FELIPE PEREIRA VIANNA
EFICIÊNCIA DOS TESTES DE
TERMORESISTÊNCIA (LENTO E RÁPIDO) EM
RELAÇÃO A FERTILIDADE DE SÊMEN
CONGELADO NA ESPÉCIE BOVINA
Botucatu – SP
FELIPE PEREIRA VIANNA
EFICIÊNCIA DOS TESTES DE
TERMORESISTÊNCIA (LENTO E RÁPIDO) EM
RELAÇÃO A FERTILIDADE DE SÊMEN
CONGELADO NA ESPÉCIE BOVINA
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista – UNESP,
Campus de Botucatu para a obtenção do
título de Mestre em Medicina Veterinária.
Área de concentração em Reprodução
Animal.
Orientador: Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa
Botucatu – SP
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Vianna, Felipe Pereira.
Eficiência dos testes de termoresistência (lento e rápido) em relação a fertilidade de sêmen congelado na espécie bovina). – Botucatu : [s.n.], 2004.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, 2004.
Orientador: Prof. Titular Frederico Ozanam Papa. Assunto CAPES: 50504002
1. Reprodução animal.
CDD 636.0824
DEDICO...
A DEUS .
Que, sem a sua ajuda e presença nos momentos difíceis, esse trabalho não se concretizaria.
Aos meus pais.
José Cláudio Alves Vianna e Maria do Carmo Pereira Vianna.
Pessoas que se sacrificaram e renunciaram alguns de seus interesses
em função dos meus.
Seres humanos de imenso caráter e coração, aos quais, devo minha
criação, moldada em valores concretos da vida.
Que acreditaram sempre no meu potencial e me deram forças para que
alcançasse os meus objetivos.
As minhas irmãs e minha sobrinha
As quais me deram muito carinho e tiveram compreensão em todos
momentos da minha vida, sendo estes felizes ou tristes.
Aos meus amigos
Rubão, Pituca, Thiago, Betão, Gala, Mazzaia, Senhor, Abe, Nazo, GÔ,
Mi, Déia e outros, os quais, me refiro por apelido em função da grande
amizade que nos une. Agradeço pela compreensão, paciência e apoio
Ao meu amigo Prof. Titular Frederico Ozanam Papa, profissional de
grande competência. Pessoa de imenso caráter que me estendeu a
mão no momento em que precisei e depositou toda sua confiança
durante a execução deste trabalho.
A Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Unesp – Botucatu
pela oportunidade e ensinamentos.
Ao meu amigo Márcio Theoro do Carmo, pelo apoio e as conversas nos
momentos difíceis durante a pós-graduação.
Ao meu amigo José Antonio Dell’ Aqua Jr., pela grande contribuição
prestada para execução deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo pela orientação e sugestões durante a
pós-graduação.
Ao Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes pela amizade e conselhos desde os
tempos da residência.
Aos amigos de pós-graduação Vítor, Danilas, Antônio, Luciana, Karen,
Aos Professores João Carlos Pinheiro Ferreira, Maria Denise Lopes,
Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga, Marco Antônio Alvarenga,
Cezinande de Meira pelas aulas ministradas e dúvidas solucionadas
durante o curso de mestrado
Ao Prof. Paulo Curi, pessoa extremamente competente e prestativa,
que me ajudou na análise estatística do experimento.
Aos Funcionários do Departamento de Reprodução, Valter, Edílson,
Marquinho pelas ajudas durante o trabalho e momentos de
descontração.
As funcionárias da pós-graduação, Denise e Maria, pela paciência e
ajuda durante o curso de mestrado.
A Clínica Veterinária Santa Clara, representada, pelo seu proprietário,
Jairo Frare, pelo aprendizado nos primeiros passos de minha vida
profissional e pelo fornecimento do material utilizado no trabalho.
A Agropecuária Jacarezinho Ltda, na pessoa do Médico Veterinário,
Luís Fernando C. Boveda, grande amigo e fundamental para o
desenvolvimento deste projeto.
“Ninguém ignora tudo, ninguém sabe tudo.
Por isso, aprendemos sempre”
µg micrograma
µL microlitro
µm/s micrômetro por segundo
µm micrômetro
µmsq micrômetro quadrado
ASBIA Associação Brasileira de Inseminação Artificial
CASA Computer Analise Sperm Automated
CFDA diacetato de carboxifluoresceína
cm centímetro
d diferença média
DLC deslocamento lateral de cabeça
DMSO dimetisulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
FBF freqüência de batimentos flagelares
FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
g grama
h hora
HTMA Hamilton Thorne Research
Hz hertz
IR índice retilíneo
mg miligrama
mL mililitro
p nível de significância
PIB Produto Interno Bruto
PI iodeto de propídeo
PNA corante fluorescente Peanut aglutinina
qsp quantidade de suficiente para
sd desvio padrão médio
sptz espermatozóide
Tris hidroximetilaminometano
TTRR teste de termoresistência rápido
TTRL teste de termoresistência lento
UNESP Universidade Estadual Paulista
VAP velocidade espermática ao longo de uma trajetória média
VCL velocidade espermática ao longo de uma trajetória real
VSL velocidade espermática considerando-se uma trajetória
% porcentagem
ºC graus Celsius
< menor que
> maior que
≥ maior ou igual
≤ menor ou igual
= igual
x vezes
106 milhões
- menos
x2 Qui-quadrado
Tabela.1. Ajuste do HTMA – IVOS – 10 para a realização das análises...47
Tabela.2. Valores percentuais da Motilidade espermática avaliada de forma
computadorizada e convencional para as seguintes variáveis: motilidade total
pós-descongelação (Descong), motilidade total pós-teste de termoresistência rápido
(TTRR) e motilidade total pós-teste de termoresistência lento
(TTRL)...55
Tabela.3. Avaliações computadorizadas da motilidade espermática; motilidade
total (Mot. T) e motilidade progressiva (Mot. P); e integridade de membrana
plasmática espermática pela técnica do Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína
(PI/CFDA) no sêmen bovino após os testes de termoresistência rápido (TTRR) e
lento
(TTRL)...57
Tabela.4. Avaliações convencionais da motilidade espermática; motilidade total
(Mot. C) e Vigor; e integridade de membrana plasmática espermática pela técnica
do Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após os
convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino após teste de
termoresistência rápido (TTRR 46ºC/30min)...61
Tabela.6. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial
(IA), agrupada de acordo com o escore de Motilidade computadorizada e
convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino após teste de
termoresistência lento (TTRL 38ºC/5 h)...61
Tabela.7. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial
(IA), agrupada de acordo com o escore de Motilidade computadorizada e
convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino para comparar a eficiência
do teste de termoresistência rápido (TTRR 46ºC/30min) com o teste de
termoresistência lento (TTRL 38ºC/5 h)...62
Tabela.8. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação Artificial
(IA), agrupada de acordo com o escore de Motilidade Total computadorizada e
convencional (Mot. T/C) do sêmen congelado bovino após a
avaliada pela técnica com Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no
sêmen bovino após a descongelação...63
Tabela.10. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação
Artificial (IA), agrupada de acordo com o número de espermatozóides com
motilidade progressiva (Nº Spz/Mot.P) no sêmen bovino após a
descongelação...63
Tabela.11. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação
Artificial (IA), agrupada de acordo com o número de espermatozóides viáveis
avaliados pelo índice de integridade de membrana plasmática (Nº
Sptz/Viáveis/PI/CFDA) pela técnica do Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína
(PI/CFDA) no sêmen bovino após a descongelação...64
Tabela.12. Percentual de prenhez em vacas Nelore após a 1ª Inseminação
Artificial (IA), agrupada de acordo com escore de Motilidade Total
computadorizada (Mot. T) e o índice de integridade de membrana plasmática
(Integridade de Membrana PI/CFDA) avaliados pela técnica de fluorescência com
Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a
computadorizada (Mot. T) e o número de espermatozóides com a membrana
plasmática íntegra (Nº Sptz/Viáveis/PI/CFDA) avaliados pela técnica fluorescência
com Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a
descongelação...65
Tabela.14. Correlação entre a Motilidade Total computadorizada
descongelação (Mot. T), teste de termoresistência rápido (Mot. TTRR),
pós-teste de termoresistência lento (Mot. TTRL); índice de integridade de membrana
pós-descongelação avaliada pela técnica de fluorescência com Iodeto de
propídio/Carboxifluoresceína(PI/CFDA); número de espermatozóide com
motilidade progressiva (CASA) e o número de espermatozóides com a membrana
plasmática íntegra (Nº Sptz/Viáveis/PI/CFDA) avaliados pela técnica fluorescência
com Iodeto de Propídio/Carboxifluoresceína (PI/CFDA) no sêmen bovino após a
Com objetivo de correlacionar e associar a eficiência do teste de termoresistência
(rápido e lento) de sêmen congelado na espécie bovina com a fertilidade a campo
após a Inseminação Artificial foram utilizados 64 ejaculados de 39 touros da raça
Nelore com idades entre 2 e 10 anos pertencentes a central de inseminação
artificial Jacarezinho Genetics. Após as colheitas as amostras de sêmen foram
avaliadas macro e microscopicamente quanto ao volume, aspecto,
turbilhonamento, motilidade total, vigor, concentração e patologia espermática.
