Life Sciences
Sorbente de troca iônica HyperCel™ STAR AX
USD 2831(1)
Sorbente para Cromatografia de Troca Aniônica
de Recuperação Avançada Tolerante a Sal
Um sorbente para cromatografia de troca aniônica, escalonável industrialmente, projetado para alta produtividade de captura de proteína e remoção de impurezas em alta ou moderada condutividade de sal (2 a 15 mS/cm), típico de matérias-primas biológicas não diluídas (isto é, sobrenadantes de cultura de células de mamíferos, matéria-prima de E. coli, plasma, outros…).
O sorbente HyperCel STAR AX é fabricado em larga escala e atende às necessidades de usuários industriais e autoridades reguladoras. Um Arquivo de Suporte Regulatório (RSF) está disponível para ajudar os usuários no desenvolvimento de procedimentos de validação. Este sorbente oferece:
` Alta capacidade de ligação dinâmica (DBC) em curto tempo de residência (2 minutos ou menos)
` Captura direta de proteína ou remoção de impureza da matéria-prima não diluída em condutividade moderada ou alta
` Excelentes propriedades de taxa de fluxo para processamento rápido da matéria-prima
` Seletividade distintiva, consistente em uma ampla faixa de condutividade (2 – 15 mS/cm)
` Maior economia de processo
Descrição
O sorbente HyperCel STAR AX é composto de uma matriz de celulose rígida que tem excelentes propriedades de fluxo e gera baixa contra-pressão, compatível com as necessidades da produção de proteína em escala de fabricação. O sorbente está disponível em várias configurações de embalagem, bem como em colunas PRC pré-empacotadas de 1 mL e 5 mL projetadas para um método rápido de otimização, triagem seletiva ou pequeno trabalho preparativo. O sorbente HyperCel STAR AX é fornecido em forma de pasta fluida/suspensão em NaCl 1M contendo 20% (v/v) de etanol ou como um bolo úmido para aplicações em escala de processo (o sorbente em formato de bolo úmido facilita a transferência do sorbente, evitando a agitação e a suspensão de grandes volumes de materiais).
O sorbente HyperCel STAR AX tem uma estabilidade química que garante processo simples de limpeza in situ (CIP) e armazenamento. Para um CIP padrão, recomenda-se o tratamento com NaOH 0,5 a 1 M, sendo possível armazenamento de longo prazo em NaOH 10 a 100 mM.
Tabela 1
Principais propriedades
Tamanho médio da partícula 80 μm Ligante de troca iônica Amina primária
Capacidade de ligação dinâmica1 >100 mg BSA/mL na faixa de
pH de 7,5 – 8,0 e condutividade de 15 mS/cm
Faixa de operação típica de condutividade de matéria-prima
2 – 15 mS/cm Condições de limpeza
recomendadas2
NaOH 1 M
1. Determinado usando BSA 5 mg/mL em Tris-HCl 25 mM, NaCl 0,14 M em tempo de residência
O sorbente HyperCel STAR AX é muito fácil de empacotar e desempacotar em colunas de laboratório, piloto e de escala de produção, e mostra excelentes propriedades de fluxo, compatíveis com os requisitos avançados processos de produção.
O sorbente pode ser empacotado em tampões baratos. Por exemplo, uma coluna com 200 mm I.D. x 150 mm de altura empacotada em um tampão de NaCl 10 mM pode ser operada em contra-pressão inferior a 1,5 bar (22 psi) (Figura 1).
