UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
THAISOLIVEIRACORDEIRO
EFEITO DO EXTRATO DA FOLHA DE SPONDIAS MOMBIN SOBRE A SUPERFÍCIE DE DENTES HUMANOS – UM ESTUDO IN VITRO
NATAL/ RN 2019
THAIS
OLIVEIRA
CORDEIRO
EFEITO DO EXTRATO DA FOLHA DE SPONDIAS MOMBIN SOBRE A SUPERFÍCIE DE DENTES HUMANOS – UM ESTUDO IN VITRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Mestra em Clínicas Odontológicas. Orientadora: Profª. Dra. Ruthinéia Diógenes Alves Uchôa Lins.
Co-orientador: Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra Borges.
Natal/RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Cordeiro, Thais Oliveira.
Efeito do extrato da folha de spondias mombin sobre a superfície de dentes humanos - um estudo in vitro / Thais Oliveira Cordeiro. - 2019.
60f.: il.
Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Ciências da Saúde, Pós Graduação em Ciências Odontológicas, Natal, 2019.
Orientadora: Dra. Ruthinéia Diógenes Alves Uchôa Lins. Coorientador: Dr. Boniek Castillo Dutra Borges.
1. Fitoterápicos - Dissertação. 2. Anacardiaceae - Dissertação. 3. Espectroscopia - Dissertação. 4. Dente - Dissertação. I. Lins, Ruthinéia Diógenes Alves Uchôa. II. Borges, Boniek Castillo Dutra. III. Título. RN/UF/BCZM CDU 615.014.2
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus amados pais Nélio e Lúcia, pela confiança depositada e me permitirem alcançar meus sonhos através de seus esforços diários.
Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida, autor do meu destino, guia presente em minha vida!
Aos meus pais, Nélio Oliveira Cordeiro e Mª Lúcia B. Oliveira, meus exemplos de vida por todos os esforços realizados e priorização da minha educação durante toda a vida. Obrigada por acreditarem em mim! Aos meus irmãos Ceiça, por ser fonte de inspiração e me direcionar a ser uma pessoa cada vez melhor, por ser um espelho para todos nós. Ao meu irmão Nélio Filho por viver esse sonho comigo e se fazer presente quando mais precisava, por lagar tudo em Teresina e ser meu amigo e protetor durante o tempo que veio morar comigo, obrigada meu irmão por ser tão companheiro e minha Thaísa e Maria Fernanda que mesmo tão pequenas já me ensinam o quanto a saudade é dolorosa e sempre me deram forças para correr atrás dos meus objetivos. A minha madrasta Maria Antônia e padrasto Justino por todo carinho e cuidado durante todos esses anos. Agradeço pelo amor dedicado durante toda a minha ausência, por serem suporte e alegria na minha vida. Sem vocês, seria impossível realizar este sonho.
Aos meus tios e primos que sempre depositaram carinho e amor em toda minha trajetória.
Aos meus orientadores Prof. Drª. Ruthinéia Diógenes Alves Uchôa Lins e Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra Borges pela atenção, por terem sempre respostas pertinentes, pela disponibilidade durante esses anos de trabalho e por me permitirem ser melhor como pessoa e pesquisadora através de seus exemplos diários de luta, honestidade, competência e fé. Agradeço ainda a professora Larissa Sgarbosa de Araújo Matuda por sua atenção e disponibilidade, por colaborar com esta pesquisa. Aos professores Drª. Diana Ferreira Gadelha de Araújo e Prof. Dr. Bruno Cesar de Vasconcelos Gurgel por serem fonte de inspiração e terem contribuído em minha formação durante o estágio em docência.
As minhas queridas amigas Ana Lúcia, Camila e Carol, que estiveram próximas a mim desde o primeiro dia de aula do mestrado sempre dispostas a serem apoio e sorrisos após dias difíceis. As minhas queridas amigas Angélica e Mayra pela amizade e por me acompanharem nessa trajetória. A amiga Aline e Mel por tornarem meus dias em Natal mais felizes e leves. A Franciara pela companhia durante a pesquisa e por sua amizade. A meu querido Ricardo por sua companhia e amizade que sempre se manteve disposto a tornar minha vida em Natal mais leve com sua presença. Ao meu querido amigo Stephano por se manter sempre presente ainda
precisava. A minha querida amiga Carina Liz por dedicar sua atenção e cuidado durante toda essa trajetória.
Aos meus queridos amigos Juliane, Maxwell, Mayara, Priscila, Larissa e Fabiane por transmitirem carinho e pela manutenção de nossa amizade desde o início da graduação.
Aos alunos do 4º período de odontologia da UFRN, que tanto me ensinaram durante o estágio em docência, estimulando que eu buscasse respostas para suas dúvidas e dividindo suas trajetórias de vida.
Aos secretários da pós-graduação Lucas e Gracinha por serem sempre tão prestativos e gentis em ajudar quando necessário.
A Floriano por sempre se disponibilizar a ajudar com o que lhe compete tecnicamente, por ser prestativo e disponível.
Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Departamento de Ciências Farmacêuticas e ao Departamento de Ciências dos Materiais. A Universidade Federal do Rio Grande do Norte, professores, alunos da pós-graduação e aos funcionários de forma geral, pela oportunidade incrível de ter contato com o conhecimento em sua forma mais inspiradora.
‘’A essência do conhecimento consiste em aplicá-lo, uma vez possuído’’
INTRODUÇÃO: O estudo da fitoterapia na prevenção e no tratamento de doenças tem estimulado pesquisas com plantas medicinais na Odontologia. Dentre essas plantas destaca-se a espécie Spondias mombin por apresentar disponibilidade de matéria-prima e amplo espectro de ações farmacológicas que incluem atividades antimicrobiana, anti-inflamatória, cicatrizante e antioxidante. OBJETIVO: Investigar o efeito do extrato de Spondias mombin L. (cajá) sobre a superfície de dentes humanos. METODOLOGIA: O extrato de cajá foi preparado em sua diluição 1:32=31,25 mg/ml. Trinta dentes humanos foram seccionados (6,0 x 6,0 mm) preservando as proximais. Os fragmentos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (n=10 por grupo) de acordo com os grupos: extrato hidroetanólico de S. mombin L., Digluconato de clorexidina 0,12% e água destilada. Cada fragmento foi imerso nas respectivas substâncias por 1 minuto, 2 vezes ao dia, durante 14 dias. Antes e após a imersão nas soluções, foram realizadas análises de cor, molhabilidade, rugosidade (Ra) e morfologia. O pH das substâncias também foi investigado. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de ANOVA (1 e 2 fatores) e teste de Tukey para múltiplas comparações. RESULTADOS: Não houve diferença estatisticamente significativa em relação a cor entre os grupos. O extrato de cajá e clorexidina 0,12% apresentaram diferenças significativas (p<0,001), enquanto água destilada não apresentou diferenças estatísticas (p>0,005). Quanto a molhabilidade, não houve diferença estatisticamente significativa entre extrato de cajá (p>0,005), clorexidina 0,12% (p>0,005) e água destilada (p>0,005). Para rugosidade, não houve diferença estatisticamente significante entre as substâncias analisadas (p>0,0005). Além disso, não houve diferença estatística entre as substâncias e o tempo de imersão (p <0,0001). O pH médio do extrato hidroetanólico de cajá e clorexidina 0,12% was de 2,95 e 6,5, respectivamente. CONCLUSÃO: O pH do extrato de S.mombin L. é ácido e da clorexidina é neutro. A molhabilidade do extrato hidroetanólico de cajá foi bom tanto quanto a clorexidina. A cor dos fragmentos dentários foi alterada após o protocolo de imersão no extrato hidroetanólico de cajá e clorexidina 0,12%. A rugosidade dos fragmentos dentários analisados se manteve inalterada após o protocolo de imersão nas diferentes soluções testadas. O exame de microscopia eletrônica de varredura mostrou que não houve diferença na superfície do esmalte entre as soluções testadas.
