ALEXSANDRA DIAS DE SOUZA XAVIER

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO - UNIFESP

INSTITUTO DE CIÊNCIAS AMBIENTAIS, QUÍMICAS E FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DA

SUSTENTABILIDADE DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

Determinação da teor de proteínas e da concentração total e concentração bioacessível de Fe e Zn em castanha de caju

(Anacardium ocidentale L.)

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ALEXSANDRA DIAS DE SOUZA XAVIER

Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências e Tecnologia da Sustentabilidade.

Orientador

Prof. Dr. Angerson Nogueira do Nascimento

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Chefe do departamento: Prof. Dr. Thiago André Moura Veiga

Coordenador do curso de mestrado acadêmico:Prof. Dr. Dário Santos Junior

Xavier, Alexsandra Dias de Souza

(Anacardium ocidentale L.) / Alexsandra Dias de Souza Xavier

Diadema, 2018. 93 fl.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas. Programa

de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia da Sustentabilidade. Departamento de Química.

Orientador: Angerson Nogueira do Nascimento

1. Castanha de caju. 2. Ferro 3. Zinco. 4. Bioacessibilidade. 5.Absorção atômica por chama.

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ALEXSANDRA DIAS DE SOUZA XAVIER

Presidente da banca:

Prof. Dr. Angerson Nogueira do Nascimento

Banca examinadora:

Prof. Dr. Dr. Diogo Librandi da Rocha Prof. Dr. Dra. Érica Aparecida Souza Silva Prof. Dr. Dr. Dário Santos Junior

Suplentes:

Prof. Dr. Dr. Flavio de Oliveira Leme Prof. Dr. Dra. Priscilla Carvalho Veggi

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Dedico esta dissertação À meus pais que muito apoiaram os meus estudos e são exemplos de dedicação, esforço, perseverança e fé. Aos meus filhos Matheus e Thaís e ao marido Éder que sempre me apoiaram e foram tão pacientes nas longas ausências por dedicação aos estudos.

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Agradecimentos

A Deus por estar presente e abençoar meus dias durante a longa jornada de execução deste trabalho.

Ao meu orientador, Prof. Angerson Nogueira do Nascimento pelo apoio, orientação e amizade para realização desse trabalho. Pelos desafios e oportunidades que proporcionaram o meu desenvolvimento intelectual e pessoal;

À Universidade Federal de São Paulo e a todos os professores responsáveis pela minha formação no mestrado.

Aos meus queridos e amados irmãos Cleber e Michel que tanto me apoiaram e incentivaram a execução deste projeto.

Aos meus familiares Tia Lourdes, Daniela, ao Marcos, Milton, Adriana, Edilene (estimados cunhados e cunhadas), Felipe, Priscila, Alexandre, Alexandro, João Pedro, Eduarda, Larissa, Lorena (estimados sobrinhos) e em especial as minhas cunhadas Paula, Tatiana e Selma que deram muito apoio e incentivo durante esta etapa de minha vida.

Aos meus queridos sogros D. Maria e Sr. Delcídio que incentivaram nas jornadas desse estudo.

Aos meus colegas de trabalho do Instituto Técnico de Barueri ITB Maria Sylvia Chaluppe Mello pelo incentivo e apoio em diversos momentos desse trabalho, em especial a Cleusa e ao amigo José Paulo†.

A todos os alunos e colegas do Laboratório de Espectrometria de Absorção Atômica (Labespa) pelo apoio e compreensão durante a execução do trabalho.

Ao Núcleo de Apoio Técnico de Ensino e Pesquisa pela colaboração durante toda a graduação. Em especial, aos técnicos Reginaldo da Silva, Palloma Conceição, Tatiane Britos, Wilson Segura, Auro Rosa pela compreensão e apoio no desenvolvimento deste projeto.

Agradeço em especial a Danielli Furtado e ao Prof. Dr. Nilson por cederem o laboratório e apoiarem o trabalho.

Aos amigos Thais, Camila, Daise e Luiza pelo apoio e acolhida em diversas etapas ao longo desse deste trabalho na Unifesp.

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Lista de figuras

Figura 1. Rota experimental adotada para a determinação de Fe e Zn total nas

amostras de castanhas de caju por FAAS...39

Figura 2. Esquema da extração sequencial de proteína da castanha de caju, seguida da etapa de análise de Fe e Zn associadas às porções de proteína...44

Figura 3. Esquema de digestão gastrointestinal simulada...50

Figura 4. Otimização da altura de observação para Fe e Zn...52

Figura 5. Estudo da vazão de acetileno para zinco e ferro...54

Figura 6: Curva de calibração empregada na quantificação de Fe (equação da reta: y= 0,003 + 0,012x; R2 = 0,999) e Curva de calibração empregada na quantificação de Zn (equação da reta: y= 0,014 + 0,054x; R2 = 0,9980) em amostras de castanhas por FAAS...56

Figura 7. Comparação de resultados de concentração total e bioacessível para ferro e zinco...63

Figura 8. Estudo do tempo de congelamento das soluções de proteína após extração sequencial...67

Figura 9. Avaliação do tempo de extração sequencial para cada solução (H2O, NaCl, NaOH e H3C-CH2-OH)...70

Figura 10. Relação de concentração de Fe e Zn associados às proteínas obtidas na extração sequencial de proteínas da castanha de caju, utilizando FAAS...74

Figura 11. Avaliação do processo de precipitação de proteínas empregando acetona um comparativo entre o total de proteína sem precipitação e com precipitação...78

Figura 12. Avaliação da bioacessibilidade de Fe e Zn presentes nos extratos proteicos obtidos a partir do processo de precipitação com acetona comparado com a quantidade total desses metais nas diferentes frações ( albumina, globulina, glutelina e prolamina) ...80

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Lista de tabelas

Tabela 1. Condições instrumentais utilizadas na determinação de ferro e zinco por FAAS por Varian AA220... 33 Tabela 2. Programa de aquecimento para digestão ácida das amostras de castanha de caju em forno de microondas... 35 Tabela 3. Tabela 3. Dados de otimização de vazão de acetileno e altura de observação para o Espectrômetro de Absorção Atômica por Chama – Varian AA200...55 Tabela 4. Resultados experimentais obtidos através da análise do material de referência (Peach Leaves) por FAAS...60 Tabela 5. Relação entre fração bioacessível e IDRs, baseado em 10 gramas de castanha consumida (cerca de 5 unidades)... 63 Tabela 6. Estimativa de teor de proteínas presentes nas amostras de castanha de caju, utilizando a analise elementar...64 Tabela 7. Quantificação de proteínas obtidas a partir do processo de extração sequencial empregando água, NaCl, NaOH e etanol...71 Tabela 8. Limite de detecção e limite de quantificação para as frações de albuminas, globulinas, glutelinas e prolaminas por FAAS...73

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Lista de abreviaturas

FAAS Flame Atomic Absorption Spectrometry

ICP- MS Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry

ICP OES Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry

IDR Ingestão Diária Recomendada

LD Limite de Detecção

LQ Limite de Quantificação

NIST National Institute of Standards and Technology

SRM Standard Reference Material

S1 Extração protéica aquosa

S2 Extração protéica salina

S3 Extração protéica alcalina

S4 Extração protéica alcoólica

TACO Tabela Brasileira de Composição dos Alimentos

USP United States Pharmacopeia

HCL Lâmpada de Cátodo Oco, Hollow Cathode Lamp

FAO Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura

WHO Organização mundial da saúde

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Resumo

Este projeto teve como objetivo quantificar a fração total e bioacessível de ferro e zinco; extrair e quantificar as frações de proteínas (albuminas, globulinas, glutaminas e prolaminas) associadas a estes elementos; submetê-las a etapa de precipitação com acetona e analisar a fração de ferro e zinco associadas às essas proteínas (metaloproteínas) e, também, as suas frações bioacessíveis.

A quantidade total desses metais foram avaliados por espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS), com método validado, utilizando diferentes figuras de mérito para esta comprovação (faixa linear de trabalho, LOD, LOQ, avaliação do efeito de matriz e avaliação do material certificado) as determinações da concentração total de Fe e Zn nas amostras de castanha e a concentração obtida para cada um destes analitos foi de 55,0 ± 1,2 mg kg-1 e 41,0 ± 0,1 mg kg-1, respectivamente.

