. A surdez de origem genética é extremamente heterogênea. A perda auditiva na infância ocasiona importantes retardos no desenvolvimento de linguagem, comprometendo a comunicação, cognição, relacionamento, sociabilidade, emotividade, aprendizagem, realizações acadêmicas e as oportunidades vocacionais.
O estabelecimento de um diagnóstico genético da perda auditiva torna possível o aconselhamento preciso sobre as chances de recorrência da perda auditiva em uma próxima gestação e fornece informações de prognóstico. Além disso, a identificação precoce de mutações específicas, por meio do diagnóstico molecular, diminui a necessidade de outros testes clínicos, e facilita as previsões quanto à progressão da perda auditiva e de outras alterações, no caso da surdez sindrômica.
O diagnóstico precoce de alterações auditivas e a intervenção iniciada até os seis meses de idade garantem à criança o desenvolvimento da compreensão e da expressão da linguagem, bem como o seu desenvolvimento social, comparável com crianças normais da mesma faixa etária. Adicionalmente, as crianças com perda auditiva que são adequadamente tratadas antes dessa idade demonstram vantagem significativa no desenvolvimento das habilidades de comunicação, quando comparadas a crianças com potencial cognitivo semelhante, mas que foram identificadas tardiamente.A triagem auditiva neonatal universal tem sido recomendada como principal estratégia para diminuir a idade em que o diagnóstico é realizado.O próximo teste recomendado em bebês com perda auditiva severa a profunda, diagnosticados por meio de testes clínicos, é o rastreamento de mutações do lócus DFNB1. A análise molecular deve incluir o rastreamento de mutações no gene GJB2, já que este gene está envolvido em cerca de metade de todos os casos de perda auditiva genética, e o rastreamento das duas grandes deleções contidas no gene GJB6, que também contribuem com uma porcentagem significativa nos casos de perda auditiva (15).
A identificação de alterações genéticas responsáveis pela neuropatia auditiva pode contribuir para uma melhor compreensão das bases moleculares e dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos diferentes fenótipos da perda auditiva. A utilização de ferramentas moleculares, que permitem um diagnóstico rápido e eficaz, é de grande interesse para o prognóstico e tratamento desses pacientes. Assim, testes genéticos em conjunto com exames clínicos e audiológicos permitem um diagnóstico preciso, desenvolvimento de tratamentos mais específicos e aconselhamento genético dos pacientes e/ou das famílias. Apesar de existirem estudos moleculares relacionados à neuropatia auditiva em diferentes populações, a população brasileira é uma das mais heterogêneas do mundo e, portanto, é necessária uma maior investigação para estabelecer o envolvimento de alterações genéticas com a etiologia da neuropatia auditiva em indivíduos brasileiros.
2
OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo do presente estudo é pesquisar alterações moleculares em pacientes com diagnóstico clínico de neuropatia auditiva em uma amostra de pacientes brasileiros.
2.2 Objetivos específicos
- Investigar a presença da mutação c.35delG e outras alterações no gene GJB2, das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6, e da mutação mitocondrial m.1555A>G no gene MTRNR1.
- Determinar a frequência de mutações do gene OTOF e PJVK em uma amostra de indivíduos brasileiros com neuropatia auditiva;
3
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 CASUÍSTICAInicialmente, foram coletadas amostras de 40 pacientes atendidos no Ambulatório de Otorrinolaringologia do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (HC – UNICAMP) e com diagnóstico clínico de neuropatia auditiva resultante da ausência ou alteração das ondas no exame de potenciais evocados auditivos de tronco encefálico, com a presença de emissões otoacústicas e/ou microfonismo coclear. Dentre estes, foram selecionados aqueles que possuíam avaliação audiológica, incluindo audiometria tonal e vocal, impedanciometria, emissões otoacústicas e potenciais evocados auditivos de tronco encefálico e que concordaram em participar do estudo.
Os pacientes que apresentaram ausência ou alteração das ondas no exame de potenciais evocados auditivos de tronco encefálico, com a presença de emissões otoacústicas e/ou microfonismo coclear foram diagnosticados clinicamente com neuropatia auditiva.
Após a avaliação clínica, foram coletadas amostras de sangue de cada paciente e encaminhadas diretamente ao Laboratório de Genética Molecular Humana do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), da UNICAMP, onde foram realizados os exames genéticos.
Foram excluídos deste estudo os pacientes que apresentaram alterações neurológicas (neuropatia periférica) ou fatores de risco para neuropatia auditiva, como tóxico-metabólicos (anóxia e hiperbilirrubinemia), imunológicos, infecciosos (STORCH), entre outros.
Todos os pacientes incluídos nesta amostra tiveram sua participação previamente autorizada, mediante assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, após terem recebido esclarecimento sobre o estudo que foi realizado. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciencias Médicas da UNICAMP, sob No 396/2006.
