MUTAÇÃO. e MUTAGÊNESE. Aparecida Maria Fontes Ribeirão Preto Julho/ 2016

MUTAÇÃO

Aparecida Maria Fontes

Ribeirão Preto – Julho/ 2016

!

e

MUTAGÊNESE

Roteiro:

Mutação de Ponto no dia a dia

Classificação Mutações Gênicas (6 categorias)

Variabilidade Genética Humana - Perspectivas Exercícios

Mutação: Definição

Agentes Mutagênicos e seus Mecanismos de Ação Tipos de Danos e Mecanismos de Reparo

Origem Tipo Celular Expressão Efeito na Função Alteração Molecular Efeito na Tradução

Mutação Gênica no dia a dia:

Mutação Gênica no dia a dia:

Mutação – Definição:

n  Qualquer alteração herdada no material genético.

Fonte de

Variabilidade

Genética

Matéria-prima da

Evolução

Efeitos

Prejudiciais

Causa de muitas

doenças genéticas

e distúrbios

Mutação – Definição:

n  Qualquer alteração herdada no material genético.

Mutação

Gênica

Afeta um único

gene

Mutação

cromossômica

Afeta o número

ou estrutura dos

cromossomos

n  Erros na replicação do DNA – fase S do ciclo celular

n  Agentes mutagênicos

n  Erros nos sistemas de reparo do DNA

Ø  RCG115: Replicação de DNA -

uma característica da

replicação do DNA é sua precisão – denominada

FIDELIDADE ou “proofreading” – isto é – a enzima DNA polimerase tem atividade de exonuclease 3’ para 5’ com função de REVISÃO, ao excisar bases inseridas erroneamente.

v 1 erro a cada 100.000 nucleotídeos

Mutação – causas:

DNA polimerase: Fidelidade

Ø  A DNA polimerase apresenta também uma atividade

exonuclease que cliva a base mal-pareada no terminal 3’da fita de DNA em crescimento.

Agentes Mutagênicos e seus Mecanismos de Ação

_Mutagênicos Agentes Exemplos Mecanismo de Mutagênese

1 Agente

Oxidante Ácido Nitroso

Desaminação (adenina convertida em hipoxantina)

2 Análogo de

Base 5- Bromodeoxiuridina

Aumenta a taxa de mal-pareamento 3 Agente Alquilante Etilmentano sulfanato e mustarda de nitrogênio

Adição de radicais nos grupos laterais nas bases

4 Agente

Intercalante Proflavina

Topoisomerase II causa quebras no DNA e como consequência inserção ou deleção em um ou poucos

nucleotídeos

5 Luz

Ultravioleta

Luz solar e lâmpada UV

Formação de dímeros de pirimidina em uma mesma fita

Tipos de Dano no DNA e Mecanismos de Reparo

Tipos de Dano Principal Mecanismo de Reparo 1 Quebras na fita de DNA Reparo pela DNA ligase

2 Base modificada

quimicamente BER - Reparo por excisão de base 3 Mal pareamento de

bases Mismatch Repair

4

Danos em regiões do DNA por cisplatina,

carboplatin e nitrosoureias

NER - Reparo por excisão de nucleotídeo

5 Dímeros de Pirimidina NER - Reparo por excisão de nucleotídeo

6 Quebras na fita dupla do DNA

NHEJ - Junção das extremidades

não homológas e HR - recombinação homóloga

Classificação das Mutações Gênicas

Bases da

Classificação Tipos de Mutação Principais características 1 Origem

Espontânea Ocorre na ausência de um agente mutagênico conhecido

Induzida Ocorre na presença de um agente mutagênico conhecido

2 Tipo Celular Somática Ocorre nas células não reprodutivas Germinativa Ocorre nos gametas

Classificação das Mutações Gênicas

Bases da Classificação

Tipos de

Mutação Principais características

3 Expressão

Condicional Expressa somente em situações restritivas (ex. Alta temperatura) Não condicional Expressa em condições permissivas,

bem como, condições restritivas

4 Efeito na Função

Perda de Função Elimina função normal Hipomórfica Reduz função normal Hipermórfica Aumenta função normal

