! "#$" $% &'#( ) $% !# " #
* + $ & ' $ ! % ,-..
,-/
0 1 2 &
3 !
" * ( # 4 ##
# 5
5 *5 6 " *
Prof. Dr. Angelo Amato Vincenzo de Paola
! "!#$ %& Prof. Dr. Valdir Ambrósio Moisés
normotensos e ratos espontaneamente hipertensos. (Characterization of sidestream cigarette smoke effects on neural control of cardiovascular system in normotensive and spontaneously hypertensive rats). In: tese de doutorado (Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina). São Paulo, 2011.
!- . /
Nome: 0 0 '!
-Professor Associado do Departamento de Medicina, Disciplina de Cardiologia da Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP/São Paulo.
. ! - ' !
Nome: 0 0 ' 1-'2 - !/- ' -3
Titulação: Professor Titular do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, USP/São Paulo.
Nome: 0 0 / ' / ! -3 4
Titulação: Professor Adjunto do Departamento de Medicina Preventiva da Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP/São Paulo.
Nome: 0 0 -4 ' ! 5 ! '
-Titulação: Professor Assistente Doutor do Departamento de Fisioterapia da Universidade Estadual Paulista, UNESP/Presidente Prudente.
Nome: 0 0 -4 ' ! .
Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, USP/São Paulo.
Nome: 0 0 6 7 $ '- - '-3 - -'
O apoio, exemplo e incentivo de cada um deles foram
indispensáveis
para
a
superação
de
todos
os
obstáculos
me inspirou e me ajudou a persistir no sonho, pela lição de vida, a de nunca desistir e tentar sempre.
Considero:te um verdadeiro mentor, formador de opiniões.
Tu crias idéias na mente dos discípulos, traduzes os termos científicos para a linguagem popular. Enriqueces o passado do país, fortaleces o presente do país e estimulas os ideais de teus discípulos.
Considero:te um mágico, transformas pesadelos em sonhos, derrotas em vitórias, o impossível em provável. Tudo isso com criatividade, naturalidade e genialidade.
Considero:te um soldado, pois combates diariamente a negatividade, o conformismo, o preconceito, a ignorância científica e moral, a apatia e a falta de verbas para as pesquisas básica e clínica. Concluis teus objetivos devido aos teus aliados, o bom humor, a humildade, a criatividade, a inteligência e principalmente a confiança de teus discípulos.
Tu tens um pretérito abastado em lembranças e conquistas, um presente aventureiro, cheio de desafios e felicidades, porque a tu é dado o direito de lidar todos os dias com o futuro. O destino desta maravilhosa nação chamada Brasil, composta por teus pesquisadores, a quem tu és um dos mais relevantes colaboradores.
Considero:te, acima de tudo, um cientista que pesquisa sonhos e realidade.
Considero:te um verdadeiro mentor.
Valeu o convívio nas horas alegres e principalmente naquelas de maior tristeza. Sua força interior continua a me incentivar nos trilhos de minha caminhada.
À minha amada vó ' - !, pelo carinho que sempre demonstrou por mim e por ter criado e educado o homem que me inspira paixão pela vida, meu maior exemplo de vida, cujos passos sigo para tentar um dia chegar perto de seu grau de evolução.
A todos os meus -'- !9 pelo carinho, respeito e incentivo que me passaram diante de várias dificuldades encontradas, principalmente no início do doutorado.
À Profa. Dra. : -/ ; - e ao Prof. Dr. ' . -, pelo esclarecimento de dúvidas relativas ao trabalho, colaboração na coleta dos dados e fornecimento de espaço para realização de grande parte dos experimentos.
Aos amigos de laboratório da Faculdade de Medicina do ABC e da UNIFESP,1 $ / 6< - , ' ! ,- '3 !, 2 /- !! ,
' 8 % '3 !9 ! 9 . ' - 9 ', -!,
/ ' 8- ! -9 , , =/- , - -, , 2 /- , ', 1 '' ,
, - , -$ $ ! , / ' , 6 '- , -! - $- , / !,
Ao Prof. Dr. - !!-, pelo incentivo à minha evolução acadêmica e pelo exemplo de ser humano.
Aos Professores - , - $ - -, - -4 - e / ' - , pelo companheirismo e incentivo durante o período da realização do projeto.
Ao Prof. Dr. 3 ' . ', Division of Endocrinology and Metabolism, School of Medicine, University of Utah, Salt Lake City, Utah – Estados Unidos, pela oportunidade da realização de uma epopéia: o meu período de intercâmbio científico no exterior. Um sonho realizado!
Aos meus tios '/ e - , aos meus primos '- , - e? ''-'e aos meus primos de segundo grau , -3, , , ' e , pela oportunidade de visitá:los, pelo carinho, respeito e por me abrigarem durante o meu período de intercâmbio científico nos Estados Unidos.
Aos amigos de laboratório da University of Utah, 6 - , , , , ''- , $, ! ' 7, ' !7 ,@-, 7! ',1 ,, , 7 e ! , que me receberam com os braços abertos e sempre foram pacientes comigo, diante do meu período de intercâmbio científico.
À minha amiga - - ! 3 ' , pelo convívio e incentivo no último período do meu doutorado e pela importantíssima e altruísta contribuição na gramática portuguesa.
A todos os amigos e companheiros os quais tive o prazer de compartilhar trabalhos, projetos, experiências clínicas, experimentais relacionadas às ciências básicas e clínicas.
! 5 ' ! 5 . !/ 3 9 - !
/ % !9 -!!B !9 % !9 ' / = !-! C /- !/ . - !
% &
' ( " ! "
) (
" ( !
* )+
! '
" ) ! "( )
," " +
! + &(
" )+
( - !
% !
) # * .
.K -3 ! avaliar os efeitos da fumaça lateral de cigarro (FLC) sobre o controle neural do sistema cardiovascular em ratos normotensos e ratos espontaneamente hipertensos (SHR). L ratos Wistar, Wistar:Kyoto (WKY) e SHR foram expostos à FLC durante três semanas, cinco dias por semana, 180 minutos por dia numa concentração de monóxido de carbono entre 100 e 300 ppm. Barorreflexo foi estimulado por uma dose vasodepressora de nitroprussiato de sódio (NPNa, 50Og/kg, i.v.) e uma dose pressora de fenilefrina (PE, 8Og/kg , i.v.). Para avaliar os efeitos da inibição da catalase no quarto ventrículo cerebral (4ºV) sobre as respostas cardiovasculares, foi injetado o inibidor de catalase 3:amino:1,2,4:triazole (ATZ, 0,01Og/100OL). ! ' ! nos ratos Wistar expostos à FLC, foi observado que a inibição da catalase causou respostas mais intensas quanto a FC basal e ao pico bradicárdico. A inibição da catalase afetou de maneira mais intensa a FC basal e o pico bradicárdico, nos ratos WKY expostos à FLC. Por outro lado, nos animais SHR a exposição à FLC afetou o pico taquicárdico após inibição central de catalase de maneira mais intensa. /' !& a exposição à FLC altera os componentes simpáticos do barorreflexo em ratos WKY e SHR, além de causar respostas cardiovasculares mais intensas perante a inibição de catalase no 4ºV em ratos Wistar e WKY.
normotensive and spontaneously hypertensive rats. [thesis dedoutorado]. São Paulo (BR). Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina; 2011.
