CIBELE BEATRIZ DA SILVA OLIVEIRA
ATIVIDADE DOS CONSTITUINTES DA SALIVA DE FLEBOTOMÍNEOS NA INFECÇÃO POR Leishmania E SUA POSSÍVEL UTILIZAÇÃO NO CONTROLE DA
LEISHMANIOSE: UMA REVISÃO
Natal - RN Setembro de 2016
por
Cibele Beatriz da Silva Oliveira
Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes
Natal - RN Setembro de 2016
Monografia apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB Oliveira, Cibele Beatriz da Silva.
Atividade dos constituintes da saliva de flebotomíneos na infecção por Leishmania e sua possível utlização no controle da Leishmaniose: uma revisão / Cibele Beatriz da Silva Oliveira. - Natal, 2016.
61 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes.
Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina.
1. Componentes salivares - Monografia. 2. Flebotomíneos - Monografia. 3. Imunidade - Monografia. 4. Leishmanioses - Monografia. 5. Vacina - Monografia. I. Guedes, Paulo Marcos da Matta. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
Gostaria de agradecer em primeiro lugar à Deus por ter me dado a oportunidade de ter chegado até aqui.
Agradeço à minha mãe, Francisca Ivonete da Silva, cuja força se tornou minha própria força. O meu diploma, antes de pertencer a mim, pertencerá a ela.
Gostaria de agradecer também ao Professor Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes que me auxiliou na construção deste trabalho e à banca examinadora. Obrigada por
contribuírem com a minha formação profissional.
Agradeço aos meus avós e tios pelo apoio financeiro sem o qual jamais conseguiria terminar o curso.
Agradeço à José Makary, pela edição de imagens e pela paciência durante estes quase cinco anos de curso.
Agradeço ao meu pai Francisco Montenegro de Oliveira, minha irmã Silvia Simone da Silva Oliveira e meus sobrinhos João Pedro, José Rafael e Daniel.
Finalmente, agradeço à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela minha formação como profissional Biomédica.
RESUMO
As leishmanioses constituem um grupo de doenças tropicais negligenciadas constituindo um grande problema de saúde pública, sendo causadas por parasitos do gênero Leishmania e transmitidas aos seres humanos e outros hospedeiros vertebrados por meio da picada de flebotomíneos infectados. Os componentes salivares dos flebotomíneos possuem atividades antihemostáticas, anti-inflamatórias e imunomoduladoras importantes para o sucesso da alimentação do inseto e que favorecem a sobrevivência do parasito. A saliva dos flebotomíneos é capaz de estimular tanto a imunidade mediada por células como também a imunidade humoral dos hospedeiros. A resposta imune contra os componentes salivares dificulta o estabelecimento dos parasitos, contribuindo como fator protetor contra o desenvolvimento da doença. Uma vez que a maior parte dos componentes salivares desses insetos são proteínas, a produção de anticorpos anti-saliva constitui um dos eventos importantes para a neutralização dos efeitos imunomoduladores, sendo um dos fatores implicados na proteção contra o estabelecimento do parasito. Além disso, anticorpos podem ser detectados no soro de humanos e outros reservatórios em campo constituindo uma ferramenta para estimar a exposição ao inseto vetor, servindo como biomarcador para demarcar as áreas de risco para a leishmaniose, além de identificar os reservatórios presentes nessas regiões. A mensuração dos níveis de anticorpos contra a saliva do vetor também tem sido utilizada na avaliação de estratégias de controle como, por exemplo, o uso de coleiras e mosquiteiros impregnados com inseticida. A capacidade apresentada por determinados componentes salivares em estimular o desenvolvimento de resposta do tipo Th1, hipersensibilidade do tipo tardia e a produção de anticorpos, tem tornada atrativa a possibilidade de desenvolvimento de vacinas baseadas em antígenos salivares. Atualmente não existe um medicamento que gere cura parasitológica em pacientes infectados e medidas profiláticas alternativas têm sido perscrutadas. Nesse contexto, a pesquisa de componentes da saliva dos insetos vetores de Leishmania, os flebotomíneos, tem gerado resultados promissores.
Palavras-chave: Componentes salivares. Flebotomíneos. Imunidade. Biomarcador. Vacina. Leishmanioses.
ABSTRACT
Leishmaniasis are a group of neglected tropical diseases constituting a serious public health problem. This group of diseases is caused by Leishmania parasites and transmitted to humans by sandflies bite. Salivary compounds of phlebotomines have anti-hemostatic, anti-inflammatory and immunomodulatory activities which are important to the success of insect feeding and parasite survival. The sandfly saliva is able to stimulate both cell-mediated immunity as well as humoral immunity in the host. The immune response against salivary components strongly influences the establishment, evolution and outcome of leishmanial infection. Salivary components of these insects are mainly proteins and the production of anti-saliva antibodies is an important event for the neutralization of immunomodulatory effects, one of the factors implicated in avoid parasite establishment. In addition, antibodies detected in human sera and other hosts can represent an important tool to estimate exposure to insect vector. This tool can be used as a biomarker to evaluate risk areas for leishmaniasis and identify hosts. The measurement of antibodies levels against the vector saliva has also been used to assess control strategies such as the use of collars and nets insecticide-treated. Salivary compounds drive the development of Th1 response, delayed type hypersensitivity and antibody production which make these compounds promising for vaccine development. Available treatment for human leishmaniasis do not generate parasitological cure, thus alternative preventive measures have been investigated. In this sense, researches with salivary components of phlebotomines insects which are vectors of Leishmania parasites, has generated promising results.
Keywords: Salivary compounds. Sand fly. Immunity. Biomarker. Vaccine. Leishmaniasis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1– Representação do ciclo de vida de Leishmania... 18
Figura 2 – Resumo do modelo proposto sobre a ação de maxadilan e a promoção da exacerbação da doença em camundongos naturalmente resistentes à infecção por L. major... 28
Figura 3 – Ações imunomodulatórias dos componentes salivares de
flebotomíneos ... 31
Figura 4 – Passos chave para implementação do uso de proteínas recombinantes da saliva de flebotomíneos em inquéritos sorológicos para estimar a
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ADO Adenosina
ADP Adenosina difosfato AMP Adenosina monofosfato ATP Adenosina trifosfato CD Cluster de diferenciação
CCR7 C-C chemokine receptor type 7 (Receptor de quimiocina do tipo 7) CMSP Células mononucleares do sangue periférico
DTH Delayed type hipersensitivity (Hipersensibilidade do tipo tardio) ERO Espécie reativa de oxigênio
FasL Fas ligante
HIV Human immunodeficiency virus (Vírus da imunodeficiência humana) Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
iNOS Inducible nitric oxide synthase (Óxido nítrico sintase induzível) IFN- γ Interferon gama
LC Leishmaniose cutânea LCD Leishmaniose cutânea difusa LCL Leishmaniose cutânea localizada LDPC Leishmaniose dérmica pós-calazar LMC Leishmaniose mucocutânea
LT-B4 Leucotrieno B4 LV Leismaniose Visceral
MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1 (Proteína quimiotática de monócitos)
MHC Major histocompatibility complex (Complexo principal de histocompatibilidade)
NETs Neutrophil extracellular traps (Armadilhas extracelulares de neutrófilos) NK Natural killer
ON Óxido nítrico PGE2 Prostaglandina E2
TGF-β Transforming growth factor beta (Fator de transformação do crescimento beta)
Th T helper (T auxiliar)
TNF-α Tumor necrosis factor alpha (Fator de necrose tumoral alfa) Treg T regulatory (T regulador)
SUMÁRIO
RESUMO... iv
ABSTRACT ... vi
LISTA DE FIGURAS ... vii
LISTA DE ABREVIAÇÕES ... viii
1 INTRODUÇÃO ... 11
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 14
2.1 Os parasitos e a doença ... 14
2.2 Ciclo biológico de Leishmania spp. ... 16
2.3 Classificação, morfologia e biologia de flebotomíneos ... 19
2.4 Importância da saliva no processo hematofágico ... 20
2.5 Composição da saliva de flebotomíneos ... 21
2.6 Papel da saliva dos flebotomíneos na imunidade do hospedeiro ... 24
2.6.1 A resposta imunológica na leishmaniose ... 24
