Bacillus thuringiensis. - Portal Embrapa

(1)

c

Bacillus Thuringiensis

Deisc Maria Fontana Capalbo

Dm em Enscnhan"a deAiimeulos, pesquisadora, Embmpa Meio Ambie111e

df'l-" • <."II{WUI.embrapo hr

Gislaync Trindade Vilas-Bôas Dm em /lficrobiologia, Universidade Esladual de Londrina

J~t/'(Jt:.l.\ 1ut"/ br

Oüvia M. Nagy Arantes Dra em Agronomia, Professor Adju nlo Universidade Estadual de loudri11a

11.IIUIII \ w•J/w

Marise T. Suzuki

Mestre em Biolecnolojj;a1 Doulomnda de

BioiCCIIOiogia pela USP/SP

Bolsisla Capes, Embmpa Meio A mbieme ml""'"'''L c.upma ~Jnblll{-•a br

Formulações e Plantas

T

ransgénicas

O

controle de insetos-pr

a-ga

de la vour:.~s noci \'OS

ao homem tem sido fe

i-to com inseticidas quí

-micos desde o início ela

década ele ·'ÍO, no século passado.

Além do problema de poluição ambiental gerados, eles se mostra -J~lm tóxicos e sem especificidade, atingindo também os insetos benéfi

-cos e induzindo casos de resistência

nos insetos praga. Outros compostos

químicos foram posteriormente ela -borados. mas o seu emprego intens

i-vo. tanto na agricultura quanto na

saúde pública. resultou em novos

casos de resistência c mesmo em resistência cruzada. Além do probl e-ma da resistência. com conseqüente

redução da efetividade do controle.

o uso de inseticidas qu.ínúcos tam -bém leYou à recluç:lo ela

hiodivcrsidade nas áreas tratada.s. à contaminaç:lo ele alimentos. do solo e da úgua.

A agricultura sustentável do sé-culoXXl exige. cada vez mais, inter -venções alternativas para o controle

c manejo ele insetos que sejam

ambientalmenre seguras e que redu

-zam o contato humano com os pesticidas químicos sintéticos. Como opção podem ser utiliz:.tclos micror -ganismos cntomopatogêJúcos, indu -indo bactérias, YÍrus. fungos e

protozoários, com vantagens num e-rosas, como por exemplo: a segura

o-r,.<~ para seres humanos c outros orga -nismos-nào-ah'o. a redução ele r esí-duos de pesticidas nos alimentos, o aumento ela a tiviclade de outros

ini-O

I

~'~:?

2or

{·

);

O

/

migos naturais c a recuperação da biodiversicla.de nos ecossistemas tra-tados.

Nos anos que se seguiram à sua

descoberta, no início elo século XX,

Baciltus thuriugh•nsis (Bt) recebeu

pouca atenção elos microbiologistas

e e nlomologistas. Entretanto. após a descoberta de sua atividade entomopatogênica. ele passou a ser

estudado por enorme quantidade ele

cientistas das mais di versas di

scipli-nas, que exploraram seus segredos em nín:l molecular, fisiológico

c

eco

-lógico. Hoje, Bt é o inseticida

microbiano mais bem-sucedido, apli -cado na proteção ele grJ.os, f-lorestas e no combate a vetores de clot>nçts aos humanos.

A atividade c:ntomopatogênica

desta bactéria é decorrente da pr

o-dução de cristais protéicos em

con-conút:lncia com o processo de esp o-rulaçâo(figura 1). Esses cristais são formados por pollpept íclios conheci

-dos como proteínas C!y que apr e-sentam propriedades entomopato

-gênkas freme a insetos elas ordens

Lepidoptera, Diptera, Coleoptera,

r

lymcnoptera, f·lomoptera, Dict yop-tera, Orthoptera, Mallophaga, além de ncmatóides (Strongylida. Tyl

en-chida l, protozoários (Diplomonadi -da l c ácaros ( A.cari)

O avanço elas pesquisas com esta bactér.ia incentivou a busca ele 110\'0S isolados comariviclacle tóxica até então desconhccicla àqueles

in-setos. bem como a obtenção. por

engenharia genética, ele l inh:tgens com atividade bioi nseticicla frente a

(2)

Quadro 1. Pesquisa desenvolvida com Bacillus thuringier\Sis no setor privado nos anos 1980 Perlodo Empresa Abbot Laborok)ril\~ Antes 810chem de 1980 Zoecon Após Abbol 1980 Solva')/Ou>tw No110 Ciba-Ge1gy ICI St.mbmo Oaw Elan;o

Rot.~ ar<l Haa•

Plant GBnelic Sy.;toms

Calgeoe Su;,g...., 16dn hc. Agrigene~cf. Cmp Goooica111Am Capas não modificadas

Fonte· Adaplado de Fmrl<fl<h.t(.<en (1993)

a

Capas melhoradas Plantas recombinantes

b

Aplicação mediada por microrganismos

Figura 1. Mia-oscopi.'l eletrônk:t de v:uredma de esporos e crist::tis (setas) ele Bacillfi.S tburitlgiensís. a) cristais com formato bipiramiclal e bl cristais com form:uo esférko.

Barras: 1 j.Ull.