,
.K / -3 !: To evaluate the effects of sidestream cigarette smoke (SSCS) on neural control of cardiovascular system in normotensive and spontaneously hypertensive rats (SHR). Wistar, Wistar:Kyoto rats (WKY) and SHR were exposed to SSCS for three weeks, five days per week, 180 minutes per day at a concentration of carbon monoxide between 100 and 300 ppm. Baroreflex was stimulated with a vasodepressor dose of sodium nitroprusside (NPNa, 50Ug/kg, iv) and with a pressor dose of phenylephrine (PE, 8Ug/kg, iv). In order to evaluate the effects of catalase inhibition into the fourth cerebral ventricle (4th V) on cardiovascular responses, we injected the catalase inhibitor 3:amino:1,2,4:triazole (ATZ, Ug/100UL 0.01). ! ' ! It was observed in Wistar rats exposed to SSCS that catalase inhibition caused more intense responses on basal HR and bradycardic peak. Central catalase inhibition affected in a higher intensity baseline HR and bradycardic peak WKY rats exposed to SSCS. On the other hand, in SHR SSCS exposure affected the tachycardic peak after central inhibition of catalase in a higher intensuty. /' !- Exposure to SSCS alters the sympathetic component of the baroreflex in WKY and SHR and caused more severe cardiovascular responses to catalase inhibition into the 4th V in Wistar and WKY rats.
1.1 CONTROLE NEURAL DA CIRCULAÇÃO 36 1.2 ENVOLVIMENTO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
NO CONTROLE DA CIRCULAÇÃO 43
1.3 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO A AGENTES POLUENTES SOBRE
O SISTEMA CARDIOVASCULAR 46
1.4 EXPOSIÇÃO AO CIGARRO E MODULAÇÃO DO SISTEMA
CARDIOVASCULAR 48
2 ,6 50
2.1 GERAL 50
2.2 ESPECÍFICO 50
3 O 51
3.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS 51
3.2 EXPOSIÇÃO À FUMAÇA LATERAL DE CIGARRO 51 3.3 REGISTRO DE PARÂMETROS CARDIOVASCULARES EM
RATOS CONSCIENTES 52
3.4 ESTIMULAÇÃO DAS RESPOSTAS BARORREFLEXAS 53
3.5 IMPLANTE CENTRAL 54
3.6 INJEÇÕES NO QUARTO VENTRÍCULO CEREBRAL 54
3.7 HISTOLOGIA 55
3.8 DROGAS UTILIZADAS 56
3.8.1 Anestésicos 56
3.8.2 injeções endovenosas 56
3.8.3 injeção central 56
3.9 PROTOCOLO EXPERIMENTAL 57
CONTROLE
4.2 RESULTADOS HISTOLÓGICOS 63
4.3 ANÁLISE DO BARORREFLEXO E VARIÁVEIS HEMODINÂMICAS EM RATOS WISTAR EXPOSTOS À FUMAÇA LATERAL DE CIGARRO E CONTROLE, 5, 15, 30 E 60 MINUTOSAPÓS INIBIÇÃO DE CATALASE NO 4ºV 65 4.4 ANÁLISE DO BARORREFLEXO E VARIÁVEIS HEMODINÂMICAS EM RATOS WISTAR EXPOSTOS À FUMAÇA LATERAL DE CIGARRO E CONTROLE 15 MINUTOS APÓS INIBIÇÃO DE CATALASE NO 4ºV
73
4.5 ANÁLISE DO BARORREFLEXO E VARIÁVEIS HEMODINÂMICAS EM RATOS WISTAR ANTES, 5, 15, 30 E 60 MINUTOS APÓS INJEÇÃO DE SALINA (VEÍCULO) NO 4ºV 81 4.6 COMPARAÇÃO DO BARORREFLEXO ENTRE RATOS WKY E SHR EXPOSTOS E À FUMAÇA LATERAL DE
CIGARRO E SEUS RESPECTIVOS GRUPOS CONTROLE 85
4.7 ANÁLISE DO BARORREFLEXO E VARIÁVEIS HEMODINÂMICAS EM RATOS WKY E SHR EXPOSTOS À FUMAÇA LATERAL DE CIGARRO E SEUS RESPECTIVOS GRUPOS CONTROLE, 5, 15, 30 E 60 MINUTOS APÓS INIBIÇÃO DE CATALASE NO 4ºV
GRUPOS CONTROLE ANTES E 15 MINUTOS APÓS INIBIÇÃO DE CATALASE NO 4ºV
105
4.9 ANÁLISE DO BARORREFLEXO E VARIÁVEIS HEMODINÂMICAS EM RATOS WKY E SHR 15 MINUTOS APÓS ADMINISTRAÇÃO DE SORO FISIOLÓGICO (VEÍCULO)
NO QUARTO VENTRÍCULO CEREBRAL 121
5 129
6 156
P 157
P , , 8 Q 171
Anexos 172
1. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal de São Paulo/Hospital São Paulo. 172 2. Artigos publicados e aceitos originados da tese. 174 3. Artigos publicados e aceitos originados de contribuições
-$ * Representação esquemática da via tradicional envolvida no reflexo baroceptor. IML: Coluna Intermedilateral; NTS: Núcleos do Tracto Solitário; RVL: Região rostroventrolateral da medula oblonga; CVL: Região caudoventrolateral da medula oblonga.
Adaptado de Valenti et al. 2007. 38
-$ ( Esquema da cânula arterial para registro da PAM e FC. 52 -$ R (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (SSCS – N=15) e grupo controle (Controle –
N=18). 61
-$ S (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (SSCS – N=15) e controle
(Controle – N=18). 62
-$ H Representação esquemática encefálica de um rato positivo, mostrando o bulbo e o cerebelo (~13.3mm caudal ao bregma). 63 -$ T Representação esquemática encefálica de um rato negativo,
após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar do grupo
controle (N=8). 67
-$ U (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar
do grupo controle (N=8). 68
-$ I (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à
fumaça lateral de cigarro (N=7). 71
-$ *) (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (N=7). 72 -$ ** (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar do grupo controle (N=8). *p<0.001: Diferente do controle (0 minutos).
