UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
Pós-graduando: Antonio Carlos Cunha Lacreta Junior Orientador: Prof. Dr. Júlio Carlos Canola
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Cirurgia Veterinária.
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Julho de 2008
IMPLANTE DE TECIDO PROSTÁTICO DO CÃO NA
OSTECTOMIA PARCIAL DO RÁDIO EM COELHOS
1. INTRODUÇÃO
O retardamento ou a ausência do processo de consolidação óssea nas correções cirúrgicas das fraturas são situações indesejadas por cirurgiões, haja vista que às vezes se tornam um problema de difícil resolução na cirurgia ortopédica. Infelizmente, ocorrem com freqüência significativa, em virtude da existência de inúmeros fatores físico-químicos, tanto locais quanto sistêmicos, que são responsáveis por estas condições. Muitas pesquisas foram e vêm sendo realizadas com intuito de evitar ou ao menos minimizar a ocorrência de falhas na consolidação óssea e, a partir delas, introduziu-se várias técnicas cirúrgicas com o uso de enxertos, ou a utilização de produtos biológicos e sintéticos que estimulam a osteogênese.
A união óssea inicia-se imediatamente após a fratura por meio de mecanismos fisiológicos com fases bem definidas (HUNSE & HYMAN, 1998). Cada uma dessas fases é mediada por substâncias biológicas distintas específicas e indispensáveis no processo completo da neofomação óssea (FOSSUM, 1997). Essas substâncias biológicas podem ativar ou impedir a osteogênese dependendo da sua presença, quantidade ou qualidade em cada fase da consolidação óssea. Sendo assim, a utilização racional de tais substâncias de forma exógena, ou, de estimulantes que promovam a produção endógena delas, chamados de osteoindutores, vêm ganhando espaço nos procedimentos cirúrgicos das correções de fraturas, com o intuito de acelerar o processo de consolidação.
Dentre os inúmeros osteoindutores biológicos e sintéticos existentes, a próstata do cão, recentemente testada mostrou-se efetiva na estimulação da osteogênese. A teoria da possibilidade da próstata do cão ser um osteoindutor biológico partiu da observação de ocorrências repetitivas de metástase óssea (lesões osteoblásticas) em casos de neoplasias prostáticas malignas. Por esta razão, LeRoy, et al. (2002) testaram a capacidade osteoindutora da próstata, utilizando-a in vivo nos ossos chatos do crânio de ratos e notaram sua eficácia pela observação de neoformação óssea periosteal nos locais de implante.
A eficiência osteoindutora da próstata do cão, comprovada por LeRoy, et al. (2002), ensejou a oportunidade de verificar se este fato ocorre em outras situações, mais especificamente na cirurgia ortopédica, onde muitas vezes há necessidade de estimular a osteogênese. O presente estudo consiste em avaliar a capacidade osteindutora da próstata do cão em ossos longos, utilizando-a na ostectomia parcial do rádio em coelhos, tendo como importância a possível utilização como um coadjuvante nas intervenções cirúrgicas corretivas das fraturas para estimular o processo de consolidação óssea.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. OSSIFICAÇÃO
O tecido ósseo é formado ou por um processo chamado de ossificação intramembranosa, que ocorre no interior de uma membrana conjuntiva, ou pelo processo de ossificação endocondral, que se inicia sobre um molde cartilaginoso, o qual é destruído gradualmente e substituído por tecido ósseo que se forma a partir de células vindas do tecido conjuntivo adjacente (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995; WEISBRODE, 1995). Durante o crescimento ósseo e o crescimento ósseo remodelado em vertebrados adultos, o novo osso formado sempre é depositado em uma matriz óssea pré-existente, enquanto a deposição óssea inicial na embriogênese, ocorre em tecido não mineralizado (WEISBRODE, 1995; CANCEDDA et al., 2000).
A ossificação intramembranosa é assim chamada por surgir no interior de membranas de natureza conjuntiva, em um local chamado centro de ossificação primário. O processo tem início pela diferenciação de células mesenquimatosas que se transformam em grupos de osteoblastos. Estes sintetizam o osteóide que logo se mineraliza englobando alguns osteoblastos que se transformam em osteócitos. Como vários destes grupos surgem quase simultaneamente no centro de ossificação, há confluência das traves ósseas formadas, dando ao osso aspecto esponjoso. Entre as traves formam-se cavidades que são penetradas por vasos sangüíneos, e por estes penetram células mesenquimatosas indiferenciadas, que irão dar origem à medula óssea (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995; WEISBRODE, 1995; REMEDIOS, 1999). A parte da membrana conjuntiva que não sofre ossificação passa a constituir o endósteo e o periósteo (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995; CANCEDDA et al., 2000).
A maior parte do crescimento e da formação se dá por meio da transformação de cartilagem numa estrutura ossificada. A ossificação endocondral tem início sobre uma peça de cartilagem hialina, de forma parecida à do osso que vai se formar, porém de tamanho menor. Consiste essencialmente em dois processos. Primeiro, a cartilagem hialina sofre modificações, com hipertrofia dos
condrócitos, redução da matriz cartilaginosa, sua mineralização e morte dos condrócitos. Segundo, as cavidades previamente ocupadas pelos condrócitos são invadidas por capilares sangüíneos e células osteogênicas vindas do conjuntivo adjacente. Essas células diferenciam-se em osteoblastos, que depositarão matriz óssea sobre a cartilagem calcificada e, desse modo, aparece tecido ósseo onde antes havia tecido cartilaginoso, sem que ocorra a transformação deste naquele (ALSBERG et al., 2002).
Tanto na ossificação intramembranosa quanto na endocondral, o primeiro tecido ósseo formado é do tipo primário. Este, pouco a pouco, é substituído por tecido secundário ou lamelar. Portanto, durante o crescimento dos ossos, pode-se ver, lado a lado, áreas de tecido primário, áreas de reabsorção e de tecido secundário (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995).
2.2. REPARAÇÃO ÓSSEA
A fratura é a quebra de um osso ou cartilagem, onde ocorre sempre hemorragia local, pela lesão de vasos sangüíneos do osso, do periósteo e dos tecidos moles adjacentes. Nota-se também destruição da matriz e morte de células ósseas junto ao local fraturado (WEISBRODE, 1995; BRADDOCK et al., 2001).
A reparação de uma fratura é variável e depende de fatores biológicos e mecânicos, que influenciam a seqüência de eventos celulares que ocorre durante a consolidação (FOSSUM, 1997; MENDES et al., 2001; FIALKOV et al., 2003). Esses fatores associados da violação dos princípios da cirurgia ortopédica podem alterar a marcha normal da consolidação óssea, protelando-a ou impedindo-a de completar-se, e produzindo, respectivamente, retardo de consolidação e pseudoartrose (BARROS & BARBIERI, 1994; MORAES, 2006).
Todos os processos fisiológicos que ocorrem dentro do osso, incluindo o processo de reparação durante a consolidação da fratura, são dependentes de suporte vascular adequado (FOSSUM, 1997). Os estágios de reparação após a fratura ou ostectomia e sua relação com o suprimento sangüíneo são fundamentais. Os leitos circulatórios, tanto medulares quanto periosteais,
proliferam muito, mas o sistema arterial medular desempenha um papel fundamental no suprimento sangüíneo para a formação do calo ósseo. O predomínio desse suprimento medular aumenta à medida que progride a fase de reparação (MORAES, 2006).
A consolidação de uma fratura ou falha óssea é um dos processos mais notáveis de reparação do organismo, porque dele resulta reconstituição do tecido lesado em outro semelhante ao original (GIORDANO et al., 2001; MENDES et al., 2001; HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006) e ocorre por meio de uma série de eventos iniciais, que culminam em regeneração óssea (REMEDIOS, 1999).
Esta é um processo extremamente complicado, que pode ser dividido em três fases seqüenciais: inflamatória, durante a qual o tecido necrótico é removido; reparatória, quando a síntese rápida de nova matriz ocorre; e remodelatória, na qual a matriz desorganizada da fase de reparo sofre processo de maturação, transformando-se em estrutura compacta e funcionalmente eficiente. Essas fases são inter-relacionadas e ocorrem temporariamente (MENDES et al., 2001; BRADDOCK et al., 2001; ASPENBERG, 2005; MORAES, 2006).
Inicialmente ocorre a injúria do tecido mole e do periósteo ao redor do osso fraturado. No foco da fratura, a ruptura do sistema canalicular resulta em morte dos osteócitos localizados nas bordas da fratura dos fragmentos ósseos. Enzimas lisossomais liberadas pela morte dos osteócitos disparam um processo de destruição da matriz óssea. Nesta fase aguda ocorre um intenso afluxo de citocinas para o local da fratura. Essas proteínas como as linfocinas ativam uma cascata de enzimas proteolíticas, resultando em coagulação e inflamação. Plaquetas locais liberam fatores de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), TGFβ (fator de crescimento de transformação β) e de crescimento epidermal, que são mediadores moleculares requeridos para a consolidação (REMEDIOS, 1999). A fase inflamatória começa imediatamente após a fratura (MORAES, 2006).