3.2 ESTUDO MOLECULAR
3.2.1 Extração do DNA genômico de sangue periférico
A extração do DNA genômico foi realizada a partir de leucócitos obtidos em 10 a 15 mL de sangue periférico coletado em tubos tipo Vacutainer contendo anticoagulante
EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético dissódico 2H2O 0,5 M pH 8,0). Foi empregado o método de extração com fenol e clorofórmio, de acordo com o protocolo adaptado no Laboratório de Genética Molecular Humana do CBMEG.
Inicialmente, em um tubo tipo Falcon de 50 mL, foram adicionados 35 mL de Solução A (Triton-X 100 a 1%; MgCl2 5 mM; Sacarose 0,32 M; Tris-HCl 10 mM pH 8,0) ao sangue coletado, para lise das hemácias. Após ser homogeneizado, o material foi mantido em gelo por 30 min.
Então, os tubos foram centrifugados a 2.000 rpm, por 15 min, a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado (pellet) foi ressuspendido em 35 mL de Solução A. Este último procedimento foi repetido até a obtenção de um pellet de coloração clara, livre de hemácias.
Posteriormente, foi adicionado 1 mL da solução B 1X (EDTA 20 mM; NaCl 20 mM; Tris-HCl 20 mM pH 8,0) e 250 μL de solução C (para 1 mL de solução C: 0,5 mL de solução B 1X, 1 mg de Proteinase K [Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemanha] e 0,5 mL de SDS 10%). O material foi incubado em banho-maria a 56°C por aproximadamente 2 horas, ou em alguns casos, a 37°C por 18 horas.
Após a incubação, foi iniciada a etapa de purificação do DNA genômico com fenol-clorofórmio. Foram adicionados 2 mL de TE 1X (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e quantidade suficiente de fenol (Merck, Darmstadt, Alemanha) saturado com Tris-HCl 10 mM pH 8,0 até dobrar o volume da amostra. Foi realizada a homogeneização por inversão lenta dos tubos durante 5 minutos.
Para a separação e recuperação da fase aquosa (sobrenadante), os tubos foram centrifugado a 2.500 rpm, por 15 minutos, à temperatura ambiente. O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi passado para um tubo tipo Falcon de 15 mL. O procedimento foi repetido por duas vezes, primeiro substituindo o fenol por solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1; v:v:v) e por último com solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1; v:v) (Merck, Darmstadt, Alemanha).
Para a precipitação do DNA, foi acrescentado 0,1 do volume da amostra de acetato de sódio 3 M pH 5,5 e 2,5 volumes de etanol absoluto (Merck, Darmstadt, Alemanha) gelado. O DNA foi capturado com auxílio de uma haste plástica esterilizada e algumas gotas de etanol 70% foram adicionadas para a retirada do excesso de sal. Após 30 minutos de secagem, as hastes foram colocadas em tubos tipo Eppendorf de 1,5 mL e as amostras foram ressuspendidas em um volume de 200 μL de TE 1X.
3.2.2 Triagem de mutações nos principais genes envolvidos na surdez não-sindrômica
Rastreamento da mutação c.35delG no gene GJB2
A mutação c.35delG no gene GJB2 foi rastreada pela técnica de PCR alelo específico. Os primers normal (NOR) e mutante (MUT) foram utilizados, em reações diferentes, para amplificar os alelos sem e com a mutação, respectivamente. O primer comum (COM) foi usado como primer reverso. Com essas duas reações (NOR e MUT) é possível identificar cada indivíduo como sendo homozigoto normal, homozigoto mutante ou heterozigoto para a mutação c.35delG. Os primers A e B foram usados como controles internos de amplificação para as reações. Esta técnica foi desenvolvida no Laboratório de Genética Molecular Humana do CBMEG, a qual se encontra patenteada (Patente NºP10005340-6; Método de teste para surdez de origem genética – UNICAMP, 2002).
Rastreamento de mutações no gene GJB2 por sequenciamento automático
3.2.2.2.1 Amplificação do gene GJB2
O éxon codificante do gene GJB2, com 681 pb, foi dividido para a amplificação pela técnica de PCR, de acordo com as condições previamente descritas por (30,41). As sequências dos primers e o tamanho dos fragmentos resultantes são mostrados na Tabela 5.
Tabela 4. Sequências dos primers utilizados para a amplificação do gene GJB2 e tamanho dos fragmentos gerados.
Par Primers 5’ 3’ Tamanho (pb)
1 Cx1F – CTC CCT GTT CTG TCC TAG
Cx1R – GAC ACG AAG ATC AGC TGC
284
2 Cx2F – GCT ACG ATC ACT ACT TCC C
Cx2R – GGT TGC CTC ATC CCT C
Para um volume de 50 μL de reação, foram utilizados: 200 a 500 ng de DNA genômico, 200μM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 20 pmol de cada primer (direto e reverso), 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase em Tampão de PCR 10X (Tris-HCl 10mM pH 8,8), 25 mM de MgCl2, completando com água até o volume final.
