Mass Analyzers. Main Components of the LC-MS

Cromatografia Líquida Acoplada à

Espectrometria de Massas (Sequencial)

Técnicas de Ionização e Analisadores de Massas Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Departamento de Química Campus da UFSM 97105-900 Santa Maria - RS Prof. Dr. Renato Zanella

e-mail: rzanella@base.ufsm.br 2011

Mass Spectrometry

Mass Analyzers

• Double Focusing Magnetic Sector

• Quadrupole Mass Filter

• Quadrupole Ion Trap

• Linear Time-of-Flight (TOF)

• Reflectron TOF

• Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance

(FT-ICR-MS)

4

Main Components of the LC-MS

Ion Optics Detector

Spray Chamber Å Å Å ÅÅ Å Mass Filter

5 API-Electrospray GC/MS Particle Beam APCI 1000 100,000 10,000

Nonpolar Very polar

FAB Thermospray M o le c u la r W e ig h t

Mass Spectrometry

Mass Spectrometry

Terms and Definitions

Molecular ion / precursor ion

Ion formed by ionization of the analyte species

Fragment ions / product ions

Ions formed by the gas-phase dissociation of the molecular ion

Relative Abundance

Relative Abundance is a measure of the relative amount of ion signal recorded by the detector

7 8

Ionization Techniques

Gas-Phase Methods

• Electron Impact (EI) • Chemical Ionization (CI)

Desorption Methods

• Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) • Fast Atom Bombardment (FAB)

Spray Methods

• Electrospray (ESI)

9

Electron Impact

Electron Impact

Advantages

• Well-Established

• Fragmentation Libraries

• No Supression

• Insoluble Samples

• Interface to GC

• Non-Polar Samples

Disadvantages

• Parent Identification

• Need Volatile Sample

• Need Thermal Stability

• No Interface to LC

• Low Mass Compounds

(<1000 amu)

• Solids Probe Requires

Skilled Operator

Chemical Ionization

Chemical Ionization

Advantages

• Parent Ion

• Interface to GC

• Insoluble Samples

Disadvantages

• No Fragment Library

• Need Volatile Sample

• Need Thermal Stability

• Quantitation Difficult

• Low Mass Compounds

(<1000 amu)

• Solids Probe Requires

Skilled Operator

13 http://www.noble.org/PlantBio/MS/ion_tech_main.html

Electrospray Ionization (ESI)

(Eletronebulização)

14

Electrospray Ionization (ESI)

Typical ions produced by electrospray ionisation:

Positive mode:

[M+H]+ protonated molecule [M+Na] +, [M+K] + … adducts

[M+CH3CN+H] + protonated, + solvent adducts

Negative mode: [M-H] - deprotonated molecule

[M+HCOO -] -, … adducts

15

Electrospray Ionization (ESI)

In source fragmentation: this is obtained by accelerating the ions in the source, in a region where the pressure is in the millibar range. The acceleration is produced by applying a voltage (cone voltage) between the sampling cone and the next extraction lens. The ions collide with residual gas molecule, gain energy and fragment.

16 +

+

Heated nitrogen drying gas Dielectric capillary entrance Nebulizer (gas shown in red) Solvent spray Electrospray Ions -4000 V Å ÅÅÅ ÅÅ Å Å Å Å Å Å Å Å ÅÅ Evaporation Rayleigh Limit Coulomb Explosion

Evaporation Analyte Ion

API-Electrospray Ionization

17

Increasing fragmentation with increasing cone voltage. The fragmentation obtained by in source fragmentation is useful for confirming a peak identity, getting structure information, improving selectivity, building libraries…

18

ESI = Ionização por eletronebulização à pressão atmosférica

1º) Bombeamento da amostra através de uma agulha nebulizadora;

2º) Aplicação de uma voltagem entre a agulha e o cone que a rodeia;

3º) Formação de uma nuvem de gotículas carregadas;

4º) Evaporação do solvente devido à presença de um dispositivo aquecido;

5º) Aumento da densidade de cargas na superfície das gotículas;

6º) Repulsão entre as cargas até os íons evaporarem das gotículas.

Electrospray Ionization (ESI)

19

ESI

Advantages

• Parent Ion

• High Mass Compounds

(>100,000 amu)

• Thermally Labile

Compounds (<0º C)

• Easy to Operate

• Interface to HPLC

• Zeptomole sensitivity

with nanospray

Solvent (MeOH, ACN, H2O,

Acetone are best) • Sensitive to Salts • Supression (low femtomole to zeptomole)

20

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

Solvent molecules (S) being protonated by the corona (SH+), then reacting with the analyte molecule (M) to give the protonated form MH+. (Atmospheric Pressure Ionization – API)

21

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) APCI = Ionização Química à Pressão Atmosférica

1º) Bombeamento da amostra através de um capilar; 2º) Vaporização do solvente e da amostra, por um

dispositivo aquecido;

3º) Ocorre “descarga elétrica em coroa”;

4º) Ionização do solvente da fase móvel;

5º) Os íons formados reagem com as moléculas do analito.