Ganho de Função Expressa em tempo incorreto ou tipo celular incorreto

Classificação das Mutações Gênicas

Bases da

Classificação Tipos de Mutação Principais características

5 Alteração Molecular

Substituição de Base Uma base é substituída por outra base Transição Pirimidina (T ou C) por pirimidina, ou

Purina (A ou G) por purina

Transversão Pirimidina (T ou C) por purina, ou Purina (A ou G) por pirimidina Inserção Presente um ou mais nucleotídeos

extras

Deleção Presente um ou mais nucleotídeos extras

6 Efeito na Tradução

Sinônima (silenciosa) Nenhuma mudança nos aminoaácidos Missense (não

sinônima) Mudança no aminoácido Nonsense (código de

término)

Criação de novo sítio de término (TAA, TAG ou TGA)

1. ORIGEM

Espontânea

e

1.1. Mutação Espontânea

Ocorre ao acaso, sem a interferência de um agente capaz de provocá-lo.

Produtos do metabolismo celular podem causar danos no DNA.

Cada gene tem uma taxa de mutação e varia conforme a espécie.

n  Gene bacteriano típico: 1x10-8 a 1x10-10 (1 a 100 por 10

bilhões de células).

n  Gene eucarioto típico: 1x10-5 a 1x10-6 (1 a 10 por 1

1.1. Mutação Espontânea

Diferenças nas taxas de mutação entre células procariotas e eucariotas pode ser explicado porque a taxa de mutação em bactérias é calculada por divisão celular e em eucariotos por gameta e são necessárias várias divisões celulares para produzir um gameta.

Variação na taxa de mutação entre as espécies

n  Diferentes capacidade de reparar mutações

n  Exposições desiguais a mutágenos

n  Diferenças biológicas nas taxas de mutações que

1.1. Mutação Espontânea

n  Diferentes capacidade de reparar mutações

n  Exposições desiguais a mutágenos

n  Diferenças biológicas nas taxas de mutações que

surgem espontaneamente

n  Erro de incorporação de base

n  Erro de replicação de DNA

n  Alterações químicas espontâneas: depurinacão ou

Desaminação de citosina

n  É a remoção de um grupo amino

Ø  Desaminação da citosina: é a

m a i s c o m u m e r e s u l t a n a formação de uma uracila.

§  Se não reparada U se pareia com

A e resulta em uma mutação de transição: C-G para T-A.

§  A base G mudou para A.

Desaminação de adenina

n  É a remoção de um grupo amino

Ø  Desaminação da adenina: é

menos frequente e resulta na hipoxantina.

§  Se não reparada a hipoxantina

pareia com a citosina e resulta em outra mutação de transição A-T para G-C.

Depurinação

n  É a remoção total da base de um nucleotídeo

§  Nesse caso, a fita mutada tem um nucleotídeo a

menos no local que ocorre depurinação

§  1 par A-T é removido.

n  Cria um sítio AP – apurínico ou apirimidínico

Página'|'13'' '

Na' depurinação' há' remoção' total' da' base' de' um' nucleótido,' por' clivagem' da' ligação' entre' essa' base' e' a' desoxirribose.' No' local' do' nucleótido' fica' apenas' a' base' associada' ao' grupo' fosfato'e'designaAse'esse'local'por'local.AP'A'local'apurínico'ou'apirimidínico.' ' ' ' À'semelhança'do'que'acontece'na'deaminação,'a'replicação'de'uma'região'danificada'vai'dar' origem'a'uma'cadeia'mutada'e'outra'cadeia'intacta.'Só'que'neste'caso,'a'cadeia'mutada'tem' um'nucleótido'a'menos'no'local'em'que'ocorre'depurinação'pois'não'apresenta'nenhuma'base' que' permita' a' ligação' de' uma' base' complementar.' Esta' mutação' pode' ter' consequências' gravíssimas' para' a' célula,' visto' que' se' ocorrer' numa' região' codificante' pode' modificar' completamente'a'proteína'resultante.' ' '' ' Das'alterações'induzidas'por'radiação'ou'químicos,'podemos'destacar'a'formação'de'dímeros' de'timina'e'de'aductos'de'DNA,'e'a'alquilação.' '

A' exposição' à' radiação' UV' induz' a' formação' de' ligações' entre' timinas' de' nucleótidos' adjacentes,'dando'origem'a'um' dímero.de.timina.'As'duas'bases'de' timina'ligamAse' entre'si' formando'um'anel'de'ciclobutano'e'deixam'de'estabelecer'ligações'com'as'adeninas'da'cadeia' complementar'(ligação'TAT'é'mais'forte'que'a'ligação'AAT).'Consequentemente'há'distorção'da' estrutura'das'cadeias'de'DNA,'o'que'pode'bloquear'a'transcrição'ou'replicação.'