As amplificações foram realizadas em aparelho termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems), sendo realizados 30 ciclos de aquecimento a 94°C para a desnaturação do DNA, seguido da temperatura de 60°C para o anelamento dos primers, e então de 72°C para a extensão das novas fitas. As condições da PCR estão resumidas na figura 16.
Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de agarose 1%, após coloração com brometo de etídio (Sigma). Os fragmentos do gene foram amplificados para posterior rastreamento de mutações por sequenciamento.
Figura 5. Ciclos utilizados na amplificação do gene GJB2.
3.2.2.2.2 Purificação dos produtos de PCR
Os fragmentos amplificados pela técnica de PCR foram purificados utilizando-se o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega Corporation, EUA). Após a purificação, a quantidade e a pureza das amostras de DNA foram determinadas por densidade óptica em espectrofotômetro NanoDrop® ND-8000 (Thermo Scientific).
As reações de sequenciamento foram realizadas no sequenciador automático ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer utilizando-se o BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem, EUA), de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Para o preparo das reações foram utilizados:
40-80ng de DNA 2μL do mix BigDye
1μL do primer direto ou reverso (5pmol/μL) H2O deionizada para completar 10μL
As condições de amplificação estão especificadas na figura 6
Figura 6. Ciclos de amplificação para posterior sequenciamento do gene GJB2.
Após a amplificação, as reações de sequenciamento foram purificadas. Primeiramente foram adicionados 2,5 μL de EDTA 125 mM e 25 μL de etanol 100%, após 15 min de incubação à temperatura ambiente (protegido da luz), a placa foi centrifugada por 45 min a 3.700 rpm (4°C). O etanol foi descartado e, posteriormente, foram adicionados 30 μL de etanol 70%. Foi realizada uma nova centrifugação, por 10 min a 3.700 rpm, sendo o etanol novamente descartado. Antes da colocação da placa no sequenciador, foram adicionados 10 μL de formamida seguida de homogeneização e centrifugação rápida. A amostra foi desnaturada (5 min a 95 ºC) e em seguida colocada no gelo por 10min.
3.2.2.2.4 Análise das sequências obtidas
As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com as sequências normais dos genes, com o auxílio dos programas Chromas Lite® (http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html) e CLC Sequence Viewer 6.1 (CLC bio A/S).
Rastreamento da mutação IVS1+1G>A no gene GJB2
A mutação IVS1+1G>A foi rastreada pela técnica de RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorfism). Para amplificação foram utilizadas as condições previamente descritas por Denoyelle et al.(1999) com o par de primers Cx26Ex1 F (5’ TCC GTA ACT TTC CCA GTC TCC GAG GGA AGA GG – 3’) e Cx26Ex1 R (5’ -CCCAAG GAC GTG TGT TGG TCC AGC CCC – 3’).Para um volume final de 50 μL, foram utilizados: 200 a 500 ng de DNA genômico,200 μM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 20 pmol de cada primer (direto e reverso), 2,5 U de enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen, Brasil) em tampão de PCR 10X (Tris-HCL 10 mM pH 8,8), 1,5 mM de MgCl2, 2,5 μL de DMSO, completando com água até o volume final. As amplificações foram realizadas em aparelho termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems). O ciclo utilizado foi o apresentado na figura 7 abaixo.
Após a amplificação pela técnica de PCR, foram gerados fragmentos de 361 pb. Posteriormente, os produtos de amplificação foram submetidos à análise de restrição utilizando a enzima Hph I (Invitrogen) por 3 horas a 37ºC. Para o preparo da reação de digestão foram utilizados: 17,5 μL do produto de PCR, 2,0 μL do tampão da enzima e 0,5
μL da enzima Hph I (5000U/μL). Para análise dos produtos gerados, os fragmentos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1,5%, corados e visualizados sob luz ultravioleta. Em indivíduos que não são portadores da mutação IVS1+1G>A são gerados 2 fragmentos: um de 117pb e outro de 244pb. Em indivíduos portadores da mutação, um dos sítios de restrição é abolido, sendo gerado apenas um fragmento de 361 pb. Para confirmar a presença da mutação, os produtos de PCR dos pacientes portadores da mutação IVS1+1G>A foram sequenciados utilizando os mesmos primers usados na PCR. A reação de sequenciamento e análise das sequências obtidas seguiram o protocolo já descrito acima.
3.2.2.4. Rastreamento das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6
A análise das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) foi realizada de acordo com os protocolos previamente descritos por (55).O rastreamento das mutações foi realizado através de uma PCR multiplex, que investiga a presença de ambas as deleções em apenas uma reação. As sequências dos primers e o tamanho dos fragmentos resultantes são mostrados na Tabela 6. Os fragmentos de DNA resultantes da amplificação contêm os pontos de quebra de ambas as deleções, assim como um segmento do éxon 1 do gene GJB6, que é usado como controle para checar a eficiência da reação e distinguir os alelos heterozigotos e homozigotos para qualquer uma das duas deleções.
Tabela 5. Sequências dos primers utilizados na triagem das deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) e tamanho dos fragmentos gerados.