A formação do hematoma que envolve o foco de fratura faz com que os segmentos lesados fiquem, em suas extremidades, desprovidos de nutrição e evoluam para necrose (MENDES et al., 2001). Os tecidos moles, o periósteo e a medula danificados, contendo grande quantidade de material necrótico
desencadeiam reação inflamatória intensa (REMEDIOS, 1999; MENDES et al., 2001). No período de 48 horas, o exsudato do hematoma contém vários mediadores inflamatórios, fatores angiogênicos e fatores de crescimento liberados pelas plaquetas, células locais, mastócitos, macrófagos, neutrófilos e linfócitos (MORAES, 2006). O hematoma promove a formação da primeira população de células no foco da fratura, incluindo granulócitos, macrófagos, linfócitos e mastócitos. Os granulócitos têm função bacteriostática e bactericida, entretanto não participam diretamente do processo de consolidação óssea. Macrófagos destroem bactérias e juntamente com linfócitos, liberam fatores angiogênicos e de crescimento celular. Osteoclastos são achados precocemente na fase inflamatória, e iniciam o processo de reabsorção e remoção do tecido ósseo morto (BARROS & BARBIERI, 1994).
Na fase de reparo, o hematoma começa a organizar-se por meio da chegada de plaquetas e deposição de fibrina (CANCEDDA et al., 2000). O periósteo e o endósteo, próximo à área fraturada, respondem à imensa proliferação, formando um tecido muito rico em células osteogênicas que constituem um colar em torno da fratura, que penetra as extremidades ósseas rompidas (BRADDOCK et al., 2001).
Macrófagos são especialmente importantes iniciando a fibroplasia. Nesta, ocorre a migração de células osteoprogenitoras do endósteo, cavidade medular, periósteo e também do endotélio para dentro do sítio de fratura. As células do endotélio também contém fatores de crescimento que promovem proliferação óssea. Associadas a fibroblastos, macrófagos e capilares, essas células mesenquimais pluripotenciais formarão o calo periosteal externo (REMEDIOS, 1999). Os fibroblastos possuem pré-requisitos indispensáveis para a ossificação na consolidação das fraturas, transformando-se em osteócitos ou se degenerando, sendo eventualmente substituídos por tecido ósseo (CHAI et al., 1997). Os macrófagos também são responsáveis pela angiogênese, por meio da produção de fatores angiogênicos que atuam localmente no calo da fratura frente a condições de hipóxia. Esses vasos sangüíneos novos representam o suprimento ósseo, originado dos tecidos moles ao redor da fratura. O suprimento
extra-ósseo manterá o calo nutrido até 10 dias após a injúria, e com a progressão da consolidação, sua contribuição será diminuída (CHAI et al., 1997).
O calo periosteal indiferenciado inicia-se ao sofrer uma rápida proliferação e transformação condrogênica. Essas células precursoras originam-se provavelmente do periósteo ou da organização do hematoma e diferenciam-se em condroblastos, fibroblastos e osteoblastos. Variações da tensão de oxigênio local determinam a diferenciação das células pluripotenciais, ou em cartilagem produzindo condroblastos; quando a tensão de oxigênio é baixa, ou em osso produzindo osteoblastos (REMEDIOS, 1999).
O tecido ósseo imaturo que surge nas extremidades ósseas fraturadas é fruto da ossificação endocondral de pequenos pedaços de cartilagem que aí se formam, como também por ossificação intramembranosa. Podem ser encontradas no local da reparação, ao mesmo tempo, áreas de cartilagem, áreas de ossificação intramembranosa e áreas de ossificação endocondral (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995).
Inicialmente há deposição de colágenos I, II e III, mas, com o decorrer do processo o tipo I predomina. Ocorre deposição de hidroxiapatita de cálcio na matriz óssea. Desta forma, o calo cartilaginoso se mineraliza envolvendo as extremidades dos fragmentos da fratura, estabilizando-a (BRADDOCK et al., 2001). Durante esse processo, partes do calo cartilaginoso são invadidas por capilares, e um novo osso começa a se formar na região central da cartilagem não reabsorvida (SCAMMELL & ROACH, 1996). Com a estabilidade, o suporte sangüíneo medular se restabelece e inicia-se a formação do calo fibrocartilaginoso, onde a cartilagem gradualmente é substituída por osso por meio de um processo idêntico ao da ossificação endocondral (REMEDIOS, 1999). Osteoblastos são sistematicamente mobilizados e recrutados para o local da fratura (SHIRLEY et al., 2005) e fazem a osteo-orientação para formação dos canais capilares. Nesse estágio, a união óssea é concluída, porém a estrutura óssea do foco da fratura é diferente do osso original (REMEDIOS, 1999). Esse calo ósseo que envolve as extremidades dos ossos fraturados é constituído por tecido ósseo imaturo que se formou de modo desordenado, mas que une
provisoriamente as extremidades ósseas fraturadas (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995).
O processo de remodelação começa quando a fratura está unida por meio do calo e o osso volta a sofrer forças devido ao movimento. Nessa fase, a cartilagem mineralizada ou o tecido ósseo primário vão sendo absorvidos e substituídos por osso estruturado, o qual será modificado em osso lamelar para a organização do sistema harvesiano. Neste árduo processo, os osteoclastos removem o osso estrutural e os osteoblastos depositam osso lamelar ao redor do canal capilar central, essas células são conhecidas como Unidade Óssea Multicelular (BMU- Bone Multicellular Unit). O processo de remodelação óssea, ou seja, a transformação do calo na forma original do osso é lento e possui como principal guia a atividade óssea piezoelétrica, fenômeno de geração de polaridade elétrica pela pressão exercida no ambiente cristalino (inorgânico) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995; REMEDIOS, 1999; MORAES, 2006).
A união óssea pode ocorrer por meio de dois mecanismos de reparo diferentes, seja a consolidação direta ou reconstrução osteonal primária por contato ou por lacuna e consolidação indireta ou reconstrução osteonal secundária por formação de calo intermediário (WEISBRODE, 1995; FOSSUM, 1997; HULSE & HYMAN, 1998; REMEDIOS, 1999).
A reconstrução osteonal primária ocorre sem formação de cartilagem (REMEDIOS, 1999) por meio do perfeito alinhamento anatômico das extremidades fraturadas e absoluta estabilidade dos fragmentos. Ocorre apenas em fraturas onde a falha é menor que um milímetro (HULSE & HYMAN, 1998; FOSSUM, 2007). Ocorre reabsorção direta da linha de fratura, seguida por deposição de osso lamelar pelos osteoblastos (REMEDIOS, 1999). O aspecto morfológico das extremidades fraturadas se caracteriza por áreas de contato e outras onde estão presentes lacunas pequenas de diferentes larguras. A reconstrução osteonal primária ainda é subdividida em consolidações por contato e lacunar (HULSE & HYMAN, 1998).
Na consolidação por contato, primeiro, a falha é preenchida por osso fibroso, seguida de reconstrução óssea longitudinal e remodelação Haversiana de
forma simultânea, por fim, em arranjo de osso lamelar ao longo do eixo longitudinal do osso (FOSSUM, 1997; HULSE & HYMAN, 1998). Já na consolidação por lacunas, o processo é muito semelhante ao da consolidação por contato, com a diferença do osso lamelar arranjar-se primeiramente perpendicular ao eixo do osso e depois, com o passar do tempo, o osso lamelar novo na lacuna torna-se longitudinalmente orientado, e restabelece a integridade anatômica e mecânica do córtex (HULSE & HYMAN, 1998).
A consolidação indireta ou reconstrução osteonal secundária por calo intermediário ocorre quando as fraturas possuem um ambiente mecânico instável (FOSSUM, 1997). Neste tipo de consolidação é necessário um ambiente com micromovimentação para estimular a formação do calo ósseo, já que é dividida em quatro estágios já descritos, inflamação, calo mole, calo duro e remodelação. (HULSE & HYMAN, 1998; REMEDIOS, 1999) Essa pequena instabilidade produz alterações piezoelétricas que aceleram a união óssea (REMEDIOS, 1999).
2.3. FATORES DE CRESCIMENTO ÓSSEO
O termo fator de crescimento define um grupo de polipeptídeos que está envolvido na proliferação e diferenciação celular e na morfogênese de tecidos e órgãos da embriogênese até a vida adulta. Estes podem agir como agentes mitogênicos, melhorando a proliferação de certos tipos de células, ou serem morfogênicos, alterando, assim, o fenótipo celular (URIST et al., 1983; LIND, 1998; REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004). Esses fatores são sintetizados por vários tecidos e tipos celulares e podem afetar células da mesma classe (ação autócrina) ou de uma classe diferente (ação parácrina) (MOHAN & BAYLINK, 1991; BAYLINK et al.,1993; REMEDIOS, 1999).
