AÇÃO DO FITOFÁRMACO CENTELLA ASIÁTICA EM RATOS
PARCIALMENTE HEPATECTOMIZADOS: ANÁLISE HISTOLÓGICA
HEPÁTICA.
Hudis Paio Junior
Faculdade de Ciências Farmacêuticas Centro de Ciências da Vida hudis.pj@puccampinas.edu.br
Prof. Dr. Pedro Paulo Barros
Grupo de Pesquisa ou Programa do Orientador Centro de Ciências da Vida
barrospp@puc-campinas.edu.br
Resumo: Avaliar in vivo a atividade hiperplásica he-pática, abordando aspectos relacionados com a mor-fologia hepática após realização de hepatectomia parcial frente ao tratamento prévio com Centella Asiática. Foram utilizados 30 ratos albinos da linha-gem Wistar divididos em 2 grupos. Os animais do Grupo Tratado (15 animais) receberam por via oral doses diárias padronizadas de soluções do fitoterápi-co Centella Asiática. Enquanto que os animais do grupo controle receberam por via oral doses diárias padronizadas de solução fisiológica. Esses dois gru-pos foram subdivididos em outros 3 subgrugru-pos com 5 animais em cada, assim organizados em função do tempo de tratamento pós-cirúrgico (24, 36 e 48 ho-ras).Ao final de cada período de tratamento, os ani-mais foram eutanasiados e imediatamente após, fra-gmento de tecido hepático foi retirado. Lâminas histo-lógicas dos espécimes do tecido hepático foram tra-tadas com Hematoxilina-Eosina e Feulgen, as ima-gens foram capturadas digitalmente e analisadas quantitativamente para se determinar a proliferação celular.Todos os grupos apresentaram regeneração hepática seguindo os padrões de normalidade, mas o fitoterápico não interferiu significativamente no pro-cesso de hiperplasia hepática. Acredita-se que possi-velmente, utilizando doses maior
es, por outra via de administração ou em um maior período de tratamento, poderia ocorrer uma interfe-rência significativa.
Palavras-chave: Hepatectomia parcial, Fitoterápicos, Ratos, Hiperplasia hepática e Centella asiatica. Área do Conhecimento: Saúde (400.00.00-1) – Farmácia (4.030.000-5)
1. INTRODUÇÃO
A Centella asiatica é uma erva daninha encon-trada na Índia, Sri Lanka e Madagascar que pertence à família das Umbelíferas. Na medicina ayurvédica é usada no tratamento de doenças de pele, feridas lo-cais e para melhora da capacidade mental, da icterí-cia e da hepatite [1]. Na Europa, a infusão de suas partes aéreas é usada para o tratamento de feridas e
úlceras [2]. É usada também para o tratamento de
dermatite, para purificação do sangue, melhora da
hipertensão e memória na Indonésia [3] eno Brasil[4].
Estudos experimentais em ratos verificaram que o uso da Centella asiatica minimizou a taxa de morta-lidade de ratos com deficiência de proteína bruta, aumentou as proteínas nitrogenadas no sangue, evi-tando a esteatose hepática [5].
A atividade terapêutica do extrato de Centella asiatica em doenças hepáticas crônicas está relacio-nada a um triterponóide, o asiaticosídeo, que restau-rou 40% das células hepáticas lesadas, trazendo-as ao estado normal [6].
No Brasil, o asiaticosídeo é amplamente comer-cializado em farmácias de manipulação. Sua utiliza-ção vai desde o tratamento de celulite, melhoria da circulação periférica, eliminação de edemas e hema-tomas, combate a processos degenerativos do tecido conjuntivo, entre outros usos. Ele é um pó branco a amarelado, com sabor amargo cuja fórmula estrutural é C48H78O19, sendo insolúvel em água e pouco solúvel em etanol.
O uso de plantas com finalidade medicinal para fins curativos e paliativos, data do período Paleolítico [7]. O consumo de plantas medicinais in natura ou devidamente preparadas vem apresentando um crescimento considerável em diversos países, o que pode ser explicado por diferentes fatores, destacan-do-se entre eles: o custo elevado e os efeitos indese-jáveis dos fármacos sintéticos, a preferência dos consumidores por “produtos naturais”, a certificação científica das propriedades farmacológicas de espé-cies vegetais, o desenvolvimento de novos métodos analíticos realizados para um controle de qualidade, o desenvolvimento de novas formas de preparação e administração de produtos fitoterápicos, um melhor conhecimento químico, farmacológico e clínico das drogas vegetais e seus derivados [8].