Posteriormente os ejaculados foram congelados com diluente (TRIS) a uma altura
de 3 cm do nitrogênio líquido (-140ºC) em um tanque de congelação durante 15
minutos. Para análise das partidas congeladas foram utilizados os parâmetros de
motilidade total subjetiva, vigor, análise computadorizada do movimento
espermático (HTMA – IVOS 10), análise de fluorescência para avaliar a
integridade de membrana pós-descongelação, após as provas rápidas (46ºC/30`)
e lenta (38ºC/5h) de termoresistência. Os valores de motilidade total após as
provas de termoresistência foram subdivididos em 4 grupos (0= 0% de motilidade,
1= 1-20% de motilidade, 2= 21-40% de motilidade e 3= > 40% de motilidade).
O teste de fertilidade foi realizado através da inseminação artificial de 3161
fêmeas da raça Nelore, com idade entre 2 e 16 anos em uma mesma propriedade,
sendo a fertilidade avaliada através do índice de prenhez a 1ª inseminação
significativas quando p< 0,05 e nos casos em que 0,05 < p < 0,10 foi referida a
tendência a significância, onde p é a probabilidade de erroneamente concluir pela
significância.
Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre as categorias
de motilidade total após testes de termoresistência (rápido e lento) influenciando
nas taxas de prenhez (72,8% para o grupo 0 e 70,14% para o grupo 3) a 1ª
inseminação artificial. Houve uma tendência a significância para motilidade total e
a taxa de prenhez (63,44% para motilidade total < 40% e 68,88% para motilidade
entre 70-80%). Para o parâmetro de integridade de membrana e a fertilidade não
foi observado relação. A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que as
provas de termoresistência não têm relação direta com a fertilidade e que talvez
mais importante do que muita prova laboratorial, seja a experiência do técnico que
trabalhando rotineiramente na congelação de sêmen de touros e conhecendo as
características seminais e a fertilidade de determinados animais, possa contorna
situações antagônicas entre os valores de provas laboratoriais e a fertilidade,
utilizando estratégias para compensar determinados problemas seminais e
With the aim of correlating the efficiency of the thermoresistance test (fast and slow) of the frozen sperm in the bovine species with the fertility 64 were used ejaculated of 39 bulls of the race Nelore with age between 2 and 10 years belonging to a Headquarter of Artificial Insemination. After the crops the sperm samples were appraised macro and microscopical as for the volume, aspect, turbine, total motility, energy, concentration and spermatic pathology.Later the ejaculated were frozen in diluent (TRIS) to a height of 3 cm of the liquid nitrogen (-140º C) in a freezing tank for 15 minutes. For analysis of the frozen departures the parameters of subjective total motility, energy, computerized analysis of the spermatic movement (HTMA – IVOS 10) were used. Fluorescence test was also used to evaluate the integrity of the
membrane post-defrosting after the proofs fast (46°C/30’) and slow (38°C/5h) of
thermoresistance. The total motility values after the thermoresistance proofs they were subdivided into 4 categories denominated of adaptation (0=0% of motility, 1= 0-20% of motility, 2= 20-40% of motility and 3= >40% of motility).The fertility test was accomplished through the artificial insemination of 3161 females of the race Nelore, with age between 2 and 16 years in a same property and the fertility was appraised through the pregnancy index after the first artificial insemination. In order to verify the association between the occurrences of interest and the fertility it was used the proof
of Qui-square, with the calculation of statistics X2 and P. The statistics were
LISTA DE ABREVIATURAS... vi
LISTA DE SÍMBOLOS... viii
LISTA DE TABELA... ix
RESUMO... xii
ABSTRACT... xiv
1 INTRODUÇÃO... 18
2 OBJETIVO E HIPÓTESE... 21
3 REVISÃO DE LITERATURA... 22
3.1 Criopreservação dos Espermatozóides... 22
3.2 Integridade da Membrana Plasmática do Espermatozóide... 22
3.3 Motilidade Convencional e Computadorizada do Sêmen Congelado.... 29
3.4 Número de Espermatozóides Viáveis (membrana plasmática intacta) na Dose Inseminante... 32
3.5 Teste de Termoresistência para avaliação do sêmen congelado... 34
4 MATERIAL E MÉTODOS... 39
4.1 Local da Pesquisa... 39
4.2 Animais... 40
4.3 Avaliação Inicial do Sêmen a Fresco... 40
4.4 Congelação do Sêmen... 41
4.5 Avaliação do Sêmen Congelado... 44
4.6 Avaliação do Sêmen Congelado... 45
4.6.1 Avaliação do Movimento Espermático Pós-Descongelação... 45
4.6.4 Teste da Integridade de Membrana Pós-Teste de Termoresistência... 51
4.6.5 Cálculo do Número de Espermatozóides com Motilidade Progressiva e Integridade de Membrana Plasmática na Dose Inseminante... 51
4.6.6 Teste de Fertilidade... 51
4.6.7 Análise Estatística... 53
5 RESULTADOS... 54
5.1 Comparação entre Motilidade Computadorizada e Convencional... 54
6 DISCUSSÃO... 67
6.1 Relação entre a Motilidade Total e a Fertilidade... 67
6.2 Avaliação da Integridade da Membrana Plasmática... 69
6.3 Relação entre o Número de Espermatozóides com a Membrana Plasmática Íntegra, Motilidade Progressiva (CASA) e a Fertilidade... 71
6.4 Relação entre os Valores do Teste de Termoresistência e a Fertilidade 72 7 CONCLUSÃO... 75
1 INTRODUÇÃO
A pecuária é uma atividade de grande importância social e econômica no
Brasil. Os cenários tanto interno, quanto externo, apontam na direção do
fortalecimento da atividade, seja como produtora de alimento de alta qualidade, seja
como geradora de divisas. As vantagens do setor pecuário nacional são
caracterizadas pela competitividade econômica, pela produção de carne sob
condições de ambientes naturais, e pela tendência de demanda dos mercados mais
exigentes, cenário esse que coloca o Brasil em posição de destaque no plano
mundial.
Atualmente o setor agropecuário tem-se mostrado imprescindível para a
economia do país, contribuindo com uma grande parcela do PIB (produto interno
bruto) brasileiro. Em conjunto com o crescimento desse setor está a preocupação do
ser humano quanto ao seu destino. É nítido que a população mundial vem
crescendo em ritmo acelerado e como conseqüência há um aumento na demanda
por alimentos.
A procura por alimentos não está apenas sustentada pela quantidade,
mas também qualidade, pois são inúmeras as preocupações do homem em relação
à saúde. Há também o surgimento de novas economias e mercados mundiais, os
quais impulsionam essa demanda.
