Estágio em Pesquisa e Trabalho de Conclusão de Curso em Biomedicina
Pesquisa dos genes estruturais, adeB e adeC, e regulatórios, adeR e
adeS, do sistema de bomba de efluxo em isolados de Acinetobacter sp.
Thaís dos Santos Hain
Porto Alegre Julho/2013
Thaís dos Santos Hain
Pesquisa dos genes estruturais, adeB e adeC, e regulatórios, adeR e
adeS, do sistema de bomba de efluxo em isolados de Acinetobacter sp.
Trabalho de conclusão de curso de graduação apresentado ao Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Gertrudes Corção
Porto Alegre Julho/2013
ÍNDICE 1. Abreviaturas 4 2. Introdução expandida 5 3. Artigo 10 3.1.Resumo 10 3.2.Introdução 11 3.3.Materiais e métodos 12 3.4.Resultados 15 3.5.Discussão 18 3.6.Referências 20 4. Conclusão e perspectivas 23
1. ABREVIATURAS
Ami amicacina
Caz ceftazidima
CCCP carboxilciadina m-clorofenilhidrazona DNA ácido desoxirribonucleico
dNTP desoxinucleotídeo trifosfato EDTA ácido etileno-diamino-tetracético
Imp imipenem
MgCl2 cloreto de magnésio
MIC Minimal Inibitory Concentration
mL mililitro
mM milimolar
ng nanograma
pb pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction
TAE tampão Tris-Acetato-EDTA Tris tris (hidroximetil) aminometano
µg micrograma
2. INTRODUÇÃO EXPANDIDA
Acinetobacter é um gênero de cocobacilos Gram-negativos, não fermentadores,
pleomórficos, não móveis e aeróbios restritos [Peleg et al. 2008], que compreende pelo menos 36 espécies diferentes [Peleg et al. 2012]. Está amplamente distribuído na natureza, em vários tipos de solo, água e alimentos. É comumente encontrado na pele e, eventualmente, pode colonizar o trato respiratório superior, sendo assim considerado um micro-organismo não patogênico em pessoas saudáveis [Dickshoorn et al. 2007]. No entanto, nas últimas décadas, algumas espécies de Acinetobacter têm se apresentado como patógenos oportunistas, responsáveis por um grande número de infecções nosocomiais [Magnet et al. 2001], que tem como alvo principal pacientes com tempo de hospitalização prolongado, severamente doentes e com baixa imunidade [Howard et al. 2012].
As infecções por Acinetobacter podem acontecer de forma esporádica ou em surtos, acometendo principalmente o sistema respiratório e o trato urinário [Huang et al. 2008]. A pneumonia associada à ventilação mecânica é uma manifestação muito frequente [Peleg et al. 2008], além de infecções de pele, tecidos moles, feridas e traumas, sistema nervoso central e septicemia [Huang et al. 2008; Coyne et al. 2011]; mais raramente podem ocorrer também endocardite e endoftalmite [O’Shea 2012]. As espécies de maior importância clínica são
Acinetobacter baumannii, Acinetobacter pittii (anteriormente chamado genoespécie 3) e Acinetobacter nosocomialis (anteriormente chamado genoespécie 13TU) [Nemec et al. 2011],
reconhecidos como responsáveis pela maioria dos casos de infecção, tanto na comunidade quanto em ambiente hospitalar [O’Shea 2012]. Esse grupo de espécies é chamado atualmente de complexo A. baumannii [Peleg et al. 2008].
Algumas características chamam a atenção da comunidade médico-científica para
Acinetobacter spp., uma delas é sua capacidade de sobreviver e crescer em diversas
condições, inclusive em superfícies secas. Isto contribui para sua disseminação em praticamente qualquer lugar, mesmo em ambiente hospitalar [Abbo et al. 2005], onde pode encontrar pacientes vulneráveis e ser transmitido pelo contato entre as pessoas ou transportado pelo ar [Dijkshoorn et al. 2007]. Outra característica, que pode ser a de maior importância clínica, é o fato de Acinetobacter spp. apresentar resistência intrínseca a diversas classes de agentes antimicrobianos [Coyne et al. 2011], sendo esta a maior dificuldade no controle e no tratamento das infecções, uma vez que o tratamento de primeira escolha nem sempre funciona. Como agravante, tem sido descrito que Acinetobacter possui grande
habilidade em adquirir diversos mecanismos de resistência [Vila et al. 2007], o que faz desse micro-organismo uma causa maior de grande preocupação em ambiente hospitalar, já que a assepsia dos materiais e aparelhos médicos pode não ser eficaz. Além disso, a resistência do patógeno aumenta com o uso indiscriminado de biocidas e antimicrobianos, prática esta que leva à seleção de micro-organismos multirresistentes [Kawamura-Sato et al. 2010], altamente capazes de sobreviver e infectar pacientes vulneráveis, causando infecções de difícil e caro tratamento, que são potencialmente letais [Dijkshoorn et al. 2007].