76
-$ *R (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (N=8).*p<0,05: Diferente do controle (0
minuto). 79
-$ *S (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (N=8). 80 -$ *H (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de salina no 4ºV de ratos Wistar (N=8). 83 -$ *T (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
fumaça lateral de cigarro (WS, N=15; SS, N=16, respectivamente) e grupos controles (WC, N=22; SC, N=18, respectivamente). *p<0,05: Diferente de WC; #p<0,05:
Diferente de WS. 87
-$ *U (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) em ratos WKY e SHR expostos à fumaça lateral de cigarro (WS, N=15; SS, N=16, respectivamente) e grupos controles (WC, N=22; SC, N=18, respectivamente). *p<0,05: Diferente de SC;
#p<0,05: Diferente de SS. 88
-$ *I (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY do grupo controle (N=8). *p<0,001: Diferente do controle (0 minuto). 91 -$ () (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY
após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY expostos à
fumaça lateral de cigarro (N=7). 95
-$ (( (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY expostos à fumaça lateral de cigarro (N=7). 96 -$ (R (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8 g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de SHR do grupo controle (N=6). *p<0,05: Diferente do controle (0 minuto). 99 -$ (S (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50 g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de SHR do
grupo controle (N=6). 100
30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV do grupo SHR exposto à fumaça lateral de cigarro (N=8). 104 -$ (F (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY do grupo controle (N=8). *p<0.005: Diferente do controle (0 minutos). 107 -$ (U (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY do grupo controle (N=8). *p<0.05: Diferente do controle (0 minutos). 108 -$ (I (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY expostos à fumaça lateral de cigarro (N=8).*p<0,05: Diferente do controle (0
minuto). 111
-$ R) (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos WKY expostos à fumaça lateral de cigarro (N=8). *p<0,05: Diferente
injeção de ATZ no 4ºV de animais SHR do grupo controle (N=6). *p<0.005: Diferente do controle (0 minuto). 115 -$ R( (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de animais SHR do
grupo controle (N=6). 116
-$ RR (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de animais SHR do grupo exposto à fumaça lateral de cigarro (N=8). *p<0.005: Diferente do
controle (0 minuto). 119
-$ RS (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de animais SHR do grupo exposto à fumaça lateral de cigarro (N=8). 120 -$ RH (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
30 e 60 minutos após a injeção de veículo no 4ºV de ratos
WKY (N=6). 124
-$ RF (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de salina no 4ºV de animais SHR (N=6). 127 -$ RU (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B)
aumento reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio (NPNa, 50g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de veículo no 4ºV de animais
. ' * Protocolos experimentais. BR: Teste de barorreflexo. 57 . ' ( Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro
(F – N=15) e controle (C – N=18). 60
. ' R Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar do grupo controle. 66 . ' S Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro. 70 . ' H Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar do grupo controle. 74 . ' T Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro. 78 . ' F Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar tratados com veículo (soro fisiológico)
barorreflexo em ratos WKY e SHR expostos e não expostos à
fumaça lateral de cigarro. 86
. ' I Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos WKY do grupo controle. 90 . ' *) Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos WKY expostos à fumaça lateral de cigarro. 94 . ' ** Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos SHR do grupo controle. 98 . ' *( Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em SHR expostos à fumaça lateral de cigarro. 102 . ' *R Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos WKY do grupo controle. 106 . ' *S Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
barorreflexo no grupo SHR controle, antes e depois da inibição
central da catalase. 114
. ' *T Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do
barorreflexo no grupo SHR exposto à fumaça lateral de cigarro. 118 . ' *F Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos WKY tratados com veículo (soro
fisiológico) no 4º V. 122
. ' *U Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do
4º V Quarto ventrículo cerebral
ATZ 3:amino:1,2,4:triazole
CEDEME Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para a Medicina e
Biologia
CO Monóxido de carbono
CVL Região caudoventrolateral do bulbo
FC Frequência cardíaca
GABA ácido δ:aminobutírico
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HO Íons hidroxila
L:Glu L:glutamato
NaCl Cloreto de sódio
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NPNa Nitroprussiato de sódio
NTS Núcleos do trato solitário
O2: Radicais superóxido
PE Fenilefrina
PE:10 Polietileno:10
PE:50 Polietileno:50
ROS Espécies reativas de oxigênio
RVL Região rostroventrolateral do bulbo
SNC Sistema nervoso central
SHR Ratos espontaneamente hipertensos
SOD Superóxido dismutase
WKY Wistar Kyoto
∆FC Variação de frequência cardíaca
1 INTRODUÇÃO
O coração é considerado um órgão fundamental para o funcionamento do organismo. Ele é responsável pelo bombeamento de sangue para todas as regiões do corpo humano (GUYTON e CROWELL, 1999).
A hipertensão é definida como uma elevação dos padrões normais da pressão arterial (PA) por um período contínuo acima de 24 horas, sendo considerada como um dos quadros patológicos que afetam o sistema cardiovascular de maior incidência na população mundial (GUYENET, 2006). Dentre os fatores de risco para a hipertensão, pode-se citar os modos de alimentação, sedentarismo, genótipo, entre outros (SCHOORLEMMER et al.
2000;BOGDARINA et al. 2007; DONTI et al. 2007).
As doenças cardiovasculares são as mais freqüentes causas de morbidade e mortalidade ao redor do mundo durante as últimas décadas (MARK, 1996;
JULIUS e NESBITT, 1996; MANCIA, 1997; NARKIEWICZ, 2001). A hipertensão
normalmente induz à ocorrência de patologias do sistema cardiovascular (GUYTON, 1981). O mesmo processo patológico pode também ocasionar sérios prejuízos ao sistema respiratório, em casos de hipertensão pulmonar (HAGER et al. 1971) e ao sistema neurológico, como casos de acidente vascular encefálico (SIEGLE et al. 1982).
1.1 CONTROLE NEURAL DA CIRCULAÇÃO
O sistema cardiovascular exerce um papel essencial na manutenção da homeostasia do meio interno. Para desempenhar esta função, este sistema dispõe de mecanismos refinados de ajuste da PA, atuando momento a momento (controle neural) e em longo prazo (controle humoral) (COLOMBARI et al. 2001).
Para que a PA no organismo seja equilibrada existem três mecanismos que visam controlá-la: o neural, o renal e o desvio do fluído capilar (COLOMBARI et al. 2001; VALENTI et al. 2009).
A regulação da circulação pelo sistema neural envolve a ativação de receptores periféricos (barorreceptores, quimiorreceptores, receptores cardiopulmonares, entre outros), cujas aferências se projetam para o sistema nervoso central (SNC) via nervos vagos e glossofaríngeos. O processamento destas informações aferentes no SNC produz uma conseqüente modulação das vias autonômicas eferentes, havendo assim, o ajuste das variáveis
cardiovasculares (freqüência cardíaca – FC, volume sistólico e resistência
periférica)(SATO et al. 2001; COLOMBARI et al. 2001; VALENTI et al. 2007).
A elevação da PA e sua manutenção em níveis elevados podem ocorrer por alterações na regulação do sistema cardiovascular. A hipertensão arterial comumente se expressa por um aumento na resistência vascular. Os mecanismos pelo qual o aumento na resistência vascular é iniciado e mantido durante a hipertensão, no entanto, não estão totalmente compreendidos (GRASSI et al. 2004; VALENTI et al. 2007).
– SHR. (FRANCHINI et al. 1993). Esse modelo apresenta maior semelhança com a hipertensão em humanos, pois a hipertensão é observada mesmo sem alteraçã significante do volume plasmático (FRANCHINI et al. 1993). Entretanto, é possível que o mesmo experimento em modelos diferentes de hipertensão possa gerar resultados diferentes, em vista da diferença entre os mecanismos que originam a hipertensão.