O método da hepatectomia parcial para estudo da hiperplasia hepática constitui-se num vasto campo para a investigação laboratorial. Os hepatócitos se proliferam em diversas situações, das quais se pode
citar: hepatite viral, reações hepatotóxicas e cirrose, mas também pode ser induzida experimentalmente por agentes químicos em animais [9].
O fígado é o maior tecido glandular do organis-mo. É um órgão multifuncional, sendo que dentre suas principais funções destacam-se a síntese e a secreção proteica, a secreção biliar, a regulação dos níveis glicêmicos e a metabolização de drogas e car-boidratos. Seu parênquima é constituído por hepató-citos com cerca de 80% da população celular do ór-gão. Os hepatócitos são células altamente diferenci-adas e estáveis, com baixo índice mitótico, no entan-to entram em divisão celular mediante estímulo tanentan-to de natureza física ou química, infecciosa ou mesmo tóxica [9].
No entanto, diversos fatores podem influenciar a hiperplasia hepática, sendo necessário que os expe-rimentos laboratoriais sejam rigorosamente controla-dos. Os fatores mais importantes são: a espécie ani-mal e linhagem utilizada; a idade dos animais, visto que ratos jovens estão em fase de crescimento, o aumento da massa hepática, condições de alojamen-to dos animais e dieta. De acordo com Matalojamen-tos Filho (1976), a retirada de menos de 2/3 do volume do fí-gado resulta em crescimento mais atenuado dos ló-bulos residuais, enquanto que a retirada de mais de 2/3 acarreta uma tendência de aumento compensató-rio do órgão, verificado pelo acúmulo de diversas substâncias [10].
Os estudos envolvendo a hepatectomia parcial podem ser realizados com diversas espécies e raças de animais. Neste estudo, utilizamos o Rattus nor-vegicus albinos, da variedade Wistar, pela facilidade de manuseio laboratorial e sua utilização na maioria dos trabalhos apresentados na bibliografia consulta-da.
Como comprovado por Machado (2002), a lesão do parênquima hepático induzida por estímulos de-sencadeia o processo de reparação, que começou ser elucidado com o advento da Biologia Molecular, cujas técnicas permitem maiores esclarecimentos dos eventos que promovem e controlam a divisão celular [9].
Assim sendo, são usados nos tecidos em prolife-ração os marcadores que se incorporam ao DNA, anticorpos como o PC-10, que marca o antígeno nu-clear de proliferação celular, o índice mitótico, que quantifica as figuras de mitose, entre outros [11].
As células de Kupffer e as células endoteliais são importantes na proliferação do parênquima hepático por liberarem substâncias, como fatores de cresci-mento (HGF, TGF-a, TGF-b, VEGF, TNF-a, INF-g) e citocinas (IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10) com efeitos
endó-crinos, parácrinos e autóendó-crinos, que induzem os he-patócitos à proliferação celular [9].
As primeiras horas após hepatectomia parcial são importantes na recuperação do tecido hepático, pois o órgão é vulnerável a substâncias químicas que podem alterar a resposta proliferativa. No entanto, diferentes métodos têm sido usados para detectar proliferação celular em vários tecidos, fornecendo informações importantes a respeito do crescimento, transformação e reparação teciduais [9].
Experimentalmente, o modelo mais empregado até hoje no estudo da regeneração hepática baseia-se em Higgins e Anderson (1931), que, após remove-rem 70% do fígado de ratos Wistar, observaram que o órgão voltava ao seu tamanho original no período de 14 a 21 dias. Após a hepatectomia parcial, os lo-bos residuais cresciam rapidamente até que o volu-me equivalesse ao de antes, e então, abruptavolu-mente, o crescimento cessava [11, 12].