Fotogrofi:lsde ,\olorisc T. Suzuki

I C.'-'!',\ I,\ IE.\oJBR.'\P A).

um espectro maior de insetos alvo.

Esses avanços coincidiram com uma mudançt decisiva no modo como :1 sociedade. e em especial os órgãos regulamen~tdores, perceberam as

conseqüências ambientais do uso

intensivo de pesticidas químicos, em

especial o desenvolvimento de re -sistência dos in:;etos aos princípios atiYos. Esses fatos estimularam inú

-meras empresas \'Oltadas ~ prod

u-~s:ào de agrotóxicos e à biotecnologia. a iniciarem ou fortificarem suas li

-nhas de pesquisa e desetwolvim

en-to com Bt (Qmdro 1), bem como a

lançarem no mercado inúmeros pro -dutos registrados à base dest.'ll.>acré

-tia.

O desenvolvimento ele novos

produtos para o controle biológico

foi possível, especiaLnente, devido

à atividade entomopatogênica desta bactéria esta r relacionada à fo

rma-ção da proteína C1y, codificada por um único gene

a

y,

o que facilita a

manipulação de diferentes genes e~y

em processos biotecnológicos. As

-sim, no Final do século XX houve uma diversificação elas estratégias

ele sua utilização no controle biológi -co: maior produção de toxinas; au-mento elo e-spectro ele ação por no -vas va ricdacles de B. thu rinp,iensis; inrrodução de genes ctyem diferen

-tes microrganismos e plantas

transgênic.ts.

Foi assim contornado o limitado espectro ele controle e obri<bs for

-mas mais e fica Lese direcionadas ele

aplie.1çào. dando espaço para novos avanços na áre:t de genética ele I3t.

explorando-se ainda m:lis as bases

de sua toxici.dacle seletiva e

especilkidacle.

Genes cry c proteínas

Cry

A patogenicldacle e a

especifi-cidade d~ uma linh;1gem ele

B

t

são

determinadas pelos tipos ele genes c1y funcionais que a mesma apre

-senta. l'ma linhagem ele B.

thw-ingiensis pode conter uma ou

v<irias cópias de um mesmo gene uy ou ele diferentes genes cujos proclu

-tosfom1arão o mesmo cristal. A loca

(3)

lizaçio preferencial em plasmíd.ios

con jugativos, bem como a freqüente

associaçiio a elementos genéticos

móveis. determina a grande cliversi-d~H.Ie destes genes e a conseqüente

ocorrência ele linhagens contendo

diferentes combinações deles, o que

resulta em perfis de toxiciclade dis-tintCJS.

Todos os avanços no conheci

-mento dos genes crvpermitiram a in-da a construção ele sondas

específi-cas para a seleção de li1lhagcns por

meio ele análise de hibridaçào, em razão ela presença ele seqüências ele

nucleotídios conhecidas. Em 1998.

Crickmore e colabomdores propuse

-ram um:..t cbssific~tçàodas proteínas

C1y, baseada someme na seqüência

de aminoácidos, não levando em

consideração o perfil de toxlcidade.

Atualmente são descritos mais de

2')0 genes diferentes, enumerados

por algarismos arábicos contendo ·H

classes com subdivisões (cryl a

cJy·-\1). As atualizações são

freqüen-tes e podem seracompanhaclas pelo

site: httJ2~j2!tnix..bipls.susx.ac. uk/

l:!m't.Je/Neil Crlckmore/Bt/index.

Modo de ação c cstrutur& das proteínas Cry

Na fonna como sãosinretiz.adas,

as proteínasC1yapresentam-se como

protoxinas sem ação entomopat

o-gêniCI, necessita ndoserativacL'ls pata

o clest!ncacle:.uncnto ele seus efeitos

tóxicos. Sua ação ocorre por via oral.

seguindo-se uma série ele passos. Ao

serem ingcridas por um inseto

sus-c<.:'lí vel, as protoxinas são

solubiliza-das no ambiente alcalino elo int

esti-no dele (pH - 10) e, em seguida, processadas por proteases

específi-cas. Os produtos ativos das proteínas Cry resultantes de todos esses

pro-cessos J igam-se de maneira

irreversí-vel a receptores ele membrana das

caulas epiteliais do intestino elo in

-seto, leva nclo

:

t

forlllilção ele poros

inespecíflcos ou canais iônicos. que

alteJam a permeabilidade das célu

-las. Essa alteração leva a um:I lise

celul::tr c à ruptura ela integriclade intestinal, com conseqüente morte

ela larva.

As proteínas Cry apresentam

massas moleculares que Yari.::un ele

/ÍO a 1 iü kDa, possuindo duas

regi-ões distintas: uma porção amino-terminal, normalmente vatiável c

as-sociada à toxiciclacle. e uma porç:io

Gtrboxi-term.inal, mais conservada

entre as proteínas, associada

geral-mente: à formação do cristal. Nos insetos pertencentes à ordem tepidoptera, a intoxicação manife

s-ta-se por paralisação imediata elo

tubo digestivo e elas peças bucais,

levando à lise celular e interrupção

da alimentação. Esses sintomas são seguidos por ruptum na integriclacle

elo intestino. inanição e posterior

septicemia, levando o inseto à

morte.