Existem diversos mecanismos de resistência aos antimicrobianos (Figura 1). Em
Acinetobacter, os mais comuns são: alterações da permeabilidade da membrana externa, com
a redução da expressão ou mutações nos genes que codificam as porinas, impedindo a entrada de antimicrobianos na célula; alteração de sítios alvo da ligação de antimicrobianos às proteínas da membrana citoplasmática; produção de enzimas, utilizadas no mecanismo de inativação enzimática das drogas, tais como β-lactamases e carbapenemases, e expressão de bombas de efluxo específicas [Munoz-Price e Weinstein 2008].
Esses mecanismos podem ser intrínsecos, uma vez que o patógeno pode apresentar ilhas de resistência, as quais possuem grupos de genes para multirresistência [Li e Nikaido 2009], ou adquiridos, quando ocorre transferência de material genético exógeno ou mutações em genes endógenos, estruturais ou regulatórios [Yoon et al. 2013].
As bombas de efluxo constituem uma classe de transportadores, responsáveis pela excreção de subprodutos metabólicos e substâncias tóxicas, captação de nutrientes e comunicação intercelular [Li e Nikaido 2004]. Diversos antimicrobianos são considerados substratos para as bombas de efluxo, agindo desta forma, podem aumentar a expressão gênica codificante para estas bombas, desenvolvendo um alto perfil de multirresistência [Magnet et al. 2001].
As bombas de efluxo são agrupadas em famílias, cada uma com um mecanismo específico. São elas: a família ABC (ATP binding cassete), que realiza o efluxo através da hidrólise de ATP; os transportadores MATE (multidrug and toxic compound extrusion), que estão presente em todos os organismos, utilizam força próton motiva e gradiente de íons sódio no efluxo; a superfamília SMR (small multidrug resistance), que é o menor sistema de efluxo, e também funciona através da força próton motiva; a superfamília dos facilitadores principais (MFS – major facilitator superfamily), que é o maior grupo de transportadores ativos secundários e utiliza a força próton motiva no sistema de antiporte; e a superfamília de transportadores resistência-nodulação-divisão (RND), que também funcionam por meio de um sistema de antiporte dependente da força próton motiva e são muito difundidos entre bactérias Gram-negativas [Li e Nikaido 2009; Piddock 2006a]. Em Acinetobacter, a resistência está associada às duas últimas, a superfamília dos facilitadores principais e a família resistência-nodulação-divisão.
O sistema de efluxo RND funciona transportando, em antiporte, prótons e drogas; por meio dele é catalisado o efluxo de diversos agentes antimicrobianos e quimioterápicos [Piddock 2006b]. Transportadores RND consistem de um componente de membrana interna pertencente à superfamília de transportadores secundários RND, um fator formador de canal de membrana externa (OMP) e uma proteína periplasmática de fusão de membranas (MFP) [Li e Nikaido 2004]. O fator OMP gera um túnel contínuo que abrange a membrana externa e o espaço periplásmico e a MFP atua aproximando as membranas interna e externa ou estabilizando a estrutura formada por OMP [Magnet et al. 2001]. A interação desses
componentes forma um sistema tripartido, que permite o transporte de substâncias através de ambas as membranas em bactérias Gram-negativas.
Estudos indicam que a membrana externa de Acinetobacter apresenta permeabilidade especialmente baixa, o que contribui para a eficiência do sistema de efluxo nesse organismo [Li e Nikaido 2009]. Adicionalmente, cepas multirresistentes muitas vezes apresentam determinantes genéticos mediadores de resistência a β-lactâmicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas.
A superexpressão de três sistemas RND: AdeABC, AdeFGH e AdeIJK (Figura 2), tem sido associada com fenótipo de multirresistência em A. baumannii [Yoon et al. 2013]. AdeIJK é responsável pela resistência intrínseca, atua no efluxo de β-lactâmicos, cloranfenicol, tetraciclinas, eritromicina, fluoroquinolonas, ácido fusídico, novobiocina e trimetoprima.
AdeFGH confere resistência a cloranfenicol, clindamicina, trimetoprima, tetraciclinas,
tigeciclina e sulfonamida; e desempenha um papel importante na resistência adquirida, assim como o sistema AdeABC, que é o sistema principal nesse tipo de resistência [Coyne et al. 2011].
Figura 2: Representação de operons dos principais sistemas de efluxo RND, em Acinetobacter.