A atual tendência mundial por demanda de alimentos, com específicos
atributos de qualidade, como a sustentabilidade ambiental, segurança alimentar,
saúde humana e responsabilidade social, representa um dos requisitos
fundamentais para o credenciamento e inserção de agentes do agronegócio nesse
Em resposta a esses fatores, há necessidade de se buscar cada vez mais
um aumento na produção de carne, o qual vem sendo conseguido através da
melhoria genética dos rebanhos, conseqüência da utilização de diversas
biotecnologias (inseminação artificial, transferência de embriões e a fertilização in
vitro), desenvolvimento de programas de avaliação dos animais e disponibilidade de
alimentos.
Uma das biotecnologias mais utilizada é a inseminação artificial que
apresentou um crescimento considerável nos últimos anos subindo de 1.520,739
doses comercializadas em 1981 para 6.870.090 em 2000, ASBIA, (2003). As
Centrais de Inseminação Artificial reconhecem a responsabilidade na produção de
sêmen de alta qualidade e mantém um rigoroso controle em todas as etapas de
produção e industrialização do sêmen.
Apesar de uma série de trabalhos publicados (DIMITROPOULOS, 1967;
ARRUDA, 1988) mostrando uma relação positiva das características seminais,
mensuradas em laboratório e a fertilidade, está claro que ainda temos uma
deficiência em conhecer e predizer como será o comportamento e resultado final de
fertilidade de uma amostra in vitro. A origem do problema inclui repetibilidade de
nossos testes laboratoriais, nossa dificuldade ainda para mensurar fertilidade, assim
como, estabelecer que existem diferenças entre as amostras de sêmen. Um outro
aspecto do problema é a tendência de sempre simplificar a natureza biológica da
subfertilidade culpando o macho ou inseminador, muitas vezes assumindo que um
simples ou um conjunto de testes englobará a maioria dos fatores importantes para
a fertilidade (SAACKE et al., 2000)
Existe essa preocupação quanto à qualidade do sêmen produzido, mas
criopreservação imposto ao sêmen e correlacioná-lo com fertilidade, sendo ainda o
teste mais fidedigno a fertilidade a campo, que é demorada e onerosa. O processo
de criopreservação das células espermáticas resulta em uma diminuição da
fertilidade comparada com sêmen a fresco, em função da morte celular e dos danos
na capacidade funcional dos espermatozóides sobreviventes (GONZALEZ, 2004).
Diversas avaliações têm sido utilizadas, tais como: verificação da
motilidade total através do método subjetivo ou computadorizado (Hamilton Thorne
Research - HTMA); a padronização das concentrações das doses inseminantes e
das patologias espermáticas; utilização de fluorocromos para verificação da
integridade das membranas espermáticas e a capacidade funcional de algumas
organelas; testes de estresse térmico; fertilização in vitro e outros mais caros,
dispendiosos e de difícil aplicabilidade na rotina.
As provas de exaustão dos espermatozóides a diversas temperaturas
ainda são muito utilizadas para correlacionar a capacidade dos espermatozóides em
suportar longos períodos de tempo a uma determinada temperatura com a fertilidade
(DIMITROPOULOS, 1972; BARNABÉ, 1980; ARRUDA, 1988).
Mediante constatações de rotina e discussões que surgem em função da
aplicabilidade das provas de termoresistência, esse trabalho foi realizado para
avaliar a eficiência dos testes de termoresistência lento (TTRL, DIMITROPOULOS,
1967) e o teste de termoresistência rápido (TTRR, MIES FILHO, 1987) em relação a
fertilidade para o sêmen congelado bovino.
Os objetivos deste trabalho foram correlacionar e associar a eficiência dos
testes de termoresistência (rápido e lento), da motilidade total pós-descongelação,
do índice de integridade da membrana plasmática, do número de espermatozóides
com movimento progressivo e do número de espermatozóides viáveis avaliados pelo
índice de integridade de membrana plasmática de sêmen congelado na espécie
bovina com a fertilidade.
A primeira hipótese testada foi de que partidas de sêmen que não se
encontravam dentro dos padrões mínimos preconizados pelo teste de
termoresistência, teriam fertilidade semelhante às partidas que estavam dentro dos
padrões mínimos estabelecidos, pois acredita-se que o teste não reflita as mesmas
condições encontradas no trato genital da fêmea, apesar do sêmen se encontrar em
temperaturas semelhantes nos dois locais (útero e frasco).
Com relação a motilidade total pós-descongelação a hipótese foi de que
partidas de sêmen que apresentassem maiores índices de motilidade total,
proporcionariam uma melhor taxa de prenhez.
Melhores taxas de prenhez seriam verificadas em partidas de sêmen que
apresentassem maiores índices de integridade de membrana plasmática e um maior
número de espermatozóides viáveis avaliados pelo índice de espermatozóides com
membrana plasmática intacta.
Com relação ao número de espermatozóides com movimento progressivo
a hipótese testada foi de que partidas de sêmen que apresentassem um maior
número progressivo, proporcionariam maiores índices de prenhez.
3.1 Criopreservação dos Espermatozóides
Mies Filho (1987) relatou que as primeiras evidências sobre a ação do
frio na preservação dos espermatozóides foram verificadas por Ivanov, que observou
que as células espermáticas colhidas do epidídimo de um carneiro morto na neve
após várias horas, ainda mantinham-se vivas.
Spallanzani (1776) apud Mies Filho (1987), constatou o fato biológico de
anabiose (suspensão das funções vitais de forma reversível do organismo (vegetal
oy animal) por congelação ou ressecamento). Relatou que os espermatozóides
permaneciam imóveis temporariamente induzindo-se a um estado de letargia do qual
poder-se-iam recuperar quando expostos a temperaturas mais elevadas.
O sucesso da criopreservação do sêmen de mamíferos foi atribuído em
grande parte a Polge, (1949) apud Zavós & Correa, (1995), que observou que o
glicerol proporcionava uma proteção às células.
Entretanto os protocolos de criopreservação expõem as células
espermáticas à inúmeras situações de estresse como as variações de temperaturas
e exposição à temperaturas não fisiológicas, estresse osmótico pelos elevados
gradientes de concentração de solutos do meio diluidor de congelação e pela
formação e dissolução de cristais de gelo no meio extracelular, os quais
comprometem sua viabilidade (WATSON & MARTIN, 2000).
A exposição das células espermáticas à temperaturas abaixo das
fisiológicas, mesmo antes de ocorrer a congelação (processo de estabilização e
redução do metabolismo das células espermáticas) é responsável por mudanças na
organização bi-dimensional dos lipídios da membrana e alteração das propriedades
espermatozóides pós-descongelação, pela antecipação da capacitação espermática
(HOLT, 2000). O estresse sofrido pelos espermatozóides durante o processo de
refrigeração é conhecido como choque frio, sendo sua sensibilidade variável entre
espécies. Estudos correlacionaram a suscetibilidade aos danos da refrigeração com
a composição de lipídios da membrana entre as espécies, ou seja, espécies
(bovinos e eqüinos) que contém concentrações de esteróides baixa e concentrações
de ácidos graxos poliinsaturados elevados, são mais predispostos aos danos do
choque térmico (DARIN-BENNETT et al., 1973).
Parks & Lynch (1992) determinaram a composição e comportamento na
fase termotrófica dos lipídios de membrana dos espermatozóides de cachaço, touro,
garanhão e galo, de acordo com uma classificação baseada no grau de sensibilidade
ao choque frio. Lipídios do sêmen total e da membrana plasmática foram divididos
em lipídios neutros, glicolipídios e fração de fosfolipídios, além de esteróides livres e
fosfolipídios ligados a ácidos graxos. O colesterol foi o esteróide encontrado em
maior quantidade dentre os lipídios espermáticos nas espécies estudadas. Dos
fosfolipídios encontrados em maior freqüência tem-se: esfingomielina,
fosfatidil-colina e fosfatidil-etanolamina. Dos ácidos graxos ligados a fosfolipídios foi
caracterizada uma alta proporção de grupos docosapentóicos e de
docosahexanóicos nos espermatozóides das espécies mamíferas e de ácidos
graxos de cadeia menor com maior número de saturações no espermatozóide de
galo. Os glicolipídios correspondem a menos de 10,0% do total de lipídios polares
das membranas espermáticas nas espécies estudadas, observando-se que o maior
glicolipídio encontrado no espermatozóide do galo é diferente do encontrado nos
espermatozóides mamíferos, demonstrando as diferenças de tolerância entre os
Existem três membranas no espermatozóide: plasmática, acrossomal e
mitocondrial. Com exceção da última, as outras apresentam diferenças em domínios
na sua estrutura e comportamento (WATSON, 1995).