Ecologia de B. lbrwingiensis Em todo o mundo, muitos pro-gramas de isolamento de B. thuringiensis têm encontrado este microrganismo distribuído em ampla. gama ele ~unbientt:s. Linhagens têm

sido isoladas principahnente a partir de amostras de sol o, de insetos vivos ou mortos e de grãos estocados ,

bem como de fontes alternativas,

como o filoplano ele espécies

vege-tais e amostras de águas de rios e

lagos. No entanto. a sua distribuição

e suas relações ecológicas permane

-cem ainda em discussão. Sabe-se

que seus esporos podem persistir no

solo por diversos anos, contudo. se

-gundo estudos recentes, B.

thuringiensisnào tem a capacidade

ele se multiplicar nem no so.lo nem na água. Diversos da elos evidenciam

que o inseto é o único ambiente

onde ocorre multiplicayào e efetiva troca ele materi31 genético entre li -nhagens de H. thuringiensis(Suzuki et ai. 200/í; Vilas-Bôas et a!., 1998). lsso explica o fato ele nunca ter sido

descrita epizootia no caso de B. thuringiansise corrobora a

seguran-ça elos produtos à base desta

bacté-Iia.

Produtos formulados à base de B. thu·rillgie,l..<õis

Formulaçôes comerciais

basea-das em B. tbu ringiensis Sà{)

com-postas por uma mistura ele células,

esporos c cristais, que são formados

por proteínas Cry. Estas proldnas

são consideradas ambic:ntalmente

seguras por apresentarem um modo

ele ação extremamente específico e

serem rapicbmentc hiodegradaclas

em ambientes natu1~tis como o solo.

Os mecanismos envolvidos no modo

ele ação de Bt garantem ele certa

fonna sua segurança especialmente

ao homem e insetos benéficos. Em

adição, extensivos estudos em labo-ratório são requeridos para a

libem-çàocle novos produtos pela Agência

Americana ele Prote~·ào Ambiental

(EPA-EliA) e outras autoridades

regulatóiias ele vários países,

incluin-do a Agência Nacional ele Vigilância

Sanitária (ANVISAJ. o Ministério da

Agricultura, Pecu:iria.c

Abastecimen-ro (tvlAPA) e o Instituto Brasileiro do

Meio Amhiente e dos Recursos

Natu-raLs Renováveis (JRAMA l no Brasil. O

Quadro 2 mostr~1 a disponibilidade de produtos 3 base ele Bt. no Brasil,

até dezembro ele 2003, registrados

nos órg~os fcclc::r:Iis <:ompetentes. A escolha ele um produto para a implantação de programas de <:o n-trole de insetos eleve levar em conta,

entre outras caJacterísticas, a eficácia

e a persistência da atividade

bioinseticida. No entanto, alguns pro-dutos têm demonstrado baixa per

-sistência e/ou atividade no campo, o

que leva a aplicações recorrentes,

dependendo elo produto e do in

se-to-alvo. Outros produtos não

atin-gem determinadas regiões da plan~

ta, como raízes, colmo c botão H oral,

que são pontos estratégicos para o

controle de várias pragas suscet.í v eis

a B. tbw·ingiensis. Assim, houve a

necessidade do desenvolvimento de

produtos l>iotecnológicos à base de

proteínas Cry, visando preencheras

!aCLmas apresentadas pelos progra

-m .. 1.s ele cont1·ole ele insetos baseados

em Bt.

Diferentes produtos

biotecno-l.ógicos foram lançados no mercado,

como o bioi nseticida Ra ven~da

Ecogen, produzido a parti.!· de uma

li11hagem ele R. tburingiensis onde

(4)

::í-Quadro 2. Biopeslicidas à base de Baclllus lhuringiensis registrados no Brasil alé 2003

Órgão de Registro Empresa Nome Ingrediente Organismo

1 _Cl_asse 2 _{Ano de}

produtora comercial ativo alvo toxicológica registro

Sumi tomo ₈_{. thuringiensis var.}

if·S

MAPA3 (anteriormente Dipel Lepidópteros 1991

Abbolt Lab.) kurslaki, HD-1

IBAMA4 Sumitomo Dipel F

8. thuringiensis var. _Thyrinl_eina_amobia _IV_4.₅ ₁₉₉₁

kurstaki, HD-1

8. thuringiensis var. _{Lepidópteros} _IV4,5 1981

MAPA Sumitomo Dipel Técnico

kurstaki, HD-1

MAPA Sumi tomo Dipel PM6 8. thuringiensis var. _{kurstaki.HD-1} Lepidópleros IV4.5 1989

MAPA Agri-control Bac-control PM B. tnurfnglensls var. Lepidópteros ~.5 1987 kurslaki. 3a, 3b

Novartis _8._{thuringiensis var.}

MAPA SA(anliga Agree Lepidópteros IIISiv" 1995

Ciba-Geigy) aiza~'Bi. GC 91

lBA MA Novartis S.A. AgreE 8. thuringiensis var. T. amobia 11151V4 1995

aizav.ei, GC 91

MAPA Milenia (antiga BacturPM 8. fhuringiensis var. A gemmata/is 1115iv" 1996

Geratec) kurstaki, H-3a. 3b

lharabras ₈_._{thuringiensis}_var.