As aplicações terapêuticas dos fatores de crescimento após o nascimento envolvem o reparo de tecidos e órgãos danificados, e também regeneração ou gênese de tecidos, induzindo novamente o processo de desenvolvimento que possibilitou a criação do tecido ou órgão durante o desenvolvimento fetal ou pós-natal (PEREIRA FILHO et al., 2004).
A formação óssea é um processo regulado pela replicação celular óssea e sua função diferenciada, a qual é representada por mudanças na síntese de colágeno ósseo (CANALIS, 1985). Durante a consolidação óssea ocorre expressão de diversos fatores de crescimento, sugerindo um forte envolvimento dos mesmos com os processos de formação óssea e cartilaginosa (OREFFO, 2004). Modelos experimentais utilizando cultura celular de osteoblastos e modelos clínicos revelam que os fatores de crescimento ósseo influenciam na atividade celular, tornando-se ferramentas poderosas para a consolidação de fraturas e aplicação de enxertos (LIND, 1998; KHAN et al., 2000). Os osteoblastos são produtores de diversos fatores de crescimento ósseo. A produção desses fatores é regulada por hormônios sistêmicos e mecanismos locais de estresse (BAYLINK et al., 1993).
Os fatores de crescimento ósseo mais pesquisados recentemente são o PDGF (Fator de crescimento derivado de plaqueta), IGFs (Fatores de crescimento similar a insulina), TGFβ (Fator de crescimento transformador β), BMPs (Proteínas ósseas morfogênicas), FGF (Fator de crescimento de fibroblastos) (MOHAN & BAYLINK, 1991; REMEDIOS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004; PEREIRA FILHO et al., 2004), EGF (Fator de crescimento epidérmico), Somatotropina (hormônio de crescimento) (CANALIS, 1985; MASTROCINQUE et al., 2004), ETs (Endotelinas) (STERN et al., 1995; LeROY et al., 2004), VEGF (Fator de crescimento vascular endotelial) (STREET et al., 2002) e OGP (Peptídeo de crescimento osteogênico) (SUN & ASHHURST, 1998).
2.3.1. Fator De Crescimento Derivado de Plaqueta (PDGF)
O PDGF foi um dos primeiros fatores de crescimento a ser identificado. O caminho para o seu isolamento teve início com a descoberta de que fibroblastos cultivados proliferavam somente quando completados com soro, mas o mesmo ocorria quando se utilizava o plasma (PEREIRA FILHO et al., 2004). Sintetizado nas plaquetas e armazenado em grânulos, também é produzido por monócitos, macrófagos, células endoteliais, fibroblastos e células musculares, sendo armazenado nas plaquetas (REMEDIOS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004),
também são achados na matriz óssea (MOHAN & BAYLINK, 1991), em leiomiócitos e nos capilares (BARBIERE & COSTA, 2004).
O PDGF apresenta três isoformas, PDGF-AA, PDGF-BB e PDGF-AB, essas exercem seus efeitos sobre células alvo pela ativação de dois receptores, α e β. Estes receptores são estruturalmente relacionados à proteína tirosinaquinase (BARBIERE & COSTA, 2004).
Possuem atividade mitogênica potente para células mesenquimais incluindo fibroblastos, leiomiócitos e osteoblastos e estimulam a expressão de TGFsβ proveniente de macrófagos (MASTROCINQUE, et al., 2004). Atua indiretamente, sobre a neovascularização, a síntese de colágeno e a reparação óssea. Estimula a produção de várias moléculas da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno, colagenase, proteoglicanos e ácido hialurônico (BARBIERE & COSTA, 2004).
Após a fratura, PDGF é liberado pelas plaquetas e depositado no sitio de fratura. Desta forma, promove proliferação fibroblástica, quimiotaxia para células inflamatórias e mesenquimais e aumento da síntese de colágeno e cartilagem (REMEDIOS, 1999). A atividade osteogênica aumentada já foi descrita em osteotomia de tíbia em ratos e defeitos da calota craniana em coelhos (MASTROCINQUE et al., 2004). A isoforma PDGF-BB é a que apresenta maior efeito quimiotáxico sobre os osteoblastos (LIND, 1998).
2.3.2. Fator De Crescimento Similar a Insulina (IGF)
As IGFs são fatores secretados pelos osteoblastos durante a formação óssea para aumentar a osteogênese e acelerar a deposição óssea (PEREIRA FILHO et al., 2004), portanto, são reguladores do crescimento ósseo, estimulando a replicação e a diferenciação celular (REMEDIOS, 1999).
Existem dois tipos, IGF-I e IGF-II. Cada um deles se liga a um receptor de membrana IGF específico, que resulta em atividade de quinase, levando a mitose de células formadoras de osso (PEREIRA FILHO et al., 2004). O IGF-II tem menor efeito quimiotáxico em osteoblastos (LIND, 1998). O IGF-I chamado de
somatomedina C, é sintetizado por hepatócitos sob a influência da somatotropina, bem como de fibroblastos e osso (MILLIS, 1999).
O IGF-I é estocado na matriz óssea e possui efeito proliferativo dose dependente em fibroblastos, precursores de osteoblastos e na síntese osteoblástica de colágeno. Os IGFs inibem a degradação de colágeno por inibição da expressão de colagenase, sendo o IGF-I, o inibidor mais potente (MILLIS, 1999). Proporcionam proliferação e aumento da atividade metabólica de osteoblastos, estimulando a mitogênese, resultando em maior produção de osteocalcina com grande especificidade para atividade osteoclástica, regulando a maturação óssea e a mineralização da matriz óssea (MASTROCINQUE et al., 2004). Também é responsável por anabolismo ósseo, atuando de forma autócrina ou parácrina para os osteoblastos (PEREIRA FILHO et al., 2004). Causa aumento na expressão de outros fatores de crescimento com os BMP-2 e BMP-4 (MASTROCINQUE et al, 2004).
2.3.3. Fator De Crescimento Transformador ββββ (TGF-ββββ)
Os TGFs-β constituem uma superfamília de mediadores locais que regulam a proliferação e as funções da maioria das células dos vertebrados (PEREIRA FILHO et al., 2004). Chamado de fator de crescimento multifuncional atua como mediador da fisiologia celular normal e da embriogênese dos tecidos (MASTROCINQUE et al., 2004). Também é considerado o maior regulador do metabolismo ósseo (REMEDIOS, 1999).
A superfamília dos TGFs-β possui cinco mediadores (TGF-β1 a β5) (REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004). São produzidos por plaquetas, macrófagos, osteoblastos e osteócitos, sendo encontrados em maior quantidade na matriz óssea e nas plaquetas (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004; PEREIRA FILHO et al., 2004).
Muitas células normais possuem receptores para estes polipeptídeos, que são ativados pela serina-tironina proteinoquinase. Osteoblastos e plaquetas apresentam grande número destes, referidos como receptores I e II (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004).
Os TGFs-β participam dos processos inflamatório e de reparação (MASTROCINQUE et al., 2004) e são liberados a partir da degradação de plaquetas no local da lesão, possibilitando e ajudando o início dos eventos de reparação (MILLIS, 1999). Também são liberados por macrófagos e matriz óssea e, adicionalmente, apresentam quimiotaxia para macrófagos, fibroblastos, condrócitos e osteoblastos (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004). O tipo TGF-β1 tem forte quimiotaxia para osteoblastos (LIND, 1998, PEREIRA FILHO et al., 2004) e quando atuam sobre osteoclastos, inibem a reabsorção óssea (MILLIS, 1999; PEREIRA FILHO et al., 2004).
Regulam a proliferação e diferenciação de células mesenquimais em condroblastos, osteoblastos e osteoclastos, direcionado a consolidação óssea (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999), sendo mitogênicos para fibroblastos e estimuladores potentes de colágeno, fibronectina e na produção de proteoglicanos pelos osteoblastos (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004).
Verifica-se em trabalhos realizados em ratos que sua aplicação subperiosteal nos ossos do crânio e no fêmur ou em sítios de fratura resultam em formação óssea, por proliferação periosteal, condrogênese e formação de osso intramembranoso, mediante em ossificação endocondral (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999).
