Caracterização molecular do HTLV-1 em pacientes com paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 em Belém, Pará.

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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 3 9 ( 5 ) :5 0 4 -5 0 6 , set-out, 2 0 0 6

COMUNICAÇÃO/COMMUNICATION

1 . Labo rató rio de Viro lo gia, do Departamento de Pato lo gia do Centro de Ciênc ias B io ló gic as do Universidade Federal do Pará, B elém, PA. 2 . Ho spital Universitário Jo ão de B arro s B arreto da Universidade Federal do Pará, B elém, PA.

Ender eço par a co r r espo ndência: Dr. Anto nio Carlo s R. Vallino to . Rua Oliveira B elo 2 3 8 /1 0 0 2 , Umarizal, 6 6 0 5 0 -3 8 0 B elém, PA. Telefax: 5 5 9 1 3 2 0 1 -7 5 8 7

e-mail: vallino to @ ufpa.br

Rec ebido para public aç ão em 3 1 /0 1 /2 0 0 6 Ac eito em 1 0 /8 /2 0 0 6

O vírus linfotrópic o de c élulas T humanas 1 ( HTLV-1 ) é um r e tr o vír us a s s o c ia do a pa to lo gia s h um a n a s c o m o l e u c e m i a /l i n fo m a d e c é l u l a s T d o a d u l to ( LLc TA) e paraparesia espástic a tropic al/mielopatia assoc iada ao HTLV ( PET/MAH)1 7_{. O HTLV-1 tem sido também assoc iado a c asos} de polimiosite, poliartrite e uveíte1 2 1 3 1 4 1 5_.

A paraparesia espástic a tropic al/mielopatia assoc iada ao HTLV ( PET/MAH) é uma doenç a desmielinizante c rônic a e pro gressiva asso c iada à infec ç ão pelo HTLV-1 e que afeta predominantemente a c oluna vertebral. Relata-se que esta doenç a afeta entre 0 ,2 e 5 % dos indivíduos infec tados na quarta déc ada de vida7 2 5_.

Caracterização molecular do HTLV-1 em pacientes com

paraparesia espástica tropical/mielopatia associada

ao HTLV-1 em Belém, Pará

Molecular characterization of HTLV-1 among patients with tropical spastic

paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy in Belém, Pará

Lucinda A. Souza

_{, Ivina G.L. Lopes}

_{, Eduardo Leitão Maia}

_{, Vânia N. Azevedo}

_,

Luiz Fernando A. Machado

_{, Marluísa O.G. Ishak}

_,

Ricardo Ishak

_{e Antonio Carlos R. Vallinoto}

RESUMO

O presente estudo avaliou a oc orrênc ia da infec ç ão pelo HTLV-1 e seus subtipos em amostras de sangue de pac ientes c om diagnóstic o c línic o de paraparesia espástic a tropic al/mielopatia assoc iada ao HTLV-1 . A detec ç ão da infec ç ão pelo HTLV realizou-se através de testes sorológic o e molec ular. Cinc o amostras estavam infec tadas pelo HTLV-1 do subtipo Cosmopolita, subgrupo Transc ontinental. Os resultados obtidos c onfirmam a oc orrênc ia de infec ç ão pelo HTLV-1 em pac ientes c om diagnóstic o c línic o de paraparesia espástic a tropic al/mielopatia assoc iada ao HTLV-1 em B elém, Pará.

Palavr as- chaves: Paraparesia espástic a tropic al/mielopatia assoc iada ao HTLV-1 . Carac terizaç ão molec ular.

ABSTRACT

The present study evaluated the oc c urrenc e of HTLV-1 and its subtypes in blood samples of patients presenting symptoms of tropic al spastic paraparesis/HTLV-1 assoc iated myelopathy. The detec tion of HTLV infec tion was performed by serologic al and molec ular assays. Five patients were infec ted by HTLV-1 of the Cosmopolitan subtype, subgroup Transc ontinental. The results c onfirm the oc c urrenc e of HTLV-1 infec tion among patients with c linic al diagnosis of tropic al spastic paraparesis/HTLV-1 assoc iated myelopathy in B elém, Pará.

Key- wo r ds: Tropic al spastic paraparesis/HTLV-1 assoc iated myelopathy. Molec ular c harac terization.

Além disso, uma síndrome neurológic a similar a PET/MAH te m sido de sc r ita e m r ar o s pac ie nte s po r tado r e s da c o -infec ç ão HIV-1 /HTLV-21 9 _{e pelo menos um pac iente infec tado} c o m HT LV- 2 j á fo i i d e n ti fi c a d o c o m u m a d o e n ç a n e u r o d e ge n e r a ti va p r o gr e s s i va c r ô n i c a c l i n i c a m e n te indistinguível de PET/MAH6 2 1_.

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So uza LA co ls

mo le c ular do HTLV-1 infe c tando pac ie nte s apr e se ntando sintomas de PET/MAH atendidos no Hospital Universitário João de B arros B arreto da Universidade Federal do Pará.