22

APCI

Advantages

Solvents

• Handles High Flow Rates

Disadvantages

• Need Volatile Sample

• Need Thermal Stability

23

Seleção da fonte:

• Experiência do laboratório e o tipo de instrumento; • ESI é mais frequentemente utilizada;

• Facilidade do uso; • Robustez;

• Seletividade para mais compostos

• APCI: • Máxima sensibilidade no modo íon positivo para compostos neutros;

• Para compostos de íon negativo que requer captura de elétron para ionização (nitratos) APCI : N-metilcarbamatos, compostos neutros

ESI :• técnica preferida e menos propensa a degradação térmica • trabalha numa faixa mais ampla de compostos

24

Principais Diferenças entre APCI e ESI • Mecanismo de Ionização:

– Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador aquecido e pneumaticamente assistido. A voltagem (~3 kV) é

aplicada a uma agulha de metal na saída do spray.

– A descarga Corona ioniza as moléculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos por transferência de prótons formando [M+H]+ ou

[MH]-• Vazão da FM:

– APCI tolera vazões na ordem de 0,2 a 2,0 mL/min, enquanto que ESI opera no máximo até 1,0 mL/min.

– ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos quanto 5 µL/min, compatível com acoplamentos capilares (µLC ou CZE).

• Fragmentação:

– Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentação, enquanto que ESI pode até formar alguns íons pseudo-moleculares.

– APCI não produz cargas múltiplas, portanto não é adequado para compostos de alta MM. • Sensibilidade:

25 ESI characteristics

Soft ionization method, provides molecular weight information. Suitable for analyzing large bio- or synthetic polymers. Suitable for analyzing polar and even ionic compounds. Less fragmentation.

APCI characteristics

Provides molecular weight information.

Suitable for analyzing less polar compounds compared to ESI. Increased fragmentation compared to ESI.

MALDI characteristics

Soft ionization method, provides molecular weight information. Suitable for analyzing very large bio- or synthetic polymers. Suitable for analyzing polar and even ionic compounds. Less fragmentation.

Ionisation Techniques

26

Fast Atom Bombardment (FAB)

27

FAB

Advantages • Parent Ion

• High Mass Compounds (10,000 amu)

• Thermally Labile Compounds (R.T.)

Disadvantages • No Fragment Library • Solubility in Matrix (MNBA,

Glycerol)

• Quantitation Difficult • Needs Highly Skilled

Operator

• Relatively Low Sensitivity (nanomole)

28

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

(MALDI)

29

MALDI

Advantages • Parent Ion

• High Mass Compounds (>100,000 amu) • Thermally Labile Compounds (R.T.) • Easy to Operate

Disadvantages

• No Fragment Library

• Wide variety of matrices

• Quantitation Difficult

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Data Acquisition Modes

SIM vs SRM

Ø Selected-Ion Monitoring

If the analysis aims at detecting target compounds of known spectral characteristics with maximum sensitivity

Ø Selected-Reaction Monitoring

Detection of selected reactions, based on the decomposition reactions of ions that are characteristic of the compounds to be analysed Three Acquisition Modes:

Ø Scanning

Complete spectra are repeatedly measured between two extreme masses

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Double-Focusing Magnetic Sector

http://www.asms.org

Advantages • Very High Resolution (60,000) • High Accuracy (<5 ppm) • 10,000 Mass Range

Disadvantages • Very Expensive

• Requires Skilled Operator • Difficult to Interface to ESI • Low resolution MS/MS without

multiple analyzers

Analisadores

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Analisador Quadrupolar (Q) • Analisador de varredura

• Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofreqüência entre pares, permitindo que apenas um íon atinja o detector de cada vez

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*

*

Filtering Selected Mass

Filtering Low Mass

M+

M+

M+

How Does a Quadrupole Mass Filter Work?

Filters out all m/z values except the one it is set to pass

Obtains a mass spectrum by sweeping across the entire mass range

Analisadores

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MS/MS with Triple Quadrupoles

The analyser of a “triple quad” instrument consists in two quadrupoles, separated by a collision cell. Such a configuration is often referred as a "tandem in space" instrument.

Precursor ions and product ions are created and analysed in different physical spaces.