Para o estudo de biocessibilidade, in vitro, o processo de digestão e quantificação da fração bioacessível de Fe e Zn na castanha de caju obteve 36% do ferro total presente na amostra se encontra na forma bioacessível e para o zinco tem-se 32%. A concentração total de proteínas foi determinada por meio de um analisador elementar (CNHS) e as frações obtidas através da extração sequencial (albuminas, globulinas, glutelinas e prolaminas) utilizando o método de Bradford. A determinação total de proteínas, obtidas por CNHS, demonstrou que a castanha analisada possui 22,1% de proteínas. Para proteínas verifica-se que a quantidade de albuminas extraídas em relação ao total de proteínas totais foi de 16,5%, já as globulinas apresentam 6,9%, as glutelinas foi obtido o valor de 8,0% e as prolaminas aparecem em quantidade bem menor, 0,1%. A determinação de Fe e Zn por FAAS em cada extrato proteíco revela que 16% do Fe extraído após a

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extração sequencial pode estar associdado as albuminas, 37% as globulinas e apenas 8,4% deste analito presente no extrato contendo glutelinas. Para o elemento Zn foi verificado que 21,5% deste analito se encontra presente no extrato de albumina, 11,71% pode estar associdado as globulinas, 4,73% as glutelinas e o teor de Zn na solução contendo prolaminas estava abaixo do LD.

Ao realizar o processo de precipitação destes extratos proteícos com acetona e submeter este precipitado ao processo de digestão gastrointestinal simulada nas prováveis metaloproteínas, pode-se verificar que a bioacessibilidade de ferro e zinco associadas às metaloproteínas é pequena comparada à amostra. Portanto, parte desses metais permanece associada às proteínas mesmo após o processo de digestão simulada e não estão bioacessíveis para serem absorvidos pelo organismo humano.

Palavras-chave: castanha de caju, bioacessibilidade, ferro, zinco, absorção atômica por chama.

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Abstract

This project aimed to quantify the total and bioaccessible fraction of iron and zinc; extracting and quantifying the protein fractions (albumins, globulins, glutamines and prolamins) associated with these elements; subjecting them to the acetone precipitation step and analyzing the iron and zinc fraction associated to proteins (metalloproteins) and also their bioaccessible fractions.

The total amount of these metals was evaluated by flame atomic absorption spectrometry (FAAS), using a validated method that was verified by following merits figures: linear working range, LOD, LOQ, matrix effect evaluation and evaluation of the certified material. The total concentration of Fe and Zn in cashew nut was 55.0 ± 1.2 mg kg-1 and 41.0 ± 0.1 mg kg-1, respectively.

The bioaccessibility essay was done in the sample and the results showed that 36% of Fe and 32% of Zn was bioaccessible. The total protein concentration was determined by an elemental analyzer (CNHS) and the fractions, obtained from a sequential extraction procedure (albumins, globulins, glutelins and prolamins), was done by Bradford’s method. The results obtained by CNHS showed that cashew nut has 22.1% of total proteins. However, the content obtained from sequential extraction showed that 16.5% of albumins, 6.9% of globulins, 8% of glutelins and 0.1% of prolamins. The determination of Fe and Zn by FAAS in each extracts reveals that 16% of Fe may be associated with albumins, 37% with globulins and only 8.4% of this analyte was associated to glutelin. For zinc there was 21.5% in albumin extract solution, 11.71% associated with globulins, 4.73% with glutelins, and the Zn content in the solution containing prolamins was below LD.

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The results obtained from evaluation of bioaccesibility of Fe and Zn in precipitated obtained after a coagulation process with acetone showed that a small quantity of these elements was bioaccessible. Therefore, a part of these metals remain associated with proteins even after the simulated digestion process and are not bioaccessible.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 15

1.2 Importância dos estudos de biocessibilidade e avaliação dos nutrientes presentes nos alimentos ... 24

2.OBJETIVO ... 28

3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 31

3.1 Instrumentação ... 31

3.2 Reagentes, solventes e amostras ... 34

3.3 Descontaminações de materiais ... 36

3.4 Otimização dos parâmetros instrumentais de operação do FAAS ... 36

3.5 Preparação da amostra ... 37

3.6 Procedimentos para validação do método ... 40

3.6.1 Faixa linear de trabalho ... 38

3.6.2 Teste de adição e recuperação ... 40

3.6.3 Limites de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) ... 40

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 51

4.1 Otimização dos parâmetros instrumentais para determinação de Fe e Zn por FAAS ... 51

4.2 Faixa linear de trabalho e calibração ... 55

4.3 Limites de quantificação e detecção ... 57

4.4 Teste de adição e recuperação ... 58

4.5 Avaliação do material de referência certificado ... 58

4.6 Quantificação total de Fe e Zn nas amostras de castanha de caju ... 60

4.7 Extração de gordura da castanha da castanha e caju e determinação de proteína total ... 63

4.8 Extração sequencial de proteína ... 65

4.9 Avaliação da estabilidade ao armazenamento e tempo de extração das proteínas ... 63

4.10 Determinação de proteínas em processo de extração sequencial ... 69

4.11 Determinação de Fe e Zn em frações de proteína extração sequencial .. 71

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4.13 Determinação de Fe e Zn em proteínas extraídas da extração sequencial ... 74 4.14 Bioacessibilidade de Fe e Zn em proteínas extraídas da extração sequencial e precipitadas com acetona ... ... 75 5. CONCLUSÕES ... 81

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Alimentos como fonte de nutrientes

O alimento é o substrato que o organismo recebe e processa através de processos metabólicos complexos e, assim, proporciona energia, crescimento, restauração e manutenção dos tecidos (Martins, Basilio, & Silva, 2014).

Os nutrientes presentes no organismo (de acordo com sua função) podem ser classificados em: energéticos (carboidratos, proteínas e lipídios), plásticos e construtores (proteínas, cálcio e ferro) (Gava, et al., 2009). Os carboidratos são as principais fontes de energia para o corpo humano, podem ser de origem animal ou vegetal e atuam na manutenção do tecido nervoso. Também melhoram o trânsito intestinal quando estão sob a forma de fibras. Além de atuarem em movimentos de contração muscular e outras formas de trabalho biológico (Gava, et al., 2009; Pinheiro, et al., 2005). As gorduras (lipídios) tem função de fornecer energia, proteger órgão vitais e facilitar a absorção de vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K) (Pinheiro e Penna, 2004). Além de serem importantes na formação do tecido adiposo, que promove proteção térmica e mecânica, sendo também componente estrutural das células (Martins, et al., 2014).

As proteínas desempenham papel importante no organismo, pois possuem função construtora na formação das células, no reparo e na construção dos tecidos, além de serem utilizados como fonte de energia. As proteínas atuam como catalisadora de reações bioquímicas (enzimas), regulam o metabolismo (hormônios),

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16 transportam nutrientes e metabólitos, possuindo também função nutricional. (Pinheiro, Porto, & Menezes, 2005).

Os minerais (Ca, Cu, Fe, K, Na, Zn, Mg, I, Se, entre outros), assim como as vitaminas, não podem ser sintetizados pelo organismo e devem ser fornecidos com a alimentação. Portanto, tem-se a necessidade constante de fornecimento através de uma ingestão diária destes elementos essenciais ao organismo (Ammerman, et al., 1995).

Dentre os elementos essenciais ao organismo destaca-se o ferro, o qual desempenha um papel ativo no metabolismo durante o transporte de oxigênio, respiração, metabolismo energético, destruição de peróxido de hidrogênio e síntese de DNA. O metabolismo do ferro é complexo porque está envolvido em muitos aspectos da vida, desde o funcionamento das hemácias e até na atividade das mioglobinas. O envolvimento do ferro em muitas dessas reações metabólicas depende de sua capacidade de receber e doar elétrons. Sabe-se que o ferro na sua forma livre pode ser tóxico para células vivas devido à geração de espécies de oxigênio ativado, que pode provocar oxidação lipídica ou ataque as proteínas e moléculas de DNA. Para evitar isso, as células vivas têm um mecanismo de armazenamento extra de ferro intracelular, em uma forma não tóxica, onde o ferro é capturado no interior de uma proteína globular oca chamada de apoferritina (Fennema, Demoradan, & Parkin, 2010).