AdeABC foi identificado no ano de 2001, em cepas multirresistentes de Acinetobacter baumanii [Manget et al. 2001]. É responsável pela redução da suscetibilidade para um amplo
espectro de antimicrobianos, tais como aminoglicosídeos, tetraciclinas, β-lactâmicos, fluoroquinolonas, cloranfenicol e trimetoprima [Nemec et al. 2007; Magnet et al. 2001]. É composto por três genes agrupados e contíguos: adeA, adeB e adeC que codificam, respectivamente, uma proteína transmembrana, um transportador e uma proteína de membrana externa, característicos da família RND [Piddock 2006a]. Esses três genes são
orientados diretamente e parecem formar um operon, precedido por um sistema regulatório composto pelos genes adeR e adeS [Marchand et al. 2004]. A redução da suscetibilidade associada ao sistema de efluxo AdeABC tem sido atribuída à sua superexpressão constitutiva e à mutações nos genes regulatórios, embora alguns estudos indiquem que a superexpressão do gene adeB, que codifica o transportador em si, seja o principal fator associado à multirresistência [Magnet et al. 2001; Dal et al. 2013].
Estudos anteriores deste grupo de pesquisa detectaram genes de resistência, determinaram o perfil de suscetibilidade [Ferreira 2010] e verificaram a presença de bombas de efluxo em isolados de Acinetobacter sp., clínicos e ambientais [Marchetti DP 2010]. O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presença dos genes estruturais e regulatórios da bomba
AdeABC nesses isolados e comparar os resultados obtidos com os resultados dos estudos
prévios, confirmando a presença da bomba e identificando os genes essenciais para seu funcionamento, a fim de elucidar os possíveis mecanismos de resistência, em isolados de
Acinetobacter sp., coletados em hospitais de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
Considerando a importância clínica de Acinetobacter, a elucidação dos seus mecanismos de resistência é de extrema importância, de modo que muito tem sido estudado sobre cepas multirresistentes; mesmo assim, ainda há muito para descobrir e discutir nesse assunto, uma vez que o entendimento sobre como se dá o fenômeno da multirresistência é a chave para contornar os grandes problemas por ela gerados.
3. ARTIGO
Pesquisa dos genes estruturais adeB e adeC, e regulatórios adeR e adeS, do
sistema de bomba de efluxo em isolados de Acinetobacter sp.
Thaís Hain1, Gertrudes Corção2
1Acadêmica em Biomedicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brasil
2
Professor Associado IV do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brasil
Endereço para correspondência: Rua Sarmento Leite, 500 Porto Alegre, RS, Brasil Cep: 90050-170
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Email: thaishain.ufrgs@gmail.com; corcao@ufrgs.com
3.1.RESUMO
Nas últimas décadas, algumas espécies de Acinetobacter têm se apresentado como patógenos oportunistas, causando diversas infecções nosocomiais. Por apresentarem resistência intrínseca a diversas classes de antimicrobianos e serem altamente capazes de adquirir outros mecanismos de resistência, esses micro-organismos tendem a desenvolver um fenótipo multirresistente, sendo assim uma causa maior de preocupação em ambiente hospitalar. Uma das principais formas de resistência em Acinetobacter é a expressão de bombas de efluxo; o sistema AdeABC, da família resistência-nodulação-divisão, utiliza a força próton motiva para catalisar o efluxo de diversos agentes antimicrobianos. Neste estudo, a presença dos genes estruturais, AdeB e AdeC, e dos regulatórios, AdeR e AdeS, da bomba
AdeABC foi pesquisada em isolados multirresistentes de Acinetobacter sp., através da técnica
de reação em cadeia da polimerase. Dentre os 98 isolados testados, 31 apresentaram todos os genes da bomba AdeABC, 30 tiveram todos os genes ausentes e os outros 37 apresentaram pelo menos um dos genes. Esses dados foram comparados com os resultados dos testes de concentração inibitória mínima, obtidos em um estudo anterior, demonstrando a presença e identificando os genes essenciais para o funcionamento da bomba AdeABC. Quando a presença da bomba não foi verificada, outros possíveis mecanismos foram sugeridos como responsáveis pela formação do perfil de multirresistência.
3.2.INTRODUÇÃO
Acinetobacter é um gênero de cocobacilos Gram-negativos, que compreende
atualmente pelo menos 36 espécies [Peleg et al. 2012]. Pode ser encontrado em vários tipos de solo, água e alimentos, assim como na pele. A maioria das espécies de Acinetobacter é considerada não-patogênica para o ser humano, porém, nas últimas décadas, Acinetobacter spp. têm se apresentado como patógenos oportunistas, responsáveis por um grande número de infecções nosocomiais [Magnet et al. 2001]. Essas infecções, que podem ocorrer de forma esporádica ou em surtos, acometem principalmente pacientes em estado grave e com tempo de internação prolongado. As principais manifestações são no sistema respiratório e urinário, incluindo pneumonia e septicemia [Coyne et al. 2011].