As membranas espermáticas em condições normais apresentam-se num
estado fluido, sendo esta característica um pré-requisito para o desempenho de suas
funções com plena eficiência. Os principais fatores que afetam esta fluidez são sua
composição relativa entre fosfolipídios e colesterol e a temperatura na qual a
membrana é exposta. Com a queda da temperatura, os lipídios passam por uma
transição de estado fluido para um estado gel, no qual as cadeias de ácidos graxos
tornam-se desordenadas e com a contínua queda de temperatura, essas se
organizam em um modelo paralelo, produzindo uma estrutura rígida, tornando estas
áreas fracas, sujeita a rupturas, fusões e permeáveis a íons (HAMMERSTED et al.,
1990).
As membranas ancoram-se no citoesqueleto que é uma complexa rede de
filamentos de proteínas que se estende pelo citoplasma e coordena a estrutura,
organização e o movimento da célula. É uma estrutura altamente dinâmica que dá a
célula uma forma tridimensional. Reorganiza-se continuamente controlando a forma,
movimento intracelular, transporte de organelas e segregação cromossomal. Este é
formado por três tipos de filamentos de proteínas: actino filamentos
(microfilamentos), microtúbulos e filamentos intermediários. Estes tipos de filamentos
são formados por diferentes sub-unidades de proteínas: actina para microfilamentos,
tubulinas para microtúbulos e fibras de proteínas para filamentos intermediários. Os
filamentos de actina e tubulinas se ligam a umas variedades de proteínas acessórias
que tem a capacidade de participar de distintas funções em diferentes regiões da
comunicação dentro da célula e capacitam a localização espacial do complexo de
proteínas e organelas (DOBRINSKI, 1996).
Essas proteínas apresentam despolimerização e repolimeração de acordo
com a temperatura a que são submetidas, o que traz importantes implicações na
criopreservação dos espermatozóides (WATSON, 1995). Spungin et al. (1995)
propuseram que a despolimeralização da F-actina do citoesqueleto é um passo
necessário para permitir a aproximação do plasmalema à membrana do folheto
externo acrossomal para produzir a exocitose, portanto, a despolimerização e
repolimerização de acordo com a temperatura do resfriamento e criopreservação
poderia contribuir com uma fusão desorganizada.
3.2 Integridade da Membrana Plasmática do Espermatozóide
A integridade da membrana plasmática tem sido um dos parâmetros mais
estudados no processo de avaliação das injúrias sofridas pela célula durante o
processo de criopreservação (DELL’ AQUA, 2000).
A integridade da membrana plasmática exerce um papel fundamental na
sobrevivência do espermatozóide no trato genital da fêmea e na manutenção de sua
capacidade fertilizante (PARKS & GRAHAN, 1992).
O uso de fluorocromos (isolados ou associados) tem promovido uma boa
metodologia de avaliação da integridade de vários compartimentos subcelulares,
como a função mitocondrial e a integridade da membrana plasmática (MARTINEZ,
As sondas fluorescentes têm sido muito utilizadas, pois têm a capacidade
de se difundir pelas células íntegras ou lesadas, mesmo na presença de algum
crioprotetor (ZÚCCARI, 1998).
As células espermáticas coradas com as sondas fluorescentes podem ser
avaliadas tanto no aspecto morfológico quanto no funcional, sem a interferência do
meio extracelular (ERICSSON et al., 1989).
Os corantes fluorescentes podem ser divididos em dois grupos; os que
não são capazes de penetrar através de uma membrana íntegra, caso do brometo
de etídeo, iodeto de propídeo e hidroetidine, entre outros (EVENSON et al., 1982;
ERICSON et al., 1989) e os compostos não polares, onde se encontram os ésteres
de fluoresceína, que têm característica de se difundirem através de uma membrana
intacta e serem hidrolisados por esterases, produzindo fluoresceína (ROTMAN &
PAPERMASTER, 1966).
O Iodeto de Propídeo se liga e fluoresce o DNA celular de vermelho, é
impermeável a membrana celular íntegra, penetrando na célula e desempenhando
sua função somente em células com a membrana lesada. O Diacetato de
Carboxifluoresceína por outro lado é permeável a célula, sendo deestereficado por
esterases não específicas resultando em Carboxifluoresceína livre que se liga a
membrana intacta, causando uma fluorescência verde (HARRISON & VICKERS,
1990).
A princípio, a técnica com sonda fluorescente foi realizada com a
utilização de um citômetro de fluxo, pois este tem a capacidade de avaliar um
número maior de células, em um tempo mais reduzido, além de determinar muitas
variáveis e ser altamente correlacionado com a fertilidade (ERICSON et al., 1989;
Harrison & Vickers (1990) adicionaram à solução de trabalho, o
formaldeído, numa diluição de 1:80, o que proporcionou a avaliação através de
preparação úmida em microscópio de epifluorescência.
Brito et al. (2003) verificaram que quando utilizaram os corantes
Diacetato de Carboxifluoresceína (CFDA) e Iodeto de Propídeo que os
espermatozóides com danos na membrana apresentam variados graus de coloração
verde e vermelha, indicando diferenças na susceptibilidade da membrana de acordo
com a região ou devida uma menor condensação do DNA. Observaram que em
alguns casos a região da peça intermediária de espermatozóides lesados,
apresentavam diferentes tonalidades de verde, indicando que o Diacetato de
Carboxifluoresceína pode ser produzido e retido dentro da mitocôndria intacta. Os
mesmos autores observaram uma alta correlação entre os valores de integridade de
membrana obtido através dos corantes CFDA e a taxa de fertilização in vitro.
Januskauskas et al. (1999) não observaram correlação entre o teste de
integridade de membrana e a taxa de não retorno ao cio aos 56 dias na espécie
bovina.
Zúccari & Papa. (1995) relataram que em relação ao sêmen congelado
eqüino, uma queda concomitante do número médio de espermatozóides íntegros e
da motilidade progressiva ocorre no teste de termoresistência.
Zúccari (1998) trabalhando com espermatozóides eqüinos, verificou
correlações existentes entre as variáveis motilidade, vigor e integridade da
membrana plasmática pela utilização das sondas fluorescentes, Iodeto de Propídeo
e Diacetato de Carboxifluoresceína, após a descongelação e durante o teste de
Januskauskas et al. (2003) trabalharam com os corantes Anexina-V e
Iodeto de propídeo para avaliar a viabilidade dos espermatozóides bovinos
pós-descongelação e verificaram que o número de células vivas e viáveis nas doses
inseminantes estavam significativamente correlacionadas com a fertilidade.
Brito et al. (2003) compararam métodos de avaliação da membrana dos
espermatozóides bovinos e verificaram que os valores de espermatozóides com a
membrana intacta determinada pelas colorações de Carboxifluoresceína/Iodeto de
propídeo e SYBR-141/Iodeto de propídeo foram maiores do que a proporção de
espermatozóides com membrana íntegra ao teste hiposmótico durante a incubação
pós-descongelação. Demonstraram que a proporção de espermatozóides intactos
determinadas pela coloração com Iodeto de propídio diminuiu constantemente
durante a incubação a 37ºC.