Apesar de sua abundância no ambiente, a deficiência de ferro em seres humanos é um problema em grande escala (Ammerman, et al., 1995; Azevedo, 2012; Canniatti-Brazaca & Germano, 2002; Bianchi, et al., 1992; Fantini, et al., 2008;

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17 Moura. et al., 2006; Kafaoglu, et al, 2016; Martins, et al., 2014). Devido à participação de ferro em vários processos e funções no organismo humano, sua deficiência gera desordens e disfunções como, por exemplo, as anemias, que chegam a atingir 24% da população mundial. Dados brasileiros da Portaria SAS/MS nº 1.247, de 10 de novembro de 2014, mostra que há casos de deficiência de 50% nos níveis de ferro em crianças menores de 5 anos, nas crianças que frequentam escolas ou creches chega a 52% e das que chegam nas Unidades Básicas de Saúde 60,2%. Os primeiros sintomas de indivíduo anêmico são: fraqueza, indisposição, fadiga generalizada, falta de apetite e palidez da pele (Canniatti-Brazaca & Germano, 2002).

É importante ressaltar que a ingestão total de ferro dependerá da composição da dieta e o estado de oxidação do ferro consumido, tais fatores determinam um papel importante na quantidade desse nutriente que será absorvida pelo organismo (Fennema, Demoradan, & Parkin, 2010).

As espécies de ferro nos alimentos podem estar na forma de ferro heme e ferro não heme. O ferro inorgânico (forma não heme) pode ser encontrado nos alimentos de origem vegetal como Fe2+ e Fe3+. O ferro orgânico (ferro heme) tem uma maior concentração em alimentos de origem animal e participa da constituição da hemoglobina, que é uma metaloproteína responsável pelo transporte de oxigênio dos pulmões até os tecidos celulares (Canniatti-Brazaca & Germano, 2002; ). Segundo a Anvisa, a ingestão diária recomendada (IDR) para ferro varia de 14 mg/dia para homens e 9 mg/dia mulheres (ANVISA, RDC nº 80, 2004).

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18 Em relação ao Zn, verifica-se que este elemento difere dos outros metais de transição, pois contém a camada eletrônica “d” completa e, assim, não participa de reação redox, mas age como ácido de Lewis para aceitar um par de elétrons, fazendo com que seja um íon estável. Geralmente se complexa com aminoácidos, peptídeos e nucleotídeos e tem afinidade com grupos tióis e hidrogênio (Mafra & Cozzolino, 2004).

O Zn encontra-se disperso na maioria dos tecidos, mas é encontrado principalmente no fígado, músculos e ossos. Além disto, propicia inúmeras funções bioquímicas, pois é componente de diversas enzimas (álcool desidrogenase, superóxido dismutase, anidrase carbônica, fosfatase alcalina e enzimas do sistema nervoso central). Participa da divisão celular, expressão genética, processos fisiológicos como crescimento e desenvolvimento, transcrição gênica, age como estabilizador de estruturas de membranas celulares, além de participar da função imune e desenvolvimento cognitivo. Sua deficiência pode causar alterações fisiológicas como, hipogonodismo, danos oxidativos, alterações do sistema imune, danos neuropsicológicos e dermatites (Mafra & Cozzolino, 2004).

O suprimento de zinco nas dietas alimentares pode ser feito através da ingestão de ovos, frangos, ostras, carnes vermelhas, fígados, nozes e leguminosas (The national Academies of Sciences, Engineering e Medicine, 2001). A IDR para Zn, segundo a ANVISA, é de 7 mg/dia para homens adultos e difere da FAO/WHO (Food and Agriculture Organization of the United Nations / World Health Organization), que recomenda 8 mg/dia para mulheres e 11 mg/dia para homens (Anvisa, 2004).

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19 As proteínas, as quais desempenham papel importante no organismo, pois tem função construtora nas células, reparo e construção dos tecidos, além de ser uma fonte energética. Além disto, constituem hormônios, enzimas, anticorpos e transporte de substâncias (Fennema, 2010).

As proteínas podem ser consideradas de alto valor biológico ou baixo. As de alto valor biológico contém grande número de aminoácidos essenciais já as de baixo valor nutricional apenas alguns. Daí a importância de ingestão de proteínas diversas na alimentação, vinda de alimentos proteicos diversos, a fim de suprir as necessidades de aminoácidos diárias (Azevedo, 2012). A maior parte de proteínas para consumo humano vem de reserva das sementes. Essas proteínas, sintetizadas no reticulo endoplamático rugoso, geralmente permancem supercompactadas, de modo que, ao ser hidrolisada fornecem nitrogênio, carbono e outros nutrientes, permitindo o crescimento e desenvolvimento do embrião. (Chagas, 1993). Segundo o principio de Osborn e Campbell (1896) as proteinas podem ser extraídas segundo a sua solubilidade em quatro grupos: albuminas, globulinas, glutelinas e prolaminas. Estão presentes, principalmente, em sementes, albuminas e globulinas.

As albuminas são solúveis em água e geralmente são proteínas enzimáticas, não demonstrando ser glicolisadas. Nestas proteínas constata-se uma grande abundância de aminoácidos essenciais como: metionina, cisteína e lisina e verifica-se a preverifica-sença de lectinas (Chagas, 1993).

As globulinas são insolúveis em água e solúveis em solução salinas. Elas constituem as principais proteínas de reserva das sementes, com alta quantidade de

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20 nitrogênio. Esse grupo de proteina mostra alto conteúdo de amidas, e a solubilidade depende da força ionica e do pH. (Payne, 1983 ; Chagas, 1993).

As glutelinas são solúveis em soluções alcalinas ou ácidas muito diluídas e insolúveis em solventes neutros e constituem uma fração proteica bastante heterogênea e junto à prolaminas constituem as principais proteínas de reserva de cereais (Payne, 1983; Chagas, 1993)

As prolaminas são proteínas solúveis em solução alcoolica (70-80%) e insolúveis em água ou álcool puro, são estudadas em sementes, porém apresentam em pequenas quantidades ( Osborne, 1909; Farfan, 1990, Chagas, 1993; Cominetti et all, 2011).

A IDR para proteínas varia conforme as fases da vida, entre os gêneros e condições destes, lactantes e pós-cirurgias. Por exemplo: para um adulto recomenda-se 50 g por dia; lactantes de 0 a 6 meses 9,1 g por dia; crianças entre 1 a 3 anos 13 g por dia, 4 a 6 anos: 19 g por dia, 7 a 10 anos: 34 g por dia e gestantes: 71 g por dia.

Uma das formas de atender estas necessidades é realizar o consumo de alimentos ricos em proteínas, dentre os quais destacamos a carne (27%), leite em pó (24%), castanhas (23%), ovo (13%), farinha de soja (34%), lentilha cozida (6%), feijão cru (20%), feijão cozido (4,8%) amendoim torrado salgado (27%) e amêndoas (18%) (Taco, 2011). Além destes a castanha de caju vem recebendo grande atenção devido a sua grande concentração de elementos e proteínas.

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21 Além do potencial nutricional, a castanha de caju é uma fonte de renda para o país. Sendo o Ceará o maior produtor de castanha de caju, seguido do Rio Grande do Norte e Piauí. Do total de castanha de caju produzida no Brasil, no ano de 2016, o nordeste detém 98% do total produzido, desses o Ceará é responsável por 50% da produção. Cerca de 70 a 80 % da produção nacional são destinados ao mercado externo, sendo os países receptores: Estados Unidos, Países Baixos (Holanda), Canadá, Líbano, Reino Unido, México, França, entre outros. (Fonte: Sindicaju, 2017).

