i
CAROLINA CINTRA GOMES
“O EFEITO DA RADIAÇÃO X E DO ALENDRONATO DE
SÓDIO NA MICROARQUITETURA ÓSSEA E NO REPARO
ÓSSEO DE RATAS COM DEFICIÊNCIA DE ESTROGÊNIO”
PIRACICABA 2013
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
CAROLINA CINTRA GOMES
“O EFEITO DA RADIAÇÃO X E DO ALENDRONATO DE
SÓDIO NA MICROARQUITETURA ÓSSEA E NO REPARO
ÓSSEO DE RATAS COM DEFICIÊNCIA DE ESTROGÊNIO”
Orientadora: Professora Doutora Solange Maria de Almeida.
Este exemplar corresponde à versão final da Tese defendida pela aluna Carolina Cintra Gomes e orientada pela Prof.ª Dra. Solange Maria de Almeida. ____________________________________
Assinatura da Orientadora
PIRACICABA 2013
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA À FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM RADIOLOGIA ODONTOLÓGICA NA ÁREA DE RADIOLOGIA ODONTOLÓGICA.
iv
G585e
Gomes, Carolina Cintra, 1979-
O efeito da radiação X e do alendronato de sódio na microarquitetura óssea e no reparo ósseo de ratas com
deficiência de estrogênio / Carolina Cintra Gomes. -- Piracicaba, SP : [s.n.], 2013.
Orientador: Solange Maria de Almeida.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
1. Ovariectomia. 2. Raios X. 3. Ossos. I. Almeida, Solange Maria de, 1959- II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III.
Título.
Informações para a Biblioteca Digital
Título em Inglês: X-ray effects and sodium alendronate on bone
microarchitecture and bone repair in rats with estrogen deficiency
Palavras-chave em Inglês: Ovariectomy, X-rays, Bone Área de concentração: Radiologia Odontológica
Titulação: Doutora em Radiologia Odontológica
Banca examinadora:
Solange Maria de Almeida [Orientador] Adriana Dibo da Cruz
Plauto Christopher Aranha Watanabe Solange Aparecida Caldeira Monteiro Rívea Inês Ferreira.
Data da defesa: 03-05-2013
vi
Dedico esse trabalho a Deus, razão de
tudo, e aos meus pais, Aristóteles e Madalena,
pelo amor incondicional, sempre me apoiando e
realizando meus sonhos.
vii
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa do seu diretor Prof. Dr.
Jacks Jorge Junior, por ter oferecido a oportunidade de conhecer e conviver com
profissionais renomados em suas áreas.
À minha querida Orientadora Prof.ª Dra. Solange Maria de Almeida, obrigada
pela oportunidade de conviver com uma profissional generosa que está sempre pronta a
ensinar o que sabe e a mostrar o melhor caminho a seguir. Não tenho palavras para
agradecer seu incentivo, respeito e confiança! Foi uma honra lhe ter como minha
professora e orientadora!
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.” (
Cora Coralina)Ao Prof. Dr. Frab Norberto Bóscolo, que me fez muitas vezes voar em sua
sabedoria, e me mostrou o valor do aprender com sua experiência. Sou uma pessoa
privilegiada por ter um professor tão competente ao meu lado! Obrigada pelo carinho e
atenção!
Ao Prof. Dr. Francisco Haiter Neto, agradeço por tudo o que me ensinou.
À Prof.ª Dra. Deborah Queiroz, pela atenção, carinho e amizade! Obrigada pelos
conselhos, ensinamentos e a delicadeza ao me receber em sua sala! Você não imagina como
fico feliz de lhe ter como minha professora!
Ao Prof. Dr. Pedro Duarte, por todas as orientações e considerações durante a
execução desse trabalho!
viii
anjo-da-guarda sempre! Muito Obrigada!
Ao Prof. Dr. Danyel Perez, pessoa que admiro pelo profissionalismo e competência,
agradeço pela gentileza em participar e poder contribuir com esse momento!
Ao Prof. Dr. Marcelo Marques, obrigada pelas orientações e contribuição nesse
trabalho!
À Prof.ª Dra. Juliana Neves, obrigada pelo auxílio com a Histologia e as
considerações na qualificação! Agradeço também pelos conselhos, pelo carinho e amizade!
À Prof.ª Dra. Rívea Inês, pelo carinho e atenção, sempre pronta para contribuir
com suas sugestões e conselhos!
Ao Prof. Dr. Sérgio Lúcio, ainda me lembro do dia em que eu entrava no mestrado
e assisti sua tese de doutorado. Ali nasceu a admiração por uma pessoa tão competente e
especial! Obrigada!
ix
Meu Deus, obrigada pelo seu amor, pela sua presença constante em todos os
momentos dessa caminhada. Obrigada por me mostrar o melhor caminho a seguir, por
nunca me deixar desistir, por estar sempre pronto para me ouvir! Sem o seu amor nada
seria possível!
Pai, Mãe, obrigada pela dedicação, carinho, renúncia, esforço e incentivo durante
toda a minha vida e principalmente nesses anos que passei em Piracicaba! A saudade
muitas vezes apertou, mas fossem quais fossem os obstáculos vocês sempre me
incentivaram a prosseguir, e lutaram comigo... Sou o que sou à custa dos seus sacrifícios!
Amo muito vocês!
Ao Marcelo, meu marido, obrigada pelo amor, atenção e carinho. Você foi um
presente que recebi no início do doutorado; e nesse período namoramos nos casamos e hoje
somos uma família! Obrigada por fazer parte desse tempo de forma tão especial!
Cristiana e Camila, irmãzinhas do meu coração, obrigada por acreditarem em mim!
Obrigada também por me acharem “inteligente”, sei que não é bem assim, mas isso sempre
serviu como incentivo!!! Amo vocês!
Vó Therezinha, nesse período a senhora nos deixou, mas sempre estará no meu
coração! Obrigada por tudo que me ensinou e o amor incondicional da melhor avó que eu
poderia ter! Te amarei sempre!
Lucas e Laís, vocês queridos sobrinhos, são bênçãos de Deus que transformam a
minha vida e me ensinam a grandeza do amor!
x
confiança! Didi, sem você tudo seria bem mais difícil!
Menê, obrigada por me ajudar em todos os momentos que preciso! Com certeza você
não é só meu cunhado, mas um amigo que sempre posso contar!
Sabrina e Rafael, amigos de Goiânia, obrigada pela amizade, pelo carinho e por ter
me dado a Helena como afilhada!
A todos os parentes e amigos que estiveram sempre disponíveis quando meu tempo
era tão limitado... que se acostumaram com os meus “Parabéns” atrasados, que aceitaram
tantos “não vou poder ir”...Obrigada pela compreensão e carinho!
Aos meus colegas Daniela Brait e Matheus, agradeço pelo convívio e pela amizade
durante toda a Pós-Graduação. Vocês são pessoas muito especiais que vou guardar sempre
no meu coração.
Às minhas amigas, Giu, Lucinha e Marina que tornaram meu período em
Piracicaba simplesmente inesquecível! Vocês estarão sempre no meu coração!
À minha madrinha Débora que sempre me encantou com sua alegria e que hoje
admiro mais ainda pela força, fé em Deus e gratidão à vida!
Aos meus amigos, Fred, Monikelly, Débora, Carla Klamt, Bia, Amanda, Laura,
Manuela, Gabriela, Luana, Anne e Saulo que quando chegaram a Piracicaba trouxeram o
verdadeiro sentido da amizade, e hoje com algumas ausências, parte da alegria de uma
turma inesquecível já faz bastante falta! Desejo muito sucesso a cada um de vocês!!!
xi
já sabia que o mundo poderia ser pequeno para uma pessoa de um coração tão grande, tão
esforçada e inteligente como você! Tenho certeza do seu sucesso!!!
Aos amigos mais novinhos, Philipe, Amaro, Thiago, Yuri, Gina, Liana, Carol,
Sayone, Taruska, Débora e Karla, obrigada pelo respeito e carinho com o doutorado
idoso... rsrs!