A triple quad instrument can be used in various ways, which are represented on the next figure. The firsts two experiments are in fact using the triple quad in a single quadrupole mode

Analisadores

35

MS/MS with Triple Quadrupoles

- The first quad (Q1) is set to pass one ion of interest

- The second quad (q2) is set to pass all ions and is flooded with a collision gas to fragment the parent ion present (collision induced dissociation or CID)

- The third quad (Q3) obtains a daughter ion spectrum by sweeping across the desired mass range

Analisadores

36

• Os íons são acelerados para aumentar a energia cinética e passar em uma câmara com o gás de colisão.

Usa-se, geralmente: Ar para o Triplo Quadrupolo He para a Ion Trap

• o uso da fonte CID tem desvantagens importantes, como a dificuldade prática de funcionamento na voltagem ótima de fragmentação para todos compostos em um método multirresíduo.

• As desvantagens podem ser resolvidas trabalhando com MS/MS Sequencial pelo uso do Triplo Quadrupolo ou sistemas Íon Trap porque a voltagem usada pode ser mais baixa ou semelhante para todos os compostos e o número de fragmentos produzidos pode ser controlado por um bom ajuste do MS/MS para especificar a fragmentação e produzir espectros simples.

37

Advantages

• Inexpensive

• Easily Interfaced to

Many Ionization

Methods

Disadvantages

• Low Resolution (<4000)

• Low Accuracy (>100 ppm)

• MS/MS requires multiple

analyzers

• Low Mass Range (<4000)

• Slow Scanning

Quadrupole Mass Analyzer/Filter

Analisadores

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Ion-Trap Analyzer

• Acúmulo de íons no interior de um campo quadrupolar 3D; • Liberação controlada de íons de diferentes massas; • Permite realizar MSn Analisadores 39

Advantages

• Inexpensive

• Easily Interfaced to

Many Ionization

Methods

• MS/MS in one analyzer

Disadvantages

• Low Resolution (<4000)

• Low Accuracy

(>100ppm)

• Space Charging

Causes Mass Shifts

• Low Mass Range

(<4000)

• Slow Scanning

Quadrupole Ion Trap

Analisadores

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Espectrômetros de Massas em Sequência (MS/MS)

• Podem ser de dois modos:

• Consecutivos no espaço usando dois espectrometros separados;

• Sucessivos no tempo usando a mesma massa no sistema mais de uma vez (ion trap)

• A técnica permite a medida de fragmentação de um pico selecionado em um espectro de massa que produz o espectro de massas do íon precursor;

• A informação é aumentada com a combinação de dois MS;

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Linear Time-of-Flight (TOF)

Advantages

• Extremely High Mass Range (>1 MDa) • Fast Scanning

Disadvantages • Low Resolution (4000) • Low Accuracy (>200 ppm) • MS/MS not possible • íons são produzidos em pulsos e acelerados em alta velocidade

por um campo elétrico num tubo de deslocamento.

• a distância da origem até o detector é fixa,

• o tempo que o íon leva para atravessar o analisador é inversamente proporcional a

sua velocidade

Analisadores

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Reflectron Time-of-Flight (TOF)

Advantages

• High Resolution (>20,000 in some models) • High Accuracy (<5ppm)

• 10,000 Mass Range • Fast Scanning

Disadvantages

• Low Resolution for MS/MS

Analisadores 43 Z-spray íon souce Hexapole íon bridge Quadrupole Hexapole collision cell MS-MS Reflectron QUADRUPOLE MS TOF MS Sistema Q-TOF/MS

Combinação de um MS Quadrupolo com um analisador TOF

• Espectros de massas contínuos “full-scan” tornam o MS/MS Q TOF mais sensível (10 - 100 vezes) que os Quadrupolos em sequência;

• TOF e o MS/MS Q TOF tem a mesma sensibilidade no modo scan e no modo de seleção do íon; • A maior capacidade do MS/MS Q TOF comparado com instrumentos Triplo Quadrupolo e MS/MS Íon Trap está na sua habilidade para determinar massas precisas nos fragmentos de íons gerados na cela de colisão.

Algumas características do Q-TOF/MS

Analisadores

44

O ESPECTRO DE MASSAS

• Espectro de massas = diagrama da intensidade relativa dos picos em função das razões massa-carga.

8Pico base = pico com a intensidade mais alta, arbitrariamente assinalada em 100. Em LC-MS o pico base geralmente é a molécula protonada e

corresponde ao íon positivo mais estável;

4Íon molecular = é o pico de maior razão massa-carga e representa o peso molecular do composto.