Atrelado a esta forte fonte de divisas é importante ressaltar que a castanha de caju é grande fonte de nutrientes tais como: lipídios (46% m/m), proteínas (25% m/m) e carboidratos (25% m/m). Em relação à composição elementar a mesma contém: 0,6% (m/m) de K e P, 0,2% de Mg e S, 0,45% (m/m) de Ca, 0,49 mg/kg de Zn, 66 mg/kg de Fe e 20 mg/kg de Cu (Neal, et al. 2015; Rezig, et al., 2013; Naozuca, 2012; Nascimento, et al., 2010; Horax, et al., 2010; Argyri, et al., 2009; Fantini, Canniatti-Barzaca, et al., 2008; Sathe, et. al., 2006). Portanto, verifica-se que o potencial nutricional da castanha é bastante diverso e apresenta elevado potencial para auxiliar no combate as carências alimentares discutidas anteriormente.

Entretanto, conhecer a quantidade de nutrientes presentes nos alimentos pode não representar a quantidade que será absorvida pelo organismo humano. Portanto, paralelo a estas determinações da concentração total, há também a preocupação em avaliar a quantidade de nutriente disponível para absorção e que efetivamente será absorvida pelo organismo. Este tipo de estudo é conhecido como avaliação da biodisponibilidade e o termo foi proposto pela área farmacêutica nos EUA, em 1974, pelo FDA (Food and Drug Administration) indicando a proporção em que

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22 determinada substância ativa era absorvida e tornava-se disponível no sítio de ação do órgão-alvo (Schweiggert & Carle, 2015; Peixoto, 2014; Van Loo Bouwman, et. al., 2014; Argyri, et al., 2009; Frenandez-Garcia, et al., 2009; Cozzolino, 2007; Moura & Canniatti-Brazaca, 2006; Benito & Miller, 1998; Ammerman, et al., 1995; Fairweather-Tait, et al., 1993; Robinson, & Sadler, 1993; Bianchi, et al., 1992; Southgate, 1989, Seth, 1974). A partir da década de 80 o termo passou a ser utilizado na área da nutrição, onde estudos envolvendo ingestão de nutrientes e sua presença em tecidos alvos passaram a ser estudados, já que a simples ingestão do nutriente não garantia o seu papel no organismo. (Southgate, 1987). Assim o termo biodisponibilidade de um nutriente ingerido pode ser definido como sua acessibilidade para processos metabólicos e fisiológicos normais. Ou seja, a eficiência com que um componente da dieta é utilizado sistematicamente através de vias metabólicas normais. Em estudos de biodisponibilidade usa-se o termo bioeficácia, que significa a eficiência com que os nutrientes são absorvidos e convertidos para sua forma ativa. Em níveis fisiológicos a biodisponibilidade de um nutriente pode ter influência para o efeito benéfico. Por outro lado, pode afetar a natureza e gravidade toxicológica devido ao excesso. Pode ser calculada e usualmente é expressa em porcentagem de ingestão. A interação entre dieta, nutriente e o indivíduo é a resposta da biodisponibilidade (Van Loo-Bouwman, eta al.,2014, Fernandes-Garcia, et al, 2012; Cozzolino, 2007). Os estudos de biodisponibilidade são complexos e para executar estes estudos diversas etapas devem ser seguidas e avaliadas. Em 1997, na Holanda, em um Congresso de Biodisponibilidade, foram propostos os aspectos a serem abordados: a especiação do nutriente, a ligação molecular, a quantidade na dieta, a matriz onde o nutriente está incorporado, os atenuadores da absorção e bioconversão, o estado nutricional

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23 do indivíduo, fatores genéticos, fatores relacionados aos indivíduos (sexo, idade, etapa de desenvolvimento fisiológico) e interações minerais (West & Castenmiller, 1998).

A metodologia abordada em estudos de biodisponibilidade de nutrientes é bastante atual no campo da nutrição (Callou, et al. 2016). Para este processo são realizados estudos que podem ser in vivo e/ou in vitro. Para os estudos in vivo, incluem-se animais de laboratório e também humanos voluntários. Esses estudos requerem aceitação em comitês de ética e pesquisas e são burocráticos de serem obtidos (Kafaoglu, et al., 2016, ). Para os estudos in vitro, simula-se a digestão gastrointestinal humana e avalia-se a taxa de absorção de nutrientes, bem como a associação entre a ingestão e parâmetros bioquímicos sanguíneos. Os estudos realizados com seres humanos são mais difíceis de serem controlados, mas possibilitam um maior entendimento do nutriente no organismo, isto é, a proporção de cada nutriente que se move do lúmen intestinal através da mucosa e o quanto atinge o tecido alvo (Cominetti, et al., 2011)

Assim, como uma alternativa preliminar a estes estudos de biodisponibilidade de minerais, são propostos procedimentos como os estudos de biocessibilidade (realizados por meio de ensaios in vitro) que, devido à simplicidade e o baixo custo, possibilita a determinação da quantidade solúvel ou dialisável do nutriente e permitem o controle apurado de variáveis, tornando um modelo importante no sentido de fornecer informações para realizar estudos mais complexos de biodisponibilidade (Peixoto, 2014; Argyri, et al., 2009; Cozzolino, 2007; Ammerman, et al., 1995; Bianchi, et al., 1992).

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24 1.2 Importância dos estudos de biocessibilidade e avaliação dos nutrientes presentes nos alimentos

Saber a concentração total de um nutriente em um alimento, informação acessível aos consumidores, não é suficiente para avaliar a absorção dos nutrientes pelo organismo, pois elementos químicos devem atingir os sítios alvo em concentrações mínimas necessárias para que exerçam suas funções nas atividades biológicas (Kafaoglu, et al., 2016). Estudos com Ag, Al, Ba, Ca, Co, Fe, Hg, Mg, Mn, Mo, Pb, Se, Sr e Zn em castanhas tem sido reportado na literatura por diferentes pesquisadores (Kafaoglu, et al.,2016, 2014; Naozuka, et al.,2010, 2011, Rodushkin, et al., 2008), porém não refletem, em termos de nutrição, a quantidade biodisponível. As informações de fração biodisponível podem ser complexas na etapa de interpretação dos dados, pois há discrepâncias entre o ser humano e o animal utilizado no experimento, uma vez que os animais de laboratório não possuem todas as características fisiológicas do ser humano (Estévez-Santiago, et al., 2016; Benito & Miller, 1998; Ammerman, Baker, & Lewis, 1995).

Assim, estudos de biacessibilidade são propostos e o processo consiste em simular, in vitro, as etapas de digestão gastrointestinal presente em um alimento. O teste mais empregado é estabelecido pela United States Pharmacopeia (USP) e pode ser simulado utilizando soluções enzimáticas como, por exemplo, a pepsina, pancreatina e sais biliares previamente produzidas industrialmente (US Pharmacopeia XXIV & National Formulary, 2000). Além disto, os estudos de bioacessibilidade estão presentes em diversos estudos nutricionais, farmacêuticos e veterinários. E a literatura possui inúmeros trabalhos avaliando-se a bioacessibilidade dos minerais e elementos em nível de traço em diferentes matrizes

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25 (Kafaoglu, et al., 2016; Estévez-Santiago, et al., 2016; Peixoto, 2014; Yeste, et al, 2014; Courraud, et al., 2013; Frenandez-Garcia, et al., 2009; Dhuique-Meyer, et al., 2007, Wastson, et al, 2000; Holt, et al, 2000).

Bertin e colaboradores em 2016 avaliou composição mineral e bioacessibilidade em Sarcocornia ambigua, uma planta de Santa Catarina, conhecida popularmente como sal-verde, muito parecida com o aspargo, obteve de 65 e 80 % de fração bioacessível para Mg e K, respectivamente (Bertin, et al, 2016). Na Turquia, pesquisadores avaliaram bioacessibilidade em diferentes castanhas e sementes, os resultados obtidos demonstram que Zn e B apresentavam os maiores valores de bioacessibilidade em relação aos demais elementos (B, Ca, Co, Cu, Fe, Mg, Mn, Ni e Zn) (Kafaoglu, et al, 2016). Portanto, apesar das matrizes avaliadas possuirem inúmeros elementos essenciais ao organismo, apenas dois elementos apresentam uma contribuição significativa para a bioacessibilidade.