Coelho et al. (1995) comparando a integridade da membrana plasmática
dos espermatozóides bovinos e sua relação com a motilidade progressiva a uma
temperatura de 38,5ºC durante 2-4 horas, observaram o efeito significativo do
reprodutor para as variáveis: motilidade progressiva e percentual de células
espermáticas com membranas plasmáticas danificadas, nos diferentes tempos de
incubação. Os pesquisadores correlacionaram positivamente o declínio da
motilidade progressiva com relação ao percentual de células íntegras em função do
tempo de incubação, sugerindo que a perda da motilidade está associada às lesões
da membrana plasmática. Os mesmos autores observaram a presença de formas
intermediárias de membranas danificadas sugerindo que a resistência da membrana
plasmática ao longo das distintas regiões dos espermatozóides, parece ser diferente,
provavelmente devido à diferenciação regional na composição da superfície da
1
célula espermática, resultando em componentes associados com funções
especializadas, localizados em domínios específicos.
Mclaughlin et al. (1992) não encontraram qualquer relação entre
motilidade e integridade de membrana, quando avaliaram à integridade da
membrana do espermatozóide humano por dois métodos independentes:
intumescimento celular em condições hiposmóticas e coloração com Hoechest
33258. Esses métodos não identificam células que apresentam formas
intermediárias de membranas danificadas, as quais podem ainda conservar sua
motilidade.
Chalah & Brillard (1998) utilizaram a coloração de SYBR-14/Iodeto de
propídio para avaliar a integridade de membrana em espermatozóides bovinos
criopreservados e incubados à 4ºC durante 0,5 ; 2 ; 4 ; 24 horas e observaram que
a integridade de membrana diminui em função do tempo.
3.3 Motilidade Convencional e Computadorizada do Sêmen
Congelado
A avaliação subjetiva da motilidade espermática tem sido utilizada
correntemente como meio de qualificar o sêmen após a descongelação, face sua
correlação com a fertilidade (LASLEY, 1944 apud FERREIRA, 2000).
Pickett et al. (1965) avaliaram temperaturas de descongelação em sêmen
congelado bovino e obtiveram uma correlação positiva entre a motilidade
pós-descongelação e a fertilidade.
Casagrande et al. (1980) trabalharam com um material pré-selecionado
motilidade como da velocidade espermática avaliadas subjetivamente com a
fertilidade. Os mesmos autores observaram que o limite mínimo de motilidade após
descongelação para sêmen de fertilidade normal é de 20% e que o coeficiente de
correlação da velocidade espermática com fertilidade é bem mais alto do que a
motilidade propriamente dita.
Kjaestad et al. (1993) trabalharam com sêmen congelado de 18 touros e
verificaram uma correlação entre motilidade e velocidade, mas não entre motilidade
e integridade de acrossomo. Os mesmos autores constaram que motilidade e
velocidade estão relacionadas com a fertilidade.
Jondet & Rabadeux (1974) relataram que descartavam as partidas de
sêmen criopreservados que não descongelassem com no mínimo de 60,0%
de motilidade.
Dois autores avaliaram e correlacionaram a motilidade
pós-descongelação de espermatozóides bovinos congelados na forma de pellets com a
taxa de não retorno ao cio aos 60-90 dias (GIBSON & GRAHAM, 1969).
Papa (1982) trabalhou com duas temperaturas (40ºC e 70ºC) de
descongelação em sêmen congelado bovino e verificou que quanto maior a
temperatura de descongelação maior o valor da motilidade total, sendo esta
correlacionada com a fertilidade (77,09% taxa de prenhez em 8441 inseminações).
O uso da análise computadorizada vem sendo cada vez mais difundida na
avaliação do sêmen de diversas espécies, como por exemplo, humanos (MARCK et
al., 1988), eqüino (FERREIRA et al., 1997) e ovino (SOUSA et al., 1999), pois é uma
alternativa à avaliação microscópica tradicional de motilidade e concentração
espermática. A técnica permite a identificação precisa das células móveis e imóveis
partir destes dados, com o auxílio de um microcomputador, é possível calcular o
percentual de motilidade, reconstituir as trajetórias espermáticas e através de suas
medidas determinar os valores médios para a velocidade espermática, linearidade,
índice retilíneo e deslocamento lateral da cabeça dos espermatozóides, sendo os
valores de suma importância para discriminar pacientes férteis ou inférteis (AMANN,
1987).
Januskauskas et al. (2001) correlacionaram a motilidade pós-
descongelação de sêmen congelado bovino e a porcentagem de linearidade
avaliado pelo método subjetivo e computadorizado. Os autores verificaram que os
valores de motilidade avaliados pelo método subjetivo são menores do que pelo
método computadorizado, mas não são estatisticamente diferentes. A motilidade
pós-descongelação avaliada pelo método subjetivo, foi significativamente
correlacionada com a fertilidade (taxa de não retorno ao cio aos 56 dias). Quando
utilizaram touros de boa fertilidade, tanto a avaliação da motilidade subjetiva quanto
computadorizada foram significativamente correlacionadas com fertilidade.
Januskauskas et al. (1996) trabalharam com palhetas de sêmen bovino
utilizando as concentrações de 10,0 e 15,0 x 106 de espermatozóides totais e
verificaram que nas doses de 15,0 x 106 a motilidade pós-descongelação não foi
correlacionada com a fertilidade, em contrapartida, essa foi significativamente
importante nas doses com 10,0 x 106.
Brahmkshtri et al. (1999) relataram que a porcentagem de motilidade,
viabilidade e integridade de acrossomo não foram correlacionadas com a taxa de
concepção. Todavia existiu uma alta correlação entre motilidade pós-descongelação
e viabilidade. Os mesmos autores relataram que a baixa correlação entre motilidade
espermatozóide em atingir o oócito, mas não indica a capacidade para realizar a
reação acrossômica com a membrana vitelínica e formar o pró-núcleo.
Farrel et al. (1998) verificaram uma alta correlação (r = 0,89 a 0,98) , entre
a associação alguns parâmetros de movimento espermático de bovinos avaliados
pelo método computadorizado (CASA) e a fertilidade.
Zhang et al. (1998) estudaram algumas características espermáticas na
espécie bovina e sua relação com a fertilidade e verificaram uma correlação
significativa entre a motilidade linear pós-descongelação e a fertilidade.
Hansen2 et al. (2004) obtiveram uma pequena correlação (r = 0,06,
P>0,05) entre motilidade pós-descongelação de sêmen bovino e a taxa de não
retorno ao estro aos 60 – 90 dias no primeiro serviço em 2.154 inseminações.
3.4 Número de Espermatozóides Viáveis (membrana plasmática
intacta) na Dose Inseminante
Um dos objetivos da técnica de inseminação artificial é maximizar o uso
do sêmen de touros geneticamente superiores com um índice de fertilidade
compatível. Dessa forma tem-se procurado reduzir o número de espermatozóides na
dose inseminante (FOULKES & STEWART, 1977). Os mesmos autores não
observaram diferença significativa na taxa de não retorno ao cio aos 60-90 dias,
utilizando-se 5,0 ; 7,0 e 9,0 x 106 espermatozóides totais por dose em palhetas de
0,25 mL, em contrapartida, as doses com 12,0 e 20,0 x 106 apresentaram uma maior
taxa de não retorno. Verificaram que o decréscimo de 1,0 x 106 espermatozóides
inseminados refletia em uma redução de 0,5% na taxa de não retorno ao cio.
2
Jondet (1972) relatou que para palhetas com volume variando entre 0,20 ;
0,40 e 0,60 mL , com o número de 3,0 x 106 espermatozóides viáveis
pós-descongelação, avaliado apenas pela motilidade progressiva, as taxas de não
retorno permanecem constantes (65,3% ; 70,4% e 62,8%) respectivamente. Com
poucas exceções a fertilidade diminuiu com a redução do número de
espermatozóides viáveis por dose (< 3,0 x 106). Doses com até 0,375 x 106
espermatozóides viáveis são passíveis de atingir taxas de concepção médias (57,2%
; 46,7% e 44,6% para volumes entre 0,20, 0,40 e 0,60 ml) sendo influenciada pelo
volume da dose e a fertilidade do touro.