45

The API Mass Spectrum

Electrospray (ESI) and APCI are both API (atmospheric pressure ionisation) techniques and produce a soft ionisation. Thus, the MS spectra obtained with API ionisation will consist mainly of the "molecular" ions, unless fragmentation techniques are applied.

The possible fragmentation techniques are in source CID (collision induced dissociation), CID in the collision cell of a tandem type instrument, fragmentation in an ion trap. This is very different from the spectra obtained with EI (electron impact ionisation).

sulfamethazine spectrum Negative ESI mass spectrum for

glucose, with chloride adducts. 46

Operating conditions

Eluent: the mobile phase must be suitable for ionisation. If it is not the case, a

small amount of modifier can be added, in order to generate the solvent gas phase ions.

Buffers: buffers must be volatile.

• Tampões voláteis (ex. Formiato de amônio)

concentração do tampão, ácido ou base usado para ajustar o pH deveriam ser o mais baixa possível (0,1%);

Substitute phosphates, sulfates, and borates with ammonium acetate or formate, trifluoroacetic acid (TFA), heptafluorobutric acid (HFBA), tetrabutylammonium hydroxide (TBAH)

47

Choosing Between Ionization Techniques

General rules can be given to chose between ESI, APCI, or EI.

ESI is preferred for compounds which are ionic or very polar or thermo labile, or

with masses higher than 1000…

APCI is preferred for compounds which are not very polar.

If we take the example of pesticides, we can rule out that:

polar pesticides will be in ESI, less polar in APCI, volatiles in APCI, non polar better done with GC/EI

48 Mass Definition

The mass spectrometer measures the exact mass. Looking at the below mass spectra, the most abundant peak is at 221.95 (top) and 219.81 (bottom). These spectra are obtained with positive ionisation (top) and negative ionisation (bottom). The peaks correspond to the protonated or deprotonated molecule.

If we look for the molecular mass of the chloridazon pesticide, we can find various values in the spectra 1.221.6379: this is the average mass. It is based on the average atomic masses.

2.221: this is the nominal mass, calculated on the nominal mass of the most abundant isotopes 3.221.0278: this is the exact (or monoisotopic) mass, based on the exact mass of the most abundant natural isotopes

The value is slightly different from the expected 222.0278 and 219.0278 because these spectra were obtained with a quadrupole instrument, which does not provide sufficient mass resolution and mass accuracy for obtaining the exact mass.

49

Benzoylurea pesticides ESI

-50

Organophosphorus ESI +

51

Carbamate analysis by LC/MS

Column: Ultra Carbamate, 100 x 4.6 mm, 3 µm Conc.: 100 µg/L each

Mobile Phase: A: 90:10 water:methanol + 10 mM ammonium formate B: 10:90 acetonitrile:methanol + 10 mM ammonium formate Gradient: 90:10 A:B to 10:90 A:B from 0-15 min.

Flow-rate: 0.25mL/min Mode: ESI+

52 mass/charge

abundance

Base Peak: most abundant ion in spectrum [M + H]+ Psuedomolecular ion or Quasi-molecular ion A + 1 A + 2 from naturally occurring isotopes

{

Mass Spectra

53

Comparação entre instrumentos MS/MS

Instrumento Sensibilidade em full scan

Seletividade Exatidão Faixa dinamica

Características

Triplo quadrupolo baixa alta baixa alta Perda Neutra

MS/MS Ion trap alta alta baixa média MSn

LC/TOF/MS alta média alta média Massa exta e

sensibilidade

LC/QTOF/MS média alta alta média Massa exata dos

fragmentos

Instrumento Características Vantagens Desvantagens

Q-TOF MS/MS Massa exata dos fragmentos de íons

Muito sensível em MS/MS para quase todos íons precursores selecionados

Full scan do íon precursor

Muito caro Não é possível

perda neutra Triplo Quadrupolo

MS/MS

Perda Neutra Sensível para quantificação no modo MRM Não dá a massa exata Quadrupolo Ion Trap MSn _{Sensível no scan de fragmentos}

facilmente deduziveis Não é possível Perda Neutra e MRM 54 Seletividade superior em LC-MS comparada com LC-UV

Será a técnica LC-TOF-MS a melhor solução?

55

Figures of Merit for Mass Analyzers

Type m/z range Resolving Power Cost

Double Focusing 2-5000 20,000 $$$$ Single Focusing 1-1400 1500 $$$ Quadrupole 1-4000 1000 $$ Ion trap 10-4000 1000 $$ Time of flight 1-100,000 30,000 $$$ Fourier Transform 18-10,000 >100,000 $$$$ 56

Sistemas de LC-MS