MAPA Novartis S.A. Thuricíde Lepidópteros if.5 1991 (antiga Sandoz) kurstaki, HD-1

lBA MA lharabras I Tluicide PM 8. thuringiensis var. Lepidópteros ~.5 1995

NovartisSA kurstaki

ANVISA NovartisSA Teknar 8. thuringiensis var. Cu/ex, Aedes. Anopheles, IV 1989 israelensis Siml.dídeos

ANVISA Sumitorno Spherico 8. sphaericus Aedes aegyp~ Culicídeos IV 1995

MAPA Agrevo Bayer EcotechPro 8. thuringiensis 1!15iv" 1998 Crop Science

MAPA Sumi tomo Xentari 8. thuringiensis ₁₁₅_~ 1998

ANVISA Sumitomo Vectolex-G 8. sphaericus Domissanitário Domissanitário7 '1999

1_Cbs~>e_t_oxic_ológic.₁_:_Til_- _m_ed_i_ana_m_e_nte_t_óxico_,_I_V_•_pouco_t_ó:<ico

'Ano em que o registro foi autoriz:tclo

'Ministério ch Agricultura, d1 Pecuária e do Abastecimento

•Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e elos Recursos, aturais Renováveis

- Ministério elo J\Icio Ambiente

5_Ag_é_n_cia_Nacio_n_a_l_d_e_Vig_il_â_n_cia_Sanitá_ri_a_/_{AN\1SA- M}_ini_s_t_ér_io_da_Sa_úd_e

"PM • pó molhá,·el (tipo de tonuulaçào)

-'Uso em campanhas tlc saúde púbica e por inst.ituiçcies especializ~1das veis pela formação de proteínas Cry

ativas <.:ontra coleópteros e lepiclóptcros. Outr:t estratégia en

-,·olvendo os genes crvé a possibili

-dade ele expressão em organismos

re<.:ombinantes lteterólogos. Essa tecnologia permitiu que a capacid a-de ele produção ela toxina Cty fosse transferida para outros organismos. agregando vantagens aos produtos,

como o controle de pragas in acessí-veis aos produtos coJTvcncionais e

maior estabiliclach~ elas proteínas Cry no ambiente. Com essa Hnaliclade. fomm utilizados organismos colon

i-zadores de plantas. como

Pseudomonas cepacia, Pseudomo

-nas fluorescens, Azospíril-lum,

Bacillus pumilus

c

Rhizoúium

fegumi11osmum, além de fungos ectomiconízicos, como Laccct1'ir4

bícolor. Da mesma forma, a introdu -çio ele genes c1y em bactérias

endofíticas que colonizam o sistema

vascular elas plantas permitiu o con

-trole dos insetos que vivem no intc-riOl·do c:wle e das raízes (Arantes er al.. 2002).

Além das linhagens ele 1:3. tburingiensismelhoraclas genetic::t -mente e da constmçào de mic

rorga-nismos recombina ntes hetcrólogos, outro produto hiotccnológico surgiu

no final do século XX, gerado pela inserção ele genes

oy

em plantas, formando as chamadas pb.ntas Bt, as

(5)

quais produzem suas próprias prote -ínas Cry. ficando protegidas elo

ata-que de insetos suscepth·eis. A pro -dução destas pb.nlas ocorre em labo-ratório com o emprego ele métodos ele engenharia genética (Capalbo ct

<~L 200·fl.

Métodos moleculares para se obter plantas Bt O desenvolvimento elas plantas

transg0nicassó foi possível devido a

universalichde ela molécula de DNA, presente nas células ele todos os

organismos vivos. Essa molécula

es-toct a informação genética e or

ques-tra os processosmetabólicosda viela. Mesmo espécies completamente di-ferentes têm mecanismos equiva

-lentes para converter a ínfOJmação

genética contida no DNA em prote

-ínas, o que sign.ifka que um

segmen-to ele DNA proveniente de uma

bac-téria pode ser bem inl'erpretado e traduzido em uma proteína funcio

-nal quando inseiiclo numa planta.

O fragmento de DNA a ser i

nse-rido no genoma da célula vegetal

normalmente acrescenta um fenótipo ou causa alterações no fenótipo original. como a produção de nova(s) proteina(s). O primeiro

passo para que isso seja feito, é a preparação do DNA exógeno, que

eleve conter, nom.ínimo, um promo

-tor (para ativar o gene), o gene ele interesse lum gene

ety

no caso elas

plantas Bt l, uma seqüência de térmi -no Cuma seqüência de DNA que sinaliza o final d<l transcrição do gene) e um gene coclificante para uma marca que permita a seleção elas células que foram transformadas.

Para a obtenção ele plantas transgênicas, o DNA exógeno eleve ser inserido no genoma ela célula vegetal, permanecendo estável. Se

a inserçio do DNA é direcionada a um loco pré-determinado, o proces -so é chamado de recombinação

homóloga. Ao contrário, se a inse

r-ção do DNA ocorrer ao acaso, o

processo é denominado rccombinaçào heteróloga. Uma vez estabelecido o DNA no genoma ela

célul:1 (cromossomo ou cloroplasto),

seqüenci~ts exógenas s:io

quimica-mente inclisl'inguívels daquelas ela

célula vegetaL ou seja, a origem da

seqü0ncia de DNA não interfere nos

processos de replicação e segrega-ção. Para a obtenção elas plantas Bt, segundo Prescott et al. 0999),

quatro técnicas de transformação têm sido correntemente utilizadas: sis-tema Agrohacterium, e letroporação, biobalisrica e microinjeçào.