A'reparação' directa' dos'dímeros'de' timina'dáAse' através'de' fotoreactivação.'Nesta'reacção,' inversa'à'dimerização,'é' utilizada'energia'da'luz'visível'para'quebrar'o'anel'de' ciclobutano'e' permitir'que'as'timinas'se'liguem'de'novo'às'adeninas'complementares.'Apesar'de'as'bactérias' utilizarem' este' processo' muito' frequentemente' os' mamíferos' e,' nomeadamente,' os' seres' humanos' não' são' capazes' de' corrigir' os' dímeros' de' timina' directamente,' estando' por' isso' mais'sujeitos'aos'efeitos'noviços'da'radiação'UV.'

Página'|'13'' '

Na' depurinação' há' remoção' total' da' base' de' um' nucleótido,' por' clivagem' da' ligação' entre' essa' base' e' a' desoxirribose.' No' local' do' nucleótido' fica' apenas' a' base' associada' ao' grupo' fosfato'e'designaAse'esse'local'por'local.AP'A'local'apurínico'ou'apirimidínico.' ' ' ' À'semelhança'do'que'acontece'na'deaminação,'a'replicação'de'uma'região'danificada'vai'dar' origem'a'uma'cadeia'mutada'e'outra'cadeia'intacta.'Só'que'neste'caso,'a'cadeia'mutada'tem' um'nucleótido'a'menos'no'local'em'que'ocorre'depurinação'pois'não'apresenta'nenhuma'base' que' permita' a' ligação' de' uma' base' complementar.' Esta' mutação' pode' ter' consequências' gravíssimas' para' a' célula,' visto' que' se' ocorrer' numa' região' codificante' pode' modificar' completamente'a'proteína'resultante.' ' '' ' Das'alterações'induzidas'por'radiação'ou'químicos,'podemos'destacar'a'formação'de'dímeros' de'timina'e'de'aductos'de'DNA,'e'a'alquilação.' '

A' exposição' à' radiação' UV' induz' a' formação' de' ligações' entre' timinas' de' nucleótidos' adjacentes,'dando'origem'a'um' dímero.de.timina.'As'duas'bases'de' timina'ligamAse' entre'si' formando'um'anel'de'ciclobutano'e'deixam'de'estabelecer'ligações'com'as'adeninas'da'cadeia' complementar'(ligação'TAT'é'mais'forte'que'a'ligação'AAT).'Consequentemente'há'distorção'da' estrutura'das'cadeias'de'DNA,'o'que'pode'bloquear'a'transcrição'ou'replicação.'

A'reparação' directa' dos'dímeros'de' timina'dáAse' através'de' fotoreactivação.'Nesta'reacção,' inversa'à'dimerização,'é' utilizada'energia'da'luz'visível'para'quebrar'o'anel'de' ciclobutano'e' permitir'que'as'timinas'se'liguem'de'novo'às'adeninas'complementares.'Apesar'de'as'bactérias' utilizarem' este' processo' muito' frequentemente' os' mamíferos' e,' nomeadamente,' os' seres' humanos' não' são' capazes' de' corrigir' os' dímeros' de' timina' directamente,' estando' por' isso' mais'sujeitos'aos'efeitos'noviços'da'radiação'UV.'

1. 2. Mutação Induzida

n  Vários agentes ambientais são capazes de danificar o

DNA

n  Mutágeno = agente ambiental capaz de aumentar de

forma significativa a taxa de mutação acima da taxa espontânea

q Análogo de Base

q Agente Alquilante

q Substância química que causa desaminação

q Substância química que causa hidroxilação

q Espécies reativas de oxigênio

q Agentes intercalantes

Análogo de Base

n  Substância química com estrutura semelhante a de

Agente Alquilante

n  Substâncias químicas que doam grupos alquila, como

metila (CH3) e etila (CH3-H2) às bases dos nucleotídeos.

q Etilmetilsulfonato – adiciona grupo etil a guanina.