O desempenho do empacotamento é consistente do laboratório a colunas em larga escala (400 mm I.D.), Valores típicos de N/m > 2000 placas e fatores assimétricos (AF) são: 1,0<AF<1,4. Figura 1
Pressão vs. Taxa de Fluxo do Sorbente HyperCel STAR AX
0 200 400 600 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Pression (bar ) Vitesse linéaire (cm/h)
Coluna: 200 mm I.D. x 150 mm de altura de leito. Tampão de empacotamento: NaCl 10 mM
Características e benefícios
Alta capacidade de ligação dinâmica em condições operacionais de ampla condutividade: evita a diluição da matéria-prima e agiliza o processamento downstream
Figura 2
Capacidade de Ligação Dinâmica vs. Tempo de Residência como Função do pH e Condutividade do Sorbente HyperCel STAR AX
7 7.25 7.5 7.75 8 8.25 8.5 4 6 8 10 12 14 16 18 20 4 6 8 10 12 14 16 18 20 4 6 8 10 12 14 16 18 20 7 7.25 7.5 7.75 8 8.25 8.5 7 7.25 7.5 7.75 8 8.25 8.5 60 80 100 120 140 160 180 60 80 100 120 140 160 180 200 60 80 100 120 140 160 180 200
Temps de séjour = 1 min Temps de séjour = 2,5 min Temps de séjour = 4 min
Conductivité
pH pH pH
Coluna: 0,5 cm I.D. x 5 cm altura de leito (~1 mL). Amostra: BSA 5 mg/mL em tampão de compensação: Tris-HCl 25 mM, pH 7,0 – 8,5. Condutividade 3 – 20 mS/cm. Tempo de residência: 1 – 4 min (0,25 – 1 mL/min). Números indicam a capacidade de ligação do BSA em mg/mL de sorbente.
Um estudo do Projeto de Experimentos (DoE) foi realizado para explorar a influência de vários pHs (7,0 a 8,5), condutividades (3 a 20 mS/cm) e tempos de residência (1 a 4 minutos) sobre a capacidade de ligação dinâmica da albumina do soro bovino (BSA) usada como um modelo.
Os dados mostram o impacto do pH e da condutividade em DBC do BSA sobre o sorbente HyperCel STAR AX. Os diagramas de contorno na Figura 2 mostram que o sorbente alcança uma alta DBC (> 100 mg/mL) em uma ampla faixa de pHs e condutividades em curto tempo de residência, permitindo flexibilidade e produtividade de processamento ideais.
Figura 3
Capacidade de Ligação Dinâmica do Sorbente HyperCel STAR AX para a Albumina do Soro Humano (HSA) de Plasma não diluído e diluído
0 5 10 15 20 25 30 35 40 H S A m g/ m L
Hyp erC el S TAR AX DE AE rigid agarose 7 mS/cm 11 mS/cm
HyperCel STAR AX DEAE agarose rigide
HSA mg/mL
A Figura 3 mostra a DBC da HSA do sorbente HyperCel STAR AX comparado a um sorbente convencional de roca aniônica de agarose rígida DEAE em condutividades correspondentes a um plasma não diluído (11 mS/cm) e diluído (7 mS/cm).
Os dados mostrados na Figura 3 confirmam que a DBC é menos afetada pela condutividade na faixa 7 – 11 mS/cm, se comparado ao sorbente convencional. Isso permite a carga direta do plasma não diluído no sorbente HyperCel STAR AX.
Combinados com excelentes características de fluxo em baixas contra-pressões (Figura 1), grandes volumes de matéria-prima podem ser processados direta e rapidamente, aumentando o rendimento global do processo e limitando o risco de degradação da proteína.
A alta capacidade de ligação facilita a operação usando colunas de volume e área de ocupação moderados, permitindo uma maior redução das necessidades de volume de tampão e gerando economia de equipamento e custos de investimento reduzidos em sorbentes.
Excelente seletividade e eficiência de separação em uma
ampla faixa de condutividades
Figura 4
Separação de uma mistura de proteína no Sorbente HyperCel STAR AX em 10 mS/cm. 0 20 40 60 80 mUA 0 10 20 30 40 50 60 mL Cytochrome C Transferrine Albumine Gradient de conductivité
Coluna pré-empacotada HyperCel STAR AX PRC de 1 mL; 100 µL de mistura (citocromo C 2 mg/mL, transferrina humana 10 mg/mL, albumina de soro bovino [BSA] 10 mg/mL). Carga: Tris-HCl 25 mM pH 8,0, 10 mS/cm. Eluir: gradiente 0 – 50% Tris-HCl 25 mM, pH 8,0 + NaCl 1 M.
A seletividade de sorbentes é um parâmetro-chave para discriminar entre a proteína-alvo e os contaminantes na matéria-prima. A triagem da seletividade de sorbentes é essencial e deve ser realizada nos estágios iniciais do desenvolvimento do processo.