INTRODUCTION:The study of phytotherapy in the prevention and treatment of diseases stimulated the research with medicinal plants in Dentistry. Among these plants, the species Spondia mombin stands out for the availability of raw material and a broad spectrum of pharmacological actions that include antimicrobial, anti-inflammatory, cicatrizant and antioxidant activities. OBJECTIVE: To investigate tooth surface changes regarding cajá (Spondias mombin L.) extract. METHOD: The cashew extract was prepared in its dilution1:16=31,25 mg/ml. Thirty human teeth were sectioned (6.0 x 6.0 mm) preserving the proximal surfaces. Dental fragments were randomly divided into 3 groups (n =10 per group) according to the substances: hydroethanolic extract (31,25 mg/ml), 0.12% chlorhexidine and distilled water. Each fragment was immersed in the respective substance for 1 minute, twice daily for 14 days. Before and after the immersion, color analysis, wettability, roughness (Ra) and morphology as well as the pH levels of the substances were investigated. Data were analyzed statistically by means of ANOVA (one and two factors) and Tukey test for multiple comparisons. RESULTS: There was a statistically significant difference between color in the groups. Cajá extract and 0.12% chlorhexidine presented significant differences (p <0.001), while distilled water showed no statistical differences (p> 0.005). Regarding wettability, there was no statistically significant difference between Cajá extract (p>0.005), 0.12% chlorhexidine, and distilled water (p>0.005). For roughnes, there was no statistically significant difference between the analyzed substances (p>0.0005). In addition, there was no statistically significant difference between the substances and immersion time (p <0.0001). The mean pH of the hydroethanolic extract of cajá and 0.12% chlorhexidine is 2.95 and 6.5, respectively. CONCLUSION: pH of the extract of S.mombin L. is acid of the chlorhexidine is neutral. The wettability of the hydroethanolic extract of cajá was as good as 0.12% chlorhexidine. Color changes were observed after the immersion in hydroethanolic extract of cajá and 0.12% chlorhexidine. Roughness of the analyzed dental fragments remained unchanged after the immersion protocols. Scanning electron microscopy showed no difference in the enamel surface between the solutions tested.
Figura 1. Seccionamento do dente com fresas de diamante em alta velocidade em baixa
rotação...27
Figura 2. Padronização das amostras após seccionamento...27
Figura 3. Preparação do extrato de S. mombin L. ...29
Figura 4. Soluções em análise no medidor de pH...29
Figura 5. Softaware utilizado para análise da gota sobre a superfície dentária (Surftens)...30
Figura 6. Inserção da gota na superfície dentária para análise da molhabilidade ...31
Figura 7. Equipamento de leitura da rugosidade...32
Figura 8. Espectrofotômetro VITA Easyshade® Compact...32
Figura 9. Imagem dos espécimes preparados para análise no MEV-FEG...33
Figura 10. Imagem ilustrativa com a demonstração da metodologia...34
Figura 11. Imagens do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo do extrato de S. mombin L., prévio após o protocolo de imersão na solução...38
Figura 12. Imagens do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo do extrato de S. mombin L., após o protocolo de imersão na solução...39
Figura 13. Imagens obtidas do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da clorexidina, prévio o protocolo de imersão na solução...40
Figura 14. Imagens obtidas do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da clorexidina, após o protocolo de imersão na solução...41
Figura 15. Imagens obtidas do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da água destilada, prévio o protocolo de imersão na solução...42
Figura 16. Imagens obtidas do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da água destilada, após o protocolo de imersão na solução...43
Tabela 1. Resultados das médias (desvios-padrão) da molhabilidade das substâncias testadas...35 Tabela 2. Médias (desvios-padrão) da análise da cor, valores de (ΔE) ...36 Tabela 3. Médias (desvios-padrão) dos valores de rugosidade antes e após os diferentes protocolos de imersão...36
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 18
2.1 AGENTES QUÍMICOS ANTIMICROBIANOS ... 18
2.2 FITOTERAPIA. ... 19
2.2.1 SPONDIAS MOMBIN L...20
2.3 CARACTERÍSTICAS DA SUPERFÍCIE DENTÁRIA...22
2.4 ALTERAÇÕES NA SUPERFÍCIE DENTÁRIA CAUSADAS POR SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS ...23 3 OBJETIVOS ... 25 3.1 OBJETIVO GERAL ... 25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 25 4 MÉTODO ... 26 4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO...26 4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS...26
4.3 SELEÇÃO,PREPARAÇÃO,ARMAZENAMENTO E DIVISÃO DA AMOSTRA ... 26
4.4 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SPONDIAS MOMBIN L. ...28
4.5 DETERMINAÇÃO DO PH DO EXTRATO...29
4.6 PROTOCOLO DE IMERSÃO...29
4.7 AVALIAÇÃO DO ÂNGULO DE CONTATO/MOLHABILIDADE...30
4.8 AVALIAÇÃO DA RUGOSIDADE...31
4.9 AVALIAÇÃO DA COR ...32
4.10 MORFOLOGIA DA SUPERFÍCIE DENTÁRIA ...33
4.11 ANÁLISE DOS DADOS ...34
5 RESULTADOS ...35
5.1 pH DO EXTRATO ...35
5.2 ÂNGULO DE CONTATO/ /MOLHABILIDADE...35
5.3 COR. ...36 5.4 RUGOSIDADE ...36 5.5 MORFOLOGIA ...37 6 DISCUSSÃO ...44 7 CONCLUSÃO ...48 REFERÊNCIAS ...49 ANEXOS ...56 APENDICES ...58
1 INTRODUÇÃO
Desde os primórdios, o uso de plantas medicinais foi preterido por falta de embasamento científico, favorecendo à substituição dos fitoterápicos pelos medicamentos alopáticos. Na década de 70, a Organização Mundial da Saúde (OMS) passou a incentivar o estudo científico das plantas medicinais, já que muitas das encontradas no Brasil ainda não possuíam eficácia científica comprovada (ALELUIA et al., 2015). A partir dos anos 80 e 90, ocorreu um aumento expressivo no mercado mundial de medicamentos fitoterápicos, especialmente nos países industrializados (FERNANDES, 2003; CALIXTO, 2001).
A 8ª Conferência Nacional de Saúde, realizada no ano de 1986, trouxe, entre suas recomendações, a “introdução de práticas alternativas de assistência à saúde no âmbito dos serviços de saúde, possibilitando ao usuário o acesso democrático de escolher a terapêutica preferida”. Com vistas à viabilização dessa recomendação, algumas medidas foram tomadas, como a regulamentação da implantação da fitoterapia nos serviços de saúde nas unidades federadas, por meio da resolução Comissão Interministerial de Planejamento e Coordenação (Ciplan nº 08, de 8 de março de 1988).
Os estudos com plantas medicinais em Odontologia têm sido desenvolvidos como uma tentativa de abrir novos caminhos para o combate às infecções bucais, possibilitando a inserção do uso de fitoterápicos como recursos preventivo e terapêutico na prática diária ambulatorial, especialmente nos serviços de atenção básica ofertados pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Nessa perspectiva, experimentos in vitro sobre a ação antimicrobiana de extratos vegetais têm sido realizados nas últimas décadas (ALELUIA et al., 2015; LIMA, 2015; MACÊDO, 2016; LIMA, 2015; ALVES, 2017) com o intuito de obter agentes químicos antimicrobianos que auxiliem o controle mecânico da microbiota bucal.
Frente às deficiências nos métodos mecânicos de higiene bucal, decorrentes da falta de destreza manual e motivação, agentes químicos antimicrobianos têm sido propostos a fim de inibir o crescimento e a proliferação de microrganismos no ambiente bucal, reduzir a adesão bacteriana às superfícies, modificar a atividade bioquímica desses microrganismos e alterar a ecologia do biofilme dentário para uma microbiota menos patogênica (MARSH, 2010).
Na atualidade o agente antimicrobiano mais utilizado no controle químico da microbiota bucal planctônica e organizada em biofilme é o digluconato de clorexidina 0,12%, em função do seu amplo espectro de ação, baixa toxicidade e elevada substantividade. Todavia, essa substância além de apresentar um custo elevado, não pode ser usada por períodos prolongados, uma vez que nessas situações, altera a microbiota natural e produz efeitos colaterais como manchamento de dentes e restaurações, descamação da mucosa e modificações no paladar (MATOS et al., 2015; HAJIFATTAHI et al., 2016).