O6-metil guanina no próximo ciclo de replicação pareia com Timina.

Substância Química que causa desaminação

n  Além da ocorrência espontânea, a desaminação pode

ser induzida por algumas substâncias químicas.

q Ácido Nitroso – desamina a citosina criando a

uracila, que no próximo ciclo de replicação pareia com adenina.

Substância Química que causa hidroxilação

n  Existem substâncias químicas que adiciona um grupo

hidroxila à citosina.

q H i d r o x i l a m i n a – c o n v e r t e a c i t o s i n a e m

hidroxilaminacitosina. Produz um tautâmero raro que pareia com adenina.

Espécies reativas de oxigênio

n  Substâncias químicas produzidas durante durante o

metabolismo aeróbico normal, assim como por radiação ozônio, peróxidos e algumas drogas.

q Espécies reativas de oxigênio – convertem a

guanina em 8-oxi-7,8-di-hidrodesoxiguanina.

Espécies Reativas de

Agentes intercalantes

n  Substâncias químicas que produzem mutações ao se

intercalarem entre as bases adjacente no DNA.

q  Proflavina, laranja de acridina, brometo de etídeo – distorcem a

estrutura tridimensional da hélice e provocam inserções e deleções de um nucleotídeo durante a replicação.

2. TIPO CELULAR

Germinativa

e

v  Linhagem Somática

v  Linhagem Germinativa

n  Mutação germinativa: ocorre nas células que vão formar

os gametas. É transmitida para gerações futuras e geram indivíduos que carregam as mutações em todas as suas somáticas e da linhagem germinativa.

n  Mutação somática: ocorre nos tecidos somáticos, que não

produzem gametas. Quando uma célula somática com uma mutação se divide (mitose) a mutação é transmitida para suas células-filhas.

2. Mutações Germinativas e Somáticas

o  Mutações somáticas estão presentes em somente alguns

tipos de células, mas não em todas as células do nosso organismo.

2. Mutações Germinativas e Somáticas

n  Organismo humano: 1014 células. Uma divisão surge

uma vez a cada 1 milhão de divisões celulares. Portanto, centenas de mutações somáticas surgem em cada pessoa.

o  Muitas mutações somáticas não tem efeito claro no

fenótipo do organismo, porque a função da célula mutante é substituída por células normais.

o  Entretanto, mutações somáticas que estimulam a

divisão celular podem ser a base para muitos cânceres.

2. Mutações Germinativas e Somáticas

o  Em alguns casos mutação ocorre no ovo fertilizado,

após a formação dos gametas. A medida que o embrião divide cada célula do corpo irá apresentar a mutação.

n  Mosaicisimo: mutação somática que ocorre em uma

única célula durante o desenvolvimento embrionário l e v a n d o a o m o s a i c i s m o . C o m o c o n s e q u ê n c i a genotipicamente o indivíduo é uma mistura.

o  Mutações adquiridas em células somáticas não

3. EXPRESSÃO

Condicional

e

3. Mutações: Condicional e Não condicional

v Não Condicional - constitutiva

v Condicional

o  Exemplo: mutação temperatura-sensitiva – mutação

condicional cuja expressão depende da temperatura.

n  Definição: Expressa somente sob condições restritivas

n  Definição: Expressa sob condições permissivas, bem

4. EFEITO NA FUNÇÃO

Perda de Função

,

Hipomórfica,

Hipermórfica

e

4.Mutações: Efeito na Função

v Ganho de Função

o  Muitas mutações ganho de função são dominantes.

n  Definição: Leva o surgimento de um novo traço ou

função ou leva o surgimento de um traço em um tecido inadequado ou em um momento inadequado.

o  Muitas vezes a expressão de um gene selvagem em um

v Hipermórfica

o  Ocorre a hiperexpressão de determinado gene.

n  Definição: Mutação na região reguladora do gene que

induz a expressão gênica.