É possível obter uma triagem rápida e otimização de condições usando uma coluna pré-empacotada Pall 1 mL PRC. Após a química apropriada ser selecionada, as condições de uso podem ser otimizadas em uma coluna de 5 mL PRC duplicando a altura. Duas colunas de 5 mL podem ser conectadas em séries para aumentar a altura do leito de colunas para 20 cm, e condições reais mais próximas do modelo em escala piloto ou para aplicações em pequena escala. As colunas de 1mL também podem ser conectadas em série.
Devido à diferença na estrutura esférica, química do ligante e densidade da carga iônica específica, como mostrado na Figura 4, a eficiência da seletividade e separação do sorbente HyperCel STAR AX é mantida em uma ampla faixa de condutividades.
Aplicações e Exemplos
As aplicações incluem a captura direta de proteínas recombinantes, anticorpos monoclonais e policlonais, derivados do plasma ou outros biofarmacêuticos.
Devido à sua capacidade de capturar proteínas diretamente de matérias-primas não diluídas, o sorbente HyperCel STAR AX também pode ser usado para a remoção inicial de contaminantes (isto é, CHO Host Cell Proteins), antes da purificação-alvo, isto é, antes da captura do MAb por uma etapa de afinidade da Proteína A.
Aplicação 1. Captura direta de albumina do plasma não diluído O objetivo é avaliar o sorbente HyperCel STAR AX como a primeira etapa em uma sequência de purificação de duas etapas para capturar a albumina do soro humano (HSA) do plasma não diluído (condutividade 11 mS/cm). O sorbente HyperCel STAR AX foi usado como uma primeira etapa de captura, seguida de uma etapa ortogonal de troca catiônica realizada no sorbente S HyperCel, sem ajuste de pH ou condutividade do plasma. Plasma não diluído puro (pH 7,6, 11 mS/cm), foi carregado com DBC de 30 mg/mL (consultar Figura 3).
O Projeto de Experimentos (DoE) em placas de filtro com 96 poços (Placas de filtro AcroPrep™ Advance, Pall) foi realizado para determinar as condições ótimas para se obter a melhor relação rendimento/pureza (um exemplo da otimização das condições de lavagem/eluição é mostrado na Figura 5).
Essas condições foram depois transferidas para a cromatografia de colunas em colunas pré-empacotadas Pall PRC (Figura 6).
Figura 5
Impacto da Lavagem (W) e Eluição (E) Condições de Pureza da HSA e Rendimento da Eluição (em percentagem) no sorbente HyperCel STAR AX (Projeto de Experimentos em Placas de Filtro de 96 poços)
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 20 15 10 5 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 50 30 40 20 10 < 88 88 – 90 90 – 92 92 – 94 94 – 96 96 – 98 > 98 <40 40 – 60 60 – 80 80 – 95 > 95 pH du lavage pH de l’élution
Conductivité du lavage (mS/cm) Conductivité de l’élution (mS/cm)
Conditions de lavage optimales Valeurs constantes Conditions d’élution optimales Pureté (%) Valeurs constantes Rendement (%) pH E 3,5 Cond. E 2,0 pH L 7,5 Cond. L 2,0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 20 15 10 5 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 50 30 40 20 10 < 88 88 – 90 90 – 92 92 – 94 94 – 96 96 – 98 > 98 <40 40 – 60 60 – 80 80 – 95 > 95 pH du lavage pH de l’élution
Conductivité du lavage (mS/cm) Conductivité de l’élution (mS/cm)
Conditions de lavage optimales Valeurs constantes Conditions d’élution optimales Pureté (%) Valeurs constantes Rendement (%) pH E 3,5 Cond. E 2,0 pH L 7,5 Cond. L 2,0
A Figura 5 mostra que o rendimento da HSA é afetado principalmente pelas condições de eluição (zona ótima: pH 3,5 – 4,2 e condutividade 2 – 27 mS/cm) enquanto a pureza é afetada principalmente pelas condições de lavagem (lavagem de alta condutividade a >15 mS/cm aumenta a pureza).