2.6.2 Efeitos da saliva sobre processos relacionados à defesa do hospedeiro . 25 2.6.3 Efeito exacerbatório da saliva na infecção por Leishmania ... 31
2.6.4 Papel da saliva na proteção contra a infecção por Leishmania spp. ... 32
2.7 Anticorpos anti-saliva de flebotomíneos e seu potencial uso como marcadores epidemiológicos de exposição ao vetor e em estratégias para o controle da doença. ... 35
2.8 Vacinas baseadas em antígenos salivares ... 39
3 CONCLUSÕES ... 44
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são um conjunto de doenças endêmicas em regiões tropicais da África, Américas e Sudoeste da Ásia (WHO, 2016). Os agentes etiológicos são protozoários do gênero Leishmania, pertencentes à ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae (DAWIT; GIRMA e SIMENEW, 2013). Segundo a Organização Mundial da Saúde, a leishmaniose pode se manifestar nas formas cutânea (LC), mucocutânea (LMC) e visceral (LV) ou calazar (WHO, 2016). A infecção ocorre por meio do inóculo de formas promastigotas na pele do hospedeiro, após a picada do inseto vetor infectado, o flebotomíneo. Atualmente existem cerca de 12 milhões a 15 milhões de indivíduos infectados com Leishmania spp. em 88 países, dos quais 79 são considerados subdesenvolvidos. A incidência anual da leishmaniose é de 0,2 a 0,4 milhões de casos de LC e 0,7 a 1,2 milhões de casos de LV, e o número de óbitos é de aproximadamente 20 mil a 30 mil pessoas por ano (WHO, 2016). No Brasil, a LV tem se expandido do ambiente rural em direção às áreas urbanas, sendo mais frequente em crianças menores de dez anos. O maior número de casos ocorre na região nordeste do país (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). O Brasil é o país que apresenta o maior número de casos de LC na América do Sul (ALVAR et al., 2012). A LC apresenta ampla distribuição, com notificações de casos ocorrendo em todas as regiões do país, atingindo principalmente indivíduos com mais de dez anos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). A leishmaniose é uma doença de grande importância para saúde pública devido à alta expansão geográfica e alta taxa de mortalidade, especialmente em crianças mal nutridas, idosos e, principalmente, pacientes portadores de coinfecção Leishmania-Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) (EZRA; OCHOA, CRAFT, 2010). Até o presente momento não existe um medicamento que gere cura parasitológica em indivíduos infectados. Os sais de antimônio (Glucantime e Pentostan) utilizados na terapêutica induzem a cura clínica e cronificação da infecção (AMATO et al., 2008; TIUMAN et al., 2011; MENEZES et al., 2015).
Entre as estratégias de controle da doença destacam-se o diagnóstico e tratamento precoce dos indivíduos doentes, o controle químico realizado com uso de inseticidas que objetivam a erradicação das formas adultas do inseto vetor, eutanásia dos animais domésticos sororreagentes ou com exame parasitológico
positivo e a promoção de atividades de educação em saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014; WHO, 2016). Apesar disso, essas estratégias de controle ainda são incapazes de eliminar a transmissão e impedir o surgimento de novos casos (GONTIJO e MELO, 2004).
Dessa forma, muito se tem buscado a respeito do desenvolvimento de novas ferramentas que auxiliem no controle e prevenção da infecção pelo parasito. Uma linha de pesquisa que tem se destacado bastante nos últimos anos vem analisando a possibilidade da utilização de proteínas obtidas a partir da glândula salivar de insetos vetores na proteção contra a transmissão do patógeno por eles carreados. Sabe-se que a composição da saliva dos insetos hematófagos é importante para o seu repasto sanguíneo, e no momento da introdução das suas peças bucais as substâncias presentes na saliva são inoculadas na pele do hospedeiro juntamente com o parasito. Muitos desses componentes desempenham um papel antihemostático (CHARLAB, 1999; HAMASAKI et al., 2009; COLLIN et al., 2012) e anti-inflamatório (BRODIE et al., 2007; WHEAT et al., 2008) no sítio da infecção, contribuindo dessa forma não só para facilitar o repasto sanguíneo do vetor, mas também influenciando o estabelecimento do parasito no tecido hospedeiro (BELKAID et al., 1998; MONTEIRO et al., 2007; MOURA et al., 2007;). Outros componentes salivares apresentam-se bastante imunogênicos, capazes de estimular uma resposta inflamatória que protege contra a evolução da doença (VALENZUELA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2015). Componentes protéicos da saliva ainda mostraram-se capazes de induzir a produção de anticorpos que podem ser detectados no soro dos hospedeiros, podendo servir como ferramenta para mapeamento de áreas de risco de exposição ao vetor ou até mesmo na identificação de reservatórios ainda não conhecidos em uma determinada área (BARRAL et al., 2000), contribuindo assim para a evidenciação de ciclos de transmissão outrora desconhecidos. Alguns componentes salivares inoculados em animais de laboratório têm conferido proteção frente ao desafio com o parasito (MORRIS et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2015), demonstrando uma nova e promissora abordagem profilática. Este trabalho tem como objetivo revisar o papel da saliva dos flebotomíneos no estabelecimento da infecção por Leishmania, enfatizando a função de seus componentes, seu papel protetor e/ou exacerbador da infecção e a sua utilização como biomarcador de exposição ao vetor. A utilização desses
componentes na produção de vacinas anti-saliva também será discutida como uma nova abordagem profilática para essa doença.
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Os parasitos e a doença
A leishmaniose pode se manifestar nas formas cutânea (LC), mucocutânea (LMC) e visceral (LV) (WHO, 2016). Essas diferentes formas clínicas, aparentemente, resultam de diferenças entre as espécies, seus reservatórios naturais, vetores e as populações infectadas, estando envolvidas a genética e resposta imune. Atualmente, considera-se que existem dois subgêneros de Leishmania: Leishmania e Viannia (LAINSON, 2010). A taxonomia de Leishmania, geralmente, correlaciona determinada espécie com uma particular manifestação clínica no homem. Parasitos do complexo Leishmania donovani (L. donovani e L. infantum ou L. chagasi) são causadores da forma visceral da doença, enquanto os complexos L. mexicana e L. braziliensis, no Novo Mundo, e L. major e L. tropica, no Velho Mundo, causam formas cutâneas ou mucocutâneas (LAINSON e SHAW, 1987; GLEW et al., 1988; GRIMALDI e TESH, 1993. apud SOARES-BEZERRA et al., 2004). As espécies L. chagasi e L. infantum de várias regiões geográficas possuem diferenças mínimas, não tendo sido possível a distinção entre elas por estudos bioquímicos e moleculares (MAURICIO et al., 2000; MAURICIO et al., 2001). Por essa razão, atualmente, L. chagasi e L. infantum tem sido consideradas como uma única espécie.
A LV, conhecida popularmente como calazar, é resultante da infecção por L. donovani ou L. infantum (VAN GRIENSVEN e DIRO, 2012). Os sintomas incluem perda de peso, hepatoesplenomegalia, febre alta, pancitopenia e hipergamaglobulinemia, e a doença é quase sempre fatal se não for tratada (BERN, MAGUIRE e ALVAR, 2008). Os fatores que contribuem para o surgimento da LV podem ser divididos em fatores relacionados ao hospedeiro e ao parasito. Entre os fatores relacionados ao hospedeiro destacam-se: a capacidade do hospedeiro em desenvolver resposta imune eficaz contra o parasito (STANLEY e ENGWERDA, 2007), o que impede manifestação clínica da doença; o seu perfil de expressão gênica (JERONIMO et al., 2007), o que determina a evolução de quadros graves ou não da doença; o estado nutricional (ANSTEAD et al., 2001), a exposição ao parasito na fase intrauterina (OSORIO et al., 2012), idade (SINGH et al., 2007) e a presença de infecções concomitantes, tais como a infecção pelo HIV (ALVAR et al.,
2008). Os fatores relacionados ao parasito incluem: a carga parasitária (MAIA et al., 2011), virulência e características genéticas do parasito (ZHANG e MATLASHEWSKI, 2010). Além disso, existem características relacionadas ao vetor que influenciam o resultado da infecção. Essas características estão principalmente ligadas à composição da saliva desses vetores e a capacidade desses componentes serem imunogênicos a ponto de induzirem resposta imune protetora no hospedeiro (MCCALL; ZHANG e MATLASHEWSKI, 2013).