As espécies de maior importância clínica, A. baumanii, A. pittii e A. nosocomialis, são responsáveis pela maioria dos casos de infecção. Esse grupo de espécies é conhecido como complexo A. baumannii [Peleg et al. 2008]. A principal característica que faz de
Acinetobacter uma causa maior de preocupação em ambiente hospitalar, é a resistência
intrínseca a diversas classes de agentes antimicrobianos [Coyne et al. 2011], além da alta capacidade de desenvolver diversos mecanismos de resistência, que tornam as infecções difíceis de tratar e potencialmente letais [Dijkshoorn et al. 2007].
Mecanismos de resistência podem ser intrínsecos, como na produção de enzimas e membranas de baixa permeabilidade, ou adquiridos, através da transferência de material genético exógeno ou de mutações em genes endógenos [Yoon et al. 2013]. Os principais mecanismos apresentados por Acinetobacter são: alterações na permeabilidade da membrana externa, alterações nos sítios de ligação de antimicrobianos, produção de enzimas utilizadas na inativação das drogas e expressão de bombas de efluxo específicas [Munoz-Price e Weinstein 2008].
As bombas de efluxo constituem uma classe de transportadores, responsáveis pela excreção de subprodutos metabólicos e substâncias tóxicas, captação de nutrientes e comunicação intercelular [Li e Nikaido 2004]. Diversos antimicrobianos são considerados substratos para essas bombas, podendo levar ao aumento da expressão gênica codificante e desenvolver, em conjunto com outros mecanismos, um alto perfil de multirresistência [Magnet et al. 2001]. Em Acinetobacter, a resistência está associada principalmente à família resistência-nodulação-divisão (RND), pertencente ao grupo de bombas de efluxo dependentes da força próton motiva.
O sistema RND funciona através do antiporte de prótons e drogas, através dele é catalisado o efluxo de diversos agentes antimicrobianos e quimioterápicos [Piddock 2006b]. Em 2001 foi identificado, em cepas multirresistentes de A. baumannii, um sistema de efluxo tripartido denominado AdeABC, que é responsável pela redução da suscetibilidade para um amplo espectro de antimicrobianos [Magnet et al. 2001]. AdeABC, composto por três genes agrupados e contíguos: adeA, adeB e adeC que codificam, respectivamente, uma proteína transmembrana, um transportador e uma proteína de membrana externa, característicos da família RND. Esses três genes são orientados diretamente e precedidos por um sistema regulatório, composto pelos genes adeR e adeS [Marchand et al. 2004]. A redução da suscetibilidade associada a esse sistema tem sido atribuída a sua superexpressão constitutiva e a mutações nos genes regulatórios, embora alguns estudos apontem o gene adeB como principal fator associado à multirresistência [Dal et al. 2013].
Para contornar os problemas gerados por micro-organismos multirresistentes, a identificação e a compreensão dos mecanismos de resistência por eles utilizados são fundamentais. Estudos anteriores deste grupo de pesquisa detectaram genes de resistência [Ferreira 2010] e verificaram a presença de bombas de efluxo em isolados de Acinetobacter sp. clínicos e ambientais [Marchetti DP 2010]. O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presença dos genes estruturais e regulatórios da bomba AdeABC e comparar os resultados obtidos com os dos estudos prévios, a fim de elucidar os possíveis mecanismos de resistência, em isolados de Acinetobacter sp., coletados em hospitais de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
3.3.MATERIAIS E MÉTODOS
Isolados de Acinetobacter sp.
Os isolados de Acinetobacter sp. utilizados neste estudo são provenientes de amostras coletadas em hospitais de Porto Alegre, RS, Brasil. Os isolados de ambiente foram obtidos a partir de amostras coletadas de efluente hospitalar, enquanto os isolados clínicos foram obtidos nos laboratórios de análises de quatro hospitais da cidade, na mesma época em que as amostras de efluente foram coletadas, estas em três hospitais. A coleta, isolamento e identificação foram realizados em um estudo anterior [Ferreira 2010]. Depois destas etapas, os isolados foram armazenados em caldo BHI com 20% de glicerol e mantidos a -20°C.
Cepas selecionadas para análise
Para análise no presente estudo, foram selecionados 72 isolados clínicos e 26 isolados de efluente hospitalar, totalizando 98 isolados de Acinetobacter sp.. A escolha das cepas foi baseada em dois estudos anteriores.