As informações dos barorreceptores são integradas em três principais sítios do tronco cerebral, antes de modularem a atividade dos neurônios eferentes simpáticos da coluna intermediolateral da medula espinhal (SATO et
al. 2003; GUYENET, 2006; SALO et al. 2006). Estes sítios são os núcleos do
Figura 1: Representação esquemática da via tradicional envolvida no reflexo baroceptor. IML: Coluna Intermedilateral; NTS: Núcleos do Tracto Solitário; RVL: Região rostroventrolateral da medula oblonga; CVL: Região caudoventrolateral da medula oblonga. Adaptado de VALENTI et al. 2007.
O NTS encontra-se situado na medula oblonga, sendo um dos responsáveis pelo controle neural da PA, considerando a proximidade com a área postrema, o NTS pode ser dividido no sentido em três porções: NTS rostral, NTS intermediário e NTS comissural (COTTLE, 1964; GUYENET et al. 2006).
cardíaca, respiração, resistência das vias aéreas e liberação de hormônios como a vasopressina (BLESSING, 1997). Essas funções são baseadas nas conexões centrais do NTS com outras regiões do bulbo incluindo a região rostro-ventrolateral do bulbo, o núcleo parabraquial e o hipotálamo (VAN GIERSBERGEN et al. 1992; BLESSING, 1997).
O NTS constitui-se de grupos de neurônios heterogêneos, localizados na porção dorsomedial do bulbo. Estendem-se rostrocaudalmente como uma coluna bilateral, desde o pólo caudal do núcleo motor do nervo facial até o óbex, onde as duas colunas fundem-se para formar uma estrutura mediana, que continua caudalmente até aproximadamente o nível caudal da decussação piramidal (TORVIK, 1956).
O NTS pode ser dividido no sentido rostrocaudal, de acordo com sua disposição em relação à área postrema, em três regiões: NTS rostral, NTS intermediário e NTS caudal (COTTLE, 1964). De acordo com Torvik (1956), o NTS pode ainda ser dividido conforme sua posição em relação ao tracto solitário, em NTS medial e NTS lateral, sendo que no limite entre essas duas regiões encontra-se o tracto solitário. A porção caudal do NTS medial, no nível do óbex, forma uma coluna única e recebe o nome de NTS comissural (COTTLE, 1964). Utiliza-se também o termo NTS subpostremal para descrever a região do NTS que corresponde à extensão rostrocaudal da área postrema (BAUDE e SHIGUEMOTO, 1998).
SNCLAIR, 1988; MIFFLIN, 1992). As sinapses das aferências gustatórias encontram-se preferencialmente no NTS rostral (ALTSCHULER et al. 1989).
Inicialmente, a realização de lesões eletrolíticas e químicas do NTS foi bastante utilizada para se determinar sua importância fisiológica para o controle do sistema neurovegetativo, em especial do sistema cardiovascular. Em ratos, a lesão eletrolítica do NTS induziu hipertensão fulminante levando a complicações que resultaram em edema pulmonar agudo e morte algumas horas após a lesão. Lesões eletrolíticas do NTS de gatos, menos abrangentes, induziram hipertensão persistente, labilidade da pressão arterial e perda de respostas barorreflexas. A lesão química de terminais noradrenérgicos com 6-hidroxidopamina, em ratos, induziu pequena elevação da pressão arterial em curto prazo com perda de sensibilidade do barorreflexo, no entanto, os animais apresentaram labilidade permanente da pressão arterial. Essas observações apoiaram as primeiras hipóteses de que disfunções químicas ou morfológicas do NTS poderiam gerar hipertensão persistente (REIS et al. 1977; COLOMBARI et al. 2001; VALENTI et al. 2007).
A pressão arterial elevada é um grande fator contribuinte para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Em indivíduos com hipertensão
arterial o reflexo barorreceptor pode estar deprimido (BRISTOW et al. 1969) e o
tônus cardíaco vagal diminuído, o qual representa um fator de risco para morte súbita do miocárdio (MALLIANI, 1991).
Por muito tempo, acreditou-se que os benefícios promovidos por estes medicamentos advinham principalmente de seus efeitos periféricos. Entretanto, estas drogas atravessam a barreira hemato-encefálica de animais (CULMAN et al. 1999; CULMAN et al. 2002; POLIDORI et al. 1996), propriedade que ainda não foi demonstrada em seres humanos.
Surpreendentemente, antagonistas de angiotensina II são eficazes mesmo em indivíduos hipertensos com níveis circulantes de angiotensina II normais ou até reduzidos. Esta observação desviou o foco dos estudos da periferia para o sistema nervoso central, especialmente os núcleos do tracto solitário. É importante ressaltar que a angiotensina II é sintetizada em várias regiões do encéfalo, e independentemente da angiotensina presente no sistema
circulatório proveniente de fontes periféricas(FERGUSON et al. 1998).
O NTS é o primeiro sítio de sinapse das fibras aferentes de barorreceptores que provêm um dos mais importantes reflexos para a regulação da pressão arterial (BLESSING, 1997). A possível participação dos barorreceptores no controle crônico, assim como no controle agudo, da pressão arterial ainda é discutida (SLEIGHT, 1997).
Entretanto, estudos de Thrasher (2002) são indicativos de que os barorreceptores são essenciais para o controle crônico da pressão arterial, uma vez que a desativação crônica dos barorreceptores, e não a desenervação, resultou em hipertensão neurogênica. Desta forma, qualquer modulador que deprima o controle reflexo central da pressão arterial pode contribuir para a patogênese da hipertensão.
terminais nervosos, entre elas, a acetilcolina, as monoaminas, como dopamina, serotonina, noradrenalina e adrenalina, os aminoácidos, como L-glutamato
(L-Glu), L-aspartato, ácido δ-aminobutírico (GABA) e glicina, e os neuropeptídeos,
como substância P, neuropeptídeo Y e a angiotensina II (VAN GIERSBERGEN et al. 1992).
O NTS intermediário e comissural estão diretamente envolvidos no controle cardiovascular e respiratório, pois todas as projeções aferentes vagais e glossofaríngeas, que conduzem informações cardio-respiratórias, fazem sua primeira sinapse nessas duas projeções do NTS (CIRIELO e CALARESU, 1981). O NTS é ricamente inervado por axônios de neurônios que sintetizam e liberam catecolaminas, sendo que o principal neurotransmissor liberado por eles é a noradrenalina (URTHALER et al. 1978; VALENTI et al. 2007).
1.2 ENVOLVIMENTO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
NO CONTROLE DA CIRCULAÇÃO
Está bem descrito na literatura que o estresse oxidativo está envolvido no desenvolvimento de disfunções cardiovasculares (ZUCKER, 2009). As espécies reativas do oxigênio (ROS, Reactive Oxygen Species), são produtos francos da respiração aeróbia, envolvendo a redução incompleta do oxigênio. Quimicamente, ROS são moléculas instáveis no microambiente celular e
eletrofílicas, sendo representadas principalmente pelos radicais superóxido (O2
-), hidroxila (HO-), e pelo próprio peróxido de hidrogênio (H2O2) - embora não
seja radicalar (CARDOSO et al. 2006; ZIMMERMAN e ZUCKER, 2009).