Ao Saulo, um verdadeiro amigo... Já sinto saudade dos nossos almoços, e lanches
no “Assagio”, nossas conversas, sua companhia sempre agradável, pela paciência ao ouvir
meus desabafos... Estarei sempre torcendo por você Sausalito!!!
Ao Adalberto, Débora, Laura, Amanda, Anne, Carla Klamt, Bia, Karla Faria e a
todos os colegas e amigos que tanto me auxiliaram na execução desse trabalho. Muito
Obrigada!!!
Aos meus amigos Fernando e Waldeck, meu respeito e gratidão por tudo o que
fizeram por mim! Vocês são exemplos de dedicação e seriedade com a profissão! Se hoje sou
apaixonada pela Clínica, devo isso a vocês!
À Luciane, pessoa e profissional invejável pela sua seriedade, organização e
capacidade de atender a todos com tanto carinho! Obrigada!
À Cidinha, à Ana, ao Adriano, à Eliene, obrigada por me permitirem entrar e
aprender tanto nesse mundo da Histologia que me parecia tão desconhecido! Sem vocês
esse trabalho não seria possível!
À Giselda, à Lú, à Vanessa, ao Jonathan e aos demais funcionários da FOP
obrigada pelo bom dia, pela organização da Clínica, pela limpeza da faculdade, pelos
xii
Ao Hospital dos Fornecedores de Cana de Piracicaba, em especial à Li, onde tive a
oportunidade de trabalhar e conhecer um pouquinho do universo da radioterapia meus
mais sinceros agradecimentos.
Ao Dr.Ricardo, engenheiro de materiais e técnico da Skyscan, obrigada por me
ensinar um pouquinho sobre à micro-CT e pela paciência e disponibilidade de me atender!
Aos pacientes que me respeitaram quando pouco poderia fazer e na humildade me
confiaram segredos e sofrimentos e, enfim, me ensinaram a ter paciência, respeito,
humildade para que hoje pudesse ser uma profissional melhor. Muito obrigada!
xiii
"A educação é a arma mais poderosa que
você pode usar para mudar o mundo”
xiv
de 15 Gy de radiação X no processo de reparação tecidual de defeitos ósseos e na microarquitetura óssea em ratas com deficiência de estrogênio. Foram utilizadas quarenta ratas (Rattus Norvegicus, Albinus Wistar), adultas, com idade de 90 dias. Os animais foram divididos aleatoriamente nos seguintes grupos: Controle ovariectomizado, Ovariectomizado / Alendronato, Ovariectomizado / Irradiado, Ovariectomizado / Alendronato / Irradiado. O alendronato (5 mg/kg corpóreo) foi administrado durante quatro semanas nos grupos Ovariectomizado / Alendronato e Ovariectomizado / Alendronato/ Irradiado. Doze dias após a terapêutica com alendronato de sódio um defeito ósseo foi confeccionado na tíbia esquerda dos animais. Três dias após, os grupos Ovariectomizado /Irradiado e Ovariectomizado / Alendronato / Irradiado tiveram os membros posteriores irradiados com 15 Gy de radiação X. As eutanásias ocorreram 10 e 33 dias após a confecção dos defeitos ósseos. O reparo ósseo foi analisado por histomorfometria e a microarquitetura óssea analisada por micro-TC. Em relação ao processo de reparação tecidual dos defeitos ósseos, a radiação X e o alendronato não apresentaram efeitos significativos (p > 0,05). Em relação à microarquitetura óssea, a radiação X aumentou a espessura da cortical óssea no tempo de 10 dias (p < 0,05); e no tempo de 33 dias, diminuiu o número de trabéculas por unidade de comprimento e aumentou a distância média entre as trabéculas (p < 0,05); o alendronato de sódio inibiu o efeito deletério da radiação X evitando o aumento da distância entre as trabéculas e a redução do número de trabéculas por unidade de comprimento no tempo de trinta e três dias (p < 0,05). Nessas condições experimentais conclui-se que a radiação X apresentou um efeito deletério sobre a microarquitetura óssea e o alendronato de sódio preservou o tecido ósseo submetido à radiação X.
xv
in the process of tissue repair of bone defects, artificially produced in estrogen-compromised rats irradiated with 15 Gy. We selected forty female adults rats (Rattus norvegicus, Wistar Albinus), aged 90 days. The animals were randomly divided into the following groups: ovariectomized; ovariectomized-alendronate; ovariectomized-irradiated; and ovariectomized-alendronate-irradiated. Sodium alendronate (5 mg/kg) was administered three times a week, for four weeks, in ovariectomized-alendronate and ovariectomized-alendronate-irradiated groups. Twelve days after the end of treatment with alendronate, a bone defect was created in animals' left tibia. Three days later, the posterior legs of ovariectomized-irradiated and ovariectomized-alendronate-ovariectomized-irradiated group animals were ovariectomized-irradiated with 15 Gy. The euthanasias occurred 10 and 33 days after bone defects creation. The presence of bone repair was analyzed by histomorphometry, and the bone microarchitecture was analyzed by micro computed tomography. In relationship to the process of tissue repair on osseous defects, the X radiation and the alendronate do not represent significant effects (p > 0,05). In relationship to the osseous microstructure, the X radiation increased the thickness of the cortical bone in the time of 10 days (p < 0,05); decreased the number of trabeculae per unit of length and increased the medium distance between the trabeculae in the time of 33 days (p < 0,05); the sodium alendronate inhibited the deleterious effect of the X radiation avoiding the increase in distance between the trabeculae and reduced the number of trabeculae per unit of length in the time of 33 days (p < 0,05). In these experimental conditions it is concluded that the radiation X had a deleterious effect on bone microarchitecture and alendronate sodium preserved bone tissue subjected to the radiation X.
xvi 2. REVISÃO DA LITERATURA 5 3. PROPOSIÇÃO 24 4. MATERIAL E MÉTODOS 25 5. RESULTADOS 45 6. DISCUSSÃO 53 7. CONCLUSÃO 60 REFERÊNCIAS 61 ANEXO 68
1
1 INTRODUÇÃO
A osteoporose é a patologia óssea metabólica mais frequente, e tem sido considerada um grave problema de saúde pública, sendo uma das mais importantes doenças associadas ao envelhecimento (Ström et al., 2011). A osteoporose pós-menopausa, uma das classificações da osteoporose, acomete milhões de mulheres em todo o mundo, e resulta em perda de massa óssea e alterações na microarquitetura do osso, as quais levam a redução da resistência desse tecido.
As alterações na microarquitetura do tecido ósseo podem influenciar na resistência do mesmo, e nem sempre podem ser observadas por meio de medições da densidade óssea mineral. Em relação ao osso esponjoso, o número, a espessura, a conectividade e a distância entre as trabéculas influenciam na resistência óssea. No osso cortical, a espessura, a área e a porosidade desse tecido são os principais determinantes. Embora algumas dessas características arquitetônicas possam ser avaliadas em cortes histológicos de espécimes provenientes de biópsias ósseas, utilizando abordagens bidimensionais, métodos mais atuais permitem a visualização tridimensional e a quantificação desses parâmetros (Compston, 2006). A micro tomografia computadorizada (micro-TC) é uma tecnologia de imagem que permite a análise tridimensional de amostras inteiras, sem a necessidade de danificá-las, podendo ser utilizada em várias resoluções de acordo com a região de interesse. Por meio da micro-TC é possível se obter análises qualitativas e quantitativas que determinam parâmetros como, por exemplo, a densidade mineral óssea, a análise da microarquitetura do osso cortical e esponjoso e a quantidade de hidroxiapatita por unidade de volume (mgHA / cc), dependendo do aparelho (Vasquez et al., 2013).