As limitações da clorexidina e de outros agentes antimicrobianos sintéticos convencionais tem encorajado a investigação de produtos naturais com maior atividade terapêutica, menor toxicidade, maior biocompatibilidade com os tecidos moles e duros da cavidade oral e menor custo, para o controle químico do biofilme e o tratamento de diferentes infecções orais (ALLAKER, 2009).
Dentre esses produtos naturais cuja ação antimicrobiana tem sido investigada, merece destaque o extrato da folha de Spondias mombin (S. mombin L.), espécie vulgarmente conhecida como cajá, pertencente à família Anacardiacea, que está distribuída em diversas regiões do Brasil e de outros países da América Latina (THADHANI et al., 2012).
Considerando que S. mombin L. tem demonstrado múltiplas atividades biológicas relevantes à manutenção e ao restabelecimento da saúde bucal, podendo assim ser utilizada como matéria prima para o desenvolvimento futuro de novos agentes antimicrobianos químicos, torna-se de extrema importância investigar o seu efeito sobre os tecidos moles e duros da cavidade oral a fim de que o mesmo seja administrado com eficácia e segurança.
Frente ao exposto, o presente estudo se propôs a investigar o pH do extrato de Spondias mombin L. e avaliar o seu efeito sobre a superfície de dentes humanos no que diz respeito às características: cor, rugosidade, morfologia de superfície e molhabilidade, comparando esse efeito com aquele produzido pela solução de digluconato de clorexidina 0,12% sobre essa mesma superfície. A hipótese nula testada foi a de que não havia diferença entre o pH do extrato de Spondias mombin L e o pH da solução de digluconato de clorexidina 0,12% assim como entre os efeitos produzidos por essas substâncias sobre as superfícies de dentes humanos no tocante a todas as variáveis investigadas. Ademais, não existem estudos na literatura vigente que tenham investigado o referido extrato frente à superfície dentária, fato este que destaca o ineditismo do estudo em questão e a sua importante contribuição para os avanços científicos na área odontológica.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Agentes químicos antimicrobianos
Os métodos mecânicos para limpeza dentária devem ser a escolha antes da utilização de qualquer tipo de agente químico para o controle rotineiro do biofilme dentário. O controle químico do biofilme dentário deverá ser empregado de forma suplementar, quando o controle mecânico, no sentido de evitar o acúmulo de bactérias sobre os dentes, não puder ser realizado diariamente ou estiver inadequado (ANDERSON, 2003; LAING et al., 2008).
Frente às limitações dos métodos mecânicos de higiene bucal, agentes químicos antimicrobianos têm sido propostos, principalmente nos casos em que há dificuldade de controle do biofilme dentário e naqueles onde é necessário reduzir demasiadamente a quantidade de microrganismos bucais (MOREIRA et al., 2009; MARSH, 2010).
A clorexidina é um antisséptico de moléculas carregadas positivamente, que apresenta um largo espectro antimicrobiano, pertencente à família de compostos conhecidos como bisbiguanida. Sua molécula se liga, provavelmente, através de forças eletrostáticas, aos grupos fosfato, carboxila ou sulfato, tanto na mucosa bucal quanto nos microrganismos e na película adquirida. Sendo assim, a clorexidina compete com o cálcio, comprometendo a aderência bacteriana e, consequentemente, inibindo a formação do biofilme. Tal substância atinge seu efeito antimicrobiano através de suas atividades bactericida e bacteriostática. Inicialmente, quando aplicada na forma de solução, gel ou verniz, a concentração é tal que o agente é bactericida. Todavia, a clorexidina também se liga às mucosas e superfícies dos dentes e, posteriormente, é liberada de forma lenta, em concentrações bacteriostáticas, durante várias horas. Diante do exposto, o que diferencia a clorexidina dos demais agentes antimicrobianos é a sua substantividade. Sua duração de ação é prolongada pela sua habilidade de adsorção às estruturas bucais e posterior liberação lenta na sua forma ativa (SILVA, 1991; ROSA; ROCHA, 1993; MATTHIJS, 2009; SOET et al., 2002; FEJERSKOV; KIDD, 2005; VAN STRYDONCK et al., 2005).
A clorexidina é um antisséptico catiônico que age contra uma ampla variedade de bactérias, fungos e alguns vírus lipofílicos (DENTON et al, 1991). Seu efeito antibacteriano ocorre através da interação não-específica com o ácido fosfolipídico da membrana celular, causando alterações na permeabilidade da membrana para íons, como potássio, e para constituintes do citosol como aminoácidos e nucleotídeos. Em altas concentrações, a atividade de enzimas associadas à membrana, como dehidrogenases e ATPase, é indiretamente afetada (DAVIES, 1973; BRECX, THEILADE; 1984).
Dentre os agentes antimicrobianos bucais mais utilizados, o digluconato de clorexidina 0,12% merece destaque devido ao seu potencial antimicrobiano e à sua característica de forte adsorção às superfícies bucais (MARSH, 2010; SCHEIE, PETERSEN, 2011). A clorexidina demonstrou ser eficaz contra várias bactérias orais. Devido ao seu amplo espectro antimicrobiano, atuando contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos, também tem sido utilizada para tratar concomitantemente doenças endodônticas (SIQUEIRA JR, PAIVA, RÔÇAS, 2007; VIANNA et al., 2008) periodontais e para prevenir a progressão de cárie (COSYN et al.,2006; DUARTE, LOTUFO, PANNUTI , 2008). Visto que a clorexidina promove alguns efeitos colaterais como pigmentação dos dentes, alteração do paladar e descamação da mucosa, os antissépticos que têm como princípio ativo o digluconato de clorexidina a 0,12% ou 0,2% apresentam média elevada para o potencial de redução da microbiota bucal quando comparados a outros antissépticos (MATOS et al., 2015).
As propriedades de um antisséptico ideal incluem: estabilidade, baixa tensão superficial, letalidade em baixas concentrações, ausência de toxicidade e poder de penetração. No entanto, nenhum produto disponível no mercado possui todos esses requisitos, o que justifica os efeitos colaterais e a pouca eficiência apresentada por alguns (MOREIRA et al., 2009; ZANIN et al., 2007). Diante dos efeitos colaterais do digluconato de clorexidina 0,12% e da sua possibilidade de causar resistência bacteriana, torna-se necessário investigar as propriedades antimicrobianas de novas substâncias e, com a rica diversidade da flora do Brasil, parece salutar o estudo de produtos derivados de plantas como princípio ativo de possíveis agentes antimicrobianos (MOTA; TURRINI; POVEDA, 2015).
O surgimento de cepas microbianas resistentes a uma grande variedade de antibióticos tem se tornado um problema significante para a saúde pública. As principais causas dessa resistência estão associadas ao uso excessivo de antibióticos nos tratamentos por prescrições médicas e à capacidade de sobrevivência intracelular de algumas bactérias, induzidas por certas infecções que impedem o acesso do medicamento em foco. Observa-se que o alto custo dos medicamentos se apresenta como um problema relevante para a população de baixa renda, gerando assim a busca por novos métodos alternativos viáveis, como o uso dos fitoterápicos (YUNES et al., 2001).
2.2 Fitoterapia
Atualmente o uso de fitoterápicos tem se intensificado em vários países, especialmente no Brasil, que possui uma flora rica e diversa, com grande potencial para o desenvolvimento dessa ciência (ASSIS, 2009; MOLINA et al., 2008; MONTES et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2007; TOMAZZONI, NEGRELLE, CENTA, 2006).
Os fitoterápicos e fitocosméticos fazem parte de um setor do mercado e da sociedade, tanto que existem políticas públicas específicas para sua reprodução enquanto atividades econômica e social, como ocorre com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Os medicamentos fitoterápicos são descritos pela ANVISA como preparações obtidas empregando-se exclusivamente matéria-prima vegetal ativa, podendo estar disponíveis na forma sólida ou líquida. Os extratos líquidos são normalmente preparados com etanol e água (ANVISA, 2017).
A partir da Resolução - RDC Nº 26, DE 13 DE MAIO DE 2014 - Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos (BRASIL,2019). São considerados produtos tradicionais fitoterápicos os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas vegetais, cuja segurança e efetividade seja baseada na tradicionalidade de uso e que sejam caracterizados pela constância de sua qualidade (ANVISA, 2017).