No primeiro, o perfil de suscetibilidade antimicrobiana dos isolados foi determinado através da técnica de disco difusão em Ágar Muller-Hinton, os antimicrobianos utilizados foram: amicacina, aztreonam, ceftazidima, cefepime, ciprofloxacina, gentamicina, imipenem, meropenem, piperacicila-tazobactam, polimixona B e ticarcilina-clavulanato [Ferreira 2010]. Os isolados resistentes a quatro ou mais classes de antimicrobianos foram considerados multirresistentes.
No segundo estudo, foi realizado o teste de concentração inibitória mínima (MIC) para as cepas classificadas como multirresistentes. No MIC foram usados três antimicrobianos, amicacina (AMI), ceftazidima (CAZ) e imipenem (IMP). Os isolados foram considerados resistentes aos compostos quando a MIC foi maior que 64 µg/ml para AMI, 32 µg/ml para CAZ e 16 µg/ml para IMP. Foi realizado ainda um segundo MIC, desta vez com a presença de um desacoplador da força próton motiva, a carboxilciadina m-clorofenilhidrazona (CCCP); a redução da MIC em pelo menos duas vezes verifica a presença de sistemas de bombas de efluxo [Marchetti DP 2010].
Amplificação dos genes adeB, adeC, adeR e adeS
A extração do DNA dos isolados multirresistentes, através do método de fervura, segundo Misbah et al, foi realizada num estudo anterior [Gusatti CS 2011]. O material genético ficou armazenado em freezer a -20°C; alíquotas foram diluídas em água Mili-Q na concentração de 1:5, que após alguns testes se mostrou a mais adequada para a utilização nas reações de cadeia da polimerase (PCR). Esse material foi utilizado no presente estudo como alvo para detecção dos genes estruturais - adeB e adeC - e regulatórios - adeR e adeS - constituintes da bomba de efluxo AdeABC.
A tabela 1 mostra os oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados, suas respectivas sequências e temperaturas ótimas de anelamento, segundo informações do fabricante.
Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados nas amplificações e respectivas
temperaturas de anelamento
Primer Sequência Tm (50mM NaCl)
adeB-F 5' - TTA ACG ATA GCG TTG TAA CC - 3' 50.1°C adeB-R 5' - TGA GCA GAC AAT GGA ATA GT - 3' 51.1°C adeC-F 5' - AGC CTG CAA TTA CAT CTC AT - 3' 51.8°C adeC-R 5' - TGG CAC TTC ACT ATC AAT AC - 3' 49.6°C adeR-F 5' - ACT ACG ATA TTG GCG ACA TT - 3' 51.4°C adeR-R 5' - GCG TCA GAT TAA GCA AGA TT - 3' 50.7°C adeS-F 5' - TTG GTT AGC CAC TGT TAT CT - 3' 51.0°C adeS-R 5' - AGT GGA CGT TAG GTC AAG TT - 3' 53.3°C
Todas as amplificações foram realizadas em um aparelho termociclador Mastercycler Personal (Eppendorf), nas seguintes condições: um período inicial de desnaturação a 94°C por 2min, seguido de 30 ciclos de anelamento, com temperatura específica para cada par de
primers (Tabela 2), extensão a 72°C e desnaturação a 94°C, cada uma das etapas com duração
de um minuto e, ao fim dos 30 ciclos, uma etapa de extensão a 72°C, com duração de oito minutos. Para cada reação foram utilizados: 1µM de cada primer, 1U (unidade) de Taq polimerase, 1x de tampão de reação da Taq polimerase, 100ng de DNA bacteriano e as respectivas concentrações de MgCl2 e dNTPs da tabela abaixo, em um volume final de 25µL.
Tabela 2. Tamanho esperado, temperatura de anelamento, e
concentrações específicas para cada gene amplificado
Gene Tamanho/pb Tm [ ] MgCl2 [ ] dNTPs
adeB 541 50°C 3,5mM 0,3mM adeC 560 49°C 4,5mM 0,3mM adeR 447 52°C 3mM 0,2mM adeS 544 52°C 3mM 0,2mM
Observando que as condições ideais eram as mesmas para os genes adeR e adeS, e os tamanhos esperados de seus fragmentos tinham uma diferença distinguível de aproximadamente 100pb, as reações desses genes foram realizadas no sistema multiplex.
Os produtos da reação de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, a corrida ocorreu em tampão TAE 1x, a 80mV, por aproximadamente uma hora, o corante utilizado foi o brometo de etídeo. Os géis foram visualizados e fotografados com o equipamento KODAK 1D.