4. Mutações: Efeito na Função

v Hipomórfica

o  Muitas vezes ocorre na região reguladora do gene.

n  Definição: Mutação que reduz, mas não elimina o nível

de expressão do gene ou a atividade da proteína.

o  Outras vezes resulta de uma substituição de aminoácido

4. Mutações: Efeito na Função

v Perda de Função

o  Também denominado Knockout ou null mutation.

n  Definição: Mutação que resulta em completa inativação

gênica ou um produto gênico não funcional.

o  Exemplo: deleção do gene completo, ou parte do gene

5. ALTERAÇÃO

MOLECULAR

Substituição de base

,

Transição,

Transversão,

Inserção

e

Deleção

5. Mutações: Alteração Molecular

v Substituição de Base

5. Mutações: Alteração Molecular

v Transição

n  Definição: Substituição de uma purina por outra purina

5. Mutações: Alteração Molecular

v Transversão

n  Definição: Substituição de uma purina por uma pirimidina

5. Mutações: Alteração molecular

v Inserção

n  Definição: Mutação que resulta na adição de um ou mais

5. Mutações: Alteração Molecular

v Inserção

5. Mutações: Alteração Molecular

v Deleção

n  Definição: Mutação que resulta na remoção de um ou mais

Mutação deleção – Fibrose cística

q  CFTR: gene que codifica a proteína transmembranal que regula o

6. EFEITO NA

TRADUÇÃO

Sinônima - silenciosa

,

Missense – não sinônima,

Nonsense – código de término

e

6. EFEITO NA

TRADUÇÃO

6. Mutações: Efeito na Tradução

v Sinônima - silenciosa

n  Definição: substituição implica em um códon sinônimo, que

não altera o aminoácido

q  Ex. ACT por ACC = ambos codificam treonina

q  Ex. CGT por CGG = ambos codificam arginina

6. Mutações: Efeito na Tradução

v Não sinônima - Missense

n  Definição: Substituição implica em um códon que altera

o aminoácido.

•  Substituição conservativa ou Mutação Neutra – troca

por um aminoácido quimicamente similar ou quando o aminoácido afetado tem pouca influência na função da proteína.

•  Substituição não conservativa – troca por um

aminoácido quimicamente diferente e induz mudança importante na estrutura e função da proteína

6. Mutações: Efeito na Tradução

6. Variantes estruturais da Hemoglobina: Mutação

Missense Neutra

q Hb Porto Alegre: α2β29(cis) apresenta uma cistéina em vez

de serina, na posição 9 da cadeia _β.

ü  Apresenta polimerização in vitro, mas não in vivo;

ü  Essa substituição de aminoácido cria um grupo de

sulfidrila na superfície da molécula da hemoglobina, possibilitando a formação de pontes de dissulfeto intermoleculares.

ü  Os homozigotos para essa hemoglobina são clínica e

hematologicamente normais, por isso ela pode ser considerada uma variante silenciosa da hemoglobina.

6. Hemoglobina S: Anemia Falciforme

v Aminoácido 6 – ácido glutâmico - da cadeia β da

hemoglobina é substituido por uma valina

o  Altera a afinidade de ligação ao oxigênio

o  Sob condições de baixa tensão de oxigênio leva a uma

distorção na estrutura terciaria da hemoglobina. Como consequência, as hemácias apresentam um formato alterado – estrutura em foice

o  Molécula de hemoglobina apresenta carga alterada

6. Doença de Gaucher: Missense

n  Tipos I: (N370S) – não neuronopática (95% casos).

n  Tipo II: (L444P) – neuronopática (1% casos)

6. Mutações: Efeito na Tradução

6. Mutações: Efeito na Tradução

v Frame shift – Mudança de fase de leitura

6 Hemoglobina de Tak

v Frame shift – Mudança de fase de leitura

n  Inserção de um nucletído AC entre a His 146 e o stop

codon 146

Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72

₍₁₉₇₅₎

3613

composition

of this

peptide

in

fTk

is

very

similar

to

what

we

have

obtained

for the

C-terminal

tryptic

peptide

of

hemo-globin

Cranston.

Furthermore,

the

C-terminal

sequences

of

the

two

chains

are

identical:

-Phe-Tyr-COOH.

It is

very

likely

that these

two

peptides

are

identical.

Accordingly,

the

structure

of

hemoglobin

Tak

would

be:

145 150 155

ITak Lys-Tyr-His-Thr-Lys-Leu-Ala-Phe-Leu-Leu-Ser-Asn-Phe-Tyr-COOH

It

is

likely that

hemoglobin

Tak

arose

because

of

a

nonho-mologous

crossover

at

position 146

(two

residues

beyond

the

postulated

crossover

of

I3Cranston)

with the

insertion

of

a

re-peated

nucleotide base

pair AC between the 146 His codon

(CAC)

and

the

UAA

termination

codon:

144

145

146

Lys

Tyr

His

Term

A

AAG

UAU

AA

GCN

OA

AAG

UAU

_CAC

UAA

GCN

...