Em relação à fitoterapia, o Decreto Federal nº 5.813 (22/06/2006) aprovou a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) e criou o Grupo de Trabalho Interministerial, com participação da sociedade civil, para elaboração do Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Ressalta-se que esse Decreto possui o objetivo de garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional (BRASIL, 2019).
Em 2008, foi realizado o Fórum para Regulamentação das Práticas Integrativas e Complementares à Saúde Bucal, onde foi discutido a regulamentação da Fitoterapia, Homeopatia, Acupuntura, Terapia Floral e Laserterapia. Levando-se em consideração as recomendações da Organização Mundial de Saúde, e dos avanços das políticas públicas de incremento às práticas integrativas nas Ciências da Saúde, e sendo da competência do Conselho Federal de Odontologia supervisionar a ética profissional, zelando pelo bem da profissão, resolve através do Resolução CFO-82/2008, reconhecer e regulamentar o uso de Práticas Integrativas e Complementares à Saúde bucal (Conselho Federal de Odontologia,2019).
Estudos avaliando fitoterápicos como Cravo da Índia, Romã, Malva, Tanchagem, Amoreira, Sálvia, Camomila, entre outras, tem sido investigada na odontologia por serem alternativas viáveis no tratamento de aftas, gengivites e abscessos bucais (Oliveira et al.,2007). Essas plantas têm apresentado ação bactericida e bacteriostática sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas constituintes do biofilme dental (Pereira et al., 2006).
A espécie Spondias mombin L. pertence à família Anacardiaceae e é distribuída em todo o Brasil, sendo o seu fruto conhecido por diversos nomes regionais, incluindo taperebá na Amazônia, pequeno cajá no Sudeste, cajamirim no sul, ou simplesmente Cajá no nordeste (BOSCO, 2000).
O cajá é rico em vitaminas A, B1, B2 e C, cálcio, fósforo, potássio, carotenoides e taninos, sendo por isso utilizado na culinária. A madeira de cajá é empregada na indústria de fabricação de móveis, enquanto a casca e as folhas são usadas na medicina popular (SACRAMENTO, 2000).
Ajao, Shonukan & B. Femi-Onadeko, (1995), trata-se do primeiro relato da validação do uso popular do S.mombin como antibacteriano através de um estudo in vitro, avaliaram os extratos aquoso e etanólico de folhas de cajazeira (S. mombin) e observaram que as zonas de inibição, Para
as bactérias Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli, são todos resistentes a 10 pg de estreptomicina. Entretanto, esses mesmos organismos são suscetíveis a 25 µL de extratos alcoólicos de S. mombin.
A atividade antimicrobiana do extrato de S. mombin L. é atribuída em parte à presença de um derivado do ácido anarcádico, que possui a capacidade de inibir a enzima β-lactamase, assim como o faz o ácido clavulânico, antibacteriano comercialmente conhecido (CORTHOU et al.,1994). Diversos estudos preliminares realizados in vitro (LIMA, 2015; LIMA, 2016; MACÊDO-COSTA, 2016; ALVES, 2017) confirmaram essa atividade do extrato de S. mombin L. frente a bactérias bucais e microrganismos superinfectantes e oportunistas.
Estudos fitoquímicos, (ASUQUO, et al., 2012; LIMA, 2015; CABRAL et al., 2016) identificaram no extrato de S. mombin L a presença de taninos, saponinas, esteróis, triterpenos, flavonoides, alcaloides e compostos fenólicos. A presença desses componentes no extrato de S. mombin L não apenas justifica a sua ação antibacteriana, como também indica atividades de natureza antiviral, antioxidante, anti-inflamatória e antitumoral.
Em um estudo in vitro (SACRAMENTO, 2000), os extratos aquosos e etanólico de folhas de cajazeira (S. mombin) inibiram o crescimento bacteriano, tendo sido este o primeiro relato da validação do uso popular dessa espécie como antibacteriano A atividade antibacteriana do cajá ocorre pela presença do derivado de ácido anarcádico, isolado das folhas de S. mombin, que possui a capacidade de inibir a enzima β-lactamase, atividade atribuída também ao ácido clavulânico, antibacteriano comercialmente conhecido.
Outros compostos secundários foram isolados das folhas e cascas dessa espécie, identificados como ácido 2-O-cafeicol-(+)-alohidroxicítrico e butil éster de ácido clorogênico, que mostraram considerável atividade antiviral (CORTHOUT, 1994), bem como o ácido elágico e a quercetina, isolados das folhas, que apresentaram atividade antiviral contra o vírus da dengue tipo 2 (SILVA, 2011).
Essas plantas são capazes ainda de produzir algumas substâncias com potencial antimicrobiano, cujas propriedades bacteriostáticas e fungiostáticas têm sido comprovadas em vários trabalhos científicos (LIMA et al., 2010).
Extratos vegetais mostraram-se eficientes na inibição do crescimento de uma ampla variedade de microrganismos, incluindo fungos, leveduras, bactérias e parasitas. Com o aumento dos microrganismos resistentes às substâncias antimicrobianas já conhecidas, observou-se que a espécie Spondias mombin continha substâncias que lhe conferiam propriedades medicinais para o controle de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (YUNES et al., 2001).
Ao avaliarem in vitro a ação antimicrobiana do extrato de S. mombin L. frente a bactérias bucais do gênero Streptococcus (LIMA, 2016) e microrganismos superinfectantes e oportunistas (LIMA, 2015; MACÊDO-COSTA, 2016; ALVES, 2017) diferentes experimentos confirmaram a eficácia dessa atividade. Componentes comotaninos, saponinas, esteróis, triterpenos, flavonoides, alcaloides e compostos fenólicos foram identificados no extrato de S. mombin L através da triagem fitoquímica do mesmo realizada em diferentes estudos (ASUQUO et al., 2012; LIMA, 2015; CABRAL et al., 2016), os quais associaram a presença dessas frações às atividades antimicrobiana, anti-inflamatória, anti-oxidante e antitumoral do extrato em questão.
2.3 Características da superfície dentária
O esmalte dentário é o tecido mais mineralizado do organismo, sendo de origem ectodérmica, formado pelas células do epitélio interno do órgão do esmalte, recobrindo a coroa dos dentes (KATCHBURIAN et al.,1996). O processo de formação do esmalte (amelogênese) tem seu início na fase de coroa do desenvolvimento do dente e consiste basicamente em dois estágios: secreção, onde os ameloblastos produzem o esmalte parcialmente mineralizado (30%), e maturação, que consiste na deposição de mineral, remoção de matéria orgânica e água (TEN CATE, 2001).
Segundo Ferraris (2006), o esmalte, também chamado de tecido adamantino, cobre a dentina em sua porção coronária, oferecendo proteção a esse tecido subjacente. É o tecido mais duro do organismo, por ser constituído por milhões de prismas altamente mineralizados, além de ser acelular, avascular e apresentar dificuldades de reparar-se frente a um trauma. A permeabilidade do esmalte é escassa, atuando, no entanto, como uma membrana semipermeável, que permite a difusão de água e de alguns íons.
O esmalte é sintetizado pelos ameloblastos e essas células são sensíveis às variações metabólicas que ocorrem no organismo. Estrias de Retzius são linhas que aparecem durante a formação do esmalte. Com a mineralização da matriz do esmalte, elas são depositadas e promovem o crescimento linear do esmalte. Linhas incrementais acentuadas aparecem devido à variação de
deposição de mineral em alguns pontos ou podem estar relacionadas a alterações metabólicas oriundas de problemas sistêmicos que afetam a amelogênese (TEN CATE, 1998; AVERY, 2000). A linha neonatal é um alargamento da estria de Retzius, que se forma durante a transição das vidas intra e extrauterina e pode ser observada em caninos e primeiros molares decíduos. A proeminência desta linha reflete mudanças nutricionais e ambientais sofridas no momento do nascimento (TEN CATE, 1998; AVERY, 2000).