A reação destas espécies com os diferentes tipos de tecidos é denominada estresse oxidativo e integra uma gama de processos degenerativos bioquímicos implicados tanto em processos normais destes sistemas, como em um grande número de mecanismos fisiopatológicos, já que os organismos permanecem em constante exposição a fontes endógenas ou exógenas de ROS (FLORAS et al. 2007). Através do estresse oxidativo, os radicais livres parecem participar do sistema imunológico macrofágico, da regulação da excitabilidade neuronal, da liberação de neurotransmissores, da modulação de canais iônicos, da sinalização celular, assim como da lesão por radiação solar e ionizante, da lesão pelo binômio isquemia-reperfusão, dos danos por neoplasias, da aterosclerose, das doenças degenerativas neurológicas, do envelhecimento (BULKLEY et al. 2002; LIN et al. 2003).
neurotransmissor excitatório de ação rápida no SNC de mamíferos, e o GABA, principal neurotransmissor inibitório de ação rápida no SNC de mamíferos (CHEN et al. 2002; MOREIRA et al. 2004).
Resultados têm demonstrado concentrações séricas aumentadas de radicais livres, principalmente do ânion superóxido, nos diversos modelos de hipertensão. Pesquisas anteriores verificaram a existência de uma
concentração mais elevada de H2O2 no sangue de indivíduos hipertensos ou
com história familiar de hipertensão, quando comparados a indivíduos não hipertensos (LACY et al. 1998).
Os radicais superóxido se mostram capazes de inativar ou reduzir a biodisponibilidade de NO no endotélio vascular, muito embora modelos de hipertensão apresentem um aumento da atividade da NOS endotelial, enzima responsável pela geração de NO no endotélio de diferentes vasos sanguíneos.
A via final desta interação entre NO e O2- é, entre outros, a formação de
peroxinitrito (ONOO-), que apresenta propriedades lesivas diretas ao endotélio
vascular, ação vasoconstritora e antinatriurética, e o aumento da resistência vascular periférica, um ponto crucial no desenvolvimento de fenômenos hipertensivos (KISHI et al. 2004; ZIMMERMAN e ZUCKER, 2009).
Entretanto, postula-se que o organismo seja dotado de diversos mecanismos de defesa contra estas espécies, reativas ou não, composto por
enzimas como a catalase, a superóxido dismutase (SOD), que desagrega o O2-,
diminuindo sua atividade, e a NOS endotelial, peptídeos mais específicos, vitaminas, entre outros. De maneira simplória, pode-se dizer que estas moléculas antioxidantes seriam doadoras de elétrons, porém que ainda assim permaneceriam quimicamente estáveis, levando a inativação ou a atenuação da atividade de radicais livres, prevenindo o dano tissular e molecular (CARDOSO et al. 2006; ZIMMERMAN e ZUCKER, 2009).
padrões de resposta desencadeada por manipulações destas áreas e o estresse oxidativo ainda é insipiente. Menos explorada ainda é a participação destas espécies na integridade do barorreflexo arterial (ZIMMERMAN e ZUCKER 2009).
Evidências apontam para níveis também elevados destas espécies radicalares em tecido nervoso cerebral de animais hipertensos, o que poderia demonstrar a participação destas espécies na manutenção de um estado de hiperativação da atividade simpática ou em um desbalanço autonômico generalizado, ou ainda a manipulação de neurotransmissores e canais iônicos neuronais (ZIMMERMAN et al. 2007; ZIMMERMAN e ZUCKER 2009).
1.3 EFEITOS DA EXPOSIÇÃO A AGENTES POLUENTES SOBRE
O SISTEMA CARDIOVASCULAR
Estudos prévios indicaram a relação existente entre a poluição ambiental e o aumento da morbidade e mortalidade cardiovascular (BRAGA et al. 2001;
DOCKERY et al. 2001; GOLDBERG et al. 2001; SCHWARTZ, 2001; MANN et
al. 2002; LIN et al. 2003). Devido ao fato de finas partículas atingirem o território alveolar, esses componentes podem entrar na circulação e influenciar importantes parâmetros circulatórios que são fatores de risco para eventos cardiovasculares adversos (SCHWARTZ, 2001).
Stone e Godleski (1999) sugeriram que as partículas oriundas do meio ambiente podem entrar no sistema sangüíneo e afetar o coração, ocasionando o início de arritmias e mortes súbitas em indivíduos susceptíveis. Mais recentemente tem sido observado que partículas ultrafinas inaladas podem ser detectadas no sistema circulatório em cerca de 1 minuto de exposição, aonde pode persistir durante horas, prejudicando outros sistemas (NEMMAR et al. 2002). Elevações da viscosidade plasmática e alterações em parâmetros sangüíneos como níveis de fibrinogênio ou de eritrócitos podem ser observados após exposição a algum agente poluente (BASKURT et al. 1990; GARDNER et al. 2000; KODAVANTI et al. 2002; SEATON et al. 1999).
Os efeitos cardiovasculares de partículas ambientais não são necessariamente mediados somente por inflamação sistêmica. É plausível que
o início da inflamação pulmonar por partículas (KODAVANTIet al. 1998, 2002;
SALDIVA et al. 2002; SCHINS et al. 2004) possa gerar reflexos que afetem a
função cardiovascular. Diversos efeitos cardiovasculares têm sido documentados como respostas à exposição de partículas, incluindo ruptura da
atividade nervosa autonômica (MAGARI et al. 2002; TARKIAINENet al. 2003),
Portanto, diferentes mecanismos, dependentes de inflamação sistêmica ou regulados por reflexos locais, podem participar na patogênese de anormalidades cardiovasculares associadas à inalação de partículas.
Existem evidências de que partículas inaladas aumentam a geração de radicais livres tanto no pulmão como no sistema cardiocirculatório
(GURGUEIRA et al. 2002; GONZÁLEZ-FLECHA, 2004; TAO et al. 2003). A
produção de radicais livres no território cardiovascular pode ser induzida por diversos eventos como inflamação (ICHIMURA et al. 2003; TOUYZ e
SCHIFFRIN, 2004), alterações no controle autônomo (CAMPESE et al. 2004),
1.4 EXPOSIÇÃO AO CIGARRO E MODULAÇÃO DO SISTEMA
CARDIOVASCULAR
Dentre os componentes considerados como agentes poluentes, pode-se incluir a fumaça produzida pelo cigarro (GERHARDT et al. 1999). A fumaça do cigarro liberada no meio ambiente é constituída por dois componentes: fumaça central ou principal e fumaça periférica ou lateral. A fumaça central é gerada quando o fumante traga o cigarro, é produzida em altas temperaturas (acima de 950ºC) e polui o ambiente após ter sido aspirada através do cigarro, entrado em contato com os pulmões e, em seguida, exalada (WEISS et al. 1983; SCHERER et al. 1990).