3.4.RESULTADOS
Os resultados obtidos nas reações de amplificação realizadas neste estudo, que mostram a presença ou ausência dos genes adeB, adeC, adeR e adeS, estão apresentados nas tabelas 3 e 4, referentes aos isolados de efluente hospitalar e isolados clínicos, respetivamente. As tabelas também apresentam a informação sobre a presença de adeA e os resultados dos testes de concentração inibitória mínima (MIC) e destes testes na presença de um desacoplador da força próton motiva (CCCP), obtidos de um trabalho anterior [Marchetti 2010], para facilitar a comparação entre os resultados dos estudos.
Tabela 3. Presença dos genes de AdeABC, resultado do MIC para os antimicrobianos e MIC
na presença de CCCP, em isolados de efluente hospitalar.
Presença dos genes Amicacina* Ceftazidima* Imipenem* adeA* adeB adeC adeR adeS MIC CCCP MIC CCCP MIC CCCP A3 + + + + + 32 32 256 256 - - A5 + - + + + <1 0 8 0 - - A16 + - + + + <1 0 16 0 - - A21 + - + + + 8 8 64 64 - - A23 + - + + + <1 0 8 0 - - A26 + + + + + <1 0 8 0 - - A81 - - + + + 32 16 128 128 - - A104 - - - <1 0 >512 >512 - - A117 - - + + + 16 8 8 8 128 128 D2 - - - <1 0 32 32 - - D7 - - - <1 0 16 16 - - G9 + - + + + <1 0 32 0 - - G13 + - + + + <1 0 64 64 - - G35 - - - <1 0 16 0 - - G46h + + + + + <1 0 16 0 - - G47h + + + + + 32 16 16 0 32 32 C22h - - - <1 0 8 0 32 32 O1 + + + + + <1 0 8 0 - - O2 + + + + + 32 32 >512 >512 - - O3 + - + + + 8 4 16 8 - - O4 + - + + + <1 0 16 16 - - O6 + - + + + 32 0 16 8 32 32 O15 + - + + + <1 0 8 0 - - O18 + - + + + <1 0 8 0 32 32 O33 + + + + + <1 0 64 32 - - O34 + + + + + <1 0 >512 >512 - -
*Os resultados de adeA e dos MICs foram obtidos em estudo anterior [Marchetti 2010].
Dentre os 26 isolados de efluente, oito (30,8%) apresentaram todos os genes do sistema AdeABC e cinco (19,23%) foram negativos para todos eles. Nos demais isolados,
onze (42,31%) apresentaram todos os genes exceto adeB e os outros dois não tinham a presença de adeA, nem de adeB (tabela 3).
Dos 72 isolados clínicos, 23 (31,94%) apresentaram os cinco genes e 25 (34,72%) foram negativos para todos os genes. Nos demais, sete (9,72%) mostraram ausência apenas de
adeB, cinco tinham mais de um gene ausente, incluindo adeB e 14 apresentaram o gene adeB
mas tiveram pelo menos um dos outros genes ausentes.
Entre os isolados ambientais pode ser observada maior proporção de isolados portadores dos genes para o sistema AdeABC do que entre os clínicos. Foi observada também uma proporção maior de isolados com ausência do gene adeB, mesmo entre cepas consideradas resistentes e com fenótipo de bomba de efluxo.
Tabela 4. Presença dos genes de AdeABC, resultado do MIC para os antimicrobianos e MIC
na presença de CCCP, em isolados clínicos.
