UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MICROPARTÍCULAS DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO)/POLOXÂMERO OBTIDAS POR
SPRAY DRYING PARA LIBERAÇÃO MODIFICADA DE METOTREXATO
DISCENTE: EDILENE GADELHA DE OLIVEIRA
ORIENTADOR: Prof. Dr. ARNÓBIO ANTÔNIO DA SILVA JÚNIOR
EDILENE GADELHA DE OLIVEIRA
MICROPARTÍCULAS DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO)/POLOXÂMERO OBTIDAS POR SPRAY DRYING PARA LIBERAÇÃO MODIFICADA DE METOTREXATO
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre do curso de Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. ARNÓBIO ANTÔNIO DA SILVA JÚNIOR
"Tudo o que um sonho precisa para ser realimado é
alguém que acredite que ele possa ser realimado”.
Dedico este trabalho a Deus, pela força, coragem e paciência que me concedeu nos momentos difíceis e por sempre me guiar em busca dos
meus objetivos.
Aos meus pais Edson e Helena, pelo carinho e apoio ao longo da minha
vida, pela dedicação aos filhos, pela mensagem de amor, humildade e perseverança em minha formação pessoal.
Ao meu irmão Evérton, pelos gestos tímidos de carinho, pelas conversas
descontraídas e por me inspirar na busca pelo conhecimento.
Ao meu esposo Afonso, pela compreensão, dedicação e amor nesses
anos de convivência, pelas conquistas compartilhadas, tristemas divididas, enfim obrigada por pensar na minha felicidade em cada projeto da nossa
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Professor Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior pela recepção calorosa no seu grupo de pesquisa, por me dar a oportunidade de crescer como profissional, e por ensinar que conhecimento é para ser repassado para aqueles que o buscam.
A todos os professores da Universidade Federal do Ceará, meu sincero agradecimento pelos ensinamentos durante a graduação e pela iniciação científica na carreira acadêmica.
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN que auxiliam os discentes em suas pesquisas e fazem do Mestrado uma oportunidade única de crescimento profissional.
Ao professor Dr. Anselmo Gomes de Oliveira do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da UNESP – Araraquara/SP pela parceria e contribuição para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores Dr. Euzébio Guimarães, Dra. Rosangela Balaban e Dr. Edson Ito pelas contribuições iniciais no aprimoramento deste trabalho.
Aos nossos colaboradores Prof. Dr. Márcio Assolim, do Departamento de Física Teórica e Experimental, pelas análises de DRX, Prof. Dr. Edson Ito, do Departamento de Engenharia de Materiais, pelas análises de MEV, Prof. Eryvaldo Sócrates, do Laboratório de Sistemas Dispersos (LaSiD), pelos ensaios de CLAE.
À professora Dra. Dulce Araújo e ao doutorando Tiago Roberto, do Núcleo de Processamento Primário e Reúso de Água produzida e Resíduos (NUPRAR), pela parceria e ajuda nos experimentos de análise térmica.
À professora Dra. Paula Machado, do Departamento de Farmácia (UFRN), e ao Dr. Kleber Silva, do Laboratório de Doenças Infecciosas e Câncer (LADIC), Centro de Biociências-UFRN, pela atenção, carisma e disponibilidade na realização dos estudos em cultura de células.
À doutoranda Camila Machado (Pós-graduação em Química-UFRN) e à professora Dra. Tereza Neuma pela ajuda nos experimentos de determinação do tamanho de partícula no Laboratório de Tecnologia em Tensoativos (LTT).
A todos os professores e alunos do Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica (TecBioFar), em especial, Margarete Moreno pela acolhida no laboratório e pela amizade, Edinara Targino pelas tristezas divididas e alegrias multiplicadas, Polyanne Nunes pela força nos momentos difíceis e sua bondade, Alice Rodrigues pela ajuda nos experimentos e pelos ensinamentos, Letícia Streck pela sua sofisticação e comprometimento.
À mestranda Izadora de Souza, pela amizade, simpatia e disponibilidade nos estudos em cultura de células.
Aos alunos de iniciação científica, em especial, Iaponira Roque, pelas longas horas de experimentos, compreensão nos momentos mais estressantes e companheirismo.
Às minhas amigas e mestrandas Bárbara Cabral e Samara Ferreira, pela amizade, simplicidade e pelas angústias superadas.
Às secretárias do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Aureliana e Fábia, pela paciência, disposição e comprometimento.
Às instituições de fomento CAPES e CNPq pelo apoio financeiro e recursos que possibilitaram o desenvolvimento deste trabalho.
RESUMO
Novos sistemas de liberação de fármacos vêm sendo utilizados para aumentar a eficácia de quimioterápicos devido à possível resistência de células cancerígenas. As micropartículas de poli (ácido láctico) (PLA) constituem uma alternativa para diminuir a toxicidade e prolongar a liberação do metotrexato (MTX). Além disso, o uso de blendas poliméricas PLA/poloxâmeros pode melhorar o perfil de liberação do fármaco devido a mudanças nas interações das partículas com superfícies biológicas. O objetivo do estudo foi desenvolver micropartículas biodegradáveis de MTX produzidas por spray drying e avaliar as interações entre o PLA e os diferentes tipos de Pluronic® (PLUF127 e PLUF68) para modular a liberação do fármaco. As variáveis de composição incluíram razões fármaco:polímero (1:10; 1:4,5; 1:3) e polímero:copolímero (25:75, 50:50, 75:25). A reprodutibilidade e a eficácia do método de spray drying foram confirmadas pela alta eficiência de incorporação dos sistemas (75,0-101,3%). As micropartículas de MTX/PLA apresentaram-se esféricas com superfície aparentemente lisa. Este formato mostrou-se dependente da razão polímero:copolímero nas partículas contendo blendas. A análise térmica e a difração de raios-X sugerem que há dispersão do fármaco por toda a matriz, enquanto que a miscibilidade entre os componentes foi dependente da razão polímero:copolímero. Nenhuma ligação química entre o fármaco e o polímero foi identificada pela análise de FTIR. As micropartículas de PLA contendo MTX apresentaram perfil de liberação prolongada, a qual se ajustou ao modelo cinético de Korsmeyer-Peppas. O PLU acelerou a taxa de liberação in vitro do fármaco devido a sua possível saída da matriz polimérica. Por outro lado, estudos de liberação do fármaco realizados em cultura de células demonstraram que o PLU modulou a taxa de MTX liberado a partir de micropartículas constituídas por blendas. Este efeito foi confirmado pela citotoxicidade dos sistemas estudados, de acordo com a quantidade de fármaco liberado em função do tempo. Portanto, o uso de PLU foi capaz de melhorar o perfil de liberação de micropartículas de PLA contendo MTX, podendo ser utilizado como carreador para modular a liberação do fármaco com potencial aplicação in vivo.
ABSTRACT
New drug delivery systems have been used to increase chemotherapy efficacy due the possible drug resistance of cancer cells. Poly (lactic acid) (PLA) microparticles are able to reduce toxicity and prolong methotrexate (MTX) release. In addition