A LC é causada por várias espécies dermotrópicas de leishmânias, que podem ser divididas em espécies do Velho Mundo, tais como: L. major e L. tropica, e espécies do Novo Mundo, tais como: L. amazonensis, L. mexicana, L. naiffi, L. braziliensis e L. guyanensis (VRIES; REEDIJK e SCHALLIG, 2015). Dependendo da espécie infectante, a LC pode assumir três manifestações clínicas diferentes: a primeira delas é a leishmaniose cutânea localizada (LCL), essa forma clínica é mais frequentemente associada aos parasitos L. major, L. tropica no Velho Mundo, enquanto no Novo Mundo, associa-se à L. mexicana, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis e L. guyanensis (MCGWIRE e SATOSKAR, 2013). A lesão característica dessa enfermidade é, geralmente, única, indolor e costuma se localizar em áreas expostas da pele, possuindo formato arredondado de base infiltrada e fundo avermelhado e granuloso (MCGWIRE e SATOSKAR, 2013). Esse tipo de lesão tende à cura espontânea, sendo, no Brasil, mais freqüentemente associada à infecção por L. braziliensis (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).
A leishmaniose cutânea difusa (LCD) se caracteriza por lesões nodulares não ulceradas na pele. Após a lesão primária inicial, ocorre disseminação das lesões para outras áreas da pele, provavelmente, pela disseminação do parasito por via linfática ou hematogênica e falha na ativação da resposta imune celular. Normalmente, os pacientes não respondem ao tratamento utilizando antimoniais pentavalentes (CHOI e LERNER, 2001; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).
A LC ainda pode se apresentar sob a forma disseminada. As espécies causadoras implicadas são L. braziliensis, L. guyanensis e L. amazonensis. A leishmaniose cutânea disseminada se caracteriza, inicialmente, pelo surgimento de lesões localizadas ulceradas, com bordas elevadas e fundo granuloso. Posteriormente, com a disseminação do parasito por via linfática ou hematogênica essas lesões aparecem em outros locais do corpo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).
A LMC pode se desenvolver alguns anos após a cura clínica da lesão cutânea ou mesmo a partir da picada de flebotomíneos infectados com L. braziliensis em indivíduos sem histórico de lesão cutânea prévia. É caracterizada pelo envolvimento das membranas mucosas devido à disseminação hematogênica e linfática do parasito ou mais raramente através da extensão direta de lesões cutâneas nas proximidades dessas mucosas. A doença geralmente se inicia com o acometimento do septo nasal, que subsequentemente é destruído pelo processo inflamatório. Complicações como pneumonia e desnutrição são geralmente relatadas como causas de morte de pacientes que apresentam essa condição (CHOI e LERNER, 2001).
É possível observar ainda a leishmaniose dérmica pós-calazar (LDPC), causada principalmente por L. donovani e caracterizada por uma erupção cutânea que surge como uma complicação da LV frequentemente observada em pacientes tratados no Sudão e, mais raramente, em países do leste africano e no subcontinente indiano. As erupções geralmente consistem de pápulas de cor clara ou hipopigmentadas localizadas na face, orelhas e antebraços e são altamente contagiosas, uma vez que apresentam muitos parasitos (CHOI e LERNER, 2001; CHAPPUIS, et. al., 2007).
2.2 Ciclo biológico de Leishmania spp.
Cerca de 70 espécies de animais, incluindo seres humanos, têm sido encontrados como hospedeiros naturais de Leishmania spp. (WHO, 2015). Os hospedeiros desses parasitos são mamíferos pertencentes a sete ordens distintas, a saber: Didelphimorphia (marsupiais), Pilosa (tamanduás e preguiças), Cingulata (tatus), Rodentia (roedores), Carnivora (sendo os cães e gatos os que estão mais relacionados aos humanos), Primata e Chiroptera (morcegos) (ROQUE e JANSEN, 2014). A transmissão do parasito ocorre através da picada de flebotomíneos fêmeas infectadas e diversos fatores de risco estão envolvidos com o desenvolvimento da doença, podendo ser citados: condições socioeconômicas desfavoráveis, tais como moradia precária e falta de condições sanitárias, desnutrição, migração populacional para áreas onde existe ciclo de transmissão, transformações ambientais como o desmatamento e urbanização e mudanças climáticas, que podem gerar efeitos sobre
os vetores, influenciando a sua sobrevivência, e reservatórios, alterando a sua distribuição (WHO, 2015).
O ciclo de vida de Leishmania spp. (figura 1), normalmente, envolve dois diferentes hospedeiros: a fêmea de flebotomíneo infectada e um mamífero vertebrado (TEIXEIRA et al., 2013). As leishmânias possuem um ciclo heteroxênico, alternando entre formas extracelulares flageladas, conhecidas como promastigotas, que podem ser isoladas do intestino do inseto vetor e formas intracelulares, sem flagelo externo, chamadas de amastigotas, que se multiplicam, principalmente, dentro dos macrófagos ou células dendríticas do hospedeiro vertebrado (NIETO et al., 2011).
Durante o repasto sanguíneo, a fêmea de flebotomíneo ingere as formas amastigotas presentes em macrófagos da pele de hospedeiros vertebrados infectados. Uma vez que possuem peças bucais curtas, esses vetores realizam hematofagia do tipo telmofágica, na qual sua probóscide penetra a pele do hospedeiro, cortando seus tecidos e lacerando capilares, o que resulta na formação de poços de sangue por meio dos quais os insetos se alimentarão (ANDRADE et al., 2007). O dano tecidual gerado por esse tipo de alimentação possibilita a liberação dos macrófagos e das formas amastigotas presentes no tecido para o sangue e, dessa forma, estes parasitos são ingeridos pelo inseto (BATES, 2007).
O desenvolvimento do parasito no inseto vetor é influenciado pela alteração das condições do hospedeiro até o intestino do inseto. As formas amastigotas transformam-se em promastigotas procíclicas, apresentando flagelos externos, e se replicando ativamente por divisão binária simples no interior da membrana peritrófica. Depois de alguns dias, a replicação diminui e os parasitos assumem forma alongada e de grande mobilidade, os promastigotas nectomonas
(DOSTÁLOVÁ e VOLF, 2012). Logo após, ocorre o rompimento da membrana
peritrófica e os parasitos são liberados no epitélio do intestino do inseto, dividindo-se por fissão binária e aderindo às microvilosidades intestinais. Essas formas então se movem em direção à porção anterior do intestino; ao atingirem a válvula estomodeal, os promastigotas nectomonas transformam-se em promastigotas leptomonas, formas mais curtas que continuam a se replicar. Por último, os parasitas diferenciam-se nas formas promastigotas metacíclicas, infectantes para os hospedeiros vertebrados e que são inoculadas na pele do hospedeiro (DOSTÁLOVÁ e VOLF,
2012; TEIXEIRA et al., 2013), sendo fagocitadas por neutrófilos, levando essas céulas à apoptose. Dessa forma, as vesículas apoptóticas contendo parasitos podem ser fagocitadas por macrófagos (PETERS e SACKS, 2009).
Como resultado da interação com a célula do hospedeiro, ocorre a internalização do parasito em um vacúolo, conhecido como vacúolo parasitóforo, no qual se diferencia na forma amastigota. Após a fusão desse vacúolo com o lissomomo, inicia-se o processo de replicação. O resultado é o rompimento da célula hospedeira com liberação de muitos parasitos que podem então infectar novas células e iniciar um novo ciclo de replicação (TEIXEIRA et al., 2013). A lesão causada por espécies dermotrópicas de Leishmania permanece na pele, entretanto, se tratando de parasitos viscerotrópicos, lesões serão encontradas em diversos órgãos, principalmente, rins, fígado, baço e medula óssea. O ciclo recomeça durante um novo repasto sanguíneo (PONTE-SUCRE, 2003).
Figura 1 – Representação do ciclo de vida de Leishmania spp.