Presença dos genes Amicacina* Ceftazidima* Imipenem* adeA* adeB adeC adeR adeS MIC CCCP MIC CCCP MIC CCCP 16 - - - <1 0 - - 16 16 23 + - + + + <1 0 - - 16 16 30 - - - <1 0 - - 32 32 32 + - - + + 32 32 - - 32 32 44 + - - + + <1 0 - - - - 50 + - + + + <1 0 - - - - 52 + - + + + 32 32 - - - - 53 + + - + + 128 64 - - 128 128 54 + - + + + <1 0 - - - - 70 + + + + + 256 32 - - 32 16 79 + + - + + <1 0 - - - - 103 + + + + + <1 0 8 2 256 2 104 + - - + + 64 16 64 64 32 32 105 + - + + + 8 8 - - - - 106 + + + + + <1 0 - - - - 115 - - - <1 0 - - - - 117 - - - 32 32 8 0 64 4 122 - - - <1 0 8 8 256 128 123 - - - 2 0 256 256 64 <1 124 - - - <1 0 - - - - 133 - - - 16 8 64 64 64 64 143 - - - <1 0 - - - - 146 - - - 16 16 512 512 128 64 147 - - - 16 4 - - 16 16 149 + + + + + 256 32 - - - - 150 - - - 32 32 - - - - 158 + + + + + <1 0 - - 16 16 188 + + - - - 64 8 - - 32 32
Tabela 4. Continuação
Presença dos genes Amicacina* Ceftazidima* Imipenem* adeA* adeB adeC adeR adeS MIC CCCP MIC CCCP MIC CCCP 190 - - - <1 0 128 8 256 8 194 + - - - - 16 8 64 16 256 128 199 - - - 4 4 128 128 256 64 202 - - - 4 0 512 0 128 32 204 - - - 64 4 - - - - 205 + + - - - <1 0 64 0 16 <1 217 + + + + + 64 64 - - - - 220 + + + + + 32 32 - - 128 64 233 + + + + + <1 0 - - - - 239 - - - <1 0 - - - - 250 + + + - - <1 0 - - - - 254 + + + + + 16 4 64 64 2 2 255 + + + + + 128 128 64 64 2 2 261 + + + + + 32 0 - - - - 264 + + + + + 2 2 8 8 8 <1 265 + + - + + 4 4 - - - - 266 + + - + + 32 8 - - - - 267 - - - <1 0 - - 16 16 269 - + + + + 256 128 128 128 16 <1 270 + + - + + <1 0 8 0 64 32 273 + + + + + <1 0 16 0 64 64 274 + + + + + 8 8 >512 >512 2 2 275 + + + + + <1 0 - - 64 64 279 + + + + + 16 16 16 0 64 64 280 + + + + + 64 32 128 128 16 2 282 + + + + + 64 16 64 64 32 32 283 + + + + + 8 4 >512 >512 32 32 284 + + + + + 8 8 >512 >512 32 16 288 + + + + + 16 16 - - - - 289 - - - 4 4 - - - - 291 + + - + + 4 4 - - - - 294 - + + - - 32 32 - - 16 8 297 - + - + + 32 8 - - - - 298 + + + + + <1 0 >512 256 256 16 299 - - - <1 0 - - 32 16 301 - - - 16 16 - - 16 8 302 - - - 8 8 - - 32 32 304 + + + - - <1 0 256 256 64 <1 306 + + + + + <1 0 32 0 128 <1 311 - - - <1 0 4 0 32 1 312 - - - <1 0 32 0 64 <1 314 + + + - - 16 16 - - 16 16 317 + + - - - 16 8 128 64 64 4 322 - - - 16 16 64 64 256 16
3.5.DISCUSSÃO
A associação entre multirresistência em Acinetobacter e a presença de bombas de efluxo tipo RND é bastante conhecida e bem fundamentada. AdeABC é um sistema de efluxo pertencente à essa família, regulado pelo sistema AdeRS, e muito importante na formação de um fenótipo multirresistente em Acinetobacter [Magnet et al. 2001].
Neste estudo foi realizada, através da técnica de PCR, uma pesquisa dos genes estruturais, adeB e adeC, e dos regulatórios, adeR e adeS, em 98 isolados de Acinetobacter sp., provenientes de amostras clínicas e ambientais, coletadas em hospitais de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. Uma comparação entre os resultados dessa pesquisa e resultados de testes feitos anteriormente com os isolados [Marchetti 2010], permite inferir os mecanismos de resistência presentes nessas amostras.
Entre os isolados clínicos foram observados níveis maiores de resistência para os três antimicrobianos testados, o que pode ser explicado pela pressão seletiva maior que estes sofrem ao infectar um hospedeiro. Todavia, como a presença de bomba de efluxo não tem ação de pressão seletiva, foi observada uma proporção maior de isolados ambientais com esta característica. Para o imipenem, pode-se observar que entre os isolados ambientais a resistência foi baixa e em nenhum isolado foi observado redução na presença do CCCP, indicando que esta resistência pode ser determinada por genes tipo bla. Por outro lado, entre os isolados clínicos o nível de resistência foi maior para este antimicrobiano e a redução na presença de CCCP foi observada em 24 dos 43 isolados resistentes. Portanto, neste caso pode-se inferir da participação do sistema de bomba de efluxo e prepode-sença de genes tipo bla, como descrito por Lee et al. 2010.
Nos 26 isolados ambientais, foi observado pelos resultados dos testes de concentração inibitória mínima, que 15 apresentaram resistência a algum dos antimicrobianos. Apenas um desses (O33) apresentou redução de MIC na presença de CCCP e foi positivo para os cinco genes, o que indica resistência devido a bomba AdeABC; nos outros catorze, possivelmente outro mecanismo que não o da bomba de efluxo é responsável pela resistência.