Constitui a fonte predominante de exposição dos indivíduos fumantes ativos. A fumaça periférica é produzida em temperaturas mais baixas (cerca de 350ºC), durante a queima lenta do cigarro que ocorre entre as tragadas. Oitenta e cinco por cento da fumaça de cigarro presente no ambiente é resultante da fumaça periférica produzida a partir da queima espontânea da extremidade do cigarro. Este componente difere da fumaça central inalada pelo tabagista ativo pelo fato de não ser filtrado, e a despeito de diferenças quantitativas, a composição química da fumaça lateral é similar à da fumaça principal (WEISS
et al. 1983;LAW et al. 1996; SOPORI et al. 1998).
A fumaça periférica é a fonte de exposição de todos aqueles que inalam a fumaça presente no meio ambiente, os chamados fumantes passivos. Os fumantes passivos podem absorver até um sexto da quantidade de fumaça absorvida por um fumante ativo (Centro Latinoamericano de Perinatología y Desarrollo Humano, 1987). Mesmo que o risco para fumantes passivos seja menor do que para fumantes ativos, a proporção de pessoas fumantes passivas é muito maior (CHEN et al. 1995).
1979). Além disso, a estimulação da liberação de noradrenalina e adrenalina no sistema nervoso simpático através da nicotina ou outros produtos também são observados (CRYER et al. 1976; TRAP-JENSEN et al. 1979).
Em vista disso, a estimulação generalizada dos receptores adrenérgicos periféricos podem se tornar responsáveis pelos efeitos agudos cardiovasculares do cigarro. Alguns estudos determinaram o barorreflexo em laboratórios sob
condições artificiais (ECKBERG et al. 1975; MANCIA et al. 1983;SMYTH et al.
1969) e sugeriram que os efeitos cardiovasculares do cigarro se associam a comprometimentos do reflexo baroceptor (NARKIEWICZ, 2001).
Estudos de Joad et al. (2006) indicam que o NTS se encontra comprometido quanto à sua função de modulação do sistema respiratório perante a exposição à fumaça de cigarro. Isso se deve, grande parte, ao aumento da reatividade dos neurônios sensoriais periféricos e nos neurônios presentes no NTS. Entretanto, o que ainda não foi relatado é se existe algum prejuízo nos centros bulbares moduladores do sistema cardiovascular perante aos efeitos da exposição passiva ao cigarro.
Com base nos dados apresentados acima, pode-se levantar a hipótese de que a exposição à fumaça lateral de cigarro aumenta o estresse oxidativo no SNC e, consequentemente, influencia a regulação neural do sistema cardiovascular. Pode-se postular também a existência de diferentes respostas dessas variáveis entre ratos de linhagem normotensa e hipertensa.
Tendo em vista os dados apresentados, nossa hipótese é a de que o
aumento do H2O2 endógeno no 4º V, causado pela inibição central da catalase
2 OBJETIVO
2.1 GERAL
Caracterizar os efeitos da inibição da catalase central sobre parâmetros cardiovasculares em ratos normotensos e hipertensos expostos à fumaça lateral de cigarro.
2.2 ESPECÍFICO
- Verificar o comportamento da pressão arterial média, pressão arterial pusátil e
freqüência cardíaca sobre influência da inibição de catalase no quarto ventrículo
cerebral em ratos Wistar, Wistar Kyoto e ratos espontaneamente hipertensos expostos à fumaça lateral de cigarro;
3 MÉTODO
3.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados ratos Wistar, Wistar Kyoto (WKY) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) machos de idade situada entre 16 e 18 semanas de idade, obtidos do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para a Medicina e Biologia (CEDEME) e mantidos no Biotério
Central da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina –
(UNIFESP/EM). A temperatura foi monitorada em torno de 22ºC, umidade de aproximadamente 60% e o ciclo claro-escuro também foi controlado e estabelecido como sendo 12 horas cada. Os animais tiveram livre acesso à alimentação e à água. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa da UNIFESP (Protocolo 0255/10).
3.2 EXPOSIÇÃO À FUMAÇA LATERAL DE CIGARRO
Foi utilizado o método proposto por Paiva et al. (2003) e adaptado para expor os animais à fumaça de cigarro em incubadora modificada. Os ratos
foram colocados em câmara transparente, com dimensões de 95x80x65 cm3,
marca comercial com a seguinte composição: 0,8 mg de nicotina, 7 mg de alcatrão e 8 mg de monóxido de carbono.
3.3 REGISTRO DE PARÂMETROS CARDIOVASCULARES EM
RATOS CONSCIENTES
As cânulas para registro da PA e FC foram inseridas na artéria aorta abdominal, através da artéria femoral direita. Antes de serem implantadas, as cânulas foram preenchidas com solução estéril constituída por NaCl (0,9%) + heparina (50U/nL) + penicilina G (2000U/mL). Tubos de polietileno foram utilizados (PE-50) conectados a um outro tubo de polietileno de menor diâmetro (PE-10), conforme apresentado na Figura 2.
Os animais permaneceram cerca de 20 minutos para se adaptarem às condições de luz e som doa ambiente. A cânula foi conectada a um transdutor de pressão Stathan P23 Db, o qual estava acoplado ao registrador Grass (Grass model) de 8 canais ou a um sistema de aquisição de dados (Biopac Systems Inc, EUA). A PAM e a FC foram registradas simultaneamente. No registrador Grass e no sistema de aquisição de dados, a FC foi obtida pelo cardiotacômetro, a partir dos sinais gerados pela pressão arterial pulsátil (PAP), ao passo que a PAM foi calculada a partir do registro da pressão arterial pulsátil de acordo com a fórmula abaixo (SATO et al. 2001):
PAM = PAdiastólica + 1/3 (PAsistólica – PA diastólica).
3.4 ESTIMULAÇÃO DAS RESPOSTAS BARORREFLEXAS
Todos os animais tiveram uma cânula de polietileno (PE-50) inserida na veia femoral durante a mesma cirurgia para implante das cânulas arteriais, sob anestesia quetamina intraperitoneal (50mg/kg) e xilazina intramuscular (50mg/kg). A cânula venosa também foi preenchida com solução estéril de NaCl 0,9% + heparina (50U/mL) + penicilina G (2000U/mL). Similarmente ao procedimento realizado para a cânula arterial.
Aproximadamente 24 horas após a cirurgia de canulação de artéria e veia femorais os testes de barorreflexo foram realizados. Utilizou-se intravenosamente uma dose pressora de fenilefrina (PE-8µg/kg, bolus) e uma
dose depressora de nitroprussiato de sódio (NPNa-50g/kg, bolus). Foi realizado
O barorreflexo foi analisado batimento a batimento para uma dada curva de aumento de pressão de perfusão, sendo ganho do barorreflexo calculado como a derivada da variação de freqüência cardíaca em função da variação da
pressão perfusão (ΔFC/ΔPAM) (ABDALA et al. 2003). O ganho parassimpático
do barorreflexo corresponde às respostas bradicárdicas, enquanto o ganho simpático do barorreflexo representa as respostas taquicárdicas (VALENTI et al. 2010).