A osteoporose pós-menopausa é uma das complicações clássicas da menopausa, estando associada à deficiência de estrogênio. Ela é definida como um estado do esqueleto caracterizado pela diminuição da resistência óssea com o
2
aumento do risco de fratura. Em pesquisas sobre osteoporose pós-menopausa, a remoção dos ovários (ovariectomia) de ratas é um método bem estabelecido (Wronski et. al.,1989, Kalu, 1991, Laib et. al., 2001). A ovariectomia induz a depleção de estrogênio e consequentemente a osteoporose. Com essa técnica, a perda óssea relacionada com a osteoporose tem sido frequentemente investigada em tíbias de ratos (Waarsing et al., 2004; Boyd et al., 2006; Brouwers et al., 2008). Assim como o período pós-menopausa, outros fatores de risco estão associados ao desenvolvimento dessa doença, como: idade, hereditariedade, raça branca, tabagismo, alcoolismo, sedentarismo, baixa ingestão de cálcio, alta ingestão de sódio e proteína animal. A exposição à radiação ionizante também está relacionada ao desenvolvimento de alterações ósseas semelhantes às observadas na osteoporose. A exposição das células à radiação ionizante gera íons de oxigênio/nitrogênio reativos pela ionização das moléculas alvo e por excitação para o estado redox celular (Varanasi et al., 1999; Kondo et al., 2010).
A produção de íons de oxigênio/nitrogênio reativos causa dano oxidativo ao DNA, lípidios e proteínas que influenciam funções celulares essenciais, incluindo a proliferação, a diferenciação e a apoptose. A radiação ionizante de baixa energia linear de transferência (raios gama, raios X) em altas doses cumulativas (>200 cGy) pode comprometer a vascularização (osteorradionecrose), levando à perda de cortical e tecido esponjoso provocando a fragilidade esquelética e eventualmente a osteoradionecrose (Nishiyama et al., 1992). Os efeitos adversos de doses mais baixas (100-200 cGy) aparecem limitados ao tecido esponjoso em modelos animais (Hamilton et al., 2006; Kondo
et al., 2009; Willey et al., 2008; Kondo et al., 2010).
A osteoporose é uma doença crônica que requer suporte em longo prazo, na ausência de um tratamento verdadeiramente curativo. De fato, as terapias atualmente disponíveis podem na melhor das hipóteses reduzir a incidência de fraturas em cerca de 50%, especialmente na região da coluna vertebral, mas não
3
tratam definitivamente o indivíduo. A avaliação do risco de fratura, baseado na combinação de medição densitométrica e predisposição junto aos fatores de risco, é um pré-requisito para saber se há necessidade de se buscar algum tipo de tratamento (Trémollières, 2012).
Como tratamento para a osteoporose, os bisfosfonatos têm sido utilizados como agentes antiosteoclásticos. Esses compostos sintéticos são caracterizados por um grupo fósforo-carbono-fósforo, análogos de pirofosfato inorgânico. Os bisfosfonatos são utilizados na Medicina, principalmente para inibir a reabsorção óssea em doenças como a osteoporose, doença de Paget e tumor ósseo. Estes compostos apresentam um efeito celular envolvendo tanto a apoptose quanto a destruição do citoesqueleto dos osteoclastos, induzindo uma diminuição da atividade osteoclástica (Drake et al., 2008).
O alendronato de sódio (4-amino-1-hidroxibutilideno-1, 1- ácido bifosfônico, sódio tri-hidratado), é um potente bisfosfonato do grupo amino, utilizado no tratamento de osteoporose e outros distúrbios esqueléticos (Rodan et
al.,1993 ; Adami et al.,1994).
Em mulheres pós-menopausa com osteoporose, doses diárias de alendronato, por via oral, aumentam a densidade óssea mineral da coluna vertebral, quadril e demais ossos do corpo (Chavassieux et al., 1997; Bilezikan, 2009).
Considerando a exposição dessas mulheres à radiação, em exames radiológicos de rotina ou até mesmo em radioterapia, e o uso do alendronato para o tratamento da osteoporose pós-menopausa, questiona-se qual seria o comportamento da microarquitetura óssea sob essas condições e nas situações de necessidade de reparo, como nos casos de fratura óssea.
Baseando-se na hipótese de que a radiação X pode comprometer a arquitetura do tecido ósseo e que o alendronato, possui uma ação
anti-4
osteoclástica que poderia diminuir esse efeito da radiação; se propõe nesse estudo avaliar o efeito do alendronato de sódio e de 15 Gy de radiação X na microarquitetura óssea e no processo de reparação tecidual de defeitos ósseos, produzidos artificialmente, em ratas com deficiência de estrogênio.
5
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Osteoporose
Parfitt (1987) descreveu a osteoporose como sendo um desequilíbrio entre a ação dos osteoblastos, células responsáveis pela deposição óssea, e a ação dos osteoclastos, responsáveis pela destruição óssea, que acarreta uma maior reabsorção óssea em detrimento da deposição. Nesse contexto, os espaços medulares tornam-se maiores, devido à remoção completa de partes de suas paredes ósseas, e os espaços medulares que estão previamente separados por trabéculas ósseas coalescem. Esse processo inicia-se com perfuração focal do osso trabecular e progride para o alargamento das perfurações, criando assim fenestrações ósseas e cavitação subendosteal no interior do córtex, Dessa forma, esse desequilíbrio terá como consequências o aumento do espaço trabecular e o adelgaçamento da cortical óssea.
Segundo Frost (1997), a definição de osteoporose verdadeira é atribuída quando se tem uma “osteopenia naturalmente irreversível” acompanhada por um aumento na fragilidade óssea. O indivíduo, sob essa condição, passaria a apresentar dores e / ou fraturas ósseas espontâneas, ou ainda fraturas que acometem a coluna vertebral com maior prevalência que as fraturas das extremidades, decorrentes de atividade física usual, o que não ocorreria em indivíduos de sexo, idade, raça e hábitos semelhantes. No caso de “osteopenia fisiológica”, a atividade normal não causaria fraturas espontâneas ou dores ósseas, ocorrendo fraturas somente após queda ou outro tipo de injúria, acometendo, em sua maioria, as extremidades ósseas.
Finkelstein (1998) classificou a osteoporose em dois tipos: I e II. A osteoporose tipo I também denominada osteoporose pós-menopausa, caracterizada clinicamente por fraturas vertebrais. A osteoporose tipo II ou senil é aquela resultante do processo de envelhecimento normal do organismo, ocorrendo tanto em mulheres quanto em homens, estando associada a uma redução mais
6
equilibrada da massa óssea cortical e trabecular, sendo comum a ocorrência de fraturas do quadril, pelve, punho, úmero proximal e corpos vertebrais.
O declínio nos níveis de estrogênio durante a menopausa é considerado como uma das principais causas de perda óssea, que se manifesta principalmente pelo aumento na reabsorção óssea pela ação dos osteoclastos. Sapir-Koren et al. (2012) apresentaram evidências que embasam um outro aspecto da perda óssea metabólica, sugerindo que a interação entre os fatores de risco: idade avançada, deficiência de estrogênio e falta de atividade física; promove uma redução nos processos anabólicos ósseos. A diminuição da formação óssea resulta na redução da resistência óssea e na incapacidade de manter a competência de suporte de carga de um esqueleto saudável e consequentemente no desenvolvimento da osteoporose pós-menopausa. Os autores mostraram que os receptores de estrogênio e os mediadores de ações estrogênicas são componentes essenciais para as respostas mecânico-adaptativas da atividade dos osteócitos e osteoblastos. Com esses resultados, concluíram ser possível que futuras estratégias para a prevenção e tratamento da osteoporose pós-menopausa, possam utilizar compostos estrogênicos (tais como moduladores seletivos do receptor de estrogênio ou fito estrogênios) e a atividade física, para complementar a terapia anti-reabsorção, visando impedir a perda óssea e, possivelmente, até mesmo inverter esse processo estimulando o ganho de massa óssea.
2.2 A radiação e o tecido ósseo
Em 2006, Hamilton et al. apresentaram um estudo com dados de desenvolvimento de um modelo de roedores para perda de massa óssea induzida por radiação. A amostra constituída por quarenta e oito ratas, com nove semanas de vida foi exposta à radiação gama, prótons, carbono ou ferro, em doses de 2 Gy, representando tanto uma exposição fracionada de um tratamento clínico quanto uma exposição que ocorre em um voo espacial. Os ratos foram sacrificados 110
7
dias após a irradiação. A tíbia, a região proximal do fêmur e as diáfises foram analisadas por meio de micro-TC. Os resultados demonstraram mudanças profundas na arquitetura trabecular. Perdas significativas na relação de volume ósseo trabecular foram observadas para todos os tipos de radiação: gama (-29%), prótons (-35%), carbono (-39%) e ferro (-34%). A densidade, a espessura, o espaçamento e o número de trabéculas também foram afetados. Os autores identificaram perda significativa de osso trabecular nos ratos irradiados com todos os tipos de radiação (dose de 2Gy) com implicações tanto para pacientes de radioterapia, em que a perda óssea num modelo animal foi demonstrada em doses baixas, quanto para os astronautas em missões espaciais, em que a radiação do espaço tem o potencial de exacerbar a perda óssea.