2.3.4. Proteínas Morfogênicas Ósseas (BMPs)
As BMPs são glicoproteínas e foram descritas por URIST (1962) como substâncias que induzem a formação de osso e cartilagem em sítios extra-esqueléticos. Desde então, cerca de 20 substâncias foram identificadas (MILLIS, 1999; GRANJEIRO et al., 2004; PEREIRA FILHO et al., 2004; GRANJEIRO et al., 2005). Pertencem à superfamília de proteínas denominadas de fator de crescimento transformador, da qual fazem parte pelo menos 43 membros (MASTROCINQUE et al., 2004). Essas proteínas são tidas atualmente como as mais promissoras em relação à osteoindução e apresentam potencial na reparação de defeitos ósseos, conforme inúmeros experimentos animais,
principalmente a BMP2, BMP4 e BMP7 (PEREIRA FILHO et al., 2004). Estão presentes na matriz óssea (MASTROCINQUE et al., 2004).
Há uma alta afinidade dessas proteínas por receptores específicos, encontrados principalmente nas superfícies de membranas dos osteoblastos e células semelhantes a fibroblastos, e como as BMPs agem nas células, elas aumentam a expressão de marcadores associados a estas, como fosfatase alcalina, receptores do paratormônio, osteocalcina e outras BMPs, e diminuem a expressão de achados miogênicos para certas células (MILLIS, 1999; GRANJEIRO et al., 2004). Células mesenquimais pluripotentes, progenitoras de osteoblastos, mioblastos, fibroblastos e células neurais, respondem às BMPs (GRANJEIRO et al., 2004).
Participam de muitas funções biológicas, incluindo crescimento e diferenciação celular na embriogênese (MASTROCINQUE et al., 2004). BMPs induzem irreversivelmente a diferenciação celular e a geração e regeneração óssea são atribuídas a um coeficiente destas associadas a fatores de crescimento derivados de osso (URIST et al., 1983). Sua atividade no processo de osteoindução envolve a diferenciação de células mesenquimais pluripotenciais em células osteogênicas (REMEDIOS, 1999), por exemplo, condroblastos e osteoblastos, possuindo quimiotaxia pelas células mesenquimais, entretanto, apesar de serem osteoindutores potentes, não possuem atividade mitogênica (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004; GRANJEIRO et al., 2005).
Dentre os tipos de BMPs, a dois, quatro, cinco, seis e sete, possuem importância fundamental na regulação da formação do tecido esquelético e reparação, e estas proteínas têm diferentes potenciais osteoindutores (MASTROCINQUE et al., 2004). Células osteoprogenitoras da medula óssea são mais responsivas à estimulação pelo tipo BMP2 (LIND, 1998). Induzem principalmente a ossificação endocondral (GRANJEIRO et al., 2004).
Quando ocorre uma fratura, BMPs difusas pela reabsorção da matriz óssea, ativam células osteoprogenitoras, resultando em mais produção de BMPs pelos osteoblastos, induzindo a formação óssea no sítio da fratura (MILLIS, 1999). Em experimentos com animais (macacos, ratos, coelhos, cães e carneiros) foram
observados resultados efetivos para consolidação de fraturas e formação de osso lamelar (MILLIS, 1999; REMEDIOS, 1999).
2.3.5. Fator De Crescimento de Fibroblastos (FGF)
O FGF é liberado por fibroblastos, osteoblastos, condrócitos, macrófagos, ossos e células endoteliais no calo da fratura e armazenado na matriz óssea (REMEDIOS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004).
Seus efeitos são mais pronunciados na neovascularização e formação de tecido de granulação no foco da fratura do que na função osteoblástica (REMEDIOS, 1999). São mitogênicos para células endoteliais, fibroblastos, condrócitos e osteoblastos. Estimula matriz óssea, deposição de colágeno e angiogênese (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004).
Existem duas formas distintas de FGF: FGF ácido e FGF básico (MILLIS, 1999). Estudo mostra que injeção de FGF básico imediatamente após formação do calo fibroso da fratura, depois de quatro dias da lesão, causou efeito significativo na consolidação da fratura (REMEDIOS, 1999).
2.3.6. Fator De Crescimento Epidérmico (EGF)
O EGF é encontrado em muitos tecidos e é liberado por plaquetas durante sua degradação (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004). Embora muitas células possuam receptores para EGF, células endoteliais, fibroblastos e células epiteliais são as que possuem os receptores em maior quantidade, por isso existe quimiotaxia maior por estes tipos celulares, estimulando a angiogênese e a atividade da colagenase (MILLIS, 1999).
2.3.7. Somatotropina (STH) – Hormônio de Crescimento
A STH é um hormônio de crescimento produzido na hipófise anterior (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004) que possui efeitos anabólicos generalizados. Possui ação importante no desenvolvimento de animais jovens, particularmente no crescimento longitudinal dos ossos (MILLIS, 1999). Também estimula a proliferação e função dos osteoblastos, eleva o crescimento de células
imaturas e a produção de IGF pelo fígado e osteoblastos, além de estimular a produção de outros fatores de crescimento (MILLIS, 1999; MASTROCINQUE et al., 2004). Podem afetar os osteoclastos, estimulando a reabsorção (MILLIS, 1999).
A STH atua diretamente em receptores próprios, produzindo efeito anabólico em osteoblastos ou indiretamente, mediante estimulação parácrina dos IGFs (MASTROCINQUE et al., 2004).
A STH aumenta em duas a cinco vezes a área óssea, o conteúdo mineral e a densidade ósseas. Em cães foi testada uma STH recombinante com bons resultados. Experimento realizado com animais, utilizando a STH sistêmica e local em técnicas de osteotomia, apresentaram bons resultados na consolidação óssea (MILLIS, 1999).
2.3.8. Endotelinas (ETs)
As ETs são polipeptídeos vasoativos produzidos por vários tecidos e que também atuam em muitos deles (STERN et al., 1995). Modulam o metabolismo ósseo regulando, osteoblastos, condrócitos e osteoclastos (KITTEN & ANDREWS, 2001). Existem dois tipos: ET-1 e ET-2 que, respectivamente, agem em receptores ET-A e ET-B, existentes principalmente nos osteoblastos. Também podem estimular a síntese de proteínas colágenas e não colágenas, afetar o metabolismo do cálcio por meio de ações inibitórias da secreção do paratormônio e estimular a reabsorção dependente de prostaglandinas. Especificamente a ET-1 pode aumentar os níveis de interleucina – 1, induzindo o aumento de interleucina – 6 (STERN et al., 1995).
2.3.9. Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF)
Sua principal habilidade é a neovascularização (angiogênese), interferindo diretamente na formação do calo e posterior ossificação, endocondral e intramembranosa (STREET et al., 2002).
2.3.10. Peptídeo de Crescimento Osteogênico (OGP)
OGP estimula a formação óssea e pode acelerar a consolidação da fratura. Em um experimento, a administração sistêmica de OGP acelerou a formação do calo ósseo por meio de ossificação endocondral, resultando em diminuição no tempo de consolidação, principalmente nos casos de instabilidade mecânica da fratura (SUN & ASHHURST, 1998).
2.4. A PRÓSTATA DO CÃO
Segundo BARSANTI (1995) e BASINGER et al. (1998), a próstata é a única glândula sexual anexa presente no cão, sendo relativamente grande, com estrutura densa e compacta, apresentando coloração amarela (ELLENPORT, 1986). No cão é ovóide, bilobada, constituída por cápsula e estroma, ambos formados por tecido muscular liso, fibroblastos e colágeno. Possui septos irregulares na região dorsal, que se estendem até o tecido conjuntivo periuretral, dividindo-a em dois lobos (STABENFELDT & EDQVIST, 1988). Apresenta, na porção ventral quantidade variável de tecido adiposo (BARSANTI, 1995).
Nos cães adultos, as células epiteliais predominam e o estroma ocupa 10% do volume, decorrente do aumento das concentrações plasmáticas de testosterona (BARSANTI, 1995), ao contrário da fase pré-púbere onde o estroma é predominante (ELLENPORT, 1986).
Embora grande parte das células epiteliais (90 a 95%) produza secreções, o material secretório fica geralmente armazenado no interior do citoplasma celular e não nos alvéolos. As células secretoras apresentam forma colunar e cubóide, possuem citoplasma intensamente eosinofílico e, freqüentemente, formam pregueamentos alveolares característicos (BASINGER et al., 1998). Estas células constituem o epitélio colunar secretor (BARSANTI, 1995). Células basais indiferenciadas localizadas ao longo da membrana basal constituem as células epiteliais restantes (BASINGER et al., 1998), que se acredita serem as precursoras do epitélio secretório (BARSANTI, 1995). O epitélio glandular colunar muda para epitélio transicional na região dos ductos secretórios, em sua porção distal, onde se abrem no interior da uretra (BARSANTI, 1995).
Após o nascimento, a glândula situa-se no interior do abdômen, até que ocorra a degeneração do úraco remanescente, por volta dos dois meses de idade, quando migra para a cavidade pélvica (BASINGER et al., 1998).