Den Daas et al. (1998) utilizaram palhetas de 0,25 mL com sêmen de 20
touros adultos com a concentração de espermatozóides viáveis por dose entre 1,1 a
11,8 x 106. Os autores constataram que não houve correlação entre o número
máximo de espermatozóides viáveis com uma maior taxa de não retorno ao cio aos
56 dias e que o número de espermatozóide necessário para se obter um valor
máximo na taxa de concepção (95%) está ao redor de 1,0 e 11,0 x 106.
Stewart & Bennett (1968) utilizaram 5,0 ; 10,0 ; 20,0 e 30,0 x 106
espermatozóides totais por dose inseminante e não observaram diferença estatística
significativa na taxa de não retorno ao cio aos 60 – 90 dias.
Shannon & Vishwanath (1995) comparando a ótima e sub-ótima
concentração espermática compatível com fertilidade entre sêmen a fresco e
congelado bovino, verificaram que a interação touro versus concentração por dose
foi significativa para sêmen congelado, mas não para sêmen a fresco, sugerindo que
o efeito da congelação não é uniforme entre os touros. Os autores relataram que
comparativamente é necessário 2,0 x 106 espermatozóides vivos no sêmen a fresco
indicando que o processo de congelação alterou a probabilidade de fertilização pelos
espermatozóides vivos ou o seu modelo de sobrevivência.
Seidel et al. (1997) relataram taxas de prenhez de 41,0 e 50,0% utilizando
doses de 1,0 x 105 e 2,5 x 105 de espermatozóides totais em palhetas de 0,1 mL de
sêmen sexado no corpo e corno uterino, contra 61,0% do grupo controle (2,5 x 106)
congelados em palhetas de 0,21 mL.
Hansen2 et al. (2004) obtiveram uma pequena correlação entre o número
de espermatozóides com movimento progressivo e a fertilidade ,estando esse
número por volta de 4,5 a 5,0 x 106. Nesse mesmo estudo os autores verificaram
uma correlação ainda maior entre o número de espermatozóides viáveis na dose
(4,5 a 5,0 x 106 por dose) avaliados pela técnica de citometria de fluxo, com as
sondas fluorescentes SYBR 14/Iodeto de propídio e a fertilidade.
3.5 Teste de Termoresistência para avaliação do sêmen congelado
Pickett et al. (1961) verificaram maior resistência dos espermatozóides
bovinos à incubação de 38ºC, avaliando a porcentagem de espermatozóides móveis,
quando congelados em nitrogênio líquido do que em gelo seco e álcool, após 90 e
180 dias de estocagem.
Dimitropoulos (1967) denominou de T.T.R.L (Teste de Termoresistência
Lento) a prova que consiste na incubação de uma amostra de sêmen à 38ºC durante
5 horas, após o que se verifica a porcentagem de motilidade progressiva,
apresentando correlação positiva e altamente significativa com a fertilidade real,
medida pelo índice de não retorno ao cio aos 60-90 dias.
2
Jondet & Rabadeux. (1974) relataram que utilizam o T.T.R.L. há vários
anos e eliminam sistematicamente todo sêmen descongelado que não apresente
pelo menos 20,0% de espermatozóides ativos após a prova. Esses mesmos autores
verificaram que quanto melhor a classificação inicial da amostra logo após o
descongelamento, menor é a diferença na queda percentual dos espermatozóides
exibindo movimentos progressivos. Eles enunciaram essa assertiva separando-as
em grupos de 65,0 a 70,0% ; 60,0 a 65,0 % e abaixo de 60,0 % de motilidade
progressiva após a descongelação. A utilização rotineira do teste apresenta as
vantagens de: possibilidade de retenção de partidas que, pela avaliação
convencional, seriam eliminadas por apresentarem índice de motilidade inferior a
60% após a descongelação (no Brasil atualmente considera-se como padrão mínimo
30%) e eliminação de certas partidas que, aparentemente, estariam aptas a serem
distribuídas por apresentarem o índice de motilidade mínimo exigido às
descongelações, mas que não correspondem ao T.T.R.L
Saacke & White (1972) relataram que o edema, a deterioração e a perda
da membrana acrossomal no sêmen incubado a 37ºC ocorre de maneira gradual,
sendo difícil quantificar. Verificaram que a retenção de acrossomo às 2 ; 4 e 8 horas
à temperatura de 37ºC foi relacionada com a fertilidade.
Pursel et al. (1972) observaram que a incubação por 2,5 e 4,5 horas
foram prejudiciais para porcentagem de espermatozóides móveis nas temperaturas
de 15 ; 20 e 30ºC.
Coulter & Foote (1974) incubaram sêmen congelado de bovino a 37ºC
durante 0 ; 3 e 6 horas e verificaram uma queda acentuada na motilidade total e na
Barnabe et al. (1980) trabalharam com as ampolas de sêmen produzido
em uma central de inseminação artificial para avaliar o teste de termoresistência e
verificaram que em média a motilidade progressiva pós-descongelação foi de
46,15%, sofrendo uma queda para 19,77% depois do teste rápido e para apenas
6,12% após o teste lento. Diante de tais resultados e considerando que o material
fora previamente selecionado quanto à qualidade e liberado para comercialização
sem que se tenha tido conhecimento de reclamações por parte dos compradores, é
de se supor que o critério de eliminação sistemática de todo sêmen congelado que
não apresente pelo menos 20% de espermatozóides ativos após o teste lento de
termoresistência poderia não ser aplicado nas amostras em questão. Os
pesquisadores relataram que talvez a prova lenta seja demasiadamente rígida para
a avaliação das amostras de sêmen. Assim, os valores para a prova rápida foram
correlacionados com os obtidos após a prova lenta, verificando-se um coeficiente de
correlação (r=0,38) que embora de média intensidade, revelou-se positivo e
altamente significante. Dessa forma, o teste de termoresistência rápido seria mais
aconselhável de ser executado, mesmo porque, o sêmen de determinados touros
pode apresentar fertilidade, apesar dos valores baixos acusados pela prova.
Arruda (1988) verificou taxas de prenhez semelhantes (teste de
qui-quadrado) ao primeiro, segundo e terceiro estro para os tratamentos do teste de
termoresistência rápido e lento. Relatou que pela análise de variância também não
detectou diferença significativa do tratamento sobre a taxa de prenhez assim com os
efeitos de touro e da interação touro versus tratamento. O autor dividiu em duas
classes de motilidade (baixa = 25,0 a 35,0% e alta 40,0 e 50,0%) as palhetas
utilizadas no teste de termoresistência rápido com a finalidade de verificar a
pesquisador concluiu que como as taxas de prenhez acumuladas para ambos os
testes se mostraram próximas é possível utilizar o teste de termoresistência rápido,
para avaliar com maior rapidez o poder fecundante do sêmen congelado, desde de
que sejam obedecidas às normas fixadas para congelação do sêmen bovino no
Brasil, a prova rápida de termo-resistência poderá substituir a prova lenta.
Monterroso et al. (1995) incubaram partidas de sêmen congelado durante
1 a 3 horas à temperatura de 39 ,41, 42 e 43ºC e verificaram que a motilidade teve
uma tendência de diminuir com o tempo de incubação, sendo maior à 39ºC do que a
42 e 43ºC. A capacidade de suportar o swim-up também diminuiu com o tempo de
incubação. Relataram que a porcentagem de motilidade foi afetada pelo tempo e
existiu uma interação tempo-temperatura de incubação. Os mesmos autores
relataram que os espermatozóides incubados a 39, 41 ou 42ºC tiveram uma leve
diminuição na taxa de clivagem e na porcentagem de embriões clivados que
desenvolveram até o estágio de 4 células, em relação aos espermatozóides não
incubados. Verificaram um aumento na produção de superóxido em todas as
temperaturas de incubação mas uma maior quantidade a temperatura de 42ºC.