Bandas de Hunter-Schreger resultam de um fenômeno óptico produzido pela diferente inclinação de grupos de prismas adjacentes. São visualizadas, microscopicamente, como bandas alternadas claras e escuras que resultam da incidência luminosa, pois a luz é transmitida ao longo eixo de um grupo de prismas e de outro grupo adjacente não. Alterando a direção de luz, as bandas podem ser invertidas (TEN CATE, 1998; AVERY, 2000). Na zona de esmalte aprismático, não se observa o efeito das bandas de Hunter-Schreger (AVERY, 2000). Próximo à dentina, existem áreas prismáticas hipomineralizadas, com aspecto ramificado, denominadas tufos. Aparecem entre os grupos de prismas de esmalte, formando um ângulo reto com a junção amelodentinária. Tais defeitos são preenchidos com material orgânico (TEN CATE, 1998; AVERY, 2000).
As lamelas de esmalte são camadas verticais da matriz, parcialmente mineralizadas, que se estendem da junção amelodentinária até a superfície do esmalte. São preenchidas com resíduos orgânicos originários da cavidade bucal ou com proteínas do esmalte. As lamelas são mais estreitas e mais longas que os tufos de esmalte e são consideradas como uma anomalia do processo de cristalização do tecido (TEN CATE, 1998; AVERY, 2000). Como a dentina se forma antes do esmalte, alguns processos odontoblásticos ficam aprisionados no esmalte. Essas extensões deixadas no esmalte pelos prolongamentos dos odontoblastos são os fusos de esmalte (AVERY, 2000).
2.4 Alterações na superfície dentária causadas por substâncias químicas
Os métodos mecânicos para limpeza dentária devem ser a escolha antes da utilização de qualquer tipo de agente químico para o controle rotineiro do biofilme dentário. O controle químico do biofilme dentário deverá ser empregado de forma suplementar (ANDERSON, 2003; LAING et al., 2008).
As manchas dentais reconhecidamente extrínsecas têm como característica o alcance de áreas superficiais externas dos dentes, mais frequentemente o esmalte, pelas substâncias químicas pigmentadas que terminam por se precipitar na superfície dental. Resultam, na maioria das vezes,
do contato intermitente dos alimentos com as estruturas que constituem o meio bucal, em particular as unidades dentais, desde sua erupção (BARATIERI et al.,2001; WATTS, ADDY, 2001; PONTEFRACT, 2004).
A relativa permeabilidade do esmalte dental, agravada pela ocorrência de poros, se configura como um elemento facilitador ao surgimento das manchas externas, favorecendo, dessa forma, a agregação e a deposição das mais diversas substâncias de baixo peso molecular, como as que estão presentes no café, no chá preto, no tabaco, em vinhos tintos, no chimarrão, na beterraba e em bebidas à base de cola (BARATIERI et al.,2001; WATTS, ADDY, 2001; PONTEFRACT, 2004).
O consumo das substâncias citadas acelera o processo de impregnação de pigmentos e corantes na estrutura dental. Ao concluir essa análise, Baratieri et al., (2001) destacam que a rugosidade da própria superfície, a porosidade interna, a presença de trincas e a ocorrência de fendas, sulcos e depressões, presentes na estrutura superficial do esmalte dental, podem vir a contribuir para essa forma de manchamento.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito do extrato hidroetanólico de Spondias mombin L. sobre a superfície de dentes humanos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Investigar o pH do extrato de S. mombin L.;
b) Verificar a rugosidade da superfície dentária frente ao referido extrato; c) Avaliar a molhabilidade do extrato de S. mombin L. na superfície dentária; d) Observar a coloração da superfície dentária antes e após o contato com tal extrato;
e) Avaliar a morfologia da superfície dentária antes e após o contato com tal extrato; f) Comparar o pH do extrato de S. mombin L. com o pH do digluconato de clorexidina
0,12%
g) Comparar os efeitos do extrato de S. mombin L. sobre as características de rugosidade, molhabilidade, coloração e morfologia da superfície dentária com aqueles produzidos pelo digluconato de clorexidina 0,12% sobre essas mesmas características de superfície.
4 MÉTODO
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Este estudo é caracterizado como um ensaio laboratorial “in vitro”, cujas variáveis de resposta são pH, molhabilidade, rugosidade, cor e morfologia de superfície. Os fatores em estudo são o extrato de S. mombin L. e a solução de digluconato de clorexidina 0,12%.
4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A presente pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), CAAE 90985118.5.0000.5292, tendo seu parecer (060970/2018) aprovado, de acordo com as normas e diretrizes regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos, regidas pela resolução nº466/2012 – CNS. Respeitando a identidade dos voluntários, foi utilizado um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (APÊNDICE A), no qual foi explicitado o risco/benefício da pesquisa.
4.3 SELEÇÃO, PREPARAÇÃO, ARMAZENAMENTO E DIVISÃO DA AMOSTRA
A seleção da amostra ocorreu por conveniência, cujo tamanho foi determinando com base em estudos anteriores que analisaram o efeito de soluções sobre a superfície dentária, sendo assim coletados 30 dentes terceiros molares humanos hígidos, parcialmente erupcionados, extraídos por razões cirúrgicas de pacientes de uma Clínica Escola de Odontologia do Rio Grande do Norte e doados pelos mesmos após o consentimento informado ter sido obtido no âmbito de um protocolo revisado e aprovado pelo CEP da UFRN, Natal, Brasil.
Após a extração dos dentes, foi realizada a remoção de detritos orgânicos dos mesmos, os quais foram seccionados longitudinalmente, separando as faces proximais (Mesial-Distal) com fresas de diamante, em alta velocidade, sob refrigeração abundante com água e baixa rotação (Figura 1). As superfícies proximais desses dentes foram seccionadas e padronizadas (Figura 2) e as amostras obtidas armazenadas em tubos com água destilada a 37°C, a fim de evitar seu ressecamento e desmineralização.
Figura 1. Seccionamento do dente com fresas de diamante, em alta velocidade, sob baixa rotação.
Fonte: Autora (2019).
Figura 2. Padronização das amostras após o seccionamento.
A amostra (n=30) do experimento foi distribuída em 3 (três) grupos, sendo eles: ● Grupo 1. Extrato hidroetanólico de Spondias mombin L., n=10;
● Grupo 2. Digluconato de Clorexidina 0,12 %, n= 10; ● Grupo 3. Água Destilada (grupo controle), n=10.
O extrato hidroetanólico de Spondias mombin L. foi usado em sua diluição 1:32 = 31,25 (mg/mL), diluído em álcool e água destilada. Essa concentração do extrato de Spondias mombin L. foi definida com base no estudo de Lima, Lins e Costa (2017), que verificou que o extrato de Spondias mombin L. apresentou atividade antimicrobiana superior ao digluconato de clorexidina 0,12% somente a partir da referida concentração.
4.4 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SPONDIAS MOMBIN L.
A matéria prima vegetal foi coletada em 2011. As folhas de S. mombin foram adquiridas numa fazenda particular na região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN com coordenadas (Tábua- RN S S° 28’ 14’’ W 35° 27’ 37’’). A amostra coletada foi depositada no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e identificado pelo botânico Alan Roque (exsicata 12252). Antes de coletado o material, foram obtidas a autorização do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBio)/Ministério do Meio Ambiente (processo 35017) e a autorização para o acesso ao patrimônio genético com finalidade de pesquisa científica via Plataforma Carlos Chagas/CNPq (processo 010688/2012-9). Houve também o registro da pesquisa na plataforma do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) , cadastrado com o número (A9CFA46).
As folhas coletadas de S. mombin foram submetidas à secagem, na sombra, sob temperatura ambiente por duas semanas. Logo após, as folhas foram trituradas em um moinho de facas. A partir de 100 g da droga vegetal de S. mombin L., foi preparado um extrato por maceração, que consistiu em deixar a droga vegetal em contato com etanol: água destilada (80:20, v/v) durante sete dias e posterior liofilização. Após esse período, o extrato foi filtrado, obtendo-se assim o extrato hidroetanólico das folhas. O extrato obtido foi concentrado sob pressão reduzida, com auxílio de um evaporador rotatório, à temperatura de 45°C, até a eliminação total do solvente orgânico. A preparação desse extrato foi realizada no Laboratório
de Farmacognosia do Departamento de Farmácia – Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Figura 3), sob colaboração com a professora Drª. Silvana M. Zucolotto.