OTak

AAG

Lys

144

UAU

Tyr

145

CAC

His

146

ACU

AAG

...

Thr

Lys

...

147

148

Recently, Fitch (25) suggested that hemoglobin Tak could

be

due

to

the

insertion

of

AC

at

position 146.

This

postulated

mechanism involves

a

match of

only

five bases

in

sequence.

However,

the similarity

in

structure

between

f3Tak

and

ICr

strongly

supports

the

contention

that there

is

a crossover

at

position

146.

If

this explanation

is

correct,

#Cr

and

1#Ta"

would differ by only

two

residues (positions

145

and 146).

It

is

unlikely that

in

hemoglobin

Tak the

oxygen-linked

salt

bonds

at

fl146

His

would be

preserved, because of the

adja-cent

large hydrophobic

group.

Accordingly, hemoglobin

Cranston and

hemoglobin

Tak

should

have

very

similar

functional

properties. It

is

interesting,

however,

that

individ-uals

having

hemoglobin

Tak

are

hematologically normal,

while those

with

hemoglobin

Cranston

have

a

compensated

hemolytic

state.

The

structure

of

hemoglobin

Cranston

provides

new

in-formation

on

the

base

sequence

at

the

3'

end of human

mRNA.

In

the

_following

paper,

Forget

et

al.

(26)

present

nucleotide

sequences

from normal human

f3

chain

mRNA

which

fit

the

C-terminal

amino-acid

sequence

of

hemoglo-bin

Cranston.

It is interesting

to

note

that the

UAA

termina-tion

codon

of

both human

a

and fB globin

mRNA

is

followed

by

the

same sequence

of

three

bases:

GCU. However,

be-yond this

point,

there

is

no

obvious homology between the

apparent

base

sequence

of

the

a

and

(#

mRNAs

deduced

from the

structures

of

variants

with extended

chains (ref.

25,

this

report) and from

sequence

studies

on

human globin

mRNA

(6,

7,

26).

The

untranslated

portions

of

globin

mRNA

may

be

im-portant

in

stabilizing the

mRNA

or

in

the

control of

tran-scription

or

translation

It

is

of

interest

that individuals who

are

heterozygous for

hemoglobins

Cranston

and

Tak

pro-duce

a

relatively large

amount

of the abnormal

chain.

It

appears as

if

reading through the chain

termination

codon

has

no

drastic effect

on

synthetic

rate.

In

contrast,

variants

with

elongated

a

chains

(hemoglobins

Constant

Spring,

Icar-ia,

Koya Dora,

Seal

Rock, and

Wayne)

appear as

minor

com-ponents in

the

hemolysates

of affected individuals.

Note

Added in

Proof: Following

submission

of this paper,

we

learned that the structural analysis

of Hb

Tak has been

completed

(27). The

sequence of

its

C-terminal tryptic peptide

is

identical

to

that of Hb

Cranston. This finding

strongly supports

the

_proposal

that

both

variants are

frameshift

mutants.

We are

indebted

to

Dr.

Richard A. Laursen

for making the

facili-ties

of

his

laboratory

available

for automatic

sequencing

determina-tions.

We

also

thank Dr. Lowell Ericsson for valuable technical

ad-vice

and

Dr.

Bernard

Forget

for

helpful

discussion and

reviewing

the manuscript.

This work was

_supported

in

_part

by

NIH Grant HL

16927

and The Nehemlas Gorin Foundation.

1.

Clegg,

_J.

B.,

Weatherall,

D.

J.

&

Milner,

P. F.

(1971)

Nature

234,337-340.

2.

Clegg,

J.

B. &

Milner,

P. F.

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Ann.

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Sci.

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Weatherall,

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Proc.

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this

issue.

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Casey,

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Tuchinda,

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&.Flatz,

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₍₁₉₇₅₎

Br.

_J.

Haematol.

31,

(Suppl.)

119-131.

Genetics:

Bun-n

et

al.

Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72

₍₁₉₇₅₎

3613

composition

of this

peptide

in

fTk

is

very

similar

to

what

we

have

obtained

for the

C-terminal

tryptic

peptide of

hemo-globin

Cranston.

Furthermore,

the

C-terminal

sequences

of

the

two

chains

are

identical:

-Phe-Tyr-COOH.

It is

very

likely that

these

two

peptides

are

identical.

Accordingly,

the

structure

of

hemoglobin

Tak would

be:

145 150 155

ITak Lys-Tyr-His-Thr-Lys-Leu-Ala-Phe-Leu-Leu-Ser-Asn-Phe-Tyr-COOH

It is

likely

that

hemoglobin

Tak

arose

because of

a

nonho-mologous

crossover at position 146

(two

residues

beyond

the

postulated

crossover

of

I3Cranston)

with the

insertion

of

a

re-peated

nucleotide base

pair

AC between the 146 His codon

(CAC)

and

the

UAA termination

codon:

144 145 146

Lys Tyr His Term

A AAG UAU AA GCN

OA

AAG UAU

_CAC

UAA

GCN ...

OTak

AAG Lys 144 UAU Tyr 145 CAC His 146 ACU AAG ... Thr Lys ... 147 148

Recently, Fitch (25) suggested that hemoglobin Tak could

be

due

to

the

insertion

of

AC

at position 146.

This

postulated

mechanism

involves

a

match

of

only five bases

in sequence.

However,

the similarity

in structure

between

f3Tak

and

ICr

strongly

supports

the

contention

that there

is a crossover at

position 146.

If

this explanation

is correct, #Cr

and

1#Ta"

would

differ

by only

two

residues (positions

145

and 146).

It is

unlikely that

in

hemoglobin Tak the oxygen-linked salt

bonds

at

fl146 His

would be

preserved, because of the

adja-cent

large hydrophobic

group.

Accordingly, hemoglobin

Cranston

and

hemoglobin

Tak

should

have

very

similar

functional

properties. It is interesting,

however,

that

individ-uals

having

hemoglobin

Tak

are

hematologically

normal,

while those

with

hemoglobin

Cranston

have

a

compensated

hemolytic

state.

The

structure

of

hemoglobin

Cranston

provides

new

in-formation

on

the

base

sequence at

the

3'

end of human

mRNA.

In the

_following

paper,

Forget

et al.

(26)

present

nucleotide

sequences

from normal human

f3

chain

mRNA

which fit the

C-terminal

amino-acid

sequence

of

hemoglo-bin

Cranston.

It is interesting to note

that the

UAA

termina-tion

codon

of

both human

a

and fB globin

mRNA is

followed

by

the

same sequence

of three bases:

GCU. However,

be-yond this

point,

there

is no

obvious homology between the

apparent

base

sequence

of

the

a

and

(#

mRNAs

deduced

from the

structures

of

variants

with extended chains

(ref.

25,

this

report)

and from

sequence

studies

on

human globin

mRNA

(6,

7,

26).

The

untranslated

portions

of

globin mRNA may

be

im-portant in

stabilizing the

mRNA or in

the

control of

tran-scription or

translation

It is

of

interest

that individuals

who

are

heterozygous for

hemoglobins

Cranston

and Tak

pro-duce

a

relatively large

amount

of the abnormal

chain.

It

appears as

if

reading through the chain

termination

codon

has

no

drastic effect

on

synthetic

rate. In contrast, variants

with

elongated

a

chains

(hemoglobins

Constant Spring,

Icar-ia,

Koya

Dora,

Seal

Rock,

and

Wayne)

appear as

minor

com-ponents in

the

hemolysates

of affected individuals.

Note Added in Proof: Following submission of this paper, we

learned that the structural analysis of Hb Tak has been completed (27). The sequence of its C-terminal tryptic peptide is identical to that of Hb Cranston. This finding strongly supports the proposal that both variants are frameshift mutants.

We are indebted to Dr. Richard A. Laursen for making the facili-ties of his laboratory available for automatic sequencing determina-tions. We also thank Dr. Lowell Ericsson for valuable technical

ad-vice and Dr. Bernard Forget for helpful discussion and reviewing the manuscript. This work was supported in part by NIH Grant HL 16927 and The Nehemlas Gorin Foundation.

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