Chicarelli et al. (2007) com o objetivo de avaliar o processo de reparo ósseo em ratas ovariectomizadas submetidas ao procedimento de irradiação, selecionaram uma amostra de cem ratas, a qual foi dividida aleatoriamente em quatro grupos experimentais: controle, ovariectomizado, irradiado e ovariectomizado/irradiado. Um defeito ósseo foi confeccionado nas tíbias de todos os animais. Três dias após a cirurgia, apenas os animais pertencentes aos grupos irradiado e ovariectomizado/irradiado receberam 8 Gy de radiação gama na região onde foi produzido o defeito ósseo. Os animais foram sacrificados nos tempo de 7, 14, 21 e 28 dias após a cirurgia. A partir de análises morfológica e estrutural, foi possível observar um atraso no processo de reparo ósseo nos animais do grupo ovariectomizado/irradiado, no qual houve uma marcante associação entre a deficiência de estrogênio e radiação ionizante, resultando na redução da produção de osso neoformado, acelerando o processo de reabsorção.
Willey et al. (2008) realizaram um estudo com o objetivo de determinar se a ativação dos osteoclastos, logo após a exposição à radiação, pode contribuir para a perda óssea relativamente aguda. Nesse estudo, 32 camundongos foram expostos a uma dose de corpo inteiro de 2 Gy de radiação para a quantificação dos efeitos iniciais da radiação sobre os osteoclastos e propriedades ósseas
8
estruturais. Camundongos fêmeos C57BL / 6 (13 semanas de idade) foram divididos em dois grupos: controle irradiado e não irradiado. Os animais foram sacrificados três dias após a exposição à radiação. A análise química do soro mostrou para o grupo irradiado (p<0,05) um aumento de 14% na concentração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)-5b, um marcador da atividade osteoclástica. Os autores encontraram números altos de osteoblastos (44%, p <0,05) e osteoclastos (+213%; p <0,001) nos cortes histológicos das metáfises da tíbia corados com TRAP. Não foi observada alteração significativa na superfície dos osteoblastos, na concentração de osteocalcina e na microarquitetura trabecular (relação do volume do osso), determinada por meio de micro-TC (p > 0,05). Os autores concluíram que esse estudo forneceu evidências quantitativas definitivas de um aumento precoce induzido pela radiação na atividade e no número de osteoclastos; e que a reabsorção óssea osteoclástica pode representar um fator contribuinte para a atrofia óssea observada após irradiação terapêutica.
Kondo et al. (2009) realizaram um estudo com o objetivo de determinar se uma única dose de radiação aguda compromete a integridade estrutural do esqueleto pós-púbere. Ratos machos, com 18 semanas de idade, foram expostos à radiação gama (137)Cs com doses de 1 Gy ou 2 Gy. O osso esponjoso foi analisado por micro-TC nos tempos de 03 ou 10 dias após a irradiação, em controles basais (tecidos coletados da área irradiada) e em controles pareados por idade. A dose de 2 Gy de radiação gama causou uma diminuição de 20% na relação de volume ósseo trabecular da tíbia dentro de 3 três dias e uma redução de 43% no período de 10 dias, ao passo que 1 Gy de radiação gama causou uma redução de 28% após 10 dias. A redução da relação de volume ósseo trabecular ocorreu devido ao aumento do espaçamento e diminuição da espessura das trabéculas. A radiação também aumentou o índice de reabsorção óssea e diminuiu a relação de volume ósseo trabecular da vértebra lombar um mês após a irradiação, mostrando a persistência da perda de osso esponjoso, embora as propriedades mecânicas, analisadas por teste de compressão, não tenham sido
9
afetadas. Os autores concluíram que uma única dose de radiação gama aumentou rapidamente o número de osteoclastos no tecido esponjoso comprometendo a microarquitetura desse tecido e a remodelação do esqueleto de ratos pós-púbere.
Muitos pacientes com metástases ósseas sintomáticas recebem radiação terapêutica, mesmo que esta seja conhecida por apresentar potenciais efeitos adversos no osso. Tendo em vista essa situação, Arrington et al. (2010) partiram da hipótese de que o uso concomitante de uma droga como os bisfosfonatos (ácido zoledrônico) ou uma combinação de ácido zoledrônico mais um agente anabólico (hormônio da paratireóide) levaria a melhorias na microarquitetura e propriedades mecânicas do osso irradiado. Células de câncer de mama humana foram injetadas na região distal do fêmur de 56 ratas, divididas em quatro grupos: sem tratamento (0 Gy), radiação administrada 4 semanas pós-injeção (20 Gy), radiação (20 Gy) e ácido zoledrônico, e radiação seguida de ácido zoledrônico e hormônio da paratireóide. Os membros esquerdos serviram como grupo controle. A perda óssea sobre o grupo de 12 semanas foi acompanhada por meio de radiografias seriadas e densitometria óssea. No final do estudo, imagens por micro-TC e testes mecânicos foram utilizados para quantificar a microarquitetura e a resistência ósseas. A radiação isoladamente não foi capaz de tratar o tumor induzido e diminuiu a densidade mineral óssea, o volume de osso trabecular e a resistência óssea. Os tratamentos com radiação+ ácido zoledrônico ou radiação + ácido zoledrônico + hormônio da paratireóide foram eficazes na preservação da arquitetura óssea trabecular e da resistência óssea em níveis normais. O tratamento com o ácido zoledrônico reduziu o risco de fragilidade mecânica após a irradiação de lesão lítica no osso. Os autores concluíram que utilização suplementar de hormônio da paratireóide não resultou no maior aumento da resistência óssea, mas esteve associado com aumentos significativos na densidade mineral óssea e no volume de massa óssea, o que sugere ser vantajoso na melhoria da arquitetura óssea após o uso da radiação terapêutica.
10
Wernle et al. (2010) realizaram um estudo com o objetivo de desenvolver um modelo com ratos que resultaria: na redução da resistência óssea após a irradiação, na quantificação das alterações morfológicas e na resistência óssea ao longo do tempo, e na determinação se a correlação positiva entre a morfologia óssea e a sua resistência é mantida após a irradiação. A amostra foi constituída por 43 camundongos fêmeos. Na décima terceira semana os membros posteriores direitos dos camundongos foram irradiados com dose de 5 Gy (n = 21) e 20 Gy (n = 22) usando radiação X. Os membros posteriores esquerdos foram utilizados como controle. Os sacrifícios ocorreram nos tempos de 2, 6, 12 e 26 semanas após a irradiação. Testes de compressão axial na região distal do fêmur foram utilizados para quantificar a resistência de todo o volume ósseo. Os autores afirmaram que a radiação resultou numa relação dose-dependente com o aumento da densidade do osso cortical e perda de osso trabecular, obtida utilizando micro-TC. No tempo de sacrifício de 02 semanas observaram que o aumento no volume ósseo estava associado ao aumento da resistência óssea após a irradiação; em 12 semanas notaram perda da resistência óssea, apesar do aumento no volume ósseo dos membros irradiados. Afirmaram que houve uma relação positiva entre o volume e a resistência óssea no grupo controle, mas essa mesma relação não foi observada no grupo irradiado. Os autores concluíram que a irradiação de uma região delimitada promove alterações substanciais na morfologia e resistência óssea, e que há uma diminuição da resistência óssea após a irradiação apesar do aumento da massa óssea.