Lima et al. (1993) fizeram uso de ratos que foram submetidos a hepatectomia parcial associada e não associada a vagotomia parcial. Os níveis glicêmicos sistêmicos foram medidos após 4, 24, 44 e 72 dias após cirurgia. Os autores concluíram que a hepatec-tomia parcial, por si só, reduz precocemente os ní-veis glicêmicos, a qual permanece constante durante o jejum, não dependendo, portanto da integridade do sistema nervoso parassimpático [13].
Aznar e colaboradores (1991) estudaram a in-fluência do diabetes sobre a hiperplasia hepática em ratos. Os autores observaram que houve uma redu-ção na popularedu-ção de hepatócitos nos animais diabé-ticos quando comparados com animais controle não diabéticos dezoito dias pós-hepatectomia parcial. Os autores concluíram que a diminuição da população de hepatócitos em animais diabéticos se deve a re-dução de insulina e glucagon, sugerindo que estes dois hormônios estimulam a hepatogênese [14].
De acordo com Callery et al. (1991), os níveis plasmáticos de prostaglandina E2 e a síntese de DNA aumentaram, assim como a capacidade das células de Kupffer em produzir prostaglandina E2, em resposta a hepatectomia parcial. Todavia, aos doze dias após hepatectomia, quando a população de he-patócitos é igual a 80% do tecido, a capacidade das células de Kupffer em produzir prostaglandina e a síntese de DNA regredia. Os autores postulam que elevados níveis de prostaglandina E2 atuam como sinal parácrino fundamental para iniciar e controlar o crescimento de novos hepatócitos durante a hiper-plasia [15].
Uma pesquisa com objetivo de avaliar o efeito da luz laser em lobos hepáticos remanescentes após
hepatectomia parcial foi elaborada por Oliveira et al. (2006). A análise dos resultados demonstrou que o laser não causou lesões hepáticas, como também estimulou a atividade proliferativa hepatocelular [16].
Silva et al. (2006) estudaram o efeito do extrato aquoso da Sida cordifolia, popularmente conhecida no Brasil como “malva-branca”, administrada oral-mente nas doses diárias de 0 (controle), 100, 200 e 400mg/kg de Sida em animais parcialmente hepatec-tomizados. Vinte e quatro horas após cirurgia os fí-gados foram removidos e avaliados por imunohisto-química (PCNA), utilizando o anticorpo monoclonal PC-10. Os autores concluíram que os animais trata-dos com Sida 100 e Sida 200 mostraram índices de hiperplasia hepática superior ao grupo controle e Si-da 400 [17].
Em estudo, Oliveira, F. M. e colaboradores (2003) propuseram um modelo de hepatectomia par-cial laparoscópica em ratos. Fazendo uso de material cirúrgico semelhante ao usado em humanos, os auto-res concluíram que o modelo é factível para o trei-namento e aprimoramento de novos cirurgiões [18] 2. OBJETIVO
Avaliar in vivo a atividade hiperplásica hepática, abordando aspectos relacionados com a morfologia hepática após realização de hepatectomia parcial frente ao tratamento prévio com Centella Asiática.
3. MÉTODO
3.1 ORGANIZAÇÃO DOS ANIMAIS
Neste trabalho foram utilizados 30 ratos albinos (Rattus norvegicus), machos, da linhagem Wistar, não isogênicos, fornecidos pós-desmame com 50 dias de idade pelo Biotério do Campus II da PUC Campinas.
Os animais foram alojados no Biotério Experi-mental do Laboratório de Fisiologia e Biofísica do Centro de Ciências da Vida, PUC-Campinas, com capacidade máxima de alojamento de 60 animais, com luz e ventilações controladas, os quais recebe-ram o fornecimento de ração sólida Nuvilab e água sem restrição até atingirem a idade de 60 dias.
Um grupo experimental denominado Grupo Tra-tado (15 animais), foi dividido em 3 subgrupos com 5 animais cada, e outro grupo experimental denomina-do Grupo Controle (15 animais) foi divididenomina-do em 3 subgrupos com 5 animais, assim organizados em função do tempo de tratamento pós-cirúrgico.
3.2 TRATAMENTO PRÉ-CIRÚRGICO
Os animais dos grupos Controle e Tratado foram alojados em gaiolas autoclaváveis com forração de maravalha autoclavada e fornecimento de ração sóli-da Nuvilab e água sem restrição e permaneceram no Biotério Experimental do Laboratório de Fisiologia e Biofísica do Centro de Ciências da Vida, PUC-Campinas, com luz e ventilações controladas.