Estudos que avaliam a bioacessibilidade de elementos essenciais em diferentes tipos de castanhas, nota-se que tais objetos de pesquisa podem ser explorados de maneira ampla. Pois, atualmente, tem havido uma preocupação da comunidade científica em se conhecer a composição estrutural das moléculas associadas aos elementos presentes em uma matriz alimentar. Uma vez que há uma infinidade de macromoléculas que possuem interação entre íons metálicos ligados a centros ativos de várias enzimas e proteínas, sendo responsáveis por diversos processos metabólitos que promovem o desenvolvimento do organismo, constituindo assim as metaloproteínas (NEVES, LIMA, et al., 2012).

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26 A função destas metaloproteínas depende de suas interações com o metal associada à macromolécula, os quais, em geral, são metais de transição (Cu, Fe, Zn, Mo, entre outros) (Afity AE-MMR, 2012).

Muitas proteínas, como, por exemplo, as enzimas ribonuclease A e a quimotripsina, contêm apenas resíduos de aminoácidos e nenhum outro constituinte químico; elas são consideradas proteínas simples. Entretanto, algumas proteínas contêm componentes químicos permanentemente associados além dos aminoácidos; elas são chamadas de proteínas conjugadas. A parte não aminoácido de uma proteína conjugada é normalmente chamada de grupo prostético. As proteínas conjugadas são classificadas com base na natureza química de seus grupos prostéticos; por exemplo: lipoproteínas contêm lipídeos, glicoproteínas contêm grupos de açúcares e metaloproteínas contêm um metal específico. Algumas proteínas contêm mais de um grupo prostético. Normalmente o grupo prostético desempenha um papel importante na função biológica da proteína (Lehninger, et al, 2002).

São exemplos de metaloproteínas: contendo ferro: ferritina, hemoglobina, mioglobina, peroxidase, citocromo oxidase; contendo zinco: Álcool-desidrogenase, anidrase carbônica; cálcio: calmodulina; molibdênio: dinitrogenase; cobre: plastocianina; cromo: citocromo oxidase; magnésio: hexoquinase, glicose 6-fosfatase e potássio: piruvato quinase. (Garcia, et al, 2005).

As metaloproteínas estão envolvidas em sistemas importantes no organismo. As metaloproteinas apresentam afinidade altas pelos metais, onde não são desfeitas após processos de isolamento ou diluição (Garcia, et al, 2005). Metaloproteínas possuem interações fracas com metais como Na e K, ligações moderadas com Ca e

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27 Mg, e já com metais de transição como Cu, Fe, Mn, Zn, Se, Cr e Mo apresenta ligações fortes, justificadas pela densidade, pequeno raio atômico e interações eletromagnéticas ou forças eletrostática (Garcia, et al, 2005).

O colágeno, por exemplo, tem sua formação dependente do ascorbato, que é fornecido através da ingestão de vitamina C (ácido ascórbico). Nessa reação o ascorbato é muito importante assim como o Fe2+. O colágeno é formado por unidades repetidas de tripeptídeos Gly-X-Y, dos quais X e Y em geral são Pro e 4-Hyp, o derivado de prolina (4R)-L-hidroxiprolina, que tem um papel importante no entrelaçamento das fibras do colágeno e na manutenção de sua estrutura. Na ausência de vitamina C, as células não conseguem hidroxilar a Pro da posição Y. Isso leva a uma instabilidade do colágeno e aos problemas no tecido conectivo observados no escorbuto. A hidroxilação de resíduos específicos de Pro no pró-colágeno, o precursor do pró-colágeno, requer a ação da enzima prolil 4-hidroxilase. Essa enzima apresenta-se em todos os vertebrados. A atividade de hidroxilação da prolina está nas subunidades a. Cada subunidade a contém um átomo de ferro não hemínico (Fe2+), e a enzima faz parte de uma classe de hidroxilases que necessitam de a-cetoglutarato em suas reações. Durante essa reação, o Fe2+ do grupamento heme se oxida, inativando a enzima e impedindo a hidroxilação da prolina. O ascorbato consumido nessa reação é necessário para restaurar a atividade enzimática – pela redução do ferro do grupamento heme (Lehninger, et al., 2002).

Outra metaloproteína associada a ferro importante é a mioglobina, descoberta sua estrutura tridimensional por John Kendrew e seus colaboradores, em 1950. A mioglobina é uma proteína ligadora de oxigênio relativamente pequena das células musculares. Ela funciona tanto para a estocagem de oxigênio quanto para facilitar a difusão do oxigênio nos tecidos musculares em contração. A mioglobina contém

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28

uma única cadeia polipeptídica de 153 resíduos de aminoácidos de sequência conhecida e um único grupo ferro-protoporfirina, ou heme. O mesmo grupo heme encontrado na mioglobina é encontrado na hemoglobina, a proteína ligadora de oxigênio dos eritrócitos, sendo responsável pela coloração vermelha amarronzada tanto da mioglobina quanto da hemoglobina. A mioglobina é particularmente abundante nos músculos de mamíferos mergulhadores, como as baleias, as focas e os botos – tão abundante que os músculos destes animais são marrons. A estocagem e a distribuição do oxigênio pela mioglobina do músculo permitem que animais que mergulham permaneçam submersos por um longo período (Campbell & Farrell, 2007).

O grupo heme planar repousa sobre uma fenda na molécula de mioglobina. O átomo de ferro no centro do grupo heme apresenta duas posições de ligação (coordenação) perpendiculares ao plano do heme . Uma delas se liga ao grupo R de um resíduo de His na posição 93; a outra corresponde ao local onde a molécula de O2 se liga. Dentro dessa fenda, a acessibilidade do grupo heme ao solvente é bem

restrita. Isso é importante para a função, pois grupos heme livres em uma solução oxigenada são rapidamente oxidados do estado ferroso (Fe2+), que é ativo na ligação reversível com o O2, para o estado férrico (Fe3+), que não se liga ao O2. A

medida que as diferentes estruturas da mioglobina foram resolvidas, os pesquisadores foram capazes de observar as mudanças estruturais que acompanham a ligação do oxigênio ou de outra molécula, e, assim, pela primeira vez, de entender a correlação entre a estrutura de uma proteína e sua função (Garcia, Magalhães, & Arruda, 2005).

O zinco no organismo está associado majoritariamente às proteínas, sua grande aplicação se dá pela ponte, justificada pela sua química de coordenação,

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entre as proteínas e a água, estima-se que o zinco esteja presente em mais de 3000 proteínas humanas já catalogadas (Krezel & Marret, 2016). A química de coordenação do zinco em proteínas e peptídeos envolve suas ligações com N, O e S do lado da cadeia de histidinas, glutamato/aspartato e cisteína.

Alguns exemplos de metaloproteínas associadas a zinco podem ser observados abaixo:

Fonte: (Krezel & Marret, 2016)

Portanto, baseado nas informações relatadas anteriormente, o presente estudo teve como objetivo avaliar a bioacessibilidade de Fe e Zn na castanha de caju e estabelecer a correlação entre estes elementos e determinados grupos de proteínas presentes nesta matriz alimentar.

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30 2 Objetivo

2.1 Objetivo principal

O objetivo principal desta pesquisa descrita nesta dissertação de mestrado foi quantificar e avaliar a bioacessibilidade de Fe e Zn, usando ensaio in vitro, presentes na castanha de caju e realizar a determinação destes analitos por FAAS.

2.2 Outros objetivos

Quantificar as proteínas presentes na castanha de caju empregando um procedimento de extração sequencial (H2O, NaCl, NaOH e H3C-CH2-OH). Os extratos obtidos são analisados por FAAS e espectrofotometria de absorção molecular (UV-Vis) para correlacionar grupos proteícos com os elementos de interesse. Otimizar o procedimento de extração sequencial para que seja possível obter a maior quantidade de proteínas possíveis e evitar a degradação destes compostos moleculares. Portanto, foram avaliados o tempo de extração e período de armazenamento (em freezer) dos extratos proteícos obtidos sequencialmente. Avaliar a bioacessibilidade de Fe e Zn nas porções de proteínas, extraídas por extração sequencial e precipitadas com acetona.

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31

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Instrumentação

As determinações de Fe e Zn nas amostras de castanha de caju foram realizadas por espectrometria de absorção atômica com atomização por chama (Varian, Spectra AA 220, Austrália). Este equipamento permite a instalação de duas lâmpadas simultâneas, porém as medidas foram realizadas de modo sequencial. A lâmpada de catodo oco utilizada é do mesmo fabricante. As condições instrumentais, para operação da lâmpada de catodo oco, utilizada no equipamento, estão descritas na tabela 1.