Os objetivos de Willey et al. (2010) foram identificar se a radiação aumenta a reabsorção óssea, e se a perda óssea pode ser prevenida por meio da administração de risedronato. Seis ratas com 20 semanas de idade foram divididas nos seguintes grupos: não irradiadas e tratadas com placebo; irradiadas com 2 Gy de radiação X e tratadas com placebo, ou irradiadas e tratadas com risedronato (30μg/kg a cada dois dias). Os animais foram sacrificados e a coleta das amostras foi realizada 1, 2, e 3 semanas após a irradiação. A análise por
11
micro-TC foi realizada em três locais: metáfise proximal da tíbia; metáfise distal do fêmur e corpo da quinta vértebra lombar. A histomorfometria dinâmica do osso cortical e trabecular foram realizadas. Segundo os autores, nas ratas irradiadas e tratadas com risedronato, a redução da relação entre o volume trabecular e o volume ósseo total em relação aos animais não irradiados foi observada em todos os três locais do esqueleto e tempos de sacrifício. Da mesma forma, a perda do número e conectividade trabecular induzida por radiação no grupo irradiado tratado com placebo foi observada em todos os locais do esqueleto durante o estudo. Os autores observaram que a perda óssea ocorreu principalmente durante a primeira semana após a irradiação e a formação de osso trabecular e cortical não sofreu redução até a segunda semana. Notaram ainda que não houve perda de volume ósseo no grupo irradiado tratado com risedronato. Na histologia observaram um maior número de osteoclastos na primeira semana no grupo irradiado tratado com placebo. Sobre os grupos tratados com risedronato afirmaram que esse bisfosfonato impediu o aumento no número de osteoclastos induzido pela radiação. Os autores concluíram que após a irradiação do corpo inteiro ocorreu uma rápida perda de osso trabecular e que o risedronato evita a perda óssea provavelmente induzida pela radiação.
Alwood et al., (2012) partindo da hipótese de que a exposição a doses relativamente baixas de radiação gama acelera as alterações estruturais características do envelhecimento esquelético, avaliaram uma amostra de 96 ratos machos com dez semanas de idade durante quatro meses. Os animais foram irradiados com 1, 10 ou 100 cGy nos intervalos de 0,96, 0,96 ou 88 cGy/min (± 10%), respectivamente, ou foram sham irradiados ( 0 cGy – controle). Os sacrifícios para a coleta dos tecidos ocorreu nos tempos de um e quatro meses após a irradiação. A análise por micro-TC foi utilizada para avaliar a microarquitetura do osso esponjoso. A irradiação com 100 cGy causou alterações transitórias na microarquitetura após um tempo superior a um mês, que só foram observadas no tempo de quatro meses no grupo controle. Os autores concluíram
12
que a irradiação com a dose de 100 cGy de raios gama acelerou o processo de alterações ósseas estruturais no esqueleto, as quais se espera observar somente numa fase pós-puberal, principalmente em casos de osteoporose tipo II.
Utilizando uma amostra de ratos submetidos à distração osteogênica mandibular após dose elevada e altamente fracionada de radiação terapêutica, Monson et al. (2012) avaliaram e quantificaram a região de reparo ósseo. Ratos machos Sprague-Dawley foram submetidos a 12 doses fracionadas de radiação X (48 Gy) na mandíbula. Após um período de recuperação de duas semanas, o distrator externo foi instalado e a distração gradual da mandíbula foi realizada. O tecido foi coletado após um período de consolidação de 28 dias. Os animais submetidos à radiação pré-operatória apresentaram adelgaçamento, atrofia e reabsorção óssea; e o reparo ósseo nesses animais se mostrou atrasado em relação ao grupo controle, embora o alongamento físico da mandíbula fosse conseguido. Os autores concluíram que este modelo murino forneceu evidência confiável dos efeitos prejudiciais de altas doses de radiação no reparo ósseo e regeneração em distração osteogênica
2.3 Bisfosfonatos
Os bisfosfonatos são análogos estáveis de pirofosfato caracterizados por uma ligação Fósforo-Carbono-Fósforo (P-C-P). Uma variedade de bisfosfonatos é sintetizada, sendo que a potência desse agente depende do comprimento e da estrutura da cadeia lateral. Os bisfosfonatos têm uma forte afinidade pela apatita óssea, tanto in vitro como in vivo, a qual serve como base para a sua utilização clínica. Esses agentes são inibidores potentes da reabsorção óssea e apresentam como mecanismo de ação a redução do recrutamento e da atividade dos osteoclastos e aumento da apoptose dessas células. (Kanis et al., 2013).
Segundo Delmas (2002), o objetivo do tratamento da osteoporose pós-menopausa é a redução da frequência de fraturas vertebrais e não vertebrais
13
(especialmente no quadril), que são responsáveis pela morbidade associada à doença. O autor realizou uma revisão de literatura sobre o tratamento da osteoporose pós-menopausa, e os resultados dos estudos revisados mostraram que o alendronato, o raloxifeno, o risedronato, o fragmento 1-34 do hormônio da paratireóide e a calcitonina nasal, reduziram significativamente o risco de fraturas vertebrais. Além disso, uma grande redução de fraturas não vertebrais foi mostrada para o alendronato, o risedronato, e o fragmento 1-34 do hormônio da paratireóide. Cálcio e vitamina D não foram suficientes para tratar indivíduos com osteoporose, mas se mostraram úteis, especialmente em mulheres idosas. A terapia com reposição hormonal apresentou importância significativa na prevenção da osteoporose em mulheres no início da menopausa. Ainda segundo o autor, a escolha do tratamento depende da idade, da presença ou ausência de fraturas, especialmente prevalentes na coluna vertebral, e do grau de densidade mineral óssea medida na coluna vertebral e no quadril. As intervenções não farmacológicas incluem ingestão de cálcio e dieta adequada, programas de exercícios físicos, redução de outros fatores de risco para fraturas osteoporóticas e redução do risco de quedas em idosos.
Em um estudo realizado por Bilezikan (2009) foram avaliados resultados de ensaios clínicos com o objetivo de demonstrar a eficácia de quatro bisfosfonatos no tratamento da osteoporose. As medicações utilizadas nos ensaios foram: alendronato, ácido zoledrônico, ibandronato e risedronato. Para a avaliação da eficácia do alendronato foram feitos dois ensaios clínicos, denominados FIT-1 e FIT-2. Todos os indivíduos receberam cálcio e vitamina D durante os estudos. No grupo FIT-1 a amostra foi composta por 2.027 mulheres na pós-menopausa (entre 54 e 80 anos de idade) que apresentavam no mínimo uma fratura vertebral. Essa amostra foi dividida em dois grupos duplo-cegos, randomizados, sendo um tratado com 5 mg / dia de alendronato e o outro placebo. Após três anos de tratamento, houve uma redução do risco de fratura para o grupo tratado em 51% em relação ao grupo placebo. O grupo FIT-2 teve uma amostra
14
constituída por 4.432 mulheres na pós-menopausa, com idade média de 68 anos, que apresentavam baixa densidade óssea mineral (≤ 0,68 g / cm³). A amostra foi dividida da mesma forma do grupo FIT-1, e o grupo tratado recebeu 10 mg / dia de alendronato. Após quatro anos e três meses seguindo o tratamento, o risco de fratura do grupo tratado foi 44% menor em relação ao grupo placebo. Os autores concluíram que todos os quatro bisfosfonatos reduzem o risco relativo de novas fraturas vertebrais em mulheres na pós-menopausa com osteoporose, quando comparados ao placebo. O alendronato, o risedronato e o ácido zoledrônico reduzem o risco relativo de novas fraturas não vertebrais e fraturas do quadril. Além disso, o uso do alendronato durante até dez anos e do risedronato até sete anos têm mostrado que a eficácia desses bisfosfonatos é mantida durante o tratamento em longo prazo.
2.3.1 O alendronato e o tecido ósseo
Khan et al. (1997) realizaram um estudo com o objetivo de determinar a meia-vida e a duração da resposta ao tratamento com alendronato intravenoso (30 mg / dia, durante 4 dias). A amostra foi constituída por mulheres com osteoporose pós-menopausa, as quais foram acompanhadas por dois anos. Aproximadamente 50% da dose total foram eliminadas durante os primeiros cinco dias, e mais 17% foram excretados nos seis meses sucessivos. Em seguida, houve uma fase de eliminação muito mais lenta com uma estimativa média da meia-vida superior a dez anos. A medida da densidade mineral óssea medida na coluna aumentou aproximadamente 5% durante o primeiro ano e permaneceu significativamente maior do que os valores estabelecidos no período de dois anos pré-tratamento. Os autores concluíram que altas doses de alendronato intravenoso administradas em um curto período de tempo está associado a uma retenção prolongada do agente no esqueleto, e sugeriram que esse tratamento tem um efeito contínuo sobre a remodelação óssea durante pelo menos um ano após a sua administração.