3.5 IMPLANTE CENTRAL
Cinco dias antes do experimento, os ratos foram anestesiados com quetamina (50 mg/kg i.p.) e xilazina (50 mg/kg i.m.) e colocados num aparelho esterotáxico. A anti-sepsia no campo cirúrgico foi feita utilizando-se polivinil-pirrolidona. Foi realizada a exposição da superfície craniana para visualização das suturas (bregma e lâmbda). A cabeça do animal foi horizontalizada com base nos parâmetros dorso-ventrais do bregma e lâmbda que deveriam ser coincidentes. Em seguida, foram afixados parafusos no crânio do animal. Uma cânula-guia de aço inoxidável medindo 15 mm foi posicionada em direção ao 4ºV. Ao final da cirurgia, foi administrado 0,2 mL de antibiótico (Pentabiótico
Veterinário – Fort Dodge 2000 U/mL, i.m.) como medida profilática.
3.6 INJEÇÕES NO QUARTO VENTRÍCULO CEREBRAL
As injeções intracerebroventriculares de drogas foram feitas com o auxílio de uma agulha injetora, em média, 2mm maior que o comprimento da cânula-guia implantada em direção ao 4ºV. A agulha injetora foi acoplada a um tubo de polietileno (PE-10), que por sua vez, estava ligada a uma seringa Hamilton de
As coordenadas estereotáxicas utilizadas pra as injeções foram obtidas e modificadas a partir do atlas de Paxinos & Watson (1986):
QUARTO VENTRÍCULO CEREBRAL:
- Ântero-Posterior: ~13,3 mm caudal ao bregma.
- Médio-Lateral: 0 mm lateral à linha média.
- Dorso-Ventral: 6-6,7 mm ventral à superfície craniana.
3.7 HISTOLOGIA
Ao final de cada experimento o 4ºV foi marcado pela injeção, ao mesmo volume das drogas utilizadas, de uma solução a 2% de azul de Evans. Os animais foram sacrificados por uma overdose de tiopental sódico (25 mg/rato) e perfundidos via transcardíaca com salina (100mL) seguido por aproximadamente 300 a 400 mL de formolaldeído (10%). Posteriormente, o encéfalo foi retirado e mantido no mesmo fixador por 24 horas e em seguida transferido para uma solução de sacarose 20% por 24 horas e 48 horas.
As áreas de injeções foram selecionadas em cortes coronais de 50 μm de
3.8 DROGAS UTILIZADAS
3.8.1 Anestésicos
- Ketamina: 50mg/kg;
- Xilazina: 50mg/kg;
3.8.2 Injeções endovenosas
- Solução fisiológica: NaCl 0,9 %;
- Fenilefrina (PE):8µg/kg
- Nitroprussiato de sódio (NPNa): 50µg/kg;
- Heparina: 50U/nL.
3.8.3 Injeção central
3.9 Protocolo experimental
O barorreflexo foi testado antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de
3-amino-1,2,4-triazole (ATZ, 0,1g/μL) no 4ºV (Tabela 1) de ratos Wistar, WKY e
SHR. Em outros grupos o baroreflexo foi testado somente aos 15 minutos e em ratos do grupo controle foram separados para realizar o protocolo 1 com
administração de salina isotônica no lugar de ATZ (Tabela 1). Objetivo
específico: verificar PAM, FC e barorreflexo após leve aumento central do
H2O2 endógeno.
Tabela 1: Protocolos experimentais. BR: Teste de barorreflexo.
Protocolo -10 min 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min
1 BR ATZ (4º V) BR BR BR BR
2 BR ATZ (4º V) - BR - -
3 BR Salina 0,9% BR BR BR BR
3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
4. RESULTADOS
4.1 COMPARAÇÃO DO BARORREFLEXO ENTRE RATOS
WISTAR EXPOSTOS À FUMAÇA LATERAL DE CIGARRO E
CONTROLE
A tabela 2 apresenta os valores basais de pressão arterial média e
frequência cardíaca, picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático e parassimpático do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro e grupo controle.
Na figura 3 é observado o aumento da pressão arterial média e queda reflexa da freqüência cardíaca ativados por fenilefrina em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro e grupo controle.
Tabela 2: Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar
expostos à fumaça lateral de cigarro (F – N=15) e controle (C – N=18).
PAM: Pressão arterial média; FC: Frequência cardíaca; GBP: Ganho parassimático do barorreflexo; GBP: Ganho parassimpático do barorreflexo.
Variável C F p value
PAM (mmHg) 108,3+2 108+2 0,8282
FC (bpm) 326,6+9 320+8 0,5981
Pico Bradicárdico (bpm) 229+12 226+9 0,8317
Pico Taquicárdico (bpm) 464,7+11 490+7 0,0689
Variação dos picos (bpm) 240,5+13 259+6 0,2484
GBP (bpm x mmHg-1) -1,71+0,09 -1,92+0,16 0,2617
Δ
P
AM
(mmHg
)
Grupos
Δ
FC
(bpm
)
Grupos
Controle SSCS
Grupos
Controle SSCS Controle SSCS
Figura 3: (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda
reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg
i.v.) em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (SSCS – N=15) e
grupo controle (Controle – N=18).
A
Δ
P
AM
(mmHg
)
Δ
FC
(
bpm
)
Group
Grupos
Controle
SSCS
Controle
SSCS
Grupos
Figura 4: (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento
reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio
(NPNa, 50g/kg i.v.) em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro
(SSCS – N=15) e controle (Controle – N=18).
4.2 RESULTADOS HISTOLÓGICOS
Conforme a figura 5, é observado um esquema de corte coronal ~13.3 mm caudal ao bregma em um rato positivo. Trata-se de uma fotomicrografia de um animal representativo do grupo experimental onde pode ser visto o trajeto da cânula injetora na altura em que irrompe o limite superior do 4º V, tratando-se de um animal positivo, que foi considerado para análise, haja vista que a droga atingiu o 4ºV. Já com base na figura 6, pode-se notar um esquema de um rato negativo, em que o implante central não atingiu a região do 4º V, portanto, foi descartado da análise dos dados.
Figura 5: Representação esquemática encefálica de um rato positivo,
4.3
ANÁLISE
DO
BARORREFLEXO
E
VARIÁVEIS
HEMODINÂMICAS EM RATOS WISTAR EXPOSTOS À FUMAÇA
LATERAL DE CIGARRO E CONTROLE, 5, 15, 30 E 60 MINUTOS
APÓS INIBIÇÃO DE CATALASE NO 4ºV
A tabela 3 apresenta os valores basais de pressão arterial média (PAM) e
frequência cardíaca, picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático e parassimpático do barorreflexo em ratos Wistar do grupo controle.
Na figura 7 é observado o aumento da pressão arterial média e queda reflexa da freqüência cardíaca ativados por fenilefrina antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar do grupo controle.
Tabela 3: Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar do grupo controle.
PAM: Pressão arterial média; FC: Frequência cardíaca; GBS: Ganho simpático do barorreflexo; GBP: Ganho parassimpático do barorreflexo. *p<0,05: Diferente do controle (0 minutos) (N=8).