O rendimento ele qualquer um

desses métodos ele transformação é extremamente baixo, e para obter alto nível ele transformantes, a sel e-ção, em geral, é feita por meio de

cultura ele tecidos incliferenciaclos (calos) sobre um meio seletivo nor -malmente contendo antibiótico ou

herbicida. Posteriormente. as células

são estimuladas a iniciar um proces

-so de diferenciação, para em seguida formar uma planta regenerada e

fé.rtil.

Estratégias de seleção de plantas transformadas Uma elas etapas essenciais ao sucesso na obtenção de uma planta

transgênica é a seleção ele clones estáveis para a fonnaçào de plantas

adultas nas quais podem ser quantificados os níveis de expressão 'da molécub de interesse. Entre as estratégias correntemente utilizadas

para recuperar transfonnantes, e

s-tão: o emprego de genes de resi

s-tência a um agente químico seletivo,

como umantibiótico ou

um

herbicida; o uso ele genes que conferem um fenótipo que permite seleção visual ou tisica (como o desenvolvimento da colof3çào); ou a identifica~'ào ele

plantas transformadas por meio ele amplificação elo gene inserido por

PCR (Reação de Polimerização em

Cadeia) ou por Southern blot. A utilização ele agentes seleti

-vos é extremamente vantajosa em

relaçio a outros métodos, por isso é

o método mais empregado na sele·· ção ele OG.r..·Js. Em meio seletivo, esses agentes impedem o desenvol -vimento de células não-transforma

-80 B;ote~.:nologia Ciéncia D DcsPnt·oll'imon/(J TJ . .]4- jcmeirolju nho 200.5

das, ou seja, que não são portadoras dos transgencs, não havendo neces-sidade de posterior .separaçüo entre

células transformadas e não-transfor

-maclas. Entre os genes ele resistência a antibióticos mais utilizados, desta-cam-se o gene blaTT!.M' que codifica resistência aos aminoglicosídios, como a ampicilina e a penicilina, o gene aadA, que confere resistência à

estreptomicina e à espectinomicina, e um gene apb, mais especificamen

-te o aph(j), também designado

nptll, que codifica para a resist~ncia

à kanamici na e à neomicina. A preocupação com os possí

-veis efeitos ambientais indesejáveis elos genes de resisrênci:.t aos anribió -ti.cos foi um dos princip:lis fatores

qu~ incentivaram o desenvolvimen -to de novas tecnologias de clonagem. Entre elas, a técnica em que as célu-las vegetais são transformadas com construções especüka.s em que o

gene ele resistência ao antibiótico se encontra flanqueado por seqüências de DNA denominadas lox. Posterior -mente, as plamas obtidas são cruza-das com outras plantas transgên\cas contendo o gene cre, que coclitka para a recombinasc Cre. Dentre as plantas resultantes, obtêm-se aque

-las em que o gene de resistência ao

antibiótico foi retirado mediante a

recombinação das seqüências lox,

n'l.-:tntendo-sc, no entanto, o gene de interesse. Um exemplo desse pro

-cesso é encontr~ldo no trabalho de Ow (2002).

Entre os métodos que permi

-tem a seleção visual dos

transfor111antes. destaca-se a utiliza -ção ele genes que codificam para a formação de pigmentos, sendo

visualiz.ada coloração específica nos transfonnantes. A enzima beta -glucuronidase é ~~ base do sistema CUS, cuja expressão é verifkada em meio ele cultura em condições propí -cias ao desenvolvimento da color

a-c;;àoaz.ul pelas células transformacbs. Essas células são então separadas

daquelas sem a coloração e

transferidas para um novo me.io de cultura, para a regeneração ele uma

(6)

-prego desse .sistema pode ser t>n -contrado no trabalho ele An~ncibia et

ai. (1997).

Quando o número de células

transformadas é baixo, pode-se tam

-bém verifica r a ocorrência ele tm ns

-formação por meio de reaçôes de PCH, utilizando-se um i nidador cuja

seqüência seja complementar ao

gene trabalhado (no caso ele planta

Bt, o próprio gent> cJy). Também, pode-se utili;,:ar o método Southern b!ot. detect:-~nclo-sc a presença de seqüências cl~::· DNA por meio da

llibridaçào com um fragmento de

DN1\, .marcado radioativamente ou

por meio de métodos col.orimétricos. Após a confirmaç1o da estahi li-dacle do gene. mediante a verifi ca-ç;lo elo fenótipo. deve-se então veri

-ficar e, ou, quantificar sua expressão. Entre os métodos utilizados, d

esw-ca-se Nortbcrn blot tdetecçào elo

RNAm). \Festem blol (detecção da

proteína coclillcada pelo gene) e ensaiosimunológicos. Postedormen

-tc, é feita a constatação e a

quanritkaçào ela atividade inseticida ela planta transgênica, por meio ele bioensaios com os insetos-alvo. Alter.t.çõcs molccuJarcs dos genes cry Antes ele serem introduzidos numa planta, os genes cr)' elevem ser alterados em sua seqüência de

DNA por mutagênese sítio-dirigida.

lsso

e

necess:lrio para que as di fe-renç;as nos mecanismos de expres

-são entre organismos procarionws e eucariontes não bloqueie ou dimin u-am a expressão elo gene. AlgLLns exemplos ele a lrerações, realizadas

na obtenção de a.lgumas phmas Bt, s:to apresentados a seguir.