Em animais pré-púberes a próstata normalmente é observada como um pequeno aumento de volume nodular na porção proximal da uretra, não atingindo mais que 1cm de diâmetro na raça Beagle. Durante a puberdade, a próstata cresce (BASINGER et al., 1998), limitando-se ao espaço retroperitonial caudal à bexiga urinária, ventral ao reto e dorsal à sínfise púbica e parede abdominal (GREEN & HONCO, 1996). A bexiga urinária repleta desloca cranialmente a próstata, e quando a glândula está vazia, pode ser visibilizada a aproximadamente 2,5cm ou mais da borda cranial do púbis (ELLENPORT, 1986).
Fisiologicamente, a função secretória da próstata parece estar associada ao transporte e manutenção dos espermatozóides, não interferindo na fertilidade. Basicamente, o fluido prostático é composto por sódio, potássio, cloreto, zinco e proteína, sendo esta última de concentração baixa quando a secreção não é induzida pela ejaculação (BASINGER et al., 1998).
A arginina-esterase, uma protease também conhecida como proteína específica prostática canina (PEPC), foi identificada no plasma seminal do cão, sendo considerada marcador imunológico específico da glândula normal e hiperplásica (SOUZA & TONIOLLO, 2001).
Por fim, o antígeno prostático específico (APE), completa a lista dos marcadores prostáticos, porém há controvérsias quanto à sua produção e secreção pela próstata canina (SOUZA & TONIOLLO, 2001).
Células prostáticas normais são encontradas em grupos ou blocos, possuem núcleo redondo e citoplasma acidofílico (BURKHARD & MEYER, 1996). O núcleo, pequeno e pouco destacado (MUZZI, 1998), possui padrão reticular ou pontilhado e o citoplasma discretamente granular. Essa conformação é chamada de padrão em favo de mel (MUZZI, 1998; ZINKL, 1999).
2.5. METÁSTASE ÓSSEA NA NEOPLASIA PROSTÁTICA
A incidência de neoplasias prostáticas em cães é baixa (GADELHA, 2003). BARSANTI (1995) e JOHNSTON et al. (1991) relatam ocorrência de 5% e 0,2 a 0,6%, respectivamente, entre todas as prostatopatias. Os adenocarcinomas são os mais freqüentes e, com maior incidência, em cães apresentando 10 anos de idade em média (DI SANTIS et al., 2001). Um estudo realizado com 52 cães na região de Ribeirão Preto demonstrou 2,63% de ocorrência das neoplasias prostáticas, 100% delas adenocarcinoma. As ocorrências de hiperplasia próstatica benigna e de hiperplasia prostática benigna cística foram de 35,53% e 19,74% respectivamente, mostrando alta prevalência em cães (LACRETA JUNIOR, 2004).
O câncer prostático em cães é clinicamente agressivo e altamente invasivo, provocando metástases através dos linfonodos ilíacos externos e internos ou dos plexos venosos vertebrais e, sistêmico, para as vértebras e pulmões. Pode ainda expandir, invadindo a bexiga urinária e ureteres, assim como a musculatura da pelve e do cólon. Há também, a possibilidade de ocorrência da metástase para o coração, rins, mesentério e omento (BARSANTI & FINCO, 1984; JOHNSTON et al. 1991; DI SANTIS et al. 2001; GADELHA, 2003).
Os sinais clínicos mais comuns de neoplasia são hemorragia uretral, estrangúria, tenesmo, hematúria, anorexia e perda de peso, dor a palpação do abdome caudal, dor lombar, dificuldade de locomoção e distúrbios gastrintestinais (JOHNSTON et al., 1991; KRAWIEC & HEFLIN, 1992; BARSANTI, 1995).
O prognóstico ruim associado ao câncer de próstata no cão pode, em parte, ser atribuído ao diagnóstico tardio da afecção (GADELHA, 2003).
Há uma importante interação entre os tumores prostáticos e o osso (BENTLEY et al., 1992). Muitos mecanismos moleculares regulam a patogênese do carcinoma prostático, sua proliferação e progressão para metástases ósseas (DEFTOS, 2000). Metástases ósseas são manifestações comuns em pacientes com câncer prostático avançado. A principal característica destas é a habilidade em induzir lesões osteoblásticas, que são observadas por neoformação óssea na trabeculação medular e por diversos graus de reabsorção óssea osteoclástica. As lesões metastáticas de outros carcinomas, como do cólon, mama e pulmão,
normalmente manifestam-se de forma osteolítica, embora uma pequena porcentagem de carcinomas mamários possa conter também um componente osteoblástico (GOLTZMAN, 1997; KELLER et al., 2001; LeROY et al., 2002). O mecanismo tecido específico responsável pela aparência osteoesclerótica do carcinoma prostático não é totalmente conhecido. Numerosos fatores produzidos pelas células prostáticas, normais e neoplásicas, têm potencial para estimular a neoformação óssea, agindo sobre os osteoblastos e osteoclastos (LeROY et al., 2004). Essas interrelações entre fatores de crescimento, neoplasia prostática e metastáse osteoblástica são mediadas tanto por ações celulares autócrinas quanto parácrinas (KOUSTSILIERIS, 1993).
A próstata pode expressar fatores de crescimento ósseo, em particular, BMPs. Esta situação sugere que as BMPs podem participar da atividade osteoindutiva das metástases ósseas nas neoplasias prostáticas e que o padrão de expressão destas proteínas pode ser importante na patogênese de metástase osteoblástica associada com o adenocarcinoma prostático (BENTLEY et al., 1992; BOYCE et al., 1999). Outros fatores de crescimento conhecidamente produzidos pelas células do câncer de próstata e que podem eventualmente contribuir com a capacidade dessas células estimularem metástases por neoformação óssea são os TGFs e os FGFs (HARRIS et al., 1994; GUISE & MUNDY, 1998; BOYCE et al., 1999; DEFTOS, 2000). Interleucinas (IL -1β, IL –6) e fator de necrose tumoral (TNF - α) também já foram implicados no desenvolvimento de metástases osteoblásticas (RITCHIE et al., 1997; BOYCE et al., 1999; DEFTOS, 2000). A expressão de osteoprotegerin (OPG) aumenta em pacientes com câncer de próstata com metástase óssea, sugerindo sua participação na característica osteoblástica dessas metástases (BOYCE et al., 1999; COREY et al., 2005).
Dentre todos os fatores de crescimento que desenvolvem resposta osteoblástica nas metástases do câncer de próstata, a ET-1 e o PTHrP tem sido identificados como fatores de neoformação óssea potenciais (GUISE & MUNDY, 1998; NELSON et al., 1999; CHIAO et al., 2000; DEFTOS, 2000). Guise et al. (2003) sugeriram que a formação de metástases ósseas osteoblásticas por estimulação da proliferação de osteoblastos e neoformação óssea podem ser
mediadas por ETs-1 produzidas pelo tumor. Células tumorais localizadas nos ossos produzem fatores, como as ET-1, que estimulam a atividade osteoblástica, resultando em neoformação óssea abundante e desorganizada, características das metástases osteoblásticas (GUISE & MOHAMMAD, 2004). Experimento realizado por LeROY et al. (2004) apresentou resultados indicando que a ativação osteoblástica pela próstata ocorre por mecanismo endotelina dependente. As células prostáticas contém significativa quantidade de ET-1 imunorreativa e também possuem expressão de receptores específicos para ET-1 (ISHIZAKA et al., 1999).
LeROY et al. (2002) realizaram experimento utilizando ratos, onde comprovaram que a implantação de fragmento de próstata com algum grau de hiperplasia benigna, na região do calvário de ratos, foi capaz de induzir neoformação óssea. Na avaliação histológica observaram que a neoformação óssea apresentava hipercelularidade, comparada ao osso pré-existente, aparência desorganizada, aumento do número de espaços vasculares, osteólise do calvário e aumento significativo no número de osteoclastos. Havia também um grau moderado de proliferação celular ao redor do tecido prostático implantado, que exibia vários graus de degeneração. Ao contrário da próstata, fragmentos de outros orgãos, como músculo, rim, bexiga e baço, implantados nos animais do grupo controle e também a escarificação do periósteo no calvário dos animais do mesmo grupo, não desenvolveram neoformação óssea, assim como proliferação celular ao redor do implante.
LeROY et al. (2004) observaram que existem mecanismos na próstata livre de neoplasia, mediados por fatores de crescimento, como as ETs, que influenciam diretamente esse processo de neoformação óssea.
3. OBJETIVOS
3.1. Avaliar a eficácia osteoindutora por meio da implantação de fragmentos da
próstata do cão em falhas ósseas experimentalmente provocadas em rádio de coelhos.