Dois isolados foram negativos para os genes e não apresentaram resistência no teste de MIC, caracterizando cepas ainda sensíveis. Seis isolados apresentaram redução de MIC na presença de CCCP, porém os valores de MIC não eram suficientes para caracterizar resistência; esses isolados apresentavam ausência do gene adeB, fato que pode explicar a
baixa resistência mostrada no teste de MIC, principalmente para ceftazidima, alguns estudos caracterizam o gene adeB como sendo o principal gene responsável pelo funcionamento de
AdeABC [Magnet et al. 2001; Dal et al. 2013]. Três isolados apresentaram todos os genes,
mas não foram considerados resistentes pelo teste de MIC, Bratu et al. 2008, observaram mutações pontuais nos genes adeR e adeS, o que pode explicar esta ausência de resistência nestes isolados.
Nos 72 isolados clínicos, 50 apresentaram resistência pelo teste de MIC, pelo menos a um dos antimicrobianos testados. Destes, oito mostraram redução de MIC na presença de CCCP e apresentaram os cinco genes, mostrando que AdeABC é responsável pela resistência nesses isolados. Oito isolados apresentaram características semelhantes, mas com ausência de alguns genes, adeB estava presente nesses isolados, isso mostra que sua expressão, independente dos outros genes, pode ser responsável pela resistência. Outros 13 isolados apresentaram redução de MIC com CCCP, mas não tinham os genes testados, indicando que estes isolados devem possuir outra bomba de efluxo dependente da força próton motiva, Lin et al. 2009, mostraram através de uma pesquisa dos genes de várias bombas de efluxo em
Acinetobacter, que outras bombas são ativas quando AdeABC não funciona ou não está
presente. Apenas dois isolados sem adeB e algum outro gene apresentaram resistência e redução de MIC, tanto AdeABC quanto outra bomba pode estar conferindo a resistência nesses casos.
Nove isolados, resistentes a pelo menos um dos antimicrobianos testados, não apresentaram redução de MIC com CCCP, portanto outro mecanismo que não bomba de efluxo (dependente da força próton motiva) deve estar conferindo essa resistência. Os outros dez isolados resistentes apresentaram redução de MIC na presença de CCCP para algum antimicrobiano, mas também mostraram resistência sem redução para outro, indicando que mais mecanismos, além da bomba de efluxo, estão presentes; cinco deles tinham os genes para AdeABC enquanto os demais devem ter outra bomba que utiliza força próton motiva.
Vinte e dois isolados clínicos não apresentaram resistência, sendo que seis deles também não tinham nenhum dos genes do sistema AdeABC. Seis isolados apresentaram todos os genes testados, mas não foram considerados resistentes no teste de MIC. Cinco isolados não resistentes tinham dois ou mais genes ausentes, em três desses isolados, os genes ausentes eram os regulatórios, o que pode explicar a baixa resistência observada no MIC. Cinco isolados não resistentes mostraram ausência de adeB, enquanto os outros genes da bomba
estavam presentes, o que indica, mais uma vez, que adeB é fundamental para o funcionamento da bomba AdeABC, como sugerido por Magnet et al. 2001.
Levando em conta a presença dos cinco genes que fazem parte dos sistemas AdeABC e
AdeRS, os valores de MIC e a redução, ou não, desses valores na presença de um inibidor da
bomba de prótons (CCCP), várias hipóteses foram aqui levantadas para auxiliar na compreensão dos mecanismos que levaram à multirresistência nos isolados de Acinetobacter utilizados neste trabalho.
3.6.REFERÊNCIAS
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4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Através desse estudo foi possível confirmar a presença, e o funcionamento, da bomba
AdeABC em isolados de Acinetobacter sp., sendo que a presença de AdeABC pode ser
observada em maior proporção nos isolados ambientais, assim como a ausência apenas do gene adeB. Além disso, a análise dos resultados revelou tendências no perfil de alguns isolados, que corrobora os achados de Lee et al. 2010, sobre a associação entre genes bla e a bomba AdeABC na resistência a carbapenêmicos, e de Magnet et al. 2001 sobre a importância do gene adeB que, como codificador da proteína transportadora, se mostrou essencial para o funcionamento do sistema AdeABC.
Ainda serão necessários mais estudos para entender porque alguns isolados apresentaram todos os genes do sistema AdeABC e do sistema regulatório, e ainda assim não apresentaram resistência nos testes de MIC. A utilização de PCR em tempo real, que seria uma ferramenta interessante para avaliar a expressão desses genes, e a pesquisa de outros sistemas de efluxo, são necessários para esclarecer o motivo do não funcionamento da bomba
AdeABC, e também elucidar os outros mecanismos, envolvidos no desenvolvimento de