O Grupo Tratado (15 animais) recebeu diaria-mente, durante uma semana antecedendo a realiza-ção da hepatectomia parcial, uma dose diária de 50mg/Kg peso, contida em volume de 1ml para um animal de 250 (±) 10 gramas de peso da solução de fitoterápico Centella asiatica, na concentração de 1,25g/100ml, por via oral administrada pelo método de gavagem.
O Grupo Controle (15 animais) recebeu diaria-mente, durante um semana antecedendo a realiza-ção da hepatectomia parcial, uma dose diária de 1 ml de solução fisiológica de cloreto de sódio na concen-tração de 0,9%, por via oral administrada pelo méto-do de gavagem.
3.3 Cirurgias: Hepatectomia Parcial
Os animais foram submetidos à anestesia geral com solução de Cloridrato de Xylasina (Virbaxyl 2%®) + Ketamina (Francotar ®), administrado por via intraperitoneal na dose de 1,5 ml/kg de peso corporal e posteriormente foram colocados em placa de con-tenção. Ambos os grupos, Controle e Tratado, foram submetidos à hepatectomia parcial, conforme
proce-dimentos descritos por Higgins e Anderson (1931) [15].
Inicialmente, procedeu-se a depilação da região abdominal ao longo da linha mediana e a assepsia da região. Em seguida, procedeu-se uma incisão ventral mediana de 3 a 4 cm, a partir do apêndice xifóide do osso externo.
Por compressão da região abdominal efetuou-se a extrusão dos lóbulos hepático mediano e lateral esquerdo, permanecendo na cavidade abdominal o lóbulo lateral direito e pequeno caudado, lobos rema-nescentes.
Imediatamente após, procedeu-se o ligamento dos lóbulos mediano e lateral esquerdo, com fios de algodão. Em seguida, procedeu-se a secção dos li-gamentos suspensores e extirpação dos lobos. Fina-lizado estes procedimentos, realizou-se a sutura com fios de algodão, da musculatura abdominal com pon-tos contínuos e a da pele com ponpon-tos separados.
3.4 OBTENÇÃO DO TECIDO HEPATICO
Após decorrido 24, 36, e 48 horas dos procedi-mentos cirúrgicos, duas horas antes da remoção dos lóbulos remanescentes e eutanásia, foi aplicado uma injeção intraperitoneal de Tecnocris® (Sulfato de Vin-cristina) na dose de 1mg/Kg de peso animais, uma vez que a cinética da hiperplasia hepática é caracte-rizada com a síntese de DNA e tem seu início cerca de 12 a 16 horas após a hepatectomia, sendo que seus valores máximos obtidos em 24 a 36 horas após a cirurgia. É seguida por uma onda de mitoses que se inicia 22 a 24 horas após a cirurgia, sendo que seus valores máximos obtidos em 33 a 34 horas após cirurgia. Ciclos adicionais de síntese de DNA acontecem aos 5 a 10 dias subsequentes. O proces-so hiperplásico se completa em 7 a 14 dias.
Em seguida os animais foram submetidos à anestesia geral por solução de Cloridrato de Xylasina (Virbaxyl 2%®) + Ketamina (Francotar ®), adminis-trado por via intraperitoneal na dose de 1,5 ml/kg de peso corporal.
Confirmada a anestesia, os animais foram colo-cados em placa de contenção na posição decúbito dorsal e a região do abdômen próxima ao tórax foi tricotomizada.
Em seguida, com o animal ainda sob efeito anes-tésico, procedeu-se a abertura do tórax com exposi-ção ao tecido hepático remanescentes, ao ser remo-vido foi realizada a coleta do material, em seguida foi feita a fixação do material com formol para que os texidos nao sofra dos efeitos de deterioração [21].
Após esse processo os animais foram eutanasi-ados por aprofundamento de anestesia com solução de Cloridrato de Xylasina (Virbaxyl 2%®) + Ketamina (Francotar ®).