Tabela 1 - Condições instrumentais utilizadas na determinação de ferro e zinco por FAAS por Varian AA220.

Elemento λ (nm) Lâmpada* I (mA) Resolução espectral (nm) Condições de operação Vazão (ml min-1) Zn Fe 213,86 248,30 HCL HCL 26 9 0,8 0,8 Monoelementar Monoelementar 1 1,5 *HCL: Hollow Cathode Lamp (Lâmpada de Cátodo Oco).

Os gases utilizados para a formação da chama foram: acetileno 99,99% (White Martins, Brasil) e ar comprimido (Compressor – Modelo MSV-6, Fabricante Schulz, Alemanha).

A água utilizada nas determinações foi produzida pelo sistema de ultrapurificação de água montado em gabinete único para produção de água

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32 purificada grau laboratório e ultrapura Tipo I ASTM (Ultrapurificador - Modelo Direct-Q, Fabricante Millipore, EUA).

Para triturar as amostras foi utilizado um processador de alimentos (Modelo PA 012, Fabricante Walita, Brasil) e as pesagens foram realizadas utilizando uma balança analítica com precisão analítica de 0,0001 g (Modelo – Ohaus Adventures – Fabricante - Mettler Toledo, Brasil).

A determinação de proteína foi realizada utilizando duas metodologias: (1) determinação da concentração total por intermédio da análise de nitrogênio e (2) empregando um método espectrofotométrico (método de Bradford). As determinações do teor de nitrogênio total nas amostras de castanha de caju (com e sem gordura) foram analisadas na Central Analítica da Universidade Federal de São Paulo – Campus Diadema, empregando um analisador elementar CHNS (Modelo 2400 – Fabricante Perkin Elmer, EUA). O teor de proteínas nas soluções extratoras foi quantificado por espectrofotometria utilizando um espectrofotômetro UV-vis, (Modelo Spectra Max M2 - Fabricante Molecular Device Corparation, USA) equipado com o software Maxi Pro 5.2. Para agitação dos tubos eppendorf, utilizados na preparação das soluções analíticas de BSA (albumina de soro bovino), foi empregado um agitador de tubos (Modelo AT56 – Fabricante Phonix, Brasil). As soluções analíticas e as amostras adicionadas na placa de Elisa foram agitadas utilizando um agitador de placas (Modelo MS3 Digital - Fabricante IKA, USA).

A amostra de castanha de caju foi digerida em forno de microondas de alta pressão (Modelo ETHOS ONE – Fabricante Milestone, USA) com emprego de frasco fechado de teflon, equipado com um dispositivo de monitoramento da pressão e

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33 temperatura em um dos vasos (referência). O programa de aquecimento utilizado na digestão ácida das amostras de castanha de caju está apresentado na tabela 2.

Tabela 2: Programa de aquecimento para digestão ácida das amostras de castanha de caju em forno de microondas.

Etapa Temperatura (ºC) Rampa (min.) Patamar (min.) Exaustão (min.) 1 60 5 1 1 2 140 5 5 1 3 180 4 5 1 4 200 4 10 1 5* 0 - 20 2 *Etapa de resfriamento

Para o processo de extração sequencial de proteínas foram utilizados: mesa agitadora micro processada (Modelo Q225M – Fabricante Quimis, Brasil), agitador do tipo vortex (Modelo Q220M – Fabricante Quimis, Brasil) e centrífuga de tubos (Modelo Spectrafuge 6C – Fabricante Labnet International, USA).

Durante a digestão gastrointestinal as amostras foram mantidas em banho termostático sob agitação linear horizontal (Quimis Aparelhos Científicos Ltda – modelo Q226M, Brasil) e, posteriormente, as soluções digeridas foram destinadas à centrifugação (Centrifuga Micro processada para Tubos - Q222TM, Fabricante Quimis, Brasil).

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34 3.2 Reagentes, solventes e amostras

Todas as soluções foram preparadas com água ultrapura (18 MΩ.cm) obtida pelo sistema Milli-Q. Os reagentes utilizados foram: ácido nítrico 65 % (Merck, Alemanha) de alto grau de pureza e peróxido de hidrogênio (Merck, Alemanha).

As soluções analíticas de referência foram preparadas em meio de 0,1 % v/v de HNO3 por meio de sucessivas diluições da solução Tritisol (Merck, Alemanha) de 1000 mg L-1 contendo Fe3+ (FeCl3) e Zn2+ (ZnCl2). Todas as soluções foram armazenadas em frascos de polipropileno (Sarstedt, Brasil).

As amostras de castanha foram adquiridas no Mercado Municipal Paulistano, localizado na Rua da Cantareira, no 306, Parque Dom Pedro II, São Paulo, Brasil.

O processo de digestão total das amostras foi realizado empregando 200 mg de castanha de caju triturada, e acrescidas de 2 ml de ácido nítrico + 1 ml de peróxido de hidrogênio + 7 ml de água ultrapura. Sendo a solução final avolumada com água ultrapura em volume final de 13 ml.

Para avaliar a interferência da matriz nas determinações elementares, foram preparadas, em triplicata, 4 soluções distintas nos tubos Falcon:

 No tubo 1, 200 mg de castanha de caju trituradas e acrescentado 2 ml de ácido nítrico + 1 ml de peróxido de hidrogênio + 7 ml de água ultrapura e 100 microlitro de uma solução de 10 mg L-1 de Fe e Zn.

 No tubo 2, 200 mg de castanha de caju trituradas e acrescentado 2 ml de ácido nítrico + 1 ml de peróxido de hidrogênio + 7 ml de água ultrapura. Soluções analíticas, chamadas de branco:

 No tubo 3, acrescentado 2 ml de ácido nítrico + 1 ml de peróxido de hidrogênio + 7 ml de água ultrapura.

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 No tubo 4, acrescentado 2 ml de ácido nítrico + 1 ml de peróxido de hidrogênio + 7 ml de água ultrapura 100 microlitro de uma solução de 10 mg L-1 de Fe e Zn.

Essas soluções foram levadas ao forno de microondas e submetidas às mesmas condições listadas na tabela 2. Ao término da digestão cada solução foi avolumada com água ultrapura em volume final de 13 ml.

A otimização das condições instrumentais para operação do equipamento, obtidas através de estudos de avaliação da altura de observação e composição da chama, foram efetuadas utilizando soluções de 10 mg L-1 de zinco e ferro. Sendo que todas as soluções foram preparadas a partir de diluições sucessivas das soluções estoque, em meio de 0,1% de HNO3. As concentrações destas soluções compreendem uma faixa de 0,1 a 15 mg L-1 em meio aquoso e todas foram avolumadas para 10 ml com água deionizada.

A extração de gordura da castanha de caju foi realizada utilizando solução contendo metanol + clorofórmio (Merck, Alemanha), na proporção de 1:2.

O processo de extração sequencial de proteínas foi realizado utilizando amostra de castanha previamente desengordurada, empregando os seguintes meios extratores: água ultrapura, solução de cloreto de sódio 1 mol L-1 (Merck, Alemanha), solução de hidróxido de sódio pH = 11 (Merck, Alemanha) e solução de álcool etílico 70% (Merck, Alemanha). As soluções extratoras foram analisadas em um espectrofotômetro empregando um comprimento de onda de 595 nm para a quantificação das proteínas presentes em cada solução. A calibração do espectrofotômetro foi realizada com soluções analíticas de referência, preparadas por meio de diluições sequenciais sucessivas de uma solução padrão de Albumina

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36 de Soro Bovino A2153 (Sigma, USA) e acrescentando o reagente de Bradford (BioRad, USA).

A etapa de digestão gastrointestinal foi realizada na presença de soluções preparadas a partir de: cloreto de sódio (Merck, Dinamarca), bicarbonato de sódio (Synth, Brasil), hidrogenofosfato de potássio (Synth, Brasil), ácido clorídrico ( Merck, Alemanha), hidróxido de sódio (Merck, Alemanha), pepsina (Sigma Aldrich, EUA), pancreatina (Sigma Aldrich, EUA) e sais biliares (Sigma Aldrich, EUA).