Figura 3. Preparação do extrato de S. mombin L.
Legenda: A: Pesagem da folha do extrato hidroetanólico de S. mombin L. após trituração. B: Evaporador rotatório a 45 º para eliminação do solvente. Fonte: Autora, (2019).
4.5 DETERMINAÇÃO DO PH DO EXTRATO
Para determinação do pH das soluções extrativas, 10,0 mL de cada solução em teste foi analisada em um phmetro calibrado com soluções tampões de fosfato e acetato, com pH 7,0 e 4,0, respectivamente, à 25 °C. As análises foram realizadas em triplicata (SILVA, 2016). Foi utilizado o medidor de pH de bancada (LUCA-210-E, LUCADEMA, São José do Rio Preto, Brasil) (Figura 4).
Figura 4. Soluções em análise no medidor de pH.
Legenda: A: Leitura no medidor de pH da solução de Digluconato de Clorexidina 0,12%. B: Leitura no medidor de pH do extrato de Spondias mombin L. Fonte: Autora (2019).
4.6 PROTOCOLO DE IMERSÃO
B
A
Cada corpo de prova foi posicionado individualmente no interior de um frasco contendo 10mL da solução específica para cada grupo, durante 1min, sob agitação, duas vezes ao dia, com intervalos de 12/12h, por 15 dias. No intervalo entre as imersões, as amostras foram armazenadas em saliva artificial (PELINO et al., 2018; TORRES et al., 2019). Amostras irregulares ou manchadas foram descartadas.
4.7 AVALIAÇÃO DO ÂNGULO DE CONTATO/MOLHABILIDADE
As propriedades físico-químicas da superfície do esmalte foram caracterizadas por medidas de ângulo de contato, utilizando o método da gota séssil para determinar a energia livre de superfície. Depois, 0,5μL de cada líquido foi dispensado, com pipeta automática, na superfície do esmalte de cada fragmento dentário, utilizando uma agulha de 0,5mm de calibre (NEVES et al., 2018). As imagens foram capturadas por uma câmera Nikon e analisadas no software Surftens 4.7 Automatic (OEG GmbH, Frankfurt, Oder, Alemanha), adaptando suas configurações para “água destilada” e “análise em 4 pontos”. Nesse software, a imagem foi aberta, ampliada, centralizada e, posteriormente, recebeu as 4 (quatro) marcações: a primeira exatamente na intercessão do ângulo formado entre a superfície do espécime e a gota; a segunda e a terceira marcações em dois locais aleatórios da superfície da gota; e, por fim, a marcação no outro ponto de intercessão entre a superfície da amostra e o final da gota. Automaticamente, após a marcação do último ponto, o software traçou o ângulo de contato da gota com o espécime e forneceu o seu valor. Cada imagem foi analisada em triplicata. E os dados dos ângulos de contato de cada grupo foram submetidos à análise (Figuras 5 e 6).
Figura 5. Softaware utilizado para análise da gota sobre a superfície dentária (Surftens).
Figura 6. Inserção da gota na superfície do dente para análise da molhabilidade.
Fonte : Autora (2019).
4.8 AVALIAÇÃO DA RUGOSIDADE
A análise da rugosidade da superfície foi realizada no Laboratório de Pesquisa -BLOCO G, da Faculdade de Odontologia de Presidente Prudente da Universidade do Oeste Paulista, antes (T1) e depois (T2) do processo de envelhecimento artificial nas amostras dos grupo 1, 2 e 3, utilizando o Rugosímetro Hommel Etamic W10 (JENOPTIK Industrial Metrology Germany GmbH) (Figura 7). Esse instrumento é equipado com uma agulha de diamante, com um raio de 2mm. Para fazer medições da rugosidade, a agulha é movida a uma velocidade constante de 0,5mm/s com uma carga de 0,7mN. O valor de corte foi definido em 0.25mm. A rugosidade superficial foi caracterizada pela rugosidade média (Ra), que é o valor da média aritmética de todas as distâncias absolutas do perfil de rugosidade a partir da linha de centro, dentro do comprimento de medida. Valores de Ra para cada amostra foram tomados ao longo do diâmetro sobre um comprimento padrão de 0,25 mm. Três traços (paralelo, oblíquo e perpendicular) foram registrados em cada amostra, em três diferentes locais (LIMA et al., 2015; SOUZA et al., 2018).
Figura 7. Equipamento de leitura da rugosidade.
Legenda: Hommel Etamic W10 (JENOPTIK Industrial Metrology Germany GmbH). Fonte: JENOPTIK (2019).
4.9 AVALIAÇÃO DA COR
Essa análise foi realizada no Laboratório de Pesquisa - BLOCO G, da Faculdade de Odontologia de Presidente Prudente da Universidade do Oeste Paulista .Todos os corpos de prova foram submetidos a uma análise cromática inicial, por meio de um espectrofotômetro VITA Easyshade® Compact, (Figura 8), que foi calibrado de acordo com as recomendações do fabricante, com a avaliação de cor calculada através do Sistema CIE L*a*b*, estabelecido pela Comission Internacionale de I’Eclairaga – CIE. Este consiste de dois eixos a* e b*, que possuem ângulos retos e representam a dimensão da tonalidade ou cor (a*: proporção vermelho-verde; b*: proporção amarelo-azul). O terceiro eixo é o brilho, representado pela letra L*, que é perpendicular ao plano a*b*. Com tal sistema, qualquer cor pode ser especificada com as coordenadas L*, a*, b* (STOBER et al., 2001; SCHULZE et al., 2003, PELINO et al, 2017).
Figura 8. Espectrofotômetro VITA Easyshade® Compact
O método de envelhecimento consistiu na imersão das amostras nas três soluções testadas (clorexidina, extrato e água destilada), por 1 minuto, duas vezes ao dia, durante 15 dias. A estabilidade de cor foi determinada pela diferença (ΔE) entre as coordenadas obtidas das amostras antes e após o procedimento de envelhecimento. A mudança total de cor, ΔE, é comumente usada para representar uma diferença de cor e é calculada a partir da fórmula: ΔE = √ (ΔL*)2 + (Δa*)2 + (Δb*)2
4.10 MORFOLOGIA DA SUPERFÍCIE DENTÁRIA
Essa análise foi realizada no Departamento de Ciências dos Materiais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Para a análise morfológica, as amostras foram submetidas ao Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV-FEG Zeiss Auriga 40. 1, Alemanha) (Figura 9), onde foram feitas leituras com aumentos de 1000X, 2000X, 3000X e 4000X e fornecidas imagens. A análise inicial foi realizada previamente ao protocolo de imersão, sem nenhum tratamento. E após o protocolo de imersão foram submetidas a análise final, as amostras foram metalizadas e montadas em bases de alumínio, com fita metálica dupla face.
Figura 9. Imagem dos espécimes preparados para análise no MEV-FEG.
Figura 10. Imagem ilustrativa com a demonstração da metodologia.
Legenda: A: cortes horizontais e verticais ao longo eixo para obtenção de faixa de superfície de esmalte dentária; B: seccionamento das faces vestibular e lingual/palatina para obtenção de superfície proximal mesial e distal com tamanho padronizado; C: Rugosímetro Hommel Etamic W10 (JENOPTIK Industrial Metrology Germany GmbH) para avaliação da rugosidade antes e após a imersão nas soluções; D: Espectrofotômetro VITA Easyshade® Compact utilizado na leitura da alteração de cor antes e após o protocolo de imersão; E:Análise no MEV FEG/EDS para mapeamento e quantificação da composição química dos fragmentos dentários antes e após protocolo de imersão; F:gotejamento de gota padronizada para análise do ângulo de contato de cada solução antes e após o protocolo de imersão; G: Distribuição dos grupos, com protocolo de imersão utilizado.
Fonte: Autora (2019).