15
Os efeitos do tratamento com alendronato por via oral sobre a qualidade óssea e remodelamento ósseo foram avaliados em mulheres com osteoporose pós-menopausa por Chavassieux et al. (1997). Biópsias ósseas transilíacas foram obtidas de 231 mulheres nos tempos de 24 meses (n = 11) e 36 meses (n = 120) a partir do início do tratamento com alendronato (doses entre 05 e 20 mg / dia ou placebo). Sessenta e quatro biópsias de tecido ósseo esponjoso foram realizadas no tempo de 24 meses (31 a partir do grupo placebo e 33 do grupo tratado com alendronato) e 95 biópsias no tempo de 36 meses (40 a partir do grupo placebo e 55 de pacientes tratados com alendronato). As amostras de tecido ósseo esponjoso foram analisadas por histomorfometria. Nos tempos de 24 e 36 meses, a espessura, o volume e a superfície osteóide (matriz orgânica do tecido ósseo) apresentaram-se significativamente diminuídos. Os autores detectaram um aumento significativo na espessura da cortical óssea acompanhada por uma redução na profundidade da erosão em biópsias obtidas no tempo de 24 meses. Os autores afirmaram que, os resultados confirmaram que a mineralização foi normal, e que a remodelação do osso trabecular mostrou-se significativamente reduzida em indivíduos que receberam, por longo tempo, doses de alendronato. Sugeriram que o aumento observado na densidade mineral óssea pode resultar tanto de uma redução do espaço trabecular, devido a uma diminuição da frequência de ativação da remodelação óssea, quanto de uma possível tendência para um equilíbrio positivo desse processo de remodelação.
A intensidade da remodelação óssea é um determinante crítico na perda mineral da microarquitetura óssea trabecular e cortical, após a menopausa. Seeman et al. (2010) em um estudo duplo-cego, utilizaram uma amostra de 247 mulheres, na pós-menopausa, que foi dividida nos seguintes grupos: denosumab (60 mg mensais por via subcutânea, durante seis meses), alendronato (70 mg semanais por via oral, durante doze meses) e placebo (doses semanais por via oral, durante doze meses). Durante doze meses todos os indivíduos receberam uma dose diária de cálcio e vitamina D. Alterações morfológicas foram avaliadas
16
na extremidade distal do rádio e na distal da tíbia por meio de tomografia computadorizada quantitativa de alta resolução periférica (HR-pQCT) e tomografia computadorizada quantitativa na distal do rádio. No grupo placebo, houve perda da densidade óssea, e redução da espessura óssea cortical (- 2,1% a - 0,8 %), na distal do radio após doze meses. O uso do alendronato evitou a redução da densidade óssea mineral e promoveu o aumento da espessura cortical. O uso do denosumab resultou no aumento da densidade óssea total e espessura cortical. Os autores não observaram diferenças entre os grupos tratados em relação ao número trabecular, a espessura, ou a separação trabecular na extremidade distal do rádio em 6 ou 12 meses. Baseados nos dados obtidos concluíram que os dois medicamentos atuaram na prevenção das consequências estruturais da perda óssea na pós-menopausa como terapias anti-reabsorção com diferentes mecanismos de ação.
Campbell et al. (2011) examinaram o efeito do hormônio da paratireóide associado ou não ao alendronato, na microarquitetura óssea, na mineralização e na resistência óssea em ratas ovariectomizadas. Ratas Wistar entre 7 e 9 meses de idade foram distribuídas em cinco grupos: (1) sham + veículo, (2) ovariectomizado + veículo, (3) ovariectomizado + hormônio da paratireóide, (4) ovariectomizado + alendronato e (5) ovariectomizado + hormônio da paratireóide e alendronato. A micro-TC da tíbia direita foi realizada in vivo, nas semanas 0, 6, 8, 10, 12 e 14, sendo que as medições da microarquitetura óssea e estimativa de parâmetros mecânicos (análise de elementos finitos) foram feitas a partir das imagens. Ao final do estudo, a micro-TC da tíbia e da quarta vértebra lombar foi realizada após o sacrifício dos animais para determinar o grau de distribuição espacial da mineralização óssea. A análise dos resultados mostrou que o alendronato preservou a microarquitetura após a ovariectomia e aumentou a espessura cortical (9%, p>0,05) e trabecular (5%, p>0,05). O tratamento combinado resultou em melhorias mais acentuadas da microarquitetura óssea do que o tratamento somente com o hormônio da paratireóide, enquanto que a
17
manutenção do estado de mineralização foi observada com o tratamento com o hormônio da paratireóide.
Burghardt et al., 2011, apresentaram um estudo no qual o objetivo foi caracterizar mudanças longitudinais na função e na microarquitetura óssea em mulheres tratadas com alendronato. Cinquenta e três mulheres pós-menopausa , com baixa densidade óssea (idade = 56 ± 4 anos), foram monitoradas por tomografia computadorizada quantitativa com alta resolução periférica (HR-pQCT) durante 24 meses. Essa amostra foi dividida em dois grupos: tratado com alendronato ou placebo. Os indivíduos foram submetidos anualmente a exame por imagem de tomografia computadorizada quantitativa com alta resolução periférica da região distal do rádio e da tíbia, ao exame de densitometria óssea, e à determinação de marcadores bioquímicos de remodelação óssea (PAMB e uNTx). Além disso, a densidade óssea e a avaliação da microarquitetura, a análise regional, a quantificação da porosidade na cortical, e a análise de micro- elementos finitos foram realizadas. Após 24 meses de tratamento, os autores observaram que o grupo alendronato apresentou melhorias significativas na distal da tíbia, principalmente em relação aos parâmetros densitométricos nas regiões cortical e trabecular e na geometria endocortical (espessura e área cortical, na região da medula) (p <0,05). A densidade mineral óssea cortical volumétrica na tíbia só mostrou uma diferença significativa entre os grupos de tratamento após 24 meses (p <0,05), porém, regionalmente, diferenças significativas na densidade mineral óssea trabecular volumétrica, no número de trabéculas e na espessura do osso cortical foram encontradas para a distal do rádio (p <0,05). A análise de correlação de Spearman revelou que a resposta biomecânica de alendronato no rádio e na tíbia foi especificamente associada com alterações na microarquitetura trabecular (| ρ | = 0,51 a 0,80, p <0,05), ao passo que houve uma progressão da perda óssea associada a uma vasta gama de mudanças na densidade, na geometria e na microarquitetura óssea (| ρ | = 0,56 - 0,89, p <0,05). A geometria endocortical e a porosidade apresentaram melhores alterações no grupo alendronato em relação à biomecânica (ρ> 0,48; p <0,05, respectivamente). A
18
partir dos achados, os autores concluíram que o alendronato apresentou uma resposta mais clara na tíbia do que no rádio, impulsionada por alterações das regiões trabecular e endocortical.