(1) O vetor ingere as formas amastigotas durante o repasto sanguíneo em um hospedeiro infectado. (2) Essas formas amastigotas se transformam nas formas promastigotas procíclicas que irão se multiplicar no intestino do inseto. (3) Na porção anterior do intestino, os promastigotas sofrem o processo de metaciclogênese e dão origem à forma infecciosa
metacíclica. (4) Os promastigotas metacíclicos são transmitidos ao hospedeiro durante o repasto sanguíneo do inseto (5) e são fagocitados pelos neutrófilos. (6) Os macrófagos são infectados diretamente pelos promastigotas, através da fagocitose dos neutrófilos infectados ou ainda pela fagocitose de corpos apoptóticos de neutrófilos infectados. (7) Os promastigotas se transformam nas formas amastigotas no interior dos macrófagos. (8) As formas amastigotas se multiplicam por divisão binária simples no interior das células. (9) O rompimento dos macrófagos infectados libera as formas amastigotas que então poderão infectar outras células. Modificado de Kato e colaboradores (2010).
2.3 Classificação, morfologia e biologia de flebotomíneos
Conhecidos popularmente como mosquito palha, tatuquiras, birigui, entre outras denominações comuns (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014), os flebotomíneos são insetos pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae incriminados como vetores de protozoários do gênero Leishmania (READY, 2013). Embora existam diversas espécies de flebotomíneos, nem todas são vetores de Leishmania. As espécies encontradas no Novo Mundo são predominantemente do gênero Lutzomyia, e espécies encontradas no Velho Mundo pertencem predominantemente ao gênero Phlebotomus (ABOU-EL-NAGA et al., 2015).
Os flebotomíneos são insetos que possuem ciclo de vida holometábolo, compreendido pelas fases de ovo, quatro estádios larvários, pupa e adulto. Não se conhece os criadouros naturais desses insetos, o que torna as ações profiláticas limitadas apenas à sua fase adulta. Ambos os sexos alimentam-se de carboidratos e as fêmeas alimentam-se de sangue de vertebrados, o que é importante para o desenvolvimento dos ovos (RANGEL e LAINSON, 2003). Os flebotomíneos são insetos de pequeno porte, possuindo coloração clara e intensa pilosidade; apresentam comportamento de vôo em pequenos saltos, sendo, em geral, animais de atividade crepuscular e noturna (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Até o momento no Brasil, duas espécies estão relacionadas com a transmissão dos parasitos que causam LV: Lutzomyia longipalpis e Lu. cruzi (SANTOS, 1998; MISSAWA e LIMA, 2006). A primeira espécie é considerada a principal espécie transmissora da L. infantum no Brasil e, recentemente, Lu. cruzi foi incriminada como vetor no Estado de Mato Grosso do Sul (PITA-PEREIRA et al., 2008). Com relação às principais espécies de flebotomíneos envolvidas na
transmissão da LC no nosso país, são citadas: Lu. flaviscutellata, principal espécie vetora de L. amazonensis; Lu. umbratilis, transmissor de L. guyanensis; Lu. intermedia, Lu. whitmani, Lu. wellcomei e Lu. migonei, relacionadas à transmissão de L. braziliensis (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).
2.4 Importância da saliva no processo hematofágico
Os insetos hematófagos enfrentam dificuldades no momento do repasto sanguíneo em um hospedeiro vertebrado devido aos mecanismos fisiológicos que dificultam a obtenção de sangue, tais como a sensação de dor provocada pela picada do inseto e a ativação do sistema hemostático do hospedeiro. Assim, é preciso que esses animais utilizem estratégias para modular a resposta fisiológica ao dano tecidual induzido após a introdução de suas probóscides, possibilitando, dessa forma, o repasto sanguíneo (SILVA, 2009; COUTINHO-ABREU; GUIMARÃES-COSTA e VALENZUELA, 2015).
A evolução tratou de conferir à saliva dos insetos hematófagos um repertório de moléculas encarregadas em promover neutralização da resposta dos hospedeiros vertebrados (SILVA, 2009). Além de propriedades antihemostáticas, que facilitam a formação de poços de sangue por meio dos quais o inseto se alimenta (RIBEIRO et al., 1999; RIBEIRO; ROWTON e CHARLAB, 2000; COLLIN et al., 2012; ALVARENGA et al., 2013), a saliva desses insetos possuem componentes anti-inflamatórios e imunomoduladores (BRODIE et al., 2007; WHEAT et al., 2008; ARAÚJO-SANTOS et al., 2014; CARREGARO et al., 2015), que controlam a inflamação local, podendo conduzir a formação de um ambiente adequado para a instalação dos micro-organismos carreados por esses vetores.
A primeira resposta hemostática ao dano vascular é a vasoconstricção, cujo objetivo é diminuir o fluxo sanguíneo, limitando assim a hemorragia. Insetos hematófagos possuem, em seu repertório de compostos salivares, substâncias que possuem ação vasodilatadora, que aumentam o fluxo sanguíneo para o local da picada, possibilitando a hematofagia (RIBEIRO et al., 1999; BRODIE et al., 2007). As lesões vasculares induzidas pela penetração do aparelho bucal do inseto na pele do hospedeiro são, ainda, acompanhadas pela ativação e agregação plaquetária, que resulta na formação de um tampão hemostático. Indo contra esse evento
protetor, a saliva do inseto hematófago apresenta componentes que agem como antiagregantes plaquetários que, possivelmente, atuam inibindo a ação de substâncias que ativam a agregação plaquetária (HAMASAKI et al., 2009). Ainda há componentes que agem diretamente sobre os fatores da coagulação (COLLIN et al., 2012) ou sobre moléculas ativadoras desses fatores (ALVARENGA et al., 2013), inibindo a sua ativação, o que resulta em bloqueio da cascata de coagulação. Em se tratando de flebotomíneos, que não dispõem de uma grande quantidade de tempo para se alimentar sobre a pele do hospedeiro, há uma grande necessidade de componentes salivares de ação antihemostática para que estes insetos consigam realizar o repasto sanguíneo (ABDELADHIM; KAMHAWI e VALENZUELA, 2014).
2.5 Composição da saliva de flebotomíneos
O perfil dos componentes salivares de flebotomíneos presentes no Velho Mundo foi analisado em nove espécies de Phlebotomus: Phlebotomus papatasi (VALENZUELA et al., 2001), P. ariasi (OLIVEIRA et al., 2006), P. perniciosus, P. argentipes (ANDERSON et al., 2006), P. duboscqi (KATO et al., 2006), P. arabicus (HOSTOMSKÁ et al., 2009), P. tobbi, P. sergenti (ROHOUŠOVÁ et al., 2012) e P. orientalis (VLKOVA et al., 2014). No Novo Mundo, os componentes salivares pertencentes ao gênero Lutzomyia foram analisados em Lu. longipalpis (VALENZUELA et al., 2004); Lu. ayacuchensis (KATO et al., 2013) e Lu. intermedia (MOURA et al., 2013).
A saliva de flebotomíneos é composta, principalmente, por proteínas e nucleosídeos, sendo a maioria desses componentes solúvel e quantidade reduzida de cada molécula é injetada na pele do hospedeiro no momento do repasto sanguíneo (ABDELADHIM; KAMHAWI e VALENZUELA, 2014). Embora possuam baixa complexidade, esses componentes apresentam propriedades farmacológicas que modulam a hemostasia e a resposta imune do hospedeiro (CAVALCANTE; PEREIRA e GONTIJO, 2003; BRODIE et al., 2007; PRATES et al., 2012; MENDES-SOUSA et al., 2013; ARAÚJO-SANTOS et al., 2014; CHAGAS et al., 2014; CARREGARO et al., 2015).
Nas últimas décadas, muitos grupos têm investigado vários aspectos da saliva dos flebotomíneos, explorando a sua composição e a atividade biológica de
seus componentes. Dentre os nucleosídeos descritos na saliva de flebotomíneos, destacam-se a adenosina (ADO) e adenosina-monofosfato (AMP). Katz e colaboradores (2000) verificaram que a ADO da saliva de P. papatasi regula negativamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase indizível (iNOS) em macrófagos ativados. Estudos mais recentes têm demonstrado que a ADO e a AMP da saliva de P. papatasi medeiam a exacerbação da infecção por Leishmania, por meio de sua atuação sobre as células dendríticas, que induzem a diferenciação de células T regulatórias no foco da infecção, levando a supressão da resposta imune e favorecendo a sobrevivência do parasito no hospedeiro (CARREGARO et al., 2015). Além disso, essas moléculas, aparentemente, estão correlacionadas com a inibição da agregação plaquetária e vasodilatação, fatores importantes para a obtenção de sangue durante o processo hematofágico (RIBEIRO et al., 1999).