Demonstraram que a integridade da fita de DNA não foi alterada pela temperatura,
utilizando-se a coloração de laranja-acridina. O aumento na produção de radicais
livres poderia causar danos ao DNA, desde que os radicais livres pudessem reagir
com o DNA para produzir nucleosídeos oxidados. O sistema de cultura utilizado para
avaliar o efeito do estresse térmico calórico nos espermatozóides não simula as
condições in vivo as quais podem ser comprometidas pelo calor .
Rota et al. (1996) incubaram sêmen de cão por 3 horas a uma
temperatura de 38ºC para verificar a eficácia da introdução do Equex STM Paste®
verificaram que a motilidade espermática e a integridade de membrana diminuem
em função do tempo. Verificaram que a proporção de células com membranas
intactas sempre foram maiores do que o número de células móveis, mas que a
utilização do Equex STM Paste® sempre proporcionou maiores índices de motilidade
e integridade de membrana.
Nagy et al. (2004) submeteram os espermatozóides bovinos a um período
de incubação de 4 horas sob uma temperatura de 37ºC para avaliar as alterações na
membrana plasmática e acrossomal e observaram que durante o período de
incubação a população de espermatozóides vivos e com acrossomo intacto
diminuíram discretamente; os espermatozóides mortos com acrossomo intacto
diminuíram de 37,4% pós-descongelação para 17,4%, em contrapartida os
espermatozóides mortos e com acrossomo rompido aumentaram de 18,0% para
35,0%. Verificaram que a porcentagem de espermatozóides positivos para PE-PNA
(corante fluorescente Peanut aglutinina) dentro da população daqueles que estavam
morrendo aumentaram significativamente de 3,5% para 66,9 %, evidenciando um
aumento na exocitose da membrana acrossomal, podendo isto ocorrer em função o
próprio processo de criopreservação ou devido a exaustão dos espermatozóide
provocada pela temperatura e tempo de incubação.
4 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi desenvolvida em três locais diferentes:
1º- A congelação e as análises iniciais do sêmen utilizado no experimento
foram realizadas na Central de Inseminação Artificial Jacarezinho “Genetics”,
localizada no município de Valparaíso – Estado de São Paulo.
2º- As análises posteriores das partidas foram realizadas no
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) – UNESP – Botucatu, Estado de São
Paulo.
3º- O teste de fertilidade foi realizado na Agropecuária Jacarezinho Ltda,
localizada no município de Valparaíso, Estado de São Paulo.
A Agropecuária Jacarezinho Ltda está localizada a 600 Km da capital do
Estado de São Paulo, 280 metros de altitude e nos últimos cinco anos apresentou
médias de temperaturas máximas de 30ºC, médias de mínimas de 20ºC e o índice
pluviométrico médio de 1100 mm, caracterizando o clima tropical (MOREIRA, 1998)
Os solos predominantes são dos tipos salmourão (AMARAL & LEINZ ,
1978), com pastagens cultivadas predominantemente dos gêneros Brachiária e
Panicum.
A propriedade é bem estruturada e seleciona seu rebanho há mais de 30
anos para precocidade e fertilidade. É dividida em retiros (composto por vários
piquetes) onde existe um encarregado responsável pelo controle de todos os dados
dos animais (peso ao nascimento, peso ao desmame, idade ao primeiro estro, peso
ao sobreano, número de animais por piquete, etc). Todos os dados captados são
4.2 Animais
Para a congelação e análises do sêmen, foram utilizados 64 ejaculados
de 39 touros da raça Nelore, com idade entre 2 e 10 anos, pertencentes a Central de
Inseminação Artificial Jacarezinho Genetics – Agropecuária Jacarezinho Ltda –
Valparaíso – Estado de São Paulo.
As colheitas de sêmen foram realizadas por meio de vagina artificial
(modelo IMV®), com auxílio de uma vaca (manequim), devidamente contida ou
através de eletroejaculação (modelo Eletrovet®).
Para o teste de fertilidade foram utilizadas fêmeas da raça Nelore, com
idade entre 2 a 16 anos, onde utilizamos animais das seguintes categorias: nulípara,
primípara e multípara. Foram inseminadas 3161 fêmeas no total.
4.3 Avaliação Inicial do Sêmen a Fresco
A avaliação inicial do ejaculado foi realizada logo após as colheitas ,
procedendo-se os exames macroscópico e microscópico e os dados obtidos de cada
animal (volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade progressiva, vigor,
concentração e patologia espermática) anotados em uma ficha de controle.
O aspecto do ejaculado foi classificado em três categorias : aquoso,
leitoso e cremoso. O turbilhonamento (movimento de massa) foi avaliado através da
deposição de uma gota de sêmen sobre uma lâmina aquecida (37ºC) e da
observação no microscópio de luz em aumento de 100x, sendo esse valor
classificado em ordem crescente : 0 , + , ++ , +++. A avaliação da motilidade
cloreto de sódio a 0,9% para efeito de diluição, com posterior retirada de uma
amostra e deposição desta sobre uma lâmina aquecida (37ºC), recobrindo-a com
uma lamínula. Esta foi inferida através de microscopia de luz, sob aumento de 200x,
sendo o resultado emitido na forma de porcentagem subjetiva de espermatozóides
móveis. A qualidade e intensidade do movimento (vigor) foram classificadas através
de uma escala de 0 a 5. Somente foram processadas as amostras portadoras dos
seguintes valores: motilidade ≥ 70% e vigor ≥ 3.
A concentração espermática foi estimada através da retirada de uma
amostra de sêmen (20 µL) diluído em 4 mL da solução de formol salina, obtendo
uma diluição de 1:200. Para análise da patologia espermática foi retirada uma
amostra de sêmen colocando-a em uma solução de formol salina (1:100), sendo
posteriormente retirada uma gota desta solução e colocada sobre uma lâmina
recoberta por uma lamínula. Foram retirados os excessos com uma folha de papel
filtro e a verificação da patologia foi feita através de um microscópio de contraste de
fase no aumento de 1000x com óleo de imersão, sendo estas classificadas em
defeitos maiores e menores. (BLOM, 1972).
4.4 Congelação do Sêmen.
Uma vez aprovados os ejaculados, os mesmos foram diluídos com
extensor (TRIS-hidroximetilaminometano) fração 1 , que não continha glicerol. Esta
solução (sêmen + diluente 1) foi levada para um balcão refrigerador a 4ºC, envolto
por um frasco contendo água a mesma temperatura em que se encontrava o
banho-maria. O frasco contendo o sêmen permanecia envolto pela água durante 2 horas,
período mínimo 4 horas de refrigeração este sêmen foi envasado em palhetas
francesas de 0,5 mL previamente refrigeradas, lacrados através de ultrassom e
colocado em seguida nas rampas de congelação na posição vertical com
capacidade para 100 palhetas. Era em seguida levado para um tanque de
congelação contendo nitrogênio líquido a uma distância de 3 cm de altura (140ºC)
onde permanecia durante 15 minutos. Após esse período as palhetas eram imersas
em nitrogênio líquido a (-196ºC) e armazenadas em botijões criobiológicos.
Composição do meio diluidor:
CONSTITUINTES QUANTIDADE
Tris3 30,28 g
Ácido Cítrico3 17,30 g
Água Bi-Destilada/Deionizada 1000 mL/qsp
DILUIDOR – TRIS – FRAÇÃO A
CONSTITUINTES QUANTIDADE
Solução Mãe 800 mL
Gema de Ovo 200 mL
Volume Final 1000 mL
DILUIDOR – TRIS – FRAÇÃO B
CONSTITUINTES QUANTIDADE
Solução Mãe 652 mL
Gema de Ovo 200 mL
Glicose 3 20 g
Glicerol 3 128 mL
Volume Final 1000 mL
Para cada mililítro de sêmen congelado são acrescidos as seguintes
quantidades de antibióticos: gentamicina (250 µg)4 , tilosina (50 µg)5, lincomicina
(150 µg)5 e espectinimicina (300 µg)5.