3.2. Avaliar se há diferenças radiográficas e histológicas da neoformação óssea
4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. ANIMAIS
Foram utilizados 28 animais da espécie leporina, machos, adultos jovens, da raça Nova Zelândia branca, não castrados, com peso variando entre três e quatro quilogramas. Os coelhos foram obtidos biotério do Hospital Veterinário Halim Atique, da Universidade de Rio Preto (UNIRP), mantidos em gaiolas individuais e alimentados com água potável e ração apropriada1 ad libitum.
A próstata foi obtida de três cães adultos jovens atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Rio Preto (UNIRP) que vieram a óbito ou foram eutanasiados, excluindo aqueles de causa infecciosa. Esses animais foram utilizados mediante autorização dos proprietários. A próstata foi removida durante a necropsia e conservada em meio de cultura refrigerado2 a 4°C. Todos os animais apresentavam algum grau de hiperplasia prostática benigna ou hiperplasia prostática benigna cística.
4.2. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados 28 coelhos distribuídos em dois grupos, cada um com 14 indivíduos, denominados grupo tratado (GT) e grupo controle (GC). Cada grupo foi subdividido em dois outros grupos com sete animais cada (GT1 e GT2 – GC1 e GC2), de acordo com o tempo de avaliação histológica de 30 (GC1 e GT1) e 60 (GC2 e GT2) dias, respectivamente.
4.2.1. Grupos Tratados (GT1 e GT2)
Nos animais destes grupos foi implantado o fragmento da próstata do cão, previamente preparado, no terço distal da diáfise do osso rádio direito, após a ostectomia parcial (falha óssea).
4.2.2. Grupos Controle (GC1 e GC2)
Os animais destes grupos foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico do grupo tratado, porém sem o implante do fragmento da próstata.
4.3. PREPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS DA PRÓSTATA DE CÃO
Em princípio foi realizada a restituição do meio de cultura, base para o experimento. Para esta restituição foram usadas 22g de meio de cultura em pó, diluídas em 900 mL de água destilada. A diluição foi realizada, adicionando lentamente o meio de cultura em pó à água destilada e misturado-o com auxílio de agitador automático, para que a mistura ficasse homogênea. Após a diluição, o pH foi aferido (5,9) e corrigido (6,8), com uso de hidróxido de sódio3, a fim de tamponar o meio de cultura. Em seguida completou-se a diluição com a adição de mais 100mL de água destilada. O meio então foi submetido à filtração, utilizando filtro de membrana de 22 micras4 e armazenado em recipiente de vidro estéril sob refrigeração a 4°C.
Os fragmentos da próstata de cão foram obtidos de animais sexualmente adultos, dois sem raça definida (SRD) e um da raça Boxer, imediatamente após o óbito ou eutanásia. O tempo entre a morte do animal e a extração da próstata não ultrapassou 20 minutos. A próstata foi removida em bloco após exteriorização da bexiga urinária seguida de ligadura da uretra. Ato contínuo à remoção, a mesma foi armazenada em solução refrigerada de meio de cultura contendo 10μg/mL de sulfato de gentamicina5 apenas para o transporte até o laboratório. Depois de retirada do meio refrigerado, foi lavada três vezes, utilizando o mesmo meio de cultura, porém sem o sulfato de gentamicina. Foram retirados o tecido conectivo periprostático, a cápsula fibrosa e a uretra e, em seguida, a próstata foi seccionada em fragmentos com 0,8cm de comprimento e 0,2cm de largura, que foram colocados em solução de meio de cultura base contendo 100mg/mL de colagenase6. Imersos na solução os fragmentos ficaram acondicionados em estufa7 a 37°C durante três horas, onde sofreram digestão enzimática. Após digestão enzimática os fragmentos foram lavados uma vez na solução de meio de cultura base enriquecido com 5% de soro fetal bovino8 e três vezes apenas em
3 Sodium hydroxide solution - SIGMA-ALDRICH 4
Filtro de membrana - MILLEX
5 Gentatec (40mg/ml) – CHEMITEC AGRO-VETERINÁRIA LTDA 6 Collagenase, Crude: Type IA – SIGMA-ALDRICH
meio de cultura base, só então foram levados ao centro cirúrgico para serem implantados nos animais.
Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados em câmara de fluxo laminar vertical9.
4.4. PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Os coelhos foram submetidos a jejum alimentar de oito horas, com água a vontade, previamente às condutas operatórias. No pré-operatório imediato (30 minutos antes do ato cirúrgico) receberam antibioticoterapia à base de enrofloxacina a 5%10, na dose de 5mg/Kg, por via subcutânea.
Os animais foram pré-medicados com 0,06 mg/kg de sulfato de atropina11 via subcutânea e 1mg/kg de cloridrato de tramadol12, via intramuscular. Após quinze minutos foi realizada a indução anestésica com cloridratos de cetamina13 (30mg/kg) e xilazina14 (2mg/kg), na mesma seringa, via intramuscular. A manutenção anestésica foi realizada em aparelho de anestesia inalatória15 com uma mistura de oxigênio16 (O2) e isoflurano17, por meio de vaporizador universal18, com máscara, em sistema aberto tipo Baraka. Após o procedimento cirúrgico os animais foram medicados, por via intramuscular com, flunixin meglumina19 na dose de 1mg/kg e ioimbina20 na dose de 0,8mg/kg.
O ato cirúrgico foi realizado no membro torácico direito de cada parcela experimental, que foi tricotomizado e preparado adequadamente com a devida anti-sepsia. Para o acesso cirúrgico do osso rádio foi realizada uma incisão longitudinal com aproximadamente quatro centímetros incluindo pele e tecido subcutâneo na face dorso-medial do antebraço, a cinco centímetros proximal do carpo (Figura 1A), até a localização do periósteo, que também foi incisado
9
Bio Seg 09 – GRUPO VECO 10 Enrotec 50® (50mg/ml) – FATEC S/A 11 Sulfato de atropina (0,5mg/ml) - ARISTON
12 Cloridrato de tramadol (50mg/ml) genérico – UNIÃO QUÍMICA 13 Dopalen® (100mg/ml) - VETBRANDS
14Dopaser® (20mg/ml) - CALIER
15 Aparelho de anestesia 2605 serie Origami - TAKAOKA 16 Oxigênio comprimido medicinal – WHITE MARTINS 17 Forane® - ABBOTT
18 Multiagente Modular 1410 - TAKAOKA 19 Meflosyl® (50mg/ml) – FORT DODGE
longitudinalmente, afastado e mantido afastado junto à musculatura adjacente, assim sendo, expondo a diáfise do rádio (Figura 1B).
A ostectomia parcial, com aproximadamente um centímetro (Figura 1C) foi realizada no terço distal da diáfise do rádio, perpendicularmente ao eixo longitudinal, a quatro centímetros da articulação do carpo, com auxílio de uma serra oscilante21 (Figura 1D), umedecendo o local constantemente com solução de cloreto de sódio a 0,9%22, evitando assim o aquecimento e a conseqüente necrose do tecido ósseo. Com intuito de preservar a ulna e os tecidos moles adjacentes ao local da ostectomia, foram utilizadas lâminas metálicas e curetas odontológicas entre o rádio e a ulna, através do ligamento interósseo, que também foi excisado. Este procedimento proporcionou uma falha óssea de aproximadamente um centímetro de extensão (Figuras 1E e 1F). No grupo tratado, depois de inspecionar e lavar a falha óssea (sítio do implante) com solução de cloreto de sódio a 0,9%, foram implantados dois fragmentos da próstata de cão previamente preparados, com aproximadamente 0,8cm de comprimento e 0,2cm de largura, de maneira que ficassem justapostos ao periósteo nas porções proximais e distais da falha (Figuras 1G e 1H). Ato contínuo foi realizada a sutura da fáscia muscular e da pele com pontos simples separados utilizando mononylon 3-023 (Figuras 1I e 1J).
O mesmo procedimento foi realizado no grupo controle, porém sem a implantação dos fragmentos da próstata do cão.
No pós-operatório, os animais foram medicados durante cinco dias com enrofloxacina a 5% na dose de 5mg/Kg, por via subcutânea uma vez ao dia e, por três dias, flunixin meglumina na dose única diária de 1mg/kg, por via subcutânea.
21 Gison pneumatic tools – Modelo NO. GP-931 22 JP indústria farmacêutica S.A.
A B
C D
E F
Figura 1. Imagens fotográficas ilustrando o procedimento cirúrgico de ostectomia do rádio de coelhos. Em A, incisão da pele; em B, exposição da porção distal da diáfise do osso rádio e colocação das curetas entre o rádio e a ulna; em C, mensuração da região da ostectomia do rádio; em D, corte do osso com serra oscilante; em E, retirada do fragmento ósseo; em F, falha óssea produzida no rádio.
4.5. AVALIAÇÃO PÓS-OPERATÓRIA
4.5.1. Avaliação clínico-cirúrgica
Os animais foram acompanhados e observados, a fim de se verificar qualquer alteração de comportamento, reação tecidual na ferida cirúrgica, claudicação e sensibilidade no apoio, ingestão alimentar e deambulação.