As proteínas presentes na glândula salivar do inseto também apresentam atividade farmacológica e muitas dessas proteínas identificadas ainda não possuem sua atividade conhecida. A maior parte dos estudos tem elucidado os componentes salivares de Lu. longipalpis e, dentre as atividades biológicas relatadas, destacam-se: ligação à aminas biogênicas, inibição de fatores da coagulação, inibição da agregação plaquetária, degradação de componentes da matriz extracelular, hidrólise de ADO e AMP, vasodilatadores e nucleotidases (ABDELADHIM; KAMHAWI e VALENZUELA, 2014).
Dentre as proteínas com ação vasodilatadora, podemos citar maxadilan, presente na saliva de Lu. longipalpis. Além do papel vasodilatador, esse peptídeo também possui atividade imunomoduladora, induzindo a produção de citocinas do perfil T auxiliar 2 (Th2), tais como interleucina-10 (IL-10), e fator de crescimento transformante-beta (TGF-), e inibindo a produção de citocinas do perfil T auxiliar 1 (Th1), como IL-12 e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-), além de inibir a produção de óxido nítrico (ON), favorecendo a sobrevivência do parasito no hospedeiro (BRODIE et al., 2007).
Com relação à atividade de endonuclease, pode-se destacar a proteína lundep, também presente na saliva de Lu. longipalpis. Essa proteína é responsável por destruir armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), constituindo um mecanismo de escape da atividade leishmanicida dessas estruturas (CHAGAS et al., 2014). As NETs são estruturas formadas por uma malha de cromatina extracelular
contendo peptídeos antimicrobianos e apresentam importante estratégia para imobilizar e matar micro-organismos invasores (BRINKMAN et al., 2004).
Collin e colaboradores (2012) demonstraram a atividade anticoagulante de lufaxin, presente na saliva de Lu. longipalpis, ligando-se ao fator Xa da via comum da coagulação. O resultado é a inibição do complexo protrombinase, responsável por converter protrombina em trombina.
PdSP15a e PdSP15b são proteínas presentes na saliva de P. duboscqi, que inibem a via intrínseca da coagulação por bloquearem a ativação do fator XII. O mecanismo pelo qual ocorre esse evento é por meio da ligação dessas proteínas às superfícies carregadas que levam à ativação do fator XII. Ao competir pelos sítios de ligação do fator, essas proteínas inibem os processos de coagulação (ALVARENGA et al., 2013).
Cerná, Mikes e Volf (2002) descreveram a presença de uma hialuronidase na saliva de flebotomíneos. Essa enzima realiza a clivagem do ácido hialurônico da matriz extracelular e sua presença na saliva dos flebotomíneos se torna importante para promover a difusão dos outros componentes salivares pelo tecido do hospedeiro.
Dois transcritos que codificam para proteínas homólogas de apirases foram identificados na saliva de P. duboscqi. As proteínas recombinantes resultantes da expressão desses transcritos demonstraram uma eficiente atividade de hidrólise de nucleotídeos, principalmente, adenosisa difosfato (ADP) e adenosina trifosfato (ATP). Uma vez que o ADP é um dos mais importantes agonistas da agregação plaquetária, este achado indica que as apirases desempenham um papel importante no processo de alimentação de P. duboscqi, uma vez que facilitam o acesso ao sangue do hospedeiro (HAMASAKI et al., 2009).
O homogenato da glândula salivar de fêmeas adultas de Lu. longipalpis demonstrou também atividade de 5’nucleotidase, que converte o AMP liberado durante o processo inflamatório em ADO com importante atividade antiplaquetária e vasodilatadora (RIBEIRO; ROWTON e CHARLAB, 2000).
Mais recentemente, proteínas atuantes como ligantes de aminas biogênicas, tais como: serotonina, norepinefrina, epinefrina, dopamina e histamina, têm sido descritas na saliva de flebotomíneos. A proteína LJM11 mostra uma afinidade muito elevada por serotonina e afinidade moderada a baixa para catecolaminas, ao passo
que a proteína LJM111 se liga às catecolaminas com afinidade muito elevada e demonstra afinidade moderada para a serotonina. Já a LJM17 se liga, eficientemente, à serotonina e também à histamina, sugerindo que a proteína ajuda a diminuir os efeitos proinflamatórios desse composto na pele durante a hematofagia do inseto (Xu et al., 2011).
O repertório salivar dos flebotomíneos pode ser modulado por fatores fisiológicos, como idade e dieta do inseto. Fêmeas de Lu. longipalpis apresentam um aumento na quantidade de proteínas salivares por volta do terceiro dia após sua emergência e as concentrações protéicas diminuem logo após o repasto sanguíneo (PRATES et al., 2008). Fatores ambientais também podem alterar a expressão de genes. Estudos sobre a expressão gênica da glândula salivar de P. papatasi mostraram importante variabilidade de expressão entre populações de diferentes habitats ecológicos e entre insetos recolhidos em diferentes épocas da temporada de flebotomíneos. Isto pode ser relacionado à variações na composição da seiva de plantas dessas diferentes regiões (COUTINHO-ABREU et al., 2011).
Apesar de todos os avanços no estudo da composição dos componentes salivares e dos esforços na compreensão do papel desses componentes, ainda há um grande número de proteínas que não apresentam qualquer homologia com outras proteínas nas bases de dados acessíveis e, portanto, se torna difícil prever a função desses componentes (ABDELADHIM; KAMHAWI e VALENZUELA, 2014).
2.6 Papel da saliva dos flebotomíneos na imunidade do hospedeiro
2.6.1 A resposta imunológica na leishmaniose
A resposta imunológica contra parasitos do gênero Leishmania depende de diversos fatores, e as infecções experimentais podem resultar em diversas manifestações clínicas a depender das espécies de parasitos e modelos animais envolvidos (SCOTT e NOVAIS, 2016). A resposta contra o patógeno inicia-se logo após a sua inoculação na pele do hospedeiro, durante o repasto sanguíneo, e a resposta protetora contra a LC e LV depende do desenvolvimento de uma resposta imune de perfil Th1 (ALEXANDER e BRYSON, 2005). As formas promastigotas metacíclicas são inoculadas e capturadas por células apresentadoras de antígeno,
tais como macrófagos e células dendríticas. Nos hospedeiros resistentes à infecção, a IL-12 produzida a partir dessas células, juntamente com sinais coestimuladores, conduzem a diferenciação e ativação de células Th1 e células natural killer (NK). O interferon-gama (IFN-γ) produzido pelas células Th1 e também por células NK medeia a ativação de macrófagos, levando a expressão da iNOS, com produção de ON, resultando na morte do parasito. A atividade leishmanicida de macrófagos induzida por IFN-γ é aumentada por outras citocinas, tais como o TNF-α. Entretanto, em hospedeiros suscetíveis, a falha na produção de IL-12 ou a alternativa produção de IL-4 desvia a resposta imune para o perfil Th2 e resulta na proliferação dos parasitos no interior das células infectadas (ALEXANDER e BRYSON, 2005). A produção de IL-10 torna os macrófagos não responsivos aos sinais de ativação e inibe a morte do parasito por diminuir a produção de ON e TNF-α, além de inibir a maturação de células dendríticas e regular negativamente a expressão do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II e moléculas coestimuladoras, assim como a produção de IL-12 (NYLÉN e SAKS, 2007). A produção de TGF-β também bloqueia a diferenciação de células do perfil Th1 (GORELIK; CONSTANT e FLAVELL, 2002). A produção de IL-10 por linfócitos T reguladores (Treg) pode tanto a facilitar progressão da doença como contribuir para manutenção da infecção latente e imunidade concomitante (ALEXANDER e BRYSON, 2005).