3.3 Descontaminações de materiais

Toda a vidraria e recipientes para a armazenagem de soluções foram lavados com detergente, enxaguados com água três vezes e imersos em soluções de HNO3 10% (v/v) por 24 horas. Em seguida, estes materiais foram enxaguados com água ultrapura e secos em estufa, sendo que a temperatura máxima da estufa foi de 40 ºC.

3.4 Otimização dos parâmetros instrumentais de operação do FAAS

Para realizar a quantificação de Fe e Zn nas amostras de castanha de caju foram realizadas otimizações dos seguintes parâmetros instrumentais para operação do FAAS: (1) ajuste da altura de observação e (2) vazão de acetileno.

A determinação da altura de observação foi realizada ajustando o fluxo de gás acetileno em 1,5 ml min-1 e o queimador fora posicionado em quatro posições distintas: 5, 10, 15 e 20 mm. Este estudo foi realizado com soluções analíticas contendo 10 mg L-1 de Fe e Zn. A partir deste estudo foi construído o perfil gráfico que correlacionava à absorbância em função da altura de observação.

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37 Em seguida, fixou-se a altura do queimador de acordo com as condições ótimas obtidas no estudo anterior e avaliaram-se as vazões de acetileno entre 1,0 e 2,5 ml min-1. As soluções analíticas de referência utilizadas neste estudo tinham a mesma concentração das empregadas no estudo anterior. Portanto, a partir dos resultados experimentais, foi possível construir um gráfico para avaliar a melhor vazão de acetileno a ser empregada neste método.

3.5 Preparação da amostra

Após o processo de otimização dos parâmetros instrumentais do FAAS, foi realizada a etapa de preparo da amostra e posterior determinação de Fe e Zn.

Para descrever a estratégia experimental adotada durante o procedimento de preparo da amostra e determinação da concentração total de Fe e Zn na castanha de caju, foi elaborado um fluxograma (Figura 1) para auxiliar na compreensão da rota experimental adotada durante o processo de quantificação elementar.

As amostras foram trituradas durante 5 minutos e foi realizada a pesagem de 0,2 g da amostra, diretamente nos frascos de teflon. Foram adicionados os seguintes reagentes: 2 ml de ácido nítrico + 1 ml de peróxido de hidrogênio + 7 ml de água ultrapura. Em seguida, realizou-se o processo de digestão utilizando-se um forno de micro-ondas com cavidade empregando o programa de aquecimento apresentado na Tabela 2.

Este aquecimento (via microondas) foi promovido de forma branda e com um aumento gradativo da temperatura até atingir 60 oC. Sendo que o tempo total do processo de digestão ácida foi de 2 h. Após a etapa de digestão, as soluções foram transferidas para tubo Falcone diluídas com água ultrapura até completar o volume de 13 ml. Estas soluções foram analisadas por FAAS seguindo as condições

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pré-38 estabelecidas pelo fabricante e, também, as otimizações dos parâmetros instrumentais descritos anteriormente.

3.6 Procedimentos para validação do método

A partir das condições otimizadas, foram iniciadas as análises quantitativas de Zn e Fe nas amostras digeridas de castanha. Entretanto, procedimentos de validação da metodologia devem ser feitos para averiguar sua aplicação nesta etapa de quantificação. Portanto, foram adotados os seguintes procedimentos analíticos de validação:

a) avaliação da faixa linear de trabalho

b) realização de teste de adição e recuperação

c) determinação de limites de detecção e quantificação d) análise de material de referência certificado

Tais procedimentos serão detalhados nos tópicos a seguir.

3.6.1 Faixa linear de trabalho

Para a avaliação da faixa linear de trabalho foram preparadas soluções analíticas de referências utilizando concentrações de padrões de Zn e Fe em uma faixa de 0 a 15 mg L-1. Tais soluções foram analisadas por FAAS e o perfil gráfico da curva de calibração obtida experimentalmente foi analisado.

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39 Figura 1. Rota experimental adotada para a determinação de Fe e Zn total nas amostras de castanhas de caju por FAAS.

Fonte: Do autor

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40 3.6.2 Teste de adição e recuperação

O efeito de matriz foi avaliado por meio de testes de adição e recuperação, os quais foram expressos em função da porcentagem (%) de recuperação. Para realizar este teste foi necessário preparar (em triplicata) o branco analítico, sendo um com adição de 1 mg L-1 de Fe e Zn e outro sem adição de Fe e Zn. Além disto, foi realizada a digestão da amostra de castanha de caju com e sem a adição de 1 mg L-1 de Fe e Zn. É importante ressaltar que todas as soluções foram submetidas ao processo de digestão ácida assistida por micro-ondas e as análises foram realizadas por FAAS, empregando as condições instrumentais otimizadas. Em seguida, os valores de absorbância obtidos a partir da análise de tais soluções, foram utilizados para calcular a porcentagem de recuperação através da seguinte expressão:

% recuperação = (amostra com adição de analito) – (amostra sem adição) x 100 (branco com adição de analito) – (branco sem adição)

Equação 1

3.6.3 Limites de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)

O limite de detecção e o de quantificação foi obtido através da análise de 10 medidas do branco analítico obtido a partir do processo de digestão ácida assistida por micro-ondas. O mesmo procedimento foi aplicado nas etapas de extração sequencial (para cada extrator) e na digestão simulada. Tais valores foram calculados conforme as Equações 1 e 2 (Anvisa, Resolução RE899, 2003).

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41 Equação 2

Equação 3

3.6.4 Análise de material de referência certificado

A avaliação da exatidão do método foi realizada empregando a análise de um material de referência certificado proveniente do NIST. Portanto, a amostra de Peach Leaves (SRM 1547, NIST, EUA) foi submetida ao mesmo procedimento de digestão total assistida por microondas empregado para as amostras de castanha de caju. Após, foi realizada a determinação da concentração total de Fe e Zn por FAAS e compararam-se os resultados experimentais com aqueles obtidos através do certificado de análise proveniente do NIST.

3.7 Determinação da concentração total de proteínas

O procedimento de determinação total de proteína presente na castanha de caju foi realizado em um analisador elementar (CHNS) com o objetivo de avaliar se a concentração de proteína é alterada ao realizar o procedimeto de extração da gordura. A castanha de caju foi triturada e dividida em duas porções. A primeira foi armazenada sem tratamento posterior. Entretanto a segunda porção passou pelas seguintes etapas:

a) Pesagem de 6 g em tubo de polipropileno de 50 ml

LD = 3 x Desvio padrão das médias do branco analítico Coeficiente de regressão angular

LQ = 10 x Desvio padrão das médias do branco analítico Coeficiente de regressão angular

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42 b) Adicionar 30 ml de uma solução contendo (10 ml de metanol e 20 ml de clorofórmio.

c) Agitar por 1 h a uma velocidade de 350 rpm

d) Separar a fração orgânica (metanol/clorofórmio) utilizando uma centrífuga, durante 20 minutos a 6000 rpm.

e) Secar o precipitado em estufa a temperatura máxima de 25 oC ,1h.

f) Levar a porção de castanha com e sem gordura para o analisador elementar (CNHS).

3.8 Procedimento de extração sequencial e quantificação de frações de proteínas

Com o objetivo de realizar um procedimento de extração sequencial de proteínas presentes na castanha de caju, foi realizada uma extração sequencial, conforme relatado na Figura 2 e as etapas deste processo descritas a seguir:

1. Inicialmente a castanha de caju cru foi triturada por 5 minutos em processador de alimentos.

2. A castanha de caju triturada (3 gramas) foi pesada em tubo falcon de 15 ml e acrescentado 13 ml solução extratora contendo metanol e clorofórmio na proporção de 1:2.

3. Em seguida, a mistura foi levada a agitação em mesa agitadora, durante 2 horas a 350 rpm.

4. Após, esta amostra foi submetida a centrifugação empregando uma velocidade de 6000 rpm por 20 minutos. A fase sólida foi separada do sobrenadante e transferida para um novo tubo de ensaio. Em seguida, realizou a evaporação do solvente contido nesta amostra isenta de gordura.