De z pac ie nte s apr e se ntando distúr b io s ne ur o ló gic o s, atendidos no Hospital Universitário João de Barros Barreto, fo r am sub metido s a exames neur o ló gic o s. Cinc o tiver am diagnóstico clínico de distúrbio neurodegenerativo típico de PET/ MAH, de ac ordo c om c ritérios c línic os estabelec idos pelo Programa Nacional de DST e Aids do Ministério da Saúde2_.

Ap ó s o d i a gn ó s ti c o c l í n i c o , o s p a c i e n te s fo r a m e nc aminhado s ao Lab o r ató r io de Vir o lo gia do Ce ntr o de Ciênc ias B iológic as da Universidade Federal do Pará, onde alíquo tas de sangue fo r am c o le tadas e m tub o s c o nte ndo EDTA, c om posterior separaç ão de plasma e de leuc óc itos ( c élulas mononuc leadas do sangue periféric o - PB MC) , que foram c ongelados a -2 0 ºC até o momento do uso.

Os soros foram testados para a presença de anti-HTLV-1 /2 ,

usando-se um ensaio imunoenzimático, ELISA (HTLV-1 /2

Ab-Capture ELISA Test System, Ortho Diagnostic Systems Inc., USA) . A extraç ão de DNA foi realizada, a partir de PB MC das amostras sororreativas para anti-HTLV-1 /2 , usando-se o do método de extraç ão de DNA total, de ac ordo c om o protoc olo da Puregene, Gentra Systems, Inc ,USA.

A reaç ão de amplific aç ão gênic a foi efetuada em duas etapas (nested PCR) , para a amplific aç ão de 1 5 9 pb da região pX do DNA pr o vir a l do HTLV- 1 /2 , s e guida da dige s tã o enzimátic a c om TaqI para a c arac terizaç ão do tipo viral2 3_{. O} s u b ti p o vi r a l fo i d e te r m i n a d o a p a r ti r d a s a m o s tr a s c arac terizadas c omo HTLV-1 utilizando-se uma nested PCR e o seqüenc iamento 7 8 8 pb do segmento 5 ’LTR c omo desc rito previamente1 0_.

Após a purific aç ão do produto da região 5 ’LTR, o DNA foi submetido ao seqüenc iamento automátic o usando-se o k it da AB I PRI SMTM _{Dye Te r m in a to r Cyc le Se q ue n c in g} ( Perkin Elmer, USA) usando-se o equipamento AB I 3 7 3 DNA Sequenc er ( Perkin Elmer, USA) .

O alinhamento das seqüências nucleotídicas da região 5 ’LTR, foi efetuada usando o programa Clustal X2 2_{. O grau de divergência} genética, a partir das seqüências obtidas e o padrão do mapa de restrição foi determinado usando-se o programa BioEdit 5 .0 9 v4_. O perfil filogenético das cepas foi realizado por meio do método de agrupamento de vizinhos (Neighbor-Joining - NJ) utilizando o modelo evolutivo de Kimura-2 parâmetros com o auxílio do programa MEGA – Molecular Evolutionary Genetics Analysis versão 3 .19_{. Para testar a c onfiabilidade da análise foram} utilizadas 1 .0 0 0 réplicas de bootstrap.

Das 1 0 amostras de pac ientes investigadas, apenas c inc o ( 5 0 % ) apresentaram sororeatividade para anti-HTLV-1 /2 . A análise de r e gião pX ide ntific o u a infe c ç ão pe lo HTLV-1 . O seqüenc iamento da região 5 ’LTR c arac terizo u as c epas c o m o pe r te n c e n te s a o s ub tipo Co s m o po lita , s ub gr upo Transc ontinental ( Figura 1 ) .

Com a análise das seqüênc ias nuc leotídic as foi possível ve r ific ar e le vada sim ilar idade e ntr e as am o str as e c o m

Boi (França) AINU (Japão) JPNBR41 (Tomé-Açu, Pará) QU1-PERU (Quechua, Peru)

TSP12827 (Belém, Pará)

TSP12383 (Belém, Pará)

AMA (Brasil) ME2-PERU ( Peru)

SNT43 (Ilha de Marajó-Pará)

TSP12481 (Belém-Pará)

SNT92 (Ilha de Marajó-Pará)

TSP12823 (Belém-Pará)

TSP12705 (Belém, Pará)

TA7 (Taiwan) ATK (Japão) BRASP31 (Japoseses, Brasil) NI3 (Peru)

TA6 (Taiwan) JPNBR177 (Japoneses, Pará) TA8 (Taiwan)

H5 (Japão) JPNBR81 (Japoneses, Pará) BL1-PERU (Peru)

OD (Mauritania, África) BO (Argelia, África) PR144 (Marrocos, África)

GH78 (Gana, África) HS35 (Caribe) StDen (Gabão-Africa)