Com relação ao sistema complemento, tem sido descrito que a via alternativa é a que melhor se relaciona com a destruição do parasito, embora também ocorra a ativação da via clássica, havendo também evidências a respeito da possível participação da via das lecitinas (GURUNG e KANNEGANTI, 2015).
2.6.2 Efeitos da saliva sobre processos relacionados à defesa do hospedeiro
Além de possuir componentes que alteram os processos hemostáticos do hospedeiro para facilitar a hematofagia, a saliva dos flebotomíneos apresenta componentes com atividade imunomoduladora, que influenciam no estabelecimento da infecção. Muitos grupos têm realizado estudos objetivando a compreensão de mecanismos relacionados à presença de componentes salivares que promovem proteção ou contribuem para a infecção e exacerbação da doença. Dentre os efeitos
imunomoduladores da saliva sobre o hospedeiro, destacam-se: indução da infiltração de células inflamatórias (SILVA et al., 2005) e do perfil de citocinas (COSTA et al., 2004; WHEAT et al., 2008) no local da picada, estimulação da produção de anticorpos (SILVA et al., 2005; MARZOUKI et al., 2011; VLKOVA et al., 2011), efeitos sobre células apresentadoras de antígeno (WHEAT et al., 2008; CARREGARO et al., 2015), inibição do sistema complemento (CAVALCANTE; PEREIRA e GONNTIJO, 2003; MENDES-SOUZA et al., 2013), modulação na produção de eicosanóides (ARAÚJO-SANTOS et al., 2010; ARAÚJO-SANTOS et al., 2014), além de levar a uma diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) por neutrófilos e induzir a apoptose dessas células (PRATES et al., 2011).
Os componentes salivares de flebotomíneos induzem o processo inflamatório no hospedeiro por meio da sua capacidade de promover o recrutamento de diferentes células inflamatórias ao local da picada (DONNELLY; LIMA e TITUS, 1998; SILVA et al., 2005; VASCONCELOS et al., 2014). Silva e colaboradores (2005) demonstraram que a saliva de Lu. longipalpis induziu um infiltrado inflamatório difuso composto por neutrófilos, eosinófilos e macrófagos em camundongos BALB/c previamente expostos à picadas de flebotomíneos. Além disso, o recrutamento de uma população celular específica após a infecção por Leishmania pode influenciar o resultado da doença (VASCONCELOS et al., 2014). Observou-se que, quando L. braziliensis é inoculada em camundongos da linhagem BALB/c juntamente com o lisado da glândula salivar do vetor, as lesões surgidas nesses animais eram intensamente mais graves que aquelas surgidas nos animais controle, com a presença de extensas acumulações mal organizadas de macrófagos epitelióides fortemente parasitados, com neutrófilos e eosinófilos abundantes, enquanto as lesões que surgiram nos animais em que o lisado da glândula salivar não havia sido inoculado resultaram em granulomas mínimos e organizados de macrófagos epitelióides que continham poucos parasitos, tendo, posteriormente, ocorrido a resolução da inflamação (DONNELLY; LIMA e TITUS, 1998).
O homogenato da glândula salivar de Lu. longipalpis também afeta a expressão de moléculas coestimuladoras importantes para a ativação de células T, levando à diminuição da expressão de Cluster de Diferenciação 80 (CD80) e aumento da expressão de CD86 na superfície de monócitos humanos, e também
confere atraso na maturação das células dendríticas, mostrando que os componentes salivares de flebotomíneos afetam significativamente o fenótipo e a função de células do sistema imunológico. Além disso, quando o homogenato da glândula salivar foi previamente incubado com antisoro, percebeu-se a diminuição dos efeitos do homogenato sobre esses monócitos, sugerindo que o desenvolvimento de anticorpos contra os componentes salivares é eficaz em bloquear os efeitos imunomoduladores da saliva (COSTA et al., 2004). Resultados obtidos por Menezes e colaboradores (2008) indicam que a saliva de Lu. intermedia é também capaz de modular a resposta de monócitos humanos.
Outro trabalho demonstrou que células dendriticas estimuladas com lipopolissacarídeo também apresentaram alteração na produção de moléculas coestimuladoras em sua superfície na presença de maxadilan, em comparação aos animais controles não tratados (figura 2). Ocorreu redução na expressão de CD80 e aumento na expressão de CD86. Além disso, o tratamento dessas mesmas células com o peptídeo maxadilan promoveu aumento da secreção de citocinas relacionadas ao perfil imune Th2 (IL-10), além de IL-1β, concomitante com a diminuição da secreção de citocinas relacionadas ao perfil imune Th1 (TNF-α, IL-12, e IFN-γ). A consequência funcional desse fenótipo foi a diminuição na eficácia dessas células dendríticas tratadas com maxadilan em induzir a proliferação de células T. Descobriu-se também que o mesmo peptídeo influenciou negativamente a expressão de receptor de quimiocina 7 (CCR7) na membrana das células dendríticas, importante para a migração dessas células do sítio de infecção para o linfonodo, onde ocorreria a ativação e proliferação de células T CD4 (WHEAT et al., 2008).
Figura 2 – Resumo do modelo proposto sobre a ação de maxadilan e a promoção da exacerbação da doença em camundongos naturalmente resistentes à infecção por L. major.
A. Modelo hipotético na ausência de maxadilan: 1) O parasito é inoculado no sitio da picada no momento do repasto sanguíneo. 2) Células dendríticas ativadas aumentam a expressão de MHC de classe II, CCR7 e moléculas coestimuladoras, tais como CD80 e CD86. Além disso, essas células secretam IL-12, TNF-α, e INF-γ. 3) A expressão de CCR7 dirige a migração dessas células dendríticas ativadas para os linfonodos, onde irão promover a diferenciação de células T naives em células Th1. 4) As células Th1 ativam macrófagos no local da infecção, levando à morte dos parasitos. B. Modelo hipotético na presença de maxadilan: 5) O peptídeo maxadilan presente na saliva do vetor é inoculado juntamente com o patógeno (Lm) no momento do repasto sanguíneo. 6) As células dendríticas ativadas diminuem a expressão de CD80 e aumentam a expressão de CD86, mantendo uma expressão normal de MHC de classe II. A produção de IL-10 permite a sobrevivência dos parasitos no interior das células infectadas. 7) Ocorre uma diminuição na expressão de CCR7 que retarda a migração das células dendríticas, garantindo uma exposição prolongada aos componentes salivares. Células dendríticas alteradas, abrigando parasitos, eventualmente migram para linfonodos drenantes e produzem sinais para a diferenciação de células do perfil Th2. 8) Como resultado, a infecção persiste devido à falta de resposta imune Th1, e os parasitos sobrevivem no interior dos macrófagos. Modificado de Wheat e colaboradores (2008).
Nucleosídeos presentes na saliva de P. papatasi, mais precisamente a ADO e a AMP, também induziram perfil tolerogênico em células dendríticas, caracterizado pelo aumento da produção de IL-10. Essas células dendríticas tolerantes induzem a
proliferação de células Treg, que levam a supressão da resposta imunológica (CARREGARO et al., 2015).
O peptídeo maxadilan também foi capaz de inibir a destruição de L. major por macrófagos e essa inibição foi relacionada à incapacidade dessas células de produzirem ON (BRODIE et al., 2007). O lisado da glândula salivar de P. papatasi foi capaz de reduzir a expressão da enzima iNOS, levando também à inibição da síntese ON por macrófagos murinos (KATZ et al., 2000).
A saliva de flebotomíneos também pode modular a produção de eicosanóides pelas células de defesa do hospedeiro. Componentes salivares de Lu. longipalpis foram capazes de induzir a formação de corpos lipídicos em macrófagos da cavidade peritoneal de camundongos da linhagem C57BL/6 concomitante ao aumento na produção de (PGE2) (ARAÚJO-SANTOS et al., 2010), e também em neutrófilos (PRATES et al., 2011), mas levaram à redução da produção de leucotrieno B4 (LT-B4) (ARAÚJO-SANTOS et al., 2014). A produção de PGE2 relaciona-se ao aumento na sobrevida do parasito (SAHA et al., 2014), enquanto o LT-B4 correlaciona-se com a destruição do mesmo (SEREZANI et al., 2006). Dessa forma, a alteração no balanço PGE2/LT-B4, induzida pela saliva do vetor, pode influenciar a imunopatogênese da doença (ARAÚJO-SANTOS et al., 2014).