4.5.2. Avaliação radiográfica
Os animais dos grupo GC1 e GT1 foram submetidos a exame radiográfico do membro torácico em dois momentos: no pós-operatório imediato e 30 dias após o procedimento cirúrgico. Foram confeccionadas radiografias em projeções mediolaterais dos membros operados.
Figura 1. (continuação) Imagens fotográficas ilustrando o procedimento cirúrgico de ostectomia do rádio de coelhos. Em G e H, colocação do implante prostático com auxílio de cânula plástica; em I, sutura das fáscias musculares e em J, sutura de pele.
J
G H
Os animais dos grupos GC2 e GT2 também foram avaliados radiograficamente, em três momentos: no pós-operatório imediato, 30 e 60 dias após a cirurgia.
Os exames radiográficos foram realizados em aparelho de Raios-X24, sobre a mesa, utilizando filmes radiográficos Kodak25, montados em chassi metálico26 com écrans intensificadores27. As radiografias foram confeccionadas utilizando técnica radiográfica com 30Kvp e três mAs.
Os filmes foram identificados com auxílio de um identificador luminoso28 e processados automaticamente29.
A avaliação da reparação óssea foi feita mediante a visibilização de reação proliferativa periosteal observada durante a interpretação radiográfica.
4.5.3. Avaliação das preparações histológicas
Os animais dos grupos GC1 e GT1 foram sacrificados conforme recomendações do Institute of Laboratory Resources, 1996, no 30˚ dia do pós-operatório. A ulna e o rádio direitos dos animais foram retirados em bloco durante a necropsia e os tecidos moles removidos. Os fragmentos ósseos foram fixados em formol tamponado (pH 7,4) com fosfatos a 10% por 48 horas em temperatura ambiente. Depois de fixados foram descalcificados em solução de ácido nítrico a 5% por cinco dias em temperatura ambiente. Após a descalcificação, os fragmentos distal e proximal à falha foram serrados e inseridos em bloco de parafina30. Os blocos prontos foram levados ao micrótomo31 e cortados transversalmente com espessura de 4μm, em ato contínuo, dispostos em lâminas de vidro, corados com hematoxilina32 e eosina33 e recobertos com lamínulas. As preparações foram avaliadas por microscopia de luz34 em aumentos de 4x e 10x. Durante a avaliação histológica foram observadas a espessura do córtex, a
24 Raicenter modelo RC 600 plus 25 Kodak MXG 18X24 26 Metaltronica 18x24 27 Kodak Lanex® 28 Metaltronica 29 Macrotec MX-2 30 Erv-plast - ERVIEGAS 31 Leitz mod 1512 32 Hematoxilina-Harris - INBRALAB 33 Eosina amarela - VETEC
arquitetura tecidual, ocorrência de necrose ou apoptose, interações das interfaces osso/implante, como reação periosteal proliferativa, osteolítica e formação de cápsula fibrosa ao redor do implante (rejeição) e suas diferenças entre os grupos tratados e não tratados.
O mesmo procedimento foi realizado nos grupos GC2 e GT2, sacrificados aos 60 dias do pós-operatório.
5. RESULTADOS
Nas avaliações radiográficas dos ossos rádio e ulna no pós-operatório imediato, para ambos os grupos, controle (GC) e tratado (GT), visibilizou-se que as falhas ósseas foram bem confeccionadas, mantendo um centímetro de comprimento, com as bordas dos fragmentos sem anfractuosidades ou esquírolas ósseas (Figuras 2A e 2B).
Nas radiografias confeccionadas aos 30 dias do pós-operatório do grupo controle (GC1), foi visibilizado preenchimento da mesma por material radiopaco, e discreta proliferação periosteal regular na cortical da ulna adjacente à falha óssea
Figura 2. Imagem radiográfica em projeções mediolateral da falha óssea (setas) em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho no pós-operatório imediato. Em A, grupo controle (sem implante de fragmentos da próstata) e em B, grupo tratado (com implante de fragmentos da próstata).
produzida no rádio (Figura 3A). Já nas radiografias aos 60 dias (GC2), os fragmentos da ostectomia apresentaram-se arredondados com proliferações ósseas periosteais discretas partindo dos fragmentos distal e proximal da falha óssea (pontes) e preenchimento da mesma por material radiopaco homogêneo (Figura 3B), não apresentando alterações radiográficas mais intensas quando comparadas às imagens obtidas aos 30 dias do pós-operatório.
No grupo tratado (GT1), visibilizou-se nas imagens radiográficas aos 30 dias do pós-operatório, proliferação periosteal regular nos fragmentos da
Figura 3. Imagem radiográfica em projeções mediolaterais da falha óssea (setas pequenas) em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho. Em A, grupo controle (sem implante de fragmentos da próstata) após 30 dias do procedimento cirúrgico e em B, grupo controle após 60 dias do procedimento cirúrgico. Notar em A e B, o preenchimento da falha óssea por material radiopaco, reação periosteal regular da cortical da ulna adjacente à falha óssea do rádio e formação de ponte óssea (seta grande).
B A
ostectomia e no córtex do osso ulna, adjacente à falha óssea produzida no osso rádio com bom preenchimento da mesma por material radiopaco homogêneo (Figura 4A). Nas imagens radiográficas do grupo tratado (GT2) aos 60 dias do pós-operatório, a proliferação periosteal dos fragmentos foi mais evidente e juntamente com a proliferação periosteal e aumento de espessura cortical da face cranial da ulna, preencheram quase toda a falha (Figura 4B).
Figura 4. Imagem radiográfica em projeções médio lateral da falha óssea (setas) em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho. Em A, grupo tratado (com implante de fragmentos do tecido prostático) após 30 dias do procedimento cirúrgico. Em B, grupo tratado (com implante de fragmentos do tecido prostático) após 60 dias do procedimento cirúrgico. Notar em A e B, o preenchimento da falha óssea por material radiopaco, a reação periosteal regular cortical da ulna adjacente a falha óssea do rádio e espessamento cortical da ulna (seta grande).
B A
Ao se avaliar comparativamente as radiografias dos animais aos 60 dias de pós-operatório, notou-se que, o preenchimento da falha por neoformação óssea foi mais intenso e mais rápido no grupo tratado (GT2) quando comparado aos animais do grupo controle (GC2) (Figuras 5A e 5B).
Figura 5. Imagem radiográfica em projeções mediolaterais da falha óssea em terço distal da diáfise do osso rádio de coelho. Em A, grupo controle (sem implante de fragmentos do tecido prostático) após 60 dias do procedimento cirúrgico e em B, grupo tratado (com implante de fragmentos do tecido prostático) após 60 dias do procedimento cirúrgico. Notar que o preenchimento da falha óssea é mais evidente em B no grupo tratado.
B A
Na avaliação histológica dos fragmentos distal e proximal do rádio realizada a partir de material coletado após sacrifício dos animais do grupo controle (GC1) e tratado (GT1) aos 30 dias de pós-operatório, foram encontradas as seguintes alterações: nas preparações histológicas do grupo controle (GC1) havia neoformação óssea ao redor dos fragmentos da ostectomia, sem alterações na espessura cortical e das superfícies periosteal e endosteal. O tecido ósseo neoformado mostrou-se organizado e com crescimento regular (Figuras 6A, 6B, 7A e 7B). Foram observados osteoblastos nas bordas ósseas e concentração discreta de osteoclastos.
Nas preparações histológicas do grupo tratado (GT1), foi possível observar tecido prostático íntegro assim como células endoteliais (Figura 6D). A neoformação óssea mostrou-se mais desorganizada (Figuras 6C, 6D, 8A e 8B) em comparação ao grupo controle e localizada adjacente ao implante de tecido prostático. O córtex apresentou-se mais delgado com superfície periosteal irregular (Figura 6C). Também foram observados osteoblastos nas bordas ósseas e maior concentração de osteoclastos. Tecido fibronecrótico sugerindo a formação de cápsula membranosa foi observado ao redor do implante (Figura 6D).
Na avaliação das preparações histológicas dos animais do grupo controle (GC2) e tratado (GT2), ambos com 60 dias pós-operatório, notou-se neoformação óssea mais intensa e com maior espessura nos animais do GT2 (Figuras 8C, 8D, 8E e 8F) comparados aos animais do GC2 (Figuras 7C e 7D). Nas preparações histológicas do GT2 também notou-se maior irregularidade do córtex ósseo e maior quantidade de lacunas na neoformação óssea quando comparado ao GC2 (Figuras 7C, 8D e 8F).