Variável 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min
PAM (mmHg) 113,9+3 119+4 118+2 110,4+3 111,5+3
FC (bpm) 308,2+16 393,9+35* 381+26 327,4+14 307+12
Pico
bradicárdico (bpm)
197,5+20 288,1+36 269,4+21 237,6+20 212+18
Pico
taquicárdico (bpm)
445,4+18 474,7+22 467+15 447,1+14 450,7+13
Variação dos picos (bpm)
243+19 186,6+19 197,6+15 220,6+13 239+13
GBP (bpm x
mmHg-1)
-1,84+0,2 -1,17+0,67 -2,9+0,67 -2,38+0,7 -1,8+0,3
GBS (bpm x
mmHg-1)
∆P
AM (
mmHg
)
Tempo (minutos)
Tempo (minutos)
∆F
C (
bpm
)
Figura 7: (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda
reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar do grupo controle (N=8).
A
Tempo (minutos)
∆P
AM (
mmHg
)
∆F
C (
bpm
)
Tempo (minutos)
Figura 8: (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e aumento
reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio
(NPNa, 50g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no
4ºV de ratos Wistar do grupo controle (N=8). A
A tabela 4 apresenta os valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca, picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático e parassimpático do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro.
Na figura 9 é observado o aumento da pressão arterial média e queda reflexa da freqüência cardíaca ativados por fenilefrina antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro.
Tabela 4: Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro.
PAM: Pressão arterial média; FC: Frequência cardíaca; GBP: Ganho parassimpático do barorreflexo; GBS: Ganho simpático do barorreflexo. *p<0,05: Diferente do controle (0 minutos) (N=7).
Variável 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min
PAM (mmHg)
109,1+2 114,3+3 112,9+3 109+2 108,5+2
FC (bpm) 328,6+11 418,6+25* 420,4+22* 387+16 346+6
Pico
bradicárdico (bpm)
230+16 322+32* 306,3+13* 265,6+7 253+8
Pico
taquicárdico (bpm)
498,1+10 519,7+11 516+11 516+9 477,6+6
Variação dos picos (bpm)
260,8+13 197,7+27 210+10,4 250,4+4 224,6+13
GBP (bpm x
mmHg-1)
-2,17+0,22 -2,24+0,57 -3,07+0,85 -2,6+0,4 -1,7+0,2
GBS (bpm x
mmHg-1)
∆P
AM (
mmHg
)
∆F
C (
bpm
)
Tempo (minutos) Tempo (minutos)
Figura 9: (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda
reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (N=7).
∆F
C (
bpm
)
Tempo (minutos)
∆P
AM (
mmHg
)
Tempo (minutos)
Figura 10: (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento
reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio
(NPNa, 50g/kg i.v.) antes, 5, 15, 30 e 60 minutos após a injeção de ATZ no
4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (N=7). B
4.4
ANÁLISE
DO
BARORREFLEXO
E
VARIÁVEIS
HEMODINÂMICAS EM RATOS WISTAR EXPOSTOS À FUMAÇA
LATERAL DE CIGARRO E CONTROLE 15 MINUTOS APÓS
INIBIÇÃO DE CATALASE NO 4ºV
A tabela 5 apresenta os valores basais de pressão arterial média (PAM) e
frequência cardíaca, picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático e parassimpático do barorreflexo em ratos Wistar do grupo controle.
Na figura 11 é observado o aumento da pressão arterial média e queda reflexa da freqüência cardíaca ativados por fenilefrina antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar do grupo controle.
Tabela 5: Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar do grupo controle.
PAM: Pressão arterial média; FC: Frequência cardíaca; GBP: Ganho parassimpático do barorreflexo; GBS: Ganho simpático do barorreflexo.
*p<0,05: Diferente do controle (0 minutos); $p<0.005: Diferente do controle (0
minutos); #p<0.0001: Diferente do controle (0 minutos) (N=8).
Variável 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min
PAM (mmHg) 113,1+1 123,5+1* 122+1* 124,2+1* 118,7+2
FC (bpm) 354,4+9 433,7+13* 437,2+15* 386.37+17 347,7+11
Pico
bradicárdico (bpm)
184+2 - 294+10# - -
Pico
taquicárdico (bpm)
487,5+3 - 519,1+7$ - -
Variação dos picos (bpm)
303,5+4 - 225,1+8# - -
GBP (bpm x
mmHg-1)
-2,58+0,13 - -2,8+0,16 - -
GBS (bpm x
mmHg-1)
∆P
AM (
mmHg
)
∆F
C (
bpm
)
Tempo (minutos)
*
Tempo (minutos)
Figura 11: (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda
reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar do grupo controle (N=8). *p<0.0001: Diferente do controle (0 minutos).
∆P
AM (
mmHg
)
∆F
C (
bpm
)
Tempo (minutos)
*
Tempo (minutos)
Figura 12: (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento
reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio
(NPNa, 50g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos
Wistar do grupo controle (N=8). *p<0.001: Diferente do controle (0 minutos). B
A tabela 6 apresenta os valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca, picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático e parassimpático do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro.
Na figura 13 é observado o aumento da pressão arterial média e queda reflexa da freqüência cardíaca ativados por fenilefrina antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro.
Tabela 6: Valores basais de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC), picos bradicárdico e taquicárdico, diferença entre os picos e ganho simpático (GBS) e parassimpático (GBP) do barorreflexo em ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro.
PAM: Pressão arterial média; FC: Frequência cardíaca; GBP: Ganho parassimpático do barorreflexo; GBS: Ganho simpático do barorreflexo.
*p<0,001: Diferente do controle (0 minutos); #p<0,05: Diferente do controle (0
minutos) (N=8).
Variável 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min
PAM (mmHg) 107,1+3 118,4+3* 115+2 106,7+2 104,5+2
FC (bpm) 312,2+11,3 403,1+9* 379,4+9* 362,2+22 314,1+1
Pico
bradicárdico (bpm)
222,5+9 - 257,5+1# - -
Pico
taquicárdico (bpm)
483,1+8 - 500,4+6 - -
Variação dos
picos (bpm)
285+27 - 279,1+29 - -
GBP (bpm x
mmHg-1)
-1.645+0,19 - -1,72+0,18 - -
GBS (bpm x
mmHg-1)
∆P
AM (
mmHg
)
Tempo (minutos)
∆F
C (
bpm
)
*
Tempo (minutos)
Figura 13: (A) Aumento da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) queda
reflexa da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por fenilefrina (PHE, 8g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (N=8).*p<0,05: Diferente do controle (0 minuto).
∆F
C(
bpm
)
Tempo (minutos)
∆P
AM (
mmHg
)
Tempo (minutos)
Figura 14: (A) Queda da pressão arterial média (∆MAP, mmHg) e (B) aumento
reflexo da freqüência cardíaca (∆FC, bpm) ativados por nitroprussiato de sódio
(NPNa, 50g/kg i.v.) antes e 15 minutos após a injeção de ATZ no 4ºV de ratos
Wistar expostos à fumaça lateral de cigarro (N=8). B