Outros estudos demonstraram que os componentes injetados durante a exposição experimental à picadas de flebotomíneos também induzem a modulação da resposta humoral. Em camundongos, foi visto que ocorre uma produção significante de IgG1 (SILVA et al., 2005), enquanto em humanos há produção de IgG1, IgG2, IgG4 e IgE (VINHAS et al., 2007; MARZOUKI et al., 2011). Em cães, a produção dos isotipos IgG1 e IgG2 foi observada (VLKOVA et al., 2011).
Em indivíduos expostos à repetidas picadas de Lu. longipalpis não infectados, verificou-se que IgG1 era o principal isotipo presente na resposta humoral desses indivíduos, mas também houve produção de anticorpos do isotipo IgE, presentes em altos níveis nos voluntários que apresentaram resposta cutânea imediata exacerbada, em contraste àqueles que apresentaram uma reação cutânea nodular, tardiamente, semelhante à reação de hipersensibilidade tardia. Nesses últimos, os níveis de anticorpos IgG eram superiores aos níveis de IgE (VINHAS et al., 2007).
Com relação ao papel dos complexos imunes, foi visto que a injeção de soro imune previamente incubado com homogenato da glândula salivar induziu infiltração precoce de macrófagos e neutrófilos em camundongos da linhagem BALB/c, sugerindo o papel desses complexos na resposta inflamatória (SILVA et al., 2005).
Componentes salivares de Lu. longipalpis induziram a apoptose de neutrófilos de camundongos da linhagem C57BL/6 por meio de mecanismo que induz a expressão de Fas ligante (FasL) e a subsequente ativação de caspases. Além disso, foi observado que esses neutrófilos apoptóticos eram altamente parasitados. A exposição dos neutrófilos aos componentes salivares dessa espécie resultou em uma acentuada diminuição na produção de ERO, corroborando com a ideia de que os componentes salivares podem influenciar a sobrevivência dos parasitos no interior dessas células. Os neutrófilos infectados com L. infantum, na presença da saliva do vetor, apresentaram maior produção proteína quimiotática de monócitos (MCP-1). A fagocitose dos neutrófilos apoptóticos, altamente parasitados pelos macrófagos teciduais, contribui para a infecção dessas células, reforçando que a saliva dos vetores desempenha papel importante nos estágios iniciais da infecção por Leishmania (PRATES et al., 2011).
A saliva de Lu. longipalpis também mostrou ser capaz de inibir as vias clássica e alternativa do sistema complemento em humanos e animais reservatórios do parasito (CAVALCANTE; PEREIRA e GONTIJO, 2003; MENDES-SOUSA et al., 2013). Recentemente, foi demonstrado que uma proteína de 11 kDa (SALO), presente na saliva de Lu. longipalpis é capaz de inibir a via clássica do complemento, por meio da inibição da clivagem de C4 e prejuízo da deposição de C4b (FERREIRA et al., 2016).
A figura 3 apresenta um resumo dos efeitos imunomodulatórios dos componentes da glândula salivar de flebotomíneos.
Figura 3 – Ações dos componentes salivares de flebotomíneos
A saliva dos flebotomíneos apresenta diversas atividades que modulam as respostas hemostáticas e imunes do hospedeiro. Alguns componen
vasodilatadora, aumentando o fluxo sanguíneo para o tecido, possibilitanto a hematofagia do inseto. Outros componentes são capazes de inibir a cascata de coagulação (não mostrado na figura). Os componentes salivares também estimulam o
celulares específicas ao local da picada e modulam a atividade de células apresentadoras de antígeno e fagócitos, o que influencia o resultado da infecção por
dos flebotomíneos também modula a produção de eic
neutrófilos. Os componentes protéicos da saliva são capazes de estimular a produção de anticorpos contra antígenos salivares que bloqueiam as ações antihesmostática e imunomoduladoras da saliva, e ainda formam complexos
processo inflamatório por promover o recrutamento de populações celulares específicas. Recentemente, componentes salivares capazes de inibir a ação do sistema complemento também têm sido caracterizados (não mostrado na figura).
2.6.3 Efeito exacerbatório da saliva na infecção por
Em razão de suas características imunomoduladoras, é compreensível o papel da saliva de flebotomíneos em facilitar a infecção por parasitos do gênero Leishmania. Belkaid e colaboradores (1988) demonstraram a formação de lesões consideravelmente destrutivas, altamente parasitadas e de início precoce em camundongos das linahgens BALB/c e C57BL/6 infectados experimentalmente com
Ações dos componentes salivares de flebotomíneos
A saliva dos flebotomíneos apresenta diversas atividades que modulam as respostas hemostáticas e imunes do hospedeiro. Alguns componentes desempenham ação vasodilatadora, aumentando o fluxo sanguíneo para o tecido, possibilitanto a hematofagia do inseto. Outros componentes são capazes de inibir a cascata de coagulação (não mostrado na figura). Os componentes salivares também estimulam o recrutamento de populações celulares específicas ao local da picada e modulam a atividade de células apresentadoras de antígeno e fagócitos, o que influencia o resultado da infecção por Leishmania
dos flebotomíneos também modula a produção de eicosanóides, e estimula a apoptose de neutrófilos. Os componentes protéicos da saliva são capazes de estimular a produção de anticorpos contra antígenos salivares que bloqueiam as ações antihesmostática e imunomoduladoras da saliva, e ainda formam complexos imunes que participam do processo inflamatório por promover o recrutamento de populações celulares específicas. Recentemente, componentes salivares capazes de inibir a ação do sistema complemento também têm sido caracterizados (não mostrado na figura).
2.6.3 Efeito exacerbatório da saliva na infecção por Leishmania
Em razão de suas características imunomoduladoras, é compreensível o papel da saliva de flebotomíneos em facilitar a infecção por parasitos do gênero Belkaid e colaboradores (1988) demonstraram a formação de lesões consideravelmente destrutivas, altamente parasitadas e de início precoce em camundongos das linahgens BALB/c e C57BL/6 infectados experimentalmente com A saliva dos flebotomíneos apresenta diversas atividades que modulam as respostas tes desempenham ação vasodilatadora, aumentando o fluxo sanguíneo para o tecido, possibilitanto a hematofagia do inseto. Outros componentes são capazes de inibir a cascata de coagulação (não mostrado recrutamento de populações celulares específicas ao local da picada e modulam a atividade de células apresentadoras Leishmania. A saliva osanóides, e estimula a apoptose de neutrófilos. Os componentes protéicos da saliva são capazes de estimular a produção de anticorpos contra antígenos salivares que bloqueiam as ações antihesmostática e imunes que participam do processo inflamatório por promover o recrutamento de populações celulares específicas. Recentemente, componentes salivares capazes de inibir a ação do sistema complemento
Em razão de suas características imunomoduladoras, é compreensível o papel da saliva de flebotomíneos em facilitar a infecção por parasitos do gênero Belkaid e colaboradores (1988) demonstraram a formação de lesões consideravelmente destrutivas, altamente parasitadas e de início precoce em camundongos das linahgens BALB/c e C57BL/6 infectados experimentalmente com
formas promastigotas metacíclicas de L. major na presença da saliva de P. papatasi; entretanto, quando apenas parasito foi inoculado nesses animais, lesões menores, menos parasitadas e de início mais tardio foram observadas. Além disso, outro dado reforçou a influência da saliva sobre o resultado da infecção através da modulação dos perfis de citocinas nestes animais: os níveis de IL-4 aumentaram significativamente nos que receberam os componentes salivares e a produção de IFN-γ foi significativamente reduzida, mostrando o papel da saliva no direcionamento da resposta imune adaptativa para o perfil Th2.
Outro estudo, realizado em 2007, mostrou que a pré-exposição de camundongos da linhagem BALB/c à componentes da saliva de Lu. intermedia, responsável pela transmissão de L. braziliensis no Brasil, foi capaz de induzir resposta inflamatória nesses animais. Entretanto, essa reposta não foi suficiente para garantir a proteção contra a doença, frente ao desafio com o parasito associado à saliva do vetor. Os animais imunizados apresentaram lesões maiores e mais persistentes do que as lesões observadas nos animais controles, além de possuírem menores níveis de IFN-γ comparado à IL-4 (MOURA et al., 2007).