4.11 ANÁLISE DOS DADOS
Os dados foram apresentados como médias + erro padrão da média. Os valores finais das amostras de cada teste foram submetidos ao teste de normalidade através do teste de Kolmogorv – Sminorv. O ângulo de contato e a cor foram examinados pela análise de variância (ANOVA) um fator e a rugosidade foi examinada pela análise de variância (ANOVA) dois fatores e pelo teste de Tukey (p <0,05). Os testes estatísticos foram realizados, utilizando-se o software GraphPad Prisma 8. A morfologia e o pH foram analisados descritivamente.
5 RESULTADOS
5.1 pH DAS SUBSTÂNCIAS TESTADAS
Ao avaliar o pH das susbtâncias testadas, as médias obtidas foram 2,95 para o extrato hidroetanólico de S. mombin L. e 6,5 para o digluconato de clorexidina 0,12% (Gráfico 1).
Gráfico 1. Resultados das médias do pH do extrato hidroetanólico de S.mombin L. e do Digluconato de Clorexidina 0,12%.
Fonte: Autora, (2019).
5.2 ÂNGULO DE CONTATO/MOLHABILIDADE
Não houve diferença estatisticamente significativa (p>0,05) entre as substâncias testadas quanto à molhabilidade. As comparações entre os grupos estão listadas na Tabela 1. Tabela 1. Médias (desvios-padrões) da molhabilidade das substâncias testadas.
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais expressam que não houve diferença estatisticamente significativa nas linhas (p>0,05). Fonte: Autora (2019).
EXT CLX AD
ÂNGULO DE
CONTATO
5.3 COR
No que diz respeito à cor da superfície dentária, somente a água destilada não provocou alterações estatisticamente significativas (p>0,05). Tanto o extrato de S. mombin L. quanto o digluconato de clorexidina 0,12% alteraram significativamente (p<0,05) a cor da superfície dentária, especialmente o extrato, que exibiu as mais elevadas médias de análise de cor. As comparações entre os grupos estão listadas na Tabela 2.
Tabela 2. Médias (desvios-padrões) das análises de cor, valores de (ΔE).
EXT CLX AD
COR 14,78±(3.05)A 7,96±(3,34)B 4,48±(0.86)C
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes denotam que houve diferenças estatisticamente significativas nas linhas (p < 0,001).
Fonte: Autora, (2019).
5.4 RUGOSIDADE
Não houve diferença estatisticamente significativa (p>0,05) entre os três grupos investigados com relação à rugosidade de superfície produzida, nem mesmo quando o fator tempo foi considerado, comparando-se as médias dos valores de rugosidade produzidos pela mesma substância em tempos diferentes (inicial – T1 e final – T2) e também as médias dos valores de rugosidade produzidos por substâncias diferentes dentro de um mesmo tempo (T1 ou T2). Ou seja, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas quanto à rugosidade de superfície produzida pelas três substâncias testadas, independentemente do tempo de avaliação.As comparações intra e intergrupos quanto à rugosidade de superfície em diferentes tempos de avaliação (inicia e final) estão listadas na Tabela 3.
Tabela 3. Médias (desvios-padrões) dos valores de rugosidade em tempos diferentes.
SUBSTÂNCIAS TEMPO INICIAL FINAL Extrato de Spondias mombin L. 4,69± (1,01) Aa 4,17± (1,23) Aa Clorexidina 5,45± (1,65) Aa 4,56± (1,52) Aa
Médias seguidas de letras maiúsculas iguais expressam que não houve diferença estatisticamente significativa nas linhas (p>0,05). Médias seguidas de letras minúsculas iguais expressam que não houve diferença estatisticamente significativa entre as colunas (p>0,05). Fonte: Autora (2019).
5.5 MORFOLOGIA
Analisando-se as imagens das fotomicrografias dos fragmentos dentários, realizadas previamente e após o protocolo de imersão nas soluções, através da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), foi possível notar que as amostras dos grupos 1 e 2 apresentaram uma superfície com ranhuras e prismas de esmalte, enquanto aquelas do grupo 3 (grupo controle) , em que a solução utilizada foi a água destilada, apresentaram imagens exibindo um padrão de caraterísticas inerentes à superfície dentária (Figuras 11, 12, 13, 14, 15 e 16). Verificou-se ainda que existia uma camada superficial que conferia uma superfície regular a todos os grupos, condizente com os dados obtidos através da análise da rugosidade. Ademais, foi possível avaliar, de forma mais definida, as análises finais, devido à metalização das superfícies, que trouxeram à tona uma melhor definição das imagens.
Figura 11. Imagens do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo do extrato de S. mombin L., antes e após o protocolo de imersão na solução.
Análise Inicial
Legenda- Fotomicrografias da disposição da superfície dentária com 2000x em modo de elétrons secundários (SE) e retroespalhados (BSE) sob voltagem de 1,0 kV. Fonte: Autora (2019).
1 2 3 4 6 7 8 9 5 10
Figura 12. Imagens do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo do extrato de S. mombin L., após o protocolo de imersão na solução.
Análise Final
Legenda- Fotomicrografias da disposição da superfície dentária com 2000x, em modo de elétrons secundários (SE) e retro-espalhados (BSE), sob voltagem de 1,0 kV. Fonte: Autora, (2019).
1 2 3 6 7 8 4 9 5 10
Figura 13. Imagens obtidas do MEV, que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da clorexidina, previamente ao protocolo de imersão na solução.
Análise Inicial
Legenda- Fotomicrografias da disposição da superfície dentária com 2000x em modo de elétrons secundários (SE) e retro-espalhados (BSE) sob voltagem de 1,0 kV. Fonte: Autora, (2019).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 14. Imagens obtidas do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da clorexidina, após o protocolo de imersão na solução.
Análise Final
Legenda- Fotomicrografias da disposição da superfície dentária com 2000x em modo de elétrons secundários (SE) e retro-espalhados (BSE) sob voltagem de 1,0 kV. Fonte: Autora, (2019).
1 2 3 6 7 8 9 4 10 5
Figura 15. Imagens obtidas do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da água destilada, prévio ao protocolo de imersão na solução.
Análise Inicial
Legenda- Fotomicrografias da disposição da superfície dentária com 2000x em modo de elétrons secundários (SE) e retro-espalhados (BSE) sob voltagem de 1,0 kV.Fonte: Autora, (2019).
4 10 5 9 8 3 v 1 7 6 2
Figura 16. Imagens obtidas do MEV que ilustram a superfície dentária dos elementos selecionados para o grupo da água destilada, após o protocolo de imersão na solução.
Análise Final
Legenda- Fotomicrografias da disposição da superfície dentária com 2000x em modo de elétrons secundários (SE) e retro-espalhados (BSE) sob voltagem de 1,0 kV. Fonte: Autora, (2019)
1 2 3 10 9 8 7 6 5 4
6 DISCUSSÃO
Este estudo avaliou o efeito do extrato hidroetanólico das folhas de Spondias mombin L. sobre a superfície de dentes humanos. A cor dos espécimes do grupo do extrato foi significativamente diferente da cor dos espécimes de outros grupos. Portanto, a hipótese nula de que o extrato não alteraria a estabilidade de cor dos dentes foi aceita assim como a hipótese nula de que o extrato não seria neutro. A hipótese nula de que o extrato não alteraria a rugosidade e que o extrato não teria um ângulo de contato ideal foram rejeitadas.
A rugosidade superficial é o conjunto das irregularidades microgeométricas que resultam em uma superfície decorrente da interação com processos de desgaste e que são formadas por numerosos sulcos e ranhuras mais ou menos variáveis em forma, direção e profundidade (NOVASKI,1994). O valor de Ra (rugosidade aritmética) é o mais comumente utilizado na odontologia. A rugosidade aritmética é expressa em micrômetros (µm) e é obtida pela média aritmética entre os picos e vales encontrados dentro de uma linha central ao longo da área avaliada (TEIXEIRA et al., 2005). Neste experimento foi utilizado o método adequado para detecção da rugosidade antes e após o protocolo de imersão das substâncias testadas.
Para garantir a estética em longo prazo, a estabilidade de cor e a rugosidade da superfície, critérios importantes são considerados. Superfícies ásperas são mais propensas à coloração devido à sua elevada capacidade de retenção (Lu et al., 2005). Assim, ao avaliar as substâncias utilizadas neste estudo, através do teste de rugosidade, ao comparar os resultados intra grupos e inter-grupos, em relação aos diferentes tempos (antes e após o protocolo de imersão), verificou-se que não houve diferença entre as substâncias testes e o controle.