Os primeiros experimentos, para a obtenç·ão de plantas expr es-sando genes

o:v.

foram realizados

usando o gene c1ylA inteiro. No entanto. somente baixos níveis de

proteínas C1y foram obtidos c a plan

-ta não apresentou qt~<dquer ath·id

a-de inseticid:1. Os primeiros sucessos

foram obtidos pela expressào de fragmentos de genes crvq

u

e

codifi

-cam para a parte tó:xic.:a de proteínas

Cry. Dessa forma. a expressão de

fragmentos truncados dos genes

c1ylAa c: c1yli\b em plant:1s de

tahaco resulta r~tm em níveis

significantes de produção ele prot

e-ínas Cry c eficiente controle de la -gartas ele McmducasC!.\.1a.

No entanto. níveis de expressào de gcnes c1y nativos truncados em plantas le\·am à procluçao de cerca

de 0.001% do total de proteínas solúveis. sendo esses nÍ\'Cis men o-res que aqueles obtidos com outros transgenes. Isso se deve ao fato do genoma da planta apresentar alto conteúdo ele Guanina (GJ e Citosina

(C), enquanto os genes e~ytêm alto conteúdo de Aclenüla (A) e Timina

(T), o que pode levar a planta a processamentos Incorretos e à for -m:~e.;:ào ele HNAm nào-funcion.ais. Além disso, os códons USllalmente presen -tes em genes CJysào raramentl:'

uti-lizados em plantas, o que pode

pro-vocar pausas no ribossomo e talvez acelerar a clcgraclaçào elo RNAm elo gene CJycontido nas plantas.

tvJuitas pla tHas Ht foram

construídas com os genes aylAb e c1y1Ac truncados, mas outros genes

também têm sido utili%ados, como o

c1y9C em milho, resultando em pro

-teção contra Ost1inia nubilalis, e a

inserção elo gene Cly3A em batatas,

Clue levou à expressão ela produção

ele altos níveis da proteína Cry5A e

ao controle ele LejJtinotarsa

decemlineata . Além desses genes.

foi construída uma versão do gene

e~y1C pa1·a <1 obtenção de altos tú

-veis de expressão em plantas. p

ro-porcionando a proteção de La baco e

alfafa contra as lagartas Spodoptem littoralis e S. exígua c de brócolis contra Plutel/a xylostella.

Com o passar dos anos e o d e-senvolvimento de novos métodos moleculares. outras gerações de phn -tas Bt surgem, cada vez mais seguras e voltadas não só ao controle clo(s)

inselo(sJ-alvo, mas também il con -servação das concliçôcs ecológicas

estabelecidas nas áreas ele cultivo.

Com esse intuito, pesquisadores vêm

desenvolvendo plantas em que as

proteínas Cry podem ser expressas somente onde e quando necessárias através elo uso de promotores tecido

específico. tempo específico ou

genes promotores induzíveis. Esses

e outros cuidados sã o tomados no sentido de minimizar o desenvolvi

-mento ele resistência elos insetos às proteínas C1y e o fluxo gênico para variedades selvagens. Al6m disso.

deve-se lembrar que várias outras

estratégias também têm sido pr

o-postas para serem utilizad:1s no cam

-po e que ajudam a retardar a oco r-rência destes eventos.

Análise de risco c adoção

da'i plantas Bt

Os debates sobre a introdução

comcrcla I cl.e plantas geneticamente

modificadas en1 algumas regiões elo

mundo levaram a questionamentos

sobre seu impacto potencial no

am-biente. Dúvidas surgiram quanto à

possibilidade ele afetar organismos

não alvo. cruzar c produzir plantas

daninhas, ter efeito adverso sobre a

biocliversiclade e reduzir efetivam

en-te o uso ele insumos químicos ind e-scjá v eis. Embora se saiba elo impacto

inevitável da agricultura sobre o

ambiente, foi questionado o quanto esras plantas afetariam o balanço entre a produção agrícola e a vida silvestre.

A controvérsia atingiu a opinião

pl'1blica, demandou. e continua de

-111<1!1da ndo, estudos extensos. Tais preocupações da sociedade trans

-formaram as pia nta.s Rt nas mais bem

estudadas quanto aos riscos/bene

fí-cios envolvidos. A comunidade cien

-tífica constatou evidências de que os

benefícios são elevados pam os pro

-dutores, porém reconhece que o

processo regulatório precisa ser mais bem ajustado. Há um bem docu -mentado histórico ele segurança da

aplicaçàv de Bt, como produto fo

r-mulado. no ambiente. devendo a

go-ra ser verificada se esta segurança é

mantida na diversiclacle de YCículos

(como outras bactérias e plantas)

desta bactéria bioinseticicla.