O lisado da glândula salivar de Lu. longipalpis também pode favorecer o estabelecimento do parasito. A inoculação de L. major, juntamente com o lisado da glândula salivar do inseto, em camundongos das linhagens BALB/c e C57BL6, resultou em reação inflamatória caracterizada por infiltrado leucocitário composto por neutrófilos, eosinófilos e células T CD45+. Além disso, houve maior aumento nos níveis de IL-10 quando comparado aos níveis de IFN-γ, sugerindo que o lisado da glândula salivar induz, preferencialmente, uma resposta do tipo Th2 (MONTEIRO, et al., 2007). A saliva dessa mesma espécie também facilita a transmissão de L. amazonensis pela indução da produção de IL-10 e IL-4 e diminuição da síntese de ON em camundongos da linhagem BALB/c (NORSWORTHY et al., 2004).
2.6.4 Papel da saliva na proteção contra a infecção por Leishmania spp.
Apesar da saliva dos flebotomíneos possuir atividade imunomoduladora, parte dos seus componentes são proteínas e, possivelmente, possuem potencial imunogênico (GOMES e OLIVEIRA, 2012). A população residente em áreas endêmicas é frequentemente exposta aos flebotomíneos, que podem estar
infectados ou não. Esses indivíduos, geralmente, apresentam manifestações leves e crônicas da doença, enquanto os viajantes, não sendo previamente expostos a esses vetores, possuem maior risco de desenvolver a doença grave. Uma das hipóteses para esse fenômeno é que a exposição frequente à picadas do inseto leva à produção de anticorpos que neutralizam as proteínas salivares e também a ativação de mecanismos celulares que podem ter efeito adverso no estabelecimento da infecção por Leishmania (ANDRADE e TEIXEIRA, 2012).
Estudos têm sugerido que a resposta imunológica dirigida contra a saliva do inseto auxilia na montagem de uma resposta anti-Leishmania. Indivíduos residentes em áreas endêmicas para leishmaniose apresentam anticorpos contra antígenos salivares (BARRAL et al., 2000; AQUINO et al., 2010; MARZOUKI et al., 2011), e a presença desses anticorpos tem se correlacionado positivamente com uma reação de hipersensibilidade do tipo tardio contra antígenos do parasito (BARRAL et al., 2000; GOMES et al., 2002; AQUINO et al., 2010).
A exposição prévia de camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 à picadas de P. papatasi não infectados confere proteção eficaz contra infecção por L. major, sendo essa proteção associada à resposta de hipersensibilidade do tipo tardio com alta produção de IFN-γ no sítio de entrada do parasito (KAMHAWI et al., 2000).
Collin e colaboradores (2009) submeteram cães a sessões repetitivas de exposição à picadas de flebotomíneos e, como resultado, observaram o desenvolvimento de resposta cutânea característica de hipersensibilidade do tipo tardia além de forte imunidade humoral com a produção de anticorpos anti-saliva específicos.
Um estudo recente avaliou a resposta imune precoce de camundongos da linhagem C57BL/6 pré-expostos à picada de P. duboscqi não infectado e camundongos naives frente ao desafio de picadas de P. duboscqi infectado com L. major. Verificou-se que a expressão de citocinas e quimiocinas após a exposição à flebotomineos infectados era maior no grupo pré-exposto à picada do inseto não infectado do que nos animais naives. Nos animais previamente expostos, as quimiocinas induziam preferenciamente o recrutamento de leucócitos e ativação de células T e células NK. Além disso, a infiltração de leucócitos para a pele, no local da picada, foi maior nos animais previamente expostos em relação aos
camundongos naive, começando com neutrófilos após 6 horas, seguidos por macrófagos, monócitos, células NK e linfócitos T CD4 no período de 24-48 horas. Dessa forma, conclui-se que o ambiente induzido no local da picada de um vetor infectado pode ser modificado em animais previamente expostos à picadas de vetores não infectados, gerando condições inóspitas para o estabelecimento do parasito (TEIXEIRA et al., 2014).
A capacidade de cada componente salivar em modular diferentemente a infecção por L. major foi demonstrada a partir da imunização de camundongos da linhagem C57BL/6 com duas proteínas de P. papatasi. Os animais imunizados com a proteína PpSP44 apresentaram agravo na infecção enquanto que os camundongos imunizados com a proteína PpSP15 apresentaram proteção duradoura contra a infecção (OLIVEIRA et al., 2008), demonstrando que apesar da possibilidade da promoção de efeitos exacerbatórios por parte das moléculas salivares, modelos experimentais imunizados com determinadas proteínas salivares desenvolvem resposta imune que direciona para a resolução da enfermidade, protegendo contra o desenvolvimento de formas clínicas mais graves.
Além disso, os efeitos protetores de determinados componentes salivares podem ser alterados pela presença do parasito. Camundongos BALB/c pré-imunizados e, subsequentemente, desafiados com o sonicado da glândula salivar de Lu. intermedia, demonstraram alta expressão de genes indutores de interferon, enquanto que a expressão desses mesmos genes em animais desafiados com o sonicado da glândula salivar do vetor, juntamente com L. braziliensis, não foi observada, sugerindo que o parasito também é capaz de modular o ambiente a favor do seu estabelecimento. A presença desses genes indutores de interferon foi ainda analisada em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de humanos não infectados residentes em uma região endêmica para L. braziliensis e que, de certa forma, estariam expostos à picadas de Lu. intermedia. A expressão desses genes também foi regulada positivamente pelo sonicado da glândula salivar dessa espécie de flebotomíneo nas CMSP desses indivíduos (WEINKOPFF et al., 2014).
Observando esses dados em conjunto, é possível concluir que a exposição prévia a saliva de flebotomíneos é capaz de induzir resposta imune protetora no indivíduo através da produção de anticorpos e do desenvolvimento do perfil de
imunidade celular do tipo Th1, podendo impedir a instalação da infecção pelo parasito.
2.7 Anticorpos anti-saliva de flebotomíneos e seu potencial uso como marcadores epidemiológicos de exposição ao vetor e em estratégias para o controle da doença.
O desenvolvimento de novas ferramentas capazes de mensurar a exposição de humanos e reservatórios animais a vetores específicos de uma determinada doença parasitária forneceria informações valiosas a respeito da transmissão do parasito e poderiam ser utilizadas para a avaliação do risco de contrair determinada enfermidade (TEIXEIRA et al., 2010). Como demonstrado anteriormente, alguns componentes salivares de flebotomíneos exibem atividade imunogênica, estimulando tanto a produção de anticorpos pelo hospedeiro, bem como o surgimento da imunidade mediada por célula.
Muitos trabalhos têm demonstrado que humanos e animais residentes em áreas endêmicas para leishmaniose produzem anticorpos contra antígenos da glândula salivar do inseto, que são inoculados no hospedeiro durante o repasto sanguíneo (BARRAL et al., 2000; ROHOUSOVA et al., 2005; TEIXEIRA et al., 2010; ROHOUSOVA et al., 2015). Uma vez que as populações de flebotomíneos tendem a permanecer agrupadas, a identificação de anticorpos capazes de reconhecer antígenos da glândula salivar, tanto em humanos como em reservatórios animais, pode ser utilizada como um indicador da distribuição espacial desses insetos, contribuindo para o direcionamento das estratégias de controle do vetor e da doença (SOUZA et al., 2010). De forma contrária, o soro de indivíduos não residentes em áreas endêmicas e sem história clínica de leishmaniose, não foi capaz de reconhecer os antígenos presentes da saliva de flebotomíneos (ANDRADE et al., 2007).
Em área endêmica para L. tropica, a resposta humoral contra a saliva de P. sargenti, seu vetor, foi comparada entre os indivíduos saudáveis e aqueles com LC ativa. Indivíduos com lesão ativa demonstraram maiores níveis de IgG anti-saliva do vetor comparado a indivíduos saudáveis (ROHOUSOVA et al., 2005). Dessa forma,