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43 5. A partir da amostra sem gordura, foi realizado o processo de extração sequencial

de proteínas com a adição de 13 ml água ultrapura.

6. Em seguida, a mistura foi levada a agitação por 1 hora a 350 rpm. A seguir, a solução foi centrifugada e o sobrenadante (S1) obtido. O resíduo foi destinado para a próxima etapa de extração.

7. Ao resíduo obtido a partir da etapa anterior, foi realizada a adição de 13 ml de NaCl 1 mol L-1, repetindo-se o procedimento de agitação por 1 h e centrifugação por 20 minutos e velocidade de agitação 350 rpm. O sobrenadante (S2) foi armazenado e a fase sólida foi submetida ao processo de extração alcalina.

8. A etapa de extração alcalina consistia na adição de 13 ml de solução de NaOH (pH=11) e realizando agitação da mistura por 1 h, conforme relatado anteriormente. O resíduo foi coletado e o sobrenadante (S3) foi transferido para um novo tubo e armazenado.

9. Finalmente, após a extração alcalina, foi realizada a adição de 13 ml de solução 70 % (v/v) de etanol à fase sólida proveniente da extração com NaOH. A mistura foi agitada por intervalo de tempo de 30 minutos e velocidades constantes de 350 rpm. Após, a mesma foi centrifugada e o sobrenadante (S4) foi transferido para um novo tubo de polipropileno.

As porções S1, S2, S3 e S4 foram analisadas em um espectrofotômetro empregando o método de Bradford.

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44 Figura 2. Esquema da extração sequencial de proteína da castanha de caju, seguida da etapa de análise de Fe e Zn associadas às porções de proteína.

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45 É importante ressaltar que a calibração do espectrofotômetro foi realizada utilizando soluções padrão de Albumina (0 mg L-1 ; 0,1 mg L-1; 0,2 mg L-1; 0,3 mg L -1

; 0,4 mg L-1 ; 0,5 mg L-1 ; 0,6 mg L-1 0,8 mg L-1 e 1 mg L-1) a partir da pesagem de 2 mg de Albumina em um tubo Eppendorf de 2 ml. Esta solução foi homogeneizada por 1 min em agitador do tipo Vortex. A seguir, foram retiradas alíquotas em diluições sucessivas para compor soluções de calibração compreendidas na faixa de 0 a 1 mg L-1 com volume total de 1 ml cada. Novamente, realizou-se a homogeinização destas soluções e transferiu-as (6 µL de cada solução) para a placa de Elisa e adicionou-se 200 µl do reagente de Bradford. A placa foi agitada por mais 5 minutos, sem luz, e, por fim, realizou-se a análise em um espectrofotômetro empregando λ = 595nm (Siloto, 2005).

Além do processo de quantificação de proteínas, foi realizada (também) a determinação de Fe e Zn em cada solução extratora (S1, S2, S3 e S4) utilizando os parâmetros instrumentais apresentados na Tabela 1.

Com base na análise proteíca via UV-Vis e a determinação elementar por FAAS, foi possível realizar as primeiras correlações entre os analitos (elementos e proteínas) presentes na amostra de castanha de caju.

3.9 Avaliação da estabilidade ao armazenamento e tempo de extração das proteínas

A fim de verificar a estabilidade das soluções obtidas a partir do procedimento de extração sequencial (S1, S2, S3 e S4), as mesmas foram submetidas ao congelamento em frezer (temperatura de - 3 O_{C) e analisadas durante duas semanas} consecutivas, empregando o método de Bradford.

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46 Com base no resultado obtido a partir da avaliação do tempo de estocagem das soluções proteícas foi realizado, também, um estudo do tempo necessário para extrair as proteínas. Neste sentido, foram pesadas 3 g de castanha de caju (isenta de gordura) em diferentes tubos de polietileno. Após, foi realizado o procedimento de extração sequencial descrito na figura 2. Entretanto, os tempos de extração foram mantidos fixos em: (a) 30 min; (b) 60 min; (c) 90 min; (d) 120 min e (f) 150 min para cada processo extrator. Ou seja, foi realizado o processo de extração sequencial completo empregando um tempo de extração de 30 min, para um determinada massa de amostra. Em seguida, repetia-se o mesmo procedimento, porém, empregando um intervalo de tempo de extração maior que o anterior.

Cada solução foi analisada por espectrofotometria, empregando o método de Bradford.

3.10 Precipitação de proteínas obtidas a partir do procedimento de extração sequencial e determinação da concentração de Fe e Zn presente em cada precipitado

Considerando os melhores resultados obtidos a partir do estudo de estabilidade e tempo de extração ideal das proteínas, foi realizado um procedimento de precipitação deste analito empregando acetona. Em seguida realizou-se a determinação de Fe e Zn neste precipitado. Este procedimento foi adotado para verificar se os elementos continuavam associados as proteínas após o processo de precipitação.

O procedimento consistia de realizar as etapas 1 a 9 , descritas no item 3.8, a partir daí foi realizado a precipitação desse material com acetona a fim de obter as

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47 possíveis metaloproteínas. O procedimento experimental adotado nesta etapa está descrito a seguir:

1. Realizar o procedimento de extração sequencial adotado no item 3.8

2. Adicionar de 30 ml de acetona (1:4) v/v em cada extrato proteíco ( S1, S2, S3 e S4) após o processo de extração sequencial.

3. Centrifugação das soluções por 10 minutos (6000 rpm) e coleta do precipitado. 4. Os precipitados foram ressuspensos utilizando 10 mL água ultrapura, 1 ml de H2O2 e 2 ml de HNO3.

5. A mistura foi levada ao banho de aquecimento sob agitação constante por 1 h à 100oC

6. As soluções digeridas foram analisadas por FAAS, a fim de determinar Fe e Zn associado a esta porção de proteína precipitada.

3.11 Digestão gastrointestinal simulada

Para verificar a bioacessibilidade de Fe e Zn na castanha de caju e das metaloproteínas foram preparadas soluções que simulam a ação dos fluídos gástrico e intestinal sobre o alimento. O preparo de tais soluções e a rota experimental adotada está descrita nos tópicos a seguir.

3.12 Preparo das soluções de fluídos gástrico e intestinal

A digestão gastrointestinal simulada da castanha de caju foi realizada em duas etapas. No primeiro estágio (digestão gástrica) foi preparado o fluido gástrico a partir de 0,10 g de NaCl, 0,16 g de pepsina e 3,5 ml de HCl (12 mol L-1). Sendo o

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48 ácido, o sal e a enzima dissolvidos em água deionizada e, ao final, avolumou-se a solução final para 50 ml.

Uma solução de NaHCO3 (3% (m/v)) foi preparada para aumentar o pH da solução gástrica de 1,2 para 6,8 para atingir as condições necessárias para se realizar a digestão intestinal. Esta solução preparada a partir da dissolução de 1,5g de NaHCO3 em 50 ml de água deionizada.

O fluído intestinal utilizado no segundo estágio (digestão intestinal) foi preparado a partir de mistura de 0,34 g de K2HPO4, 0,5 g de pancreatina, 0,675 g de sais biliares, 3,75 ml de NaOH 0,2 mol L-1 avolumados para 50 ml. Os sólidos foram dissolvidos em água deionizada antes da adição de NaOH, o volume da solução foi ajustado para 100 ml e o pH foi mantido a 6,8.

3.13 Digestão simulada gastrointestinal

As soluções descritas anteriormente foram utilizadas para simulação do processo gastrointestinal conforme apresentado na Figura 3. Para o primeiro estágio, uma massa de 0,2 g de amostra previamente triturada foi colocada em tubo Falcon de 15 ml e foram adicionados 3 ml de fluído gástrico. A mistura foi agitada em agitador do tipo vortex (30 segundos) e, em seguida, mantida em banho termostático a 36 °C por 2 h, com agitação constante 80 rpm.

Decorrido este período, foi adicionado volume adequado de NaHCO3 (3% (m/v)) a fim de ajustar o pH da solução de 1,2 para 6,8 e acrescido um volume de 3 ml de fluído intestinal para o segundo estágio. A solução novamente foi mantida em banho termostático (36 O