(7)

processo rcgul:ttório das plantas

transgênicas, e das plantas Bt esp e-cificunente, devem levar em conta

a c:uacterística peculiar destas plan

-tas ele dissemina r um princípio ins

e-ticida, tendo por veículo a própri<t

planta. A ma.ioria elos pesricicbs sin

-téticos e também os nattu"ais são aplicados por pulverização em t

em-po c quanticbde dctcmlinados: a

cobertura nunc:t atinge 100% e. em

conseqüencia, o pri ndpio ativo nào

atinge todas as partes elas plantas. O

agricultor decide quando, onde e como será aplicado o pesticida tradi

-cional, enquanto o princípio pestici

-da das plantas transgen.icas (como

nas plnntas Bt) será liberado. na

maioria elos casos, durante todo o

ciclo ele vida da planta e, com fre -qüência, em rodas as partes da pl:-t n

-ta.

Como forma dt: garantia ele se-gurança para o ambiente e os consu -midores, compele aos órgãos pú

bli-cos ele cada país controlar o uso ele produtos utiliz;~dos no ambiente (ali

-mentos, agricultura, pecuária, sa t'icle

pública, entre outros), requerendo

sua avaliação adequada previam

en-te ao seu registro para uso comercial.

Compete ainda aos mesmos órgãos

públicos estabelecer os critérios par.t a avaliaÇ'ào destes produtos, dentro

de normas específicas que consid

e-rem as diferenç·as fundamentais e n-tre produtos quí.micos c biológicos,

transgênicos e não transgênicos, no

que se refere a <:omposiçào, forma

de ação c comportamento no ambi

-ente.

Os riscos ambientais analisados

pa~ as plantas t ransgênicas com

ca-racterística pesticida (caso elas plan

-tas Btl enquadram-se em quatro ca

-tegorias amplas: -11uxo gên.ico do

lransgene para outras espéci.es ou

variedades:-e\·oluçãodc resistência

nas pragas-ah·o; - efeitos adversos

nas espécies não ah·o expostas à

proteína Bt; -eft'itos ela proteína Bt na biora elo solo; d:~s C[ll<tis discutir

e-mos brevemente as duas últimas.

Efeito nas espécies não alvo

Quando estão no campo, as

cul-turas abrigam não somente os in

se-tos-praga, mas também outros artró

-podes (parasitóides e predadores), os quais desempenham importante

papel na regulação elas popula~ões ele herbívoros. Em termos eco

lógi-cos, essa hierarquia é chamada de

interação trófica. As interações trúfi

-cas c os mecanismos para a interfe -rência das plantas Bt sobre essas interações sfto complexos e depen

-dem ele muitos fatores, como: nível

de resistência da planta, especifici

-dade elo novo caráter introduzido/ expresso, em quais tecidos este c a-ráter será expresso e por quanto

tempo, presença ele plantas suscetí

-\'Cis próximas e manejo ela cultura, ou seja, aplica çào de inseticidas, con-trole de plantas invasoras, entre ou

-tros. A preocupaç·ão que levou a

estes estudos foi a de que os insetos

-alvo pudessem adquirir a proteína Cry produzida na planta Bt quando

se alimentassem dela e, assim, expor

a proteína aos inLmigos naturais, seja

por meio ele seus fluidos corpóreos,

seja mediante cont:uninaçãode suas

larvas e disseminação em suas fezes

H)'t a.inda a possibilidade de que, com

a rl.'clução elas aplicações de i nsetici

-clas em culturas Bt. as pragas secu

n-dárias tornem-se import:lntes, at

in-gindo opa pel de praga primária em

relação àquela cultura.

Deve-se ressaltar que, em uma

análise ele dsco, a pesar da necess icla-cle ele se saber quantos e quais orga-nismos podem consumir os tecidos elas plantas, esse consumo c a

dis-pers:lo deles na cadeia trófica só se

constitui em risco se,

em

nível nor

-mal de consumo ('111 c.1.mpo, resultar em efeitos adversos.

Em 200], a Agência ele Proteção

Ambiental americana (EP AJ concluiu,

em reavaliação elo risco apresentado

por plantas Bt, que as proteínas Cry

de Br procluziclas nas plantas tr:ms

-gê.nicas não apresentam efeitos ad

-versos às populações de organismos não alvo expostas ~s quantidades

desta proteína que são enconrraclas

nos tecidos dessas plantas

( v.·v·.'W. cpa.g m·

í

pesti cicles;'hiopest

i-cidesipips/br bracl.lttm).

Efeitos da proteína 8t na biota do solo Para que o ecossistema solo per-maneç..t saudá vc:l. é necess:üio ma n-ter sua biocliversidadc

e

a estabilida

-de dest:t di\'ersidade. Assim. um dano

potencial associado a plantas Bt é a

possibilidade de alterações nos gru-pos funcionais presentes no solo,

favorecendo determinado grupo em detrimento ele outro. Proteínas Bt

podem apresentar 110\'0 efeito tóxi -co para a biot::t, ou ser uma nova fonte de substrato. Muclan~,:as na

di-versidade dos microrganismos do solo

podem a Iterar irrcversivelmente a a

dinâmica funcional elo sistema sol

o-planta original.