Com o objetivo de examinar o potencial da imagem por ressonância magnética para monitorar os efeitos do alendronato na estrutura óssea trabecular em seres humanos (in vivo), Folkesson et al. (2011) compararam os resultados obtidos com as medições provenientes de exame de densitometria óssea e tomografia computadorizada quantitativa com alta resolução periférica. Para isso, 79 mulheres pós-menopausa osteopênicas foram divididas em grupo controle (n = 26) e grupo tratado com alendronato (n = 53). As imagens foram obtidas no início do estudo, 12 e 24 meses após. Os locais de aquisição das imagens incluíram distal da tíbia (imagem por ressonância magnética e tomografia computadorizada quantitativa com alta resolução periférica), distal do rádio (imagem por ressonância magnética, exame de densitometria óssea, e tomografia computadorizada quantitativa com alta resolução periférica) e proximal do fêmur (imagem por ressonância magnética e exame de densitometria óssea). Foram avaliados parâmetros da estrutura óssea trabecular como: relação de volume ósseo e volume trabecular (BV/TV), número de trabéculas (Tb.N), o espaçamento entre as trabéculas (Tb.Sp) e espessura trabecular (Tb.Th). Alterações longitudinais e correlações para as medições de tomografia computadorizada quantitativa com alta resolução periférica e exame de densitometria óssea também foram avaliadas. Dentre os resultados apresentados, efeitos significativos no número de trabéculas na região distal da tíbia após 24 meses foram observados nas imagens por ressonância magnética e tomografia computadorizada quantitativa com alta resolução periférica. Os autores concluíram que o estudo demonstra a viabilidade da imagem por ressonância magnética de detectar resposta longitudinal ao tratamento com alendronato em mulheres osteopênicas,
in vivo, baseada em parâmetros de estrutura óssea trabecular; e que embora mais
19
futuro, contribuir para novos conhecimentos sobre os efeitos da osteoporose e terapias relacionadas sem o uso de radiação ionizante.
Para fornecer um suporte para a aplicação clínica do alendronato na Citologia, Li et al. (2012) estudaram os efeitos de alendronato sobre a função dos osteoblastos. Nessa experiência, foi observada a influência da linha celular MG63 co-incubação pelo alendronato, em concentrações de 1 x 10 9) mol / L, 1 x 10 (-7) mol / L ou 1 x 10 (-5) mol / L sobre a função dos osteoblastos (proliferação, morfologia das células, atividade da fosfatase alcalina, expressão de colágeno do tipo I e efeito da deposição de cálcio). Os autores notaram que a proliferação, a morfologia das células, a atividade da fosfatase alcalina e a síntese de colágeno do tipo I de MG63 não foram influenciadas pelo alendronato, numa concentração de 1 x 10 (-9) mol / L e 1 x 10 (-7) mol / L; mas a atividade da fosfatase alcalina, bem como a produção de colágeno tipo I foram aumentadas sob uma concentração mais elevada (1 x 10 (-5) mol / L). Observaram que a deposição de cálcio de MG63 se mostrou aumentada sob uma concentração mais baixa (1 x 10 (-9) mol / L), mas foi inibida na concentração mais elevada. Em conclusão, segundo os autores, o alendronato em baixa concentração pode estimular a função de mineralização dos osteoblastos, de certo modo, favorecendo a formação óssea.
Baiomy et al. (2012) avaliaram os efeitos do alendronato e do ácido zoledrônico administrados localmente sobre a taxa de osteogênese em cães submetidos à distração mandibular. Após a corticotomia mandibular, os segmentos ósseos foram mantidos em posição neutra por distração durante sete dias. Em seguida, a distração foi iniciada a uma taxa de 0,5 mm, duas vezes por dia durante dez dias para obter uma distração total de 10 mm, seguida por um período de consolidação. Os animais foram divididos em três grupos de acordo com a droga injetada: solução salina, correspondente ao grupo controle; e ácido zoledrônico e alendronato, correspondentes aos grupos experimentais. Os cães foram sacrificados nos tempos de 02, 06 e 10 semanas após a distração. As
20
amostras foram coletadas para exames radiográficos, avaliação da densidade mineral óssea e avaliação histológica. Nas radiografias e resultados histológicos os autores observaram que a formação do osso e a maturação dos grupos experimentais foram mais rápidas quando comparadas com o grupo controle, concluindo que a administração local do ácido zoledrônico e do alendronato demonstrou ser eficaz na redução do período de consolidação óssea.
Toker et al., em 2012, apresentaram um estudo no qual o objetivo foi avaliar o efeito do alendronato sobre a cicatrização de feridas óssea em um modelo experimental. Numa amostra de quarenta ratos Wistar do sexo masculino, foram realizados defeitos ósseos na região calvária. Os animais foram divididos em quatro grupos com dez animais cada: grupo de enxerto de osso autógeno; grupo de enxerto de osso autógeno com terapia sistêmica com alendronato (0.01 mg / kg peso corporal por dia durante 8 semanas); grupo de enxerto de osso autógeno com terapia local com alendronato (1 mg / mL para 5 min); grupo sem tratamento (controle). Os animais foram sacrificados após oito semanas. Foram analisados: número de osteoblastos, lamelas ósseas, formação e área de osso neoformado. Os autores notaram que o número de osteoblastos aumentou significativamente no grupo de enxerto de osso autógeno com terapia local com alendronato em comparação com o grupo de enxerto de osso autógeno (p <0,05). Tanto a aplicação sistêmica como a local do alendronato aumentou significativamente a neoformação óssea em comparação com o grupo de enxerto de osso autógeno (p <0,05) sem diferença significativa entre a utilização local ou sistêmica (p> 0,05). O grupo de enxerto de osso autógeno com terapia local com alendronato apresentou aumento significativo no volume ósseo total, quando comparado ao grupo de enxerto de osso autógeno (p <0,05). Os autores concluíram que o alendronato melhora a neoformação óssea junto ao enxerto de osso autógeno no modelo do defeito na região calvária de ratos.
Chen et al. (2012) realizou um estudo para examinar os efeitos combinados de uma medicina tradicional chinesa, Hachimi-jio-gan (HJG), um
21
composto da medicina chinesa, com o alendronato, em ratos com perda óssea induzida por ovariectomia. A amostra composta por ratos Sprague-Dawley, com seis meses de idade, foi submetida à ovariectomia ou cirurgia sham. Oito semanas mais tarde, os ratos ovariectomizados foram tratados com HJG, ou alendronato ou com a combinação HJG + alendronato. A resposta do esqueleto ósseo foi avaliada usando micro-TC, software de análise de imagem e marcadores bioquímicos. Este estudo demonstrou que o tratamento com HJG ou alendronato por si só aumentou o volume de osso trabecular, a densidade mineral óssea, e a microarquitetura do osso vertebral e na região proximal da tíbia se apresentou parcialmente melhorada em ratos ovariectomizados. O tratamento com alendronato nos ratos ovariectomizados resultou em redução significativa tanto na reabsorção óssea quanto na formação óssea. O tratamento com HJG para ratos ovariectomizados inibiu a reabsorção óssea, sem efeitos marcados na formação de osso. De acordo com os resultados apresentados, os autores concluíram que o tratamento combinado de HJG e alendronato aumentou significativamente a massa óssea trabecular e preservou a microarquitetura do osso, em comparação com a ação dos tratamentos isolados.
Tommasini et al., 2012, quantificaram as alterações nas microporosidades ósseas induzidas pela redução dos níveis de estrogênio com dois tratamentos para osteoporose. A amostra composta por ratas Sprague-Dawley com seis meses de idade foi dividida em quatro grupos: controle, ovariectomizadas não tratadas, ovariectomizadas tratadas com hormônio da paratireoide e ovariectomizadas tratadas com alendronato. Para a avaliação, o quadrante medial da diáfise femoral foi dividido em regiões endosteal, intracortical e periosteal, permitindo a quantificação de osteoblastos que são formados, sobretudo, antes e depois do início do tratamento. Dentre os resultados encontrados pelos autores, a relação entre o volume trabecular e o volume ósseo total na espessura total do córtex foi significativamente mais baixa em ratas tratadas com alendronato em relação às tratadas com hormônio da paratireoide. Na região endosteal, o volume médio lacunar foi significativamente menor no
22
grupo ovariectomizado não tratado em relação ao grupo controle, indicando um decréscimo no tamanho lacunar na superfície endosteal após a redução do estrogênio. O efeito do tratamento (ovariectomizado, alendronato e hormônio da paratireoide) sobre o número de lacunas por volume de tecido era dependente do local específico no córtex (endosteal, intracortical, periosteal). Nas regiões endosteal e intracortical a relação entre o volume trabecular e o volume ósseo total foi significativamente menor no grupo alendronato em relação ao grupo ovariectomizado, sugerindo um efeito local específico do tratamento com alendronato na densidade da lacuna do osteócito. Os autores concluíram que os tratamentos atuais de osteoporose podem alterar o número, tamanho e distribuição das microporosidades no osso cortical de ratas.