O baixo pH da substância extrato não afetou a rugosidade, levando em consideração que o extrato foi testado em superfície de dentes humanos, algo que pode ter tornado este resultado distinto dos estudos dos autores mencionados. Mesmo o pH do extrato sendo mais ácido, não alterou a rugosidade, fato este que pode ser justificado pela análise da molhabilidade, por ser tão bom tanto quanto a clorexidina, e também pode explicar as imagens geradas pelo MEV (Figuras 11,12) sem riscos evidentes após o protocolo de imersão no extrato. Dantas et al., (2015) definiram molhabilidade como a capacidade do líquido molhar um sólido, exemplificando-a como uma gota de líquido em repouso sobre uma superfície sólida sobre a qual, o líquido pode ou não se espalhar. A água sendo um líquido polar tende a se espalhar sobre uma superfície com alta energia superficial e a formar uma gota em áreas com baixa energia. Uma maneira de quantificar esse comportamento é a análise do ângulo de contato de
uma gota séssil, descrita pelo ângulo da secção da gota de um material líquido, sobre uma superfície em equilíbrio.
Molhamento é o grau de espalhamento na qual a gota-fluído escoa pela superfície sólida. A medida do molhamento é o ângulo de contato, que é formada entre a gota-esfera e o plano do substrato. Se o ângulo for pequeno o molhamento é bom, se o ângulo for maior que 90º graus o molhamento é ruim. Um bom molhamento significa que existe forte atração entre as moléculas da substância e o sólido. Essa atração é influenciada pela energia superficial (FEJERSKOV; KIDD, 2011). Neste estudo obteve-se um bom resultado para essa variável investigada, levando em consideração que a solução testada, o extrato de S. mombin L. apresentou ângulo menor que 90º, logo o molhamento do extrato hidroetanólico na superfície de dentes humanos é tão bom quanto a clorexidina que apresentou resultados similares.
A estabilidade da cor pode ser avaliada visualmente e por instrumentos específicos. A metodologia utilizada no presente estudo está de acordo com estudos anteriores, que utilizaram a espectrofotometria e o sistema de coordenadas CIE L * a * b * (CRUVINEL et al., 2010; GURDAL et al., 2002). O sistema CIE L * a * b * foi escolhido para avaliar a variação de cor (DE), pois é adequado para a determinação de pequenas alterações de cor e possui vantagens como repetibilidade, sensibilidade e objetividade (FESTUCCIA et al., 2012). Neste estudo, foi utilizada a espectrofotometria, na qual resultados foram automaticamente fornecidos através de um sistema de coordenadas (CIE L * a* b*) (PAUL et al., 2002; WITKOWSKI et al.,2012; FESTUCCIA et al., 2012; GUDALR et al., 2002).
Diante das variáveis das análises finais, os autores relataram que valores de ΔE variando de 1 a 3 são perceptíveis a olho nu (Lee et al., 2000). A mudança de cor pode ser detectada a olho nu para valores de ΔE iguais ou superiores a um, ou por colorimetria ou espectrofotometria quanto (Paul et al., 2002; Kim-Pusateri et al., 2009; Witkowski et al.,2012; Festuccia et al., 2012). Como pode ser visto na seção de resultados, a solução do extrato de S. mombin L. resultou em mudanças clinicamente inaceitáveis na cor dos espécimes dentários utilizados assim como a clorexidina, em comparação, com o grupo controle que produziu os menores valores de ΔE=4,48 (p > 0,05). Resultado contrário ao que foi observado no estudo de Moreira et al., (2013), que investigaram diferentes enxaguatórios bucais na superfície de dentes bovinos e obtiveram em seus resultados que não foi notada mudança de cor dentária após exposição à clorexidina.
No presente estudo o extrato hidroetanólico de S.mombin L. alterou a cor dos fragmentos dentários, apresentando ΔE =14,78. Corroborando com nossos achados através do estudo de
Guimarães et al., (2006), os participantes da pesquisa notaram que houve mudança na coloração dentária e após o uso da clorexidina por 14 dias.
Um fato que pode estar relacionado com a alteração de cor após o protocolo de imersão do extrato de S.mombin é que este apresenta dentre seus componentes taninos, que estão associados a adstringência. Componente também presentes em bebidas ricas em tanino, como chá, café e vinho tinto (PRINZ , LUCAS, 2000) . Este componente apresenta atividades bactericidas e fungicidas que ocorrem por três características gerais comuns aos dois grupos (taninos hidrolisáveis e taninos condensados): complexação com íons metálicos; atividade antioxidante e sequestradora de radicais livres; habilidade de complexar com outras moléculas, principalmente proteínas e polissacarídeos (MELLO, SANTOS, 2001).
Clinicamente, o efeito das soluções estudadas pode ser modificado por vários fatores que não foram replicados neste estudo in vitro. Entre esses fatores, a saliva poderia diluir ou tamponar o pH do extrato hidroetanólico de S.mombin, reduzindo o efeito, diminuindo a coloração dos fragmentos dentários que foram imersos nessas soluções e ainda por meio do auxílio com a higienização mecânica através da escovação diária.
No estudo de Akasapu, Hegde, Murthy (2018) observaram e compararam a morfologia e a morfometria da superfície do esmalte em várias superfícies da dentição permanente e em seus achados encontraram padrões de prisma bem definido predominantemente em ambos os dentes anteriores e posteriores permanentes. Os fragmentos dentários analisados através do MEV neste estudo, demonstraram que após o protocolo de imersão foi observada a presença de prismas suavemente arredondados, dispostos uniformemente na superfície, com contornos de prisma delineados. Nos dentes analisados neste estudo, não houve o uso de quaisquer métodos físicos ou químicos previamente, e somente após as análises iniciais, as amostras foram submetidas ao protocolo de imersão. Outro fator é que na primeira leitura as amostras não foram metalizadas a fim de que fosse evitada concitar uma modificação na superfície dentária e somente após o protocolo de imersão as amostras foram metalizadas para a análise final.
Uma das limitações do estudo é que in vitro o resultado deste estudo não pode ser aplicado diretamente em situações clínicas. Fatores como saliva, higiene bucal, temperatura e pH também podem afetar nossos resultados. Futuros estudos in vivo são necessários para confirmar nossos resultados e a implementação clínica (GRACCO et al., 2015). Nesta pesquisa, todo esforço foi feito para manter todas as variáveis tão próximas das condições reais quanto possível, uma vez que a superfície do esmalte foi o foco desta investigação. Grande cuidado foi
tomado para selecionar as superfícies com a menor quantidade de dano pré-existente. A simulação do envelhecimento correspondeu ao protocolo de uso comumente utilizado por Guimarães et al., (2006) e Soygun et al., (2017). Adicionalmente, foram mantidas a cada 12 horas os fragmentos dentários submersos em saliva artificial (Gel de CMC 2,5%-8%, Xarope simples 20%, Flavorizante cereja 0,1%, Glicerina 10% e Água para soluções orais).
Os achados do presente estudo trazem à literatura importantes resultados e reflexões acerca do efeito do extrato de S. mombin L. e de outras soluções, como o Digluconato de
clorexidina 0,12%, sobre a superfície de dentes humanos. Contudo, outros trabalhos devem ser realizados a fim de averiguar outros possíveis efeitos de soluções enxaguatórias bucais na superfície dentária de forma longínqua.
7 CONCLUSÃO
Os resultados sugerem que:
1. O pH do extrato hidroetanólico de Spondias mombin L. é ácido e o do Digluconato de clorexidina 0,12% é neutro;
2. A molhabilidade do extrato hidroetanólico de S. mombin L é semelhante a molhabilidade da solução de Digluconato de clorexidina 0,12%;
3. Tanto o extrato hidroetanólico de S. mombin L. quanto à solução de Digluconato de clorexidina 0,12% modificam a coloração da superfície dentária;
4. Nenhuma das soluções testadas altera a rugosidade da superfície dentária;
5. O exame de microscopia eletrônica de varredura mostra que não há diferença na morfologia de superfície do esmalte entre as soluções testadas.