As palhetas foram descongeladas em banho-maria a uma temperatura de
37ºC durante 30 segundos. Eram descongeladas 2 palhetas de cada partida e todo
volume foi depositado em frascos de vidro de 5 mL, onde o conteúdo era
homogeneizado e posteriormente amostras eram retiradas para realização da
concentração espermática da dose e avaliação da motilidade total. Em seguida esse
frasco era lacrado com rolhas de cortiça e deixados em banho-maria durante 5 horas
a 38ºC (teste de termoresistência lento), para serem avaliados os índices de
motilidade progressiva, sendo o padrão mínimo aceitável de ≥ 20%
(DIMITROPOULOS, 1967) . Algumas partidas foram avaliadas utilizando o teste de
termoresistência rápido em que o sêmen permaneceu por 30 minutos em
banho-maria a 46ºC (MIES FILHO, 1987), sendo o padrão mínimo de aprovação o mesmo
referido para o teste de termoresistência lento. Através da análise do sêmen na
Central de Inseminação foram separadas aleatoriamente 27 partidas para serem
utilizadas na inseminação artificial. Os dados de inseminação artificial dessas
partidas foram agregados aos dados referentes as partidas analisadas pelo método
computadoriado, pois as doses das 27 partidas de sêmen já haviam sido utilizadas
na estação de monta. Os dados das partidas analisadas pelo método Convencional
e Computadorizado foram agregados pois estatisticamente os valores de motilidade
total não se apresentaram diferentes. (ver Tabela.2.)
4.6 Avaliação do Sêmen Congelado
3
No laboratório de andrologia do Departamento de Reprodução Animal e
Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) –
Unesp – Botucatu – SP , foram analisadas 37 partidas de sêmen, separadas
também aleatoriamente e diferentes daquelas avaliadas na Central de Inseminação
Artificial. Foram realizados os seguintes exames: avaliação subjetiva e
computadorizada da motilidade espermática, teste de integridade de membrana e
testes de termoresistência rápido e lento. Os dados dos números de inseminação
artificial dessas partidas (2094 IA) foram submetidas as análises estatistícas de
Qui-quadrado e de correlação, pois apresentavam todas as avalições (CASA, Integridade
de Membrana e Convencional)
4.6.1 Avaliação do Movimento Espermático Pós-Descongelação
As palhetas foram descongeladas a 37ºC durante 30 segundos e
analisadas para as seguintes variáveis: motilidade total e vigor pelo método subjetivo
ao microscópio de luz; a motilidade total , progressiva, velocidade espermática ao
longo de uma trajetória real (VCL - µm/s), velocidade espermática ao longo de uma
trajetória média (VAP - µm/s), velocidade espermática considerando-se uma
trajetória retilínea com origem no primeiro ponto analisado e final no último (VSL -
µm/s), linearidade calculada através da relação matemática entre VCL e VSL (LIN -
%), índice retilíneo (IR - %), deslocamento lateral de cabeça (DLC - µm), freqüência
dos batimentos flagelares (FBF – Hz), elongação (%) e área da cabeça (µmsq)
através da análise computadorizada do movimento espermático.
A análise subjetiva foi realizada colocando-se uma gota de sêmen
lamínula. O exame foi realizado em microscópio de luz no aumento de 200x, onde a
motilidade era avaliada e estimada em uma escala de porcentagem com valores
entre 0-100% e o vigor estimado em uma escala de 1 a 5.
As análises computadorizadas da motilidade foram realizadas a uma
temperatura de 38ºC, tendo sido analisados quatro campos e anotados os valores
médios.
Tabela.1. Ajuste do HTMA – IVOS – 10 para a realização das análises
CARACTERÍSTICA AJUSTE
Número de pontos examinados 30
Tamanho mínimo da célula 3 pixels
Contraste para células imóveis 50 pixels
Limite inferior para o índice retilíneo 70%
Referência: Velocidade Média (VAP) < 40 µm/s
Referência: Velocidade lenta (VAP) < 30 µm/s
Referência: Velocidade lenta (VSL) < 20 µm/s
Limite inferior de tamanho 5 pixels
Limite superior de tamanho 3 pixels
Limite inferior de intensidade 0,24
Limite superior de intensidade 1,19
Limite inferior de alongamento 0%
Limite superior de alongamento 100%
Lentos contados como móveis Não
Magnificação 1,95
4.6.2 Avaliação do Movimento Espermático e do Vigor Pós-Teste de
Termoresistência
O volume total da palheta foi depositado em um frasco de vidro de 5 mL e
posteriormente lacrados com uma rolha de cortiça onde permaneceram no teste de
termoresistência rápido (T.R.R.R) em uma temperatura de 46ºC durante 30 minutos
e no teste de termoresistência lento (T.R.R.L) em uma temperatura de 38ºC durante
5 horas.
Ao final do período uma amostra de cada frasco era retirada e analisada
microscópio de contraste de fase; motilidade total , progressiva, VCL, VAP, VSL,
LIN, IR, DLC, FBF, elongação e área da cabeça através da análise computadorizada
do movimento espermático.
As análises subjetivas e computadorizadas foram realizadas semelhante
ao descrito no item 4.6.1.
Os valores de motilidade total Computadorizada e Convencional foram
subdivididos em 4 categorias e denominados de grupos(0 = 0% de motilidade, 1 =
1-20% de motilidade, 2 = 21-40% de motilidade e 3 = > 40% de motilidade.
4.6.3 Teste de Integridade da Membrana Plasmática Pós-
Descongelação
Uma amostra do sêmen descongelado foi colocada em uma solução de
citrato de sódio a 2,94%, para facilitar a visualização dos espermatozóides corados,
pois em função do diluente utilizado algumas amostras não apresentavam boa
nitidez dos espermatozóides fluorescentes. Essa técnica foi desenvolvida no
laboratório de andrologia do Departamento de Reprodução Animal – UNESP –
Botucatu – SP (PAPA , 2004)9 e posteriormente transferida para solução de trabalho
de fluorescência, descrita por Harrison & Vickers (1990) e modificada por Zúccari
(1998), conforme esquema abaixo:
Solução de Estoque
- 9,2 mg Diacetato de Carboxifluoresceína6
- 20 mL DMSO (Dimetilsulfóxido) 7
Solução 2
- 10 mg Iodeto de Propídio 6
- 20 mL DMSO
Solução 3
- 1 parte Formalina a 40%
- 79 partes Solução Fisiológica 8
Solução 4
- 3 g Citrato de Sódio 3
- 100 mL Solução Fisiológica
Preparo da Solução de Trabalho
20 µL de Solução 1
10 µL de Solução 2
10 µL de Solução 3
960 µL da Solução 4
Para avaliação de amostras
20 µL da Solução de sêmen + citrato de sódio
40 µL da Solução de trabalho
6
As soluções de estoque 1 e 2 foram preparadas ao abrigo da luz,
acondicionadas em tubos de ensaio recobertos com papel alumínio em alíquotas de
1 ml e congeladas a -20ºC. Soluções de estoque 3 e 4 eram armazenadas em
geladeiras a 5ºC.
Uma alíquota (40 µL) da solução de trabalho foi colocada em ependorfes
de 1,5 mL e acondicionadas em uma caixa de isopor com tampa, acrescentando-se
a essa 20 µL da solução de sêmen e citrato de sódio.
A avaliação foi realizada em microscópio de epifluorescência em aumento
de 400x. Foram contadas 100 células espermáticas em uma mesma lâmina
classificando-as como íntegras e lesadas, conforme sua coloração (FERREIRA,
2000):
Íntegros = Espermatozóides com membrana plasmática íntegra, células
coradas pelo Diacetato de Carboxifluoresceína apresentando-se verde em toda sua
extensão
Lesados = Espermatozóides com membranas plasmáticas e acrossomal
lesadas. Células coradas pelo Iodeto de Propídio,se apresentado vermelhas
Os espermatozóides que apresentaram dupla coloração foram
classificados como lesados.
4.6.4 Teste da Integridade de Membrana Pós-Teste de
Termoresistência