O alendronato é o bisfosfonato mais comum utilizado para o tratamento da osteoporose, sendo capaz de aumentar a densidade mineral óssea, suprimindo a reabsorção do osso. O eldecalcitol é uma droga mais potente que o alfacalcidol, capaz de inibir a reabsorção óssea, mantendo a função dos osteoblastos. A partir da ação dessas drogas, Sugimoto et al. (2013) utilizaram um modelo de rato ovariectomizado e investigaram os efeitos de tratamentos combinados com eldecalcitol e alendronato ou com alfacalcidol e alendronato na quantidade de massa óssea e na resistência óssea. Setenta e cinco ratos do sexo feminino (32 semanas de idade) foram divididos em sete grupos: (1) grupo de controle sham operado, (2) grupo ovariectomizado/controle, (3) grupo eldecalcitol, (4) grupo alfacalcidol, (5) grupo alendronato, (6) grupo eldecalcitol + alendronato, e (7) grupo alfacalcidol + alendronato. Os ratos ovariectomizados foram tratados por via oral, durante 12 semanas, com as seguintes doses diárias: eldecalcitol (0.015 μg / kg); alfacalcidol (0.0375 μg / kg); alendronato (0.2 mg / kg). Na região da coluna lombar e do fêmur, os autores observaram que a monoterapia com eldecalcitol e alfacalcidol aumentou significativamente a densidade mineral óssea. Os tratamentos com eldecalcitol + alendronato e alfacalcidol + alendronato aumentaram significativamente a densidade mineral óssea, em comparação com a monoterapia com alendronato, como um efeito aditivo. Em particular, a terapia
23
eldecalcitol + alendronato resultou em uma densidade mineral óssea significativamente mais elevada do que alfacalcidol + alendronato no fêmur. Em testes mecânicos da coluna lombar, as monoterapias com eldecalcitol e alfacalcidol aumentaram significativamente a carga de rotura, e eldecalcitol + alendronato e alfacalcidol + alendronato aumentaram significativamente a carga final em comparação com a monoterapia com alendronato. No fêmur, os grupos eldecalcitol, eldecalcitol + alendronato e alfacalcidol + alendronato apresentaram aumento significativo para a carga de rotura, em comparação com os animais do grupo ovariectomizado de controle. O grupo eldecalcitol + alendronato resultou em uma resistência óssea significativamente mais elevada do que o grupo alendronato. A análise histomorfométrica revelou que a monoterapia com eldecalcitol e a terapia combinada de eldecalcitol + alendronato tiveram um potente efeito inibidor sobre parâmetros de reabsorção óssea (superfície dos osteoclastos e superfície óssea desgastada), mantendo ao mesmo tempo parâmetros de formação óssea (superfície de osteoblastos e de superfície osteóide). Em contraste, as terapias com alfacalcidol e alfacalcidol + alendronato reduziram significativamente os parâmetros histológicos reabsorção e formação óssea. Segundo os autores, os resultados sugerem que eldecalcitol ou alfacalcidol usado em combinação com alendronato apresentam vantagens terapêuticas adicionais quando comparado à monoterapia com alendronato. O tratamento combinado eldecalcitol + alendronato produz um efeito especialmente benéfico anti-osteoporose, inibindo a atividade osteoclástica e mantendo a função dos osteoblastos, em comparação com o tratamento combinado de alfacalcidol + alendronato.
24
3 PROPOSIÇÃO
Nesse estudo propõe-se avaliar o efeito da terapia com alendronato de sódio e da radiação X, na dose de 15 Gy, em ratas com deficiência de estrogênio:
no processo de reparação tecidual de defeitos ósseos; na microarquitetura óssea.
25
4 MATERIAL E MÉTODOS
O projeto dessa pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal da Universidade Estadual de Campinas, sob protocolo de número 1858-1.
Foram selecionadas quarenta ratas (Rattus Norvegicus, Albinus Wistar), adultas, com idade de noventa dias e peso variando entre 250 – 275g, procedentes do Biotério Central da Unicamp. Durante a pesquisa, os animais foram mantidos em gaiolas de policarbonato, em local com temperatura e umidade controladas e com ciclo alternado de doze horas claro-escuro. A alimentação dos animais constou de ração balanceada padrão e água ad libitum.
4.1 Ovariectomia
Todos os animais foram pesados e anestesiados via intramuscular, com 0,1 mg / kg de peso corpóreo de solução de Cloridrato de Ketamina (Dopalen® Agribrands do Brasil Ltda., Paulínea, SP, Brasil) e 0,05 mg / kg de peso corpóreo de solução de Cloridrato de Xylasina (Rompum®, Bayer S.A., São Paulo, SP, Brasil). Para o preparo do campo cirúrgico realizou-se a tricotomia da região abdominal lateral. Após a antissepsia local com álcool iodado, foram realizadas incisões cutâneas e musculares bilaterais em sentido longitudinal, na região da última costela e próxima ao nível do rim, sendo o tecido muscular divulsionado para a exposição dos ovários. Procedeu-se a hemostasia por meio da ligação da parte superior da trompa com o auxílio de fio de sutura (Fio de seda 3.0, Ethicon, Johnson do Brasil S.A., São José dos Campos, SP, Brasil) e posteriormente a excisão do ovário e gordura circundante (Figura 1). A musculatura e a pele foram então suturadas (fio Mononylon 4.0, Ethicon, Johnson do Brasil S.A., São José dos Campos, SP, Brasil) e em seguida os animais receberam antibiótico por via intramuscular 01 mg / kg de peso corpóreo (Pentabiótico Veterinário Pequeno Porte, Laboratório FORT DODGE Saúde Animal Ltda., Campinas, SP, Brasil).
26
Figura 1 - Procedimento cirúrgico para a ovariectomia, consistindo na excisão dos ovários e gordura circundante. A cirurgia foi realizada bilateralmente em todos os animais.
4.2 Grupos experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente em oito grupos experimentais, contendo cinco animais cada, conforme descrito abaixo e, sucintamente, apresentado na Tabela 1.
Grupo Controle (n = 10): Formado por animais submetidos ao procedimento cirúrgico para a remoção de seus ovários.
Grupo Alendronato (n = 10): Formado por animais submetidos ao procedimento cirúrgico para a remoção de seus ovários e que receberam 5 mg / Kg de peso corpóreo de alendronato de sódio, por via enteral, 03 vezes por semana durante 04 semanas.
Grupo Irradiado (n = 10): Formado por animais submetidos ao procedimento cirúrgico para a remoção de seus ovários e posteriormente irradiados com 15 Gy de radiação X.
27
Grupo Alendronato/ Irradiado (n = 10): Formado por animais submetidos ao procedimento cirúrgico para a remoção de seus ovários, que receberam 5 mg / Kg de peso corpóreo de alendronato de sódio, por via enteral, 03 vezes por semana durante 04 semanas e foram posteriormente irradiados com 15 Gy de radiação X.
Tabela 1 – Diferentes grupos de estudo utilizados
Grupos Nº de ratos Tratamento
Controle (OVX) 10 _ Alendronato (OVX / ALN) 10 5 mg/kg corpóreo de Alendronato de sódio Irradiado (OVX / RXT) 10 15 Gy de radiação X Alendronato/ Irradiado (OVX /ALN / RXT) 10 5 mg/kg corpóreo de Alendronato de sódio + 15 Gy de radiação X 4.3 Terapêutica
No quarto dia após a ovariectomia (Chicarelli et al., 2007) , a administração do bisfosfonato alendronato de sódio foi iniciada. Antes da administração do alendronato, a alimentação (ração e água) foi suspensa por uma hora, a fim de simular o jejum recomendado antes da ingestão do medicamento. Nos animais pertencentes aos grupos alendronato e alendronato/ irradiado, foram administrados 5 mg / Kg de peso corpóreo de xarope de alendronato de sódio 1,25 mg / ml. A administração foi realizada via enteral, utilizando-se uma seringa de 3 ml e uma agulha de gavagem assegurando que as soluções fossem depositadas diretamente no estômago dos animais (Figura 2). O tratamento com o alendronato