O assunto é tão extenso quanto

a diversidade de micro e macrorga

-nismos presentes no solo. Para

efei-to ele il ustraçào, podem-se apres~n

tar os seguintes efeitos, potenciais.

de plantas Bt na biota elo solo:

• Organismos fragmentadores e,

ou. clccompositorcs - Plantas Bt exsudam, em maior ou menor quan

-tidade, toxinas atra \·és elas raíLes,

que pocleria m afetar org:m.ismos rcs

-ponsá veis pela cidagem de matéria

orgânica, reduzindo ou impedindo a degradação de compostos como ce -lulose, hemicelulose, qui tina, Jignina, com conseqüências par:~ a fertilida

-de de plantas:

• Organismos envolvidos na fixa-çàocle N" atmosférico-se toxinas Bt afetarem bactérias envolvidas na

fi-xação biológica elo nitrogênio, como

as bactérias diazotróficas (Aznspiril-lum. Herbt:tsfJirillum. Azotohocte1),

ou as si mbióticas ( Rhizobium e Bmdbyrizobium), haverá dano às

plantas que se beneficiam desta

fi-xação biológica ele N₂;

• Organismos produtores de me

-tabóli.tos secundários-Fungos, b::tct

e-rias e ac..:Unomicetos, produtores ele

metabólitossecunclários(enzimas,an

(8)

presença ele pb n.tas Bt, uma vez que

as toxinas Bt podem inibir o

desen-volvimento desses organismos no

solo, e comisso interromper o c ido

de a tiviclades benéficas desses

org:J-nismos, como controle biológico na

-tural.

Há muitos artigos cientfficos que

evidenciam a inocuidaclc

e a

ausên-cia de efeitos na biota do solo. pois

quando presente no solo, parte elas

mol~culas de proteínas C1y é degra

-dada e parte delas ~ aclsorvida às

partículas do solo (não apresentando

efeito algum sobre minhocas. nema-tóicles, protozoários, bactérias e fun

-gos presentes nele) sendo sugerida a leitura elo trabalho ele Rumjanek e

J::onseca !)OO:íl sobre o tema.

Comentários finais

Todos os sistemas ele produção

agrícola causam, inevita \'elmente.

al-gum impacto ambiental. O uso de

plantas e microrganismos, transgêni

-cos ou convencionais constitui mais

um fator de impacto, entre os muitos

já estabelecidos. A genômica e as

ferramentas biotecnológicas podem

apresentar benefícios ambientais,

devendo ser avaliadas no contexto

ele cada ecossistema e prática de

manejo.

Pode-se, com segurança.

con-cluir que; alguns fatores básicos

ele-vem, obrigatoriamente, ser

conside-rados numa avaliação de risco

po-tencial ao meio ambiente. Entre es

-ses fatores, podem ser incluídos:

comportamento já conhecido ou pre

-visível do organismo transgênico;

possibilidade ele multip.licaçào e

dis-seminaç:ào em ecossistemas descri-tos; e impacto conhecido ou previsí-vel sobre plant:~s, animais e

micror-ganismos-não-alvo. O controle de

pragas é essencial para manter a

proclutiYid:lde em níveis elevados,

para que não seja necessária a e

x-pansão ela área agriculturável, favo

-recendo, dessa forma. :1 preservação

ambiental, sem prejuízo da instala

-ção da crescente população.

A avaliação e o estabelecimento

ele métodos para o estudo de impa c

-to ele biopesticielas for;:tm apr

esenta-dos no final dos anos 90. Esses méto

-dos elevem ser estabelecidos para as

pl::tntas transgênicas, uma vez que as

ações voltadas para a segurança

ambiental elevem promover a

pre-servação da bioc!iversidade, a manu

-tenção dos ecossistemas e os

res-pectivos padrões ele sustentabilidade

requeridos. Hespostas a questôes

como sobrevivência, dissemina~ào,

colonjzação e função da liberação

desses organismos em seus hai.Jítats

precisam ser obtidas, bem como

devem ser considerados os aspectos socioeconômicos e os problemas

adv.inclos da ausência de barreiras

políticas ou fronteiras que restrinjam

a disseminação do organismo. Reco

-nhece-se que a liberação de

transgênicosno ambiente sem av

ali-étçào apropriada ele seu impacto

ambiental pode levar a prejuízos

importantes, especialmente em

fun-(,:ào elos cLt..stos elevados da tecnologia.

Além disso, a biocliversidade está

relacionada aos valores e às

tracli-ções culturais elas comunidades, que

nào podem ser relegadas a nível

inferior de consideração.

Ressnlta-se, ainda, que futuras

pesquisas com transgênese devem

incluiT plantas com maior resistência

a doenças e estresses (bióticos e

abióticos\ com maior conteúdo

nutricional, bem como espécies ele

plantas e animais com capacidade

de produzir proteínas ele importân

-cia farmacêutica, como vacinas. Para

tanto são necessárias atuaçà o proativa

dos órgãos públicos de pesquisa e

uma polítka pública que preconize

sua melhor atuação neste cenário de

mudanças econômicas e temológicds.

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