3.5 ANÁLISE DAS LAMINAS HISTOLOGICAS
Tendo em vista as atividades realizadas, descritas anteriormente, pode-se verificar que estas resultaram na obtenção de lâminas histológicas, que foram confeccionada e coradas de duas maneiras: Hematoxilina-Eosina e Feulgen, o que nos possibili-tou avaliar a atividade hiperplásica do fígado após hepatectomia parcial.
Tal avaliação ocorreu através da contagem das figu-ras de mitose e apoptose através de microscopia com o aumento de 400x em que foram contados 40 campos de cada lâmina e esses resultados foram posteriormente comparados entre o grupo Tratado e o Controle.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para fim de obtermos uma avaliação da regeneração hepatica dos animais, utilizamos como parâmetro de analise para o estudo dois enfoques, o numero de mitoses e apoptoses.
Para análise desses parâmetros foram confecciona-das e coraconfecciona-das laminas histológicas com fragmentos remanescente do fígado dos animais. A partir das laminas foram analisados através de microscopia de luz 40 campos, buscando a quantificação dos parâ-metros utilizados no estudo.
Ao termino da leitura dos grupos de animais envolvi-dos, foi realizado uma comparação entre os parâme-tros observados através do software ANOVA, que cruzou os dados obtidos de todos os grupos tratados e controle com o tempo de tratamento (24, 26 e 48 horas), em que não revelou resultados não significa-tivos, uma vez que neste estudo, todos os grupos apresentaram regeneração hepática seguindo os padrões de normalidade, e não mostraram diferença significativa no nível de apoptose. Como podemos observar nas figuras a seguir:
No entanto, é possível que os estudos Silva (2012), foram diferente dos obtidos neste trabalho, uma vez que utilizaram como forma de lesão ao tecido hepáti-co a intoxicação por uma droga, quando no presente trabalho foram realizadas lesões cirúrgicas com a remoção de parte do fígado o que pode ter influenci-ado nos dinfluenci-ados obtidos. contudo, se houvesse um aumento na dosagem utilizada, tempo de tratamento maior, formas e extratos diferences como nos estu-dos de; B. Antony et al.(2011) comprovaram que o tratamento com Centella asiatica por 3 meses em ratos intoxicados por CCl4, mostrou níveis séricos reduzidos de ALT em animais que foram tratados com dosagem de 20mg/kg e níveis séricos quase normalizados com a dosagem de 40mg/kg [19]. ou mesmo no estudo de B. Antony et al.(2011), e Yun Zhao (2014) que obtiveram resultados mais expres-sivos, pois eles apresentaram condições diferentes das realizadas neste presente estudo. O período de tratamento foi de 3 meses e 5 semanas respectiva-mente, e não apenas 7 dias como foi realizado neste trabalho, o que poderia aumentar relativamente os resultados encontrados.
Já por Somchit M.N. et al. (2004), que tem comprado que o extrato aquoso de Centella asiatica por via in-traperitoneal possui atividades antinociceptivas e an-tiinflamatórias, variando sua ação em decorrência da concentração do extrato [20]. e por fm o estudo de Somchit M.N. et al. (2004) em que a via de adminis-tração foi intraperitoneal, e não via oral como na
pre-sente pesquisa. Isto pode ser explicado levando-se em consideração que ao administrar o fitoterápico via oral, este sofre a ação de enzimas e pH muito ácido, o que não ocorre quando introduzido via neal. Deve-se ressaltar também que a via intraperito-neal promove uma absorção mais rápida do fitofár-maco, devido à grande superfície de absorção da cavidade abdominal e que seria uma via impróprio para o uso de um fitoterápico pela população, uma vez que essa técnica requer um conhecimento espe-cífica para aplicação.
5. CONCLUSÃO
Após todos as etapas realizadas do presente estudo, chegamos a conclusão de que a Centella Asiática na dosagem, a via de administração utilizada e o tempo de duração do tratamento não indicou melhoras sig-nificativas na proteção hepática e na hiperplasia dos animais em estudo uma vez que as taxas de hiper-plasia hepática permaneceu nos padrões de normali-dade, acreditando que se a dosagem e a via de ad-ministração fosse alterada os resultados poderiam ser mais significativos para estudos nessa área.
AGRADECIMENTOS
Ao Fundo de Apoio à Iniciação Científica – FAPIC/ Reitoria, PUC Campinas.
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