Itis (Congo-África) PH236A (Gabão, África)

LIB1 (Gabão, África) LIB2 (Gabão, África) Efe1 (Congo, África)

MEL5 (Ilhas Salomão)

86 58 61 86 69 98 78 48 56 62 58 0.005 Subgrupo Transcontinental (A) Subgrupo Japonês (B) Subgrupo E Subgrupo Norte-Africano (D) Subgrupo Oeste-Africano (C)

Grupo África Central

HTLV-1e

HTLV-1c Boi (França)

AINU (Japão) JPNBR41 (Tomé-Açu, Pará) QU1-PERU (Quechua, Peru)

TSP12827 (Belém, Pará)

TSP12383 (Belém, Pará)

AMA (Brasil) ME2-PERU ( Peru)

SNT43 (Ilha de Marajó-Pará)

TSP12481 (Belém-Pará)

SNT92 (Ilha de Marajó-Pará)

TSP12823 (Belém-Pará)

TSP12705 (Belém, Pará)

TA7 (Taiwan) ATK (Japão) BRASP31 (Japoseses, Brasil) NI3 (Peru)

TA6 (Taiwan) JPNBR177 (Japoneses, Pará) TA8 (Taiwan)

H5 (Japão) JPNBR81 (Japoneses, Pará) BL1-PERU (Peru)

OD (Mauritania, África) BO (Argelia, África) PR144 (Marrocos, África)

GH78 (Gana, África) HS35 (Caribe) StDen (Gabão-Africa)

Itis (Congo-África) PH236A (Gabão, África)

LIB1 (Gabão, África) LIB2 (Gabão, África) Efe1 (Congo, África)

MEL5 (Ilhas Salomão)

86 58 61 86 69 98 78 48 56 62 58 0.005 Subgrupo Transcontinental (A) Subgrupo Japonês (B) Subgrupo E Subgrupo Norte-Africano (D) Subgrupo Oeste-Africano (C)

Grupo África Central

HTLV-1e

HTLV-1c

Figur a 1 - Ár vo r e filo genética mo str ando as r elaçõ es das cepas do vír us linfo tr ó pico de cé lula s T huma na s de scr ita s no pr e se nte tr a ba lho ( TSP1 8 3 2 3 , DQ8 9 7 6 8 2 ; TSP1 2 4 8 1 , DQ8 9 7 6 8 3 ; TSP1 2 7 0 5 , DQ8 9 7 6 8 4 ; TSP1 2 8 2 3 , DQ8 9 7 6 8 5 e TSP1 2 8 2 7 , DQ8 9 7 6 8 6 ) com aquelas disponíveis no GenBank. A ár vo r e fo i co nstr uída po r meio do méto do de Neighbo r-Jo ining apó s o alinhamento de 4 1 0 nucleo tídeo s da r egião 5 ’LTR. A amo str a Mel5 fo i usada co mo gr upo exter no ( o utgr o up) . O supo r te estatístico foi efetuado por meio do uso de 1 .0 0 0 r éplicas de bootstr ap.

a m o s tr a s is o la da s de pa c ie n te s a s s in to m á tic o s , c uj a s se q üê nc ias e stão de sc r itas na lite r atur a, não te ndo sido de te r m inado q ualq ue r padr ão m o le c ular c ar ac te r ístic o assoc iado a PET/MAH. O mapa de restriç ão das amostras, o b tido a par tir da análise das se q üê nc ias nuc le o tídic as, demonstrou similaridade de 6 6 ,7 % entre as mesmas.

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam, por métodos moleculares, a ocorrência de infecção pelo HTLV-1 em pacientes portadores de diagnóstico clínico de PET/MAH em Belém ( Pará) e corroboram achados sorológicos anteriores que descreviam a associação da infecção pelo HTLV-1 com PET/MAH na região5 _{e no Brasil}1 3 2 0_.

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Este subgrupo viral foi, também, enc ontrado em pac ientes c hilenos c om PET/MAH1 8_{, o que c orrobora estudos anteriores} que relatam que a maioria das c epas de HTLV-1 isoladas da Améric a do Sul pertenc e ao subgrupo Transc ontinental1 1 2 6_.

As c omparaç ões das seqüênc ias nuc leotídic as da região 5 ’LTR e do mapa de restriç ão entre as amostras c om PET/ MAH e e n tr e e s ta s c o m c e p a s i s o l a da s de p a c i e n te s a s s into m á tic o s de s c r ito s na lite r a tur a , r e ve lo u e le va da sim ila r ida de nã o ha ve ndo dife r e nç a s signific a tiva s q ue possam justific ar a patogenic idade do vírus e, o fato de que apenas 0 ,2 a 5 % dos indivíduos infec tados desenvolvem a

PET/MAH7 2 5_{. Contudo, somente um estudo envolvendo um}

número maior de indivíduos c om diagnóstic o desta patologia poderá c onfirmar ou não essa hipótese.

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