Figura 6. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso rádio de coelhos. Em A (4x) e B (10x), grupo controle (GC1). Notar neoformação óssea organizada (NO) adjacente ao córtex ósseo do rádio (CT) sem alterações; em C (4x) e D (10x), grupo tratado (GT1). Notar neoformação óssea desorganizada (NOD) adjacente ao córtex ósseo do rádio caracterizando irregularidade e lise (CTL) e fragmento prostático (FP) envolvido por tecidofibronecrótico (FN). HE
NO NO CT NOD NOD CTL FP FN A B C D
A B
C D
Figura 7. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso rádio de coelhos. Grupos controle (4x), A e B (GC1) e, C e D (GC2). Notar neoformação óssea organizada (NO) adjacente ao córtex ósseo do rádio (ct) sem alterações. Em B (GC1) e D (GC2) nota-se desorganização discreta da neoformação óssea (NOD). HE
NO NO NO NOD ct ct ct ct
B A
C D
E F
Figura 8. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso rádio de coelhos. Grupos tratados (4x), A e B (GT1) e, C, D, E e F (GT2). Notar em todas as figuras extensa neoformação óssea desorganizada (NOD) com a formação de lacunas em vários graus. A córtex do rádio (ct) apresentou adelgaçamento em vários graus. HE
NOD NOD NOD NOD NOD NOD ct ct ct ct ct ct
Nas preparações histológicas dos animais do grupo tratado (GT2) a partir do terço distal da ulna, adjacente à falha óssea obtida por meio de procedimento cirúrgico, notou-se neoformação óssea com as mesmas características e intensidade das encontradas nos fragmentos proximal e distal do rádio, com exceção do córtex que efetivamente não apresentava o mesmo grau de adelgaçamento (Figuras 9A e 9B).
A B
Figura 9. Fotomicrografias de cortes histológicos das áreas de falhas ósseas confeccionadas por meio de cirurgia, no terço distal da diáfise do osso ulna de coelhos. Em A e B (4x), grupo tratado (GT2). Neoformação óssea desorganizada (NOD) com a formação de lacunas em vários graus. A córtex da ulna (ctu) evidenciou adelgaçamento discreto. HE
NOD NOD
ctu ctu
6. Discussão
A colheita e preparação dos fragmentos da próstata deste estudo seguiram a mesma metodologia empregada por LeRoy et al. (2002), entretanto, os fragmentos produzidos, não eram suficientemente firmes, e acabavam se desfazendo com a manipulação constante. Desta maneira, foram realizados ajustes na dose da colagenase de 200mg/mL para 100mg/mL e no tempo de digestão enzimática em estufa, de quatro para três horas. Esses ajustes permitiram a confecção de um fragmento de 0,8cm x 0,2cm, considerado suficientemente resistente para manipulação até o momento do implante. Acredita-se que as condições morfológicas das próstatas utilizadas, possam ter interferido, pois com doses e tempos maiores, LeRoy et al. (2002), obtiveram fragmentos ideais com aproximadamente 1mm3. A finalidade da preparação dos fragmentos prostáticos foi manter as células próstaticas viáveis e remover o colágeno dos fragmentos, a fim de obter maior contato entre as células endoteliais prostáticas e o osso, permitindo que os fatores crescimento ósseo que estão na membrana celular interagissem com o mesmo.
O coelho é um modelo experimental muito usado nos estudos que envolvem a fisiopatologia óssea frente às fraturas e seus diferentes tipos de tratamento. Muitos modelos experimentais são utilizados para estudar o processo de consolidação de fraturas, o problema é que devido às diferenças anatômicas, biológicas e técnicas, nem sempre esses modelos possuem parâmetros adequados para a espécie de interesse final, para qual se realiza o experimento. Independente de vantagens e desvantagens próprias de cada modelo, o ideal será aquele que melhor se adeqüar ao estudo proposto (MATOS et al., 2001). Aproximadamente 35% de todos os estudos científicos do sistema músculo-esquelético são realizados em coelhos (PEARCE et al., 2007). Já foram descritos estudos ortopédicos usando coelhos como modelos experimentais com diversas finalidades, dentre elas, o uso de enxertos, comportamento da consolidação de fraturas, técnicas cirúrgicas ortopédicas, uso de fatores de crescimento, utilização de materiais biológicos e sintéticos como indutores de crescimento ósseo, entre outras. Algumas vantagens do uso desses animais são a facilidade de
manuseá-los, o porte (tamanho), baixo custo de manutenção, não requer muito espaço para mantê-los durante o período experimental e especialmente a curta maturidade esquelética, cerca de seis meses após a maturidade sexual (MATOS et al., 2001; PEARCE et al., 2007). Em comparação com outras espécies, as alterações ou mudanças no esqueleto do coelho são mais rápidas, assim como a fase de remodelação óssea (PEARCE et al., 2007), desta forma, otimiza e diminui o tempo do experimento. TAVARES et al. (1994), BARROS et al. (2001), DEL CARLO et al. (2003), LIMA et al. (2004), MORAES et al. (2004), MIRANDA et al. (2005) e CIANI et al. (2006) utilizaram a ostectomia do osso rádio em coelhos com sucesso. Por esses motivos o coelho foi escolhido como modelo experimental para essa pesquisa, assim como a ostectomia do osso rádio como a sede da lesão experimental.
TAVARES et al. (1994), MORAES et al. (2004) e MIRANDA et al. (2005), utilizaram técnica anestésica fixa com cetamina e cloridrato de xilazina em coelhos. Tentou-se reproduzir as técnicas descritas por estes autores e não obtêve-se êxito. A analgesia foi pobre e os animais apresentavam dor quando o periósteo era pinçado. Isto pode ser explicado pela extensa gama de medicamentos com mesmo princípio farmacológico, porém produzidos por empresas diferentes, portanto com suas particularidades em relação à ação dos princípios, ou ainda, por conta do tipo de ambiente que pode oferecer estímulos diferentes, mais ou menos intensos. A modalidade anestésica, utilizando derivado opióide na medicação pré-anestésica (cloridrato de tramadol), um agonista α2 -adrenérgico (cloridrato de xilazina) associado à anestésico dissociativo (cloridrato de cetamina) na indução e o isofluorano na manutenção anestésica, promoveram analgesia adequada, durante a monitorização não houve oscilações dignas de nota nos parâmetros dos pacientes, que também obtiveram retorno anestésico sem excitações.
Com relação à avaliação clínica, alguns animais restringiram-se se alimentar no pós-operatório imediato e outros diminuíram a ingestão do alimento. Não demonstraram qualquer alteração da marcha ou claudicação. Não houve contaminação da ferida cirúrgica e a cicatrização ocorreu entre o sétimo e o 10°
dia de pós-operatório, corroborando os achados de BARROS et al. (2001), DEL CARLO et al. (2003), LIMA et al. (2004), MORAES (2006) e LIMA et al. (2007).
Radiograficamente houve discreta diferença entre os animais dos grupos controle GC1 (30 pós-operatório) e GC2 (60 dias pós-operatório). O GC1 apresentou preenchimento da falha óssea por material radiopaco, e discreta proliferação periosteal regular na cortical do osso ulna adjacente à falha óssea produzida no osso rádio. Já nas radiografias aos 60 dias (GC2), os fragmentos da ostectomia apresentaram-se arredondados com discretas proliferações ósseas periosteais partindo dos fragmentos distal e proximal da falha óssea (pontes) e preenchimento da mesma por material radiopaco homogêneo, características também observadas nos animais do grupo tratado GT1 (30 dias pós-operatório). Nas imagens radiográficas do grupo tratado (GT2) aos 60 dias do pós-operatório, a proliferação periosteal dos fragmentos foi mais evidente e juntamente com a proliferação periosteal e o aumento de espessura cortical da face cranial da ulna, preencheram quase toda a falha. Em experimentos com coelhos, MATOS et al. (2001), LIMA et al. (2004), MORAES et al. (2004), CIANE et al. (2006), MORAES (2006) também preenchimento da falha óssea por material radiopaco durante a avaliação pós-operatória.
Os achados radiográficos do GT1 semelhante ao GC2 e o preenchimento mais evidente e acentuado da falha óssea observado no GT2 corroboram com as análises realizadas por LeROY et al. (2002) no que diz respeito à osteoindução mediada por fatores de crescimento liberados por fragmentos da próstata do cão. Segundo REMEDIOS (1999), na primeira fase da consolidação óssea, a fase inflamatória, plaquetas locais liberam fatores de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), TGFβ (fator de crescimento de transformação β) e de crescimento epidermal, que são mediadores moleculares requeridos para a consolidação. GUISE & MUNDY (1998), NELSON et al. (1999), CHIAO et al. (2000), DEFTOS (2000) e LeROY et al. (2004) citaram a expressão desses fatores pelas células da próstata, assim como de BMPs, ETs e PTHrP, todos considerados fatores de crescimento ósseo.