Figura 6
Transferência de condições determinadas nas Placas de 96 Poços para a Coluna Pré-Empacotada 1 mL HyperCel STAR AX PRC
mL 10 0 2500 mUA 2000 1500 1000 500 0 . FT W1 W2 E 20 FT W1 W2 E P Fraction non retenue (FT) Lavage 1 Lavage 2, pH 7,5, 20 mS/cm Élution, pH 4,0, 2 mS/cm Albumine IgG Transferrine Albumine P = Plasma
As condições determinadas nas placas de 96 poços foram aplicadas à cromatografia do plasma não diluído no sorbente HyperCel STAR AX em uma coluna pré-empacotada 1 mL PRC. O Cromatograma (Figura 6) e a análise de SDS-PAGE de frações confirmaram que a maioria dos contaminantes foram eliminados pela lavagem de alta condutividade, gerando, em uma única etapa, uma fração de HSA com 99% de pureza e 90% de rendimento.
Além disso, como mostrado antes na Figura 3, o sorbente HyperCel STAR AX usado na etapa de captura com plasma não diluído teve um DBC >30 mg/mL, mais do que o dobro do que o sorbente de agarose DEAE convencional testado nessas condições. A HSA foi eluída por uma simples redução de pH (4,0), sem adição de sal, permitindo uma carga direta em uma coluna de troca catiônica ortogonal (Sorbvente S HyperCel).
Esta última etapa de limpeza no sorbente S HyperCel gerou uma fração purificada da HSA eluída em pH 7,0 com pureza >99%, e uma capacidade de cerca de 65 mg/mL (Tabela 2).
Tabela 2
Purificação em duas etapas da albumina do soro humano do plasma não diluído.
Carga Capacidade (mg/mL) Rendimento Pureza Captura em sorbente HyperCel STAR AX Plasma não diluído > 30 mg/mL 90% 99% Limpeza em sorbente S HyperCel pH 4,0 eluído no sorbente HyperCel STAR AX 65 mg/mL 95% > 99%
Aplicação 2. Remoção inicial de CHOPs antes da captura da Proteína A de um anticorpo monoclonal (MAb
)
O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto de uma etapa de pré-purificação usando o sorbente HyperCel STAR AX antes da captura por um sorbente convencional da Proteína A de um anticorpo monoclonal (MAb) da matéria-prima da cultura de células de um mamífero (Figure 7).
O conteúdo das CHOPs contaminantes (Proteínas do ovário de hamster chinês) foi comparado por meio de um teste ELISA comercial para os dois esquemas de purificação mostrados na Figura 7.
Figura 7
Esquema de purificação do MAb convencional e alternativo incluindo a Etapa de Pré-Purificação no sorbente HyperCel STAR AX
400 3300 362000 413000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Teneur en CHOP x 1000 (ppm) CCS HyperCel Protéine A
STAR AX HyperCelSTAR AX
+ protéine A
CCS CHOP : 413 000 ppm
HyperCel STAR AX Mode negatif (FT: fraction non retenue) CHOP : 362 000 ppm Protéine A (mode capture/élution) CHOP : 400 ppm Protéine A (mode capture/élution) CHOP : 3 300 ppm
Os dados mostram que usando o sorbente HyperCel STAR AX antes da Proteína A resulta em uma melhor redução da CHOP (>8 vezes). Devido a este efeito sinérgico, começando do conteúdo de uma Proteína Celular Hospedeira inicial (HCP) de 413.000 ppm, o nível final da CHOP é reduzido para ~400 ppm (3 logs de redução), com uma recuperação do MAb de 90%.
Uma etapa pré-purificação pode impactar positivamente a economia do processo ao aumentar o tempo de vida de uma coluna de Proteína A de alto valorusada como etapa padrão para a captura do MAb.
Informações sobre pedidos
Sorbente HyperCel STAR AXDescrição Código do produto
5 mL 20197-018 25 mL 20197-026 100 mL 20197-032 1 L 20197-046 5 L 20197-058 10 L 20197-064
Colunas pré-empacotadas HyperCel STAR AX PRC
Descrição Código do produto
Coluna PRC 5x50 HyperCel STAR AX, 1 mL
PRCSTARAX1ML PRC Coluna 8x100
HyperCel STAR AX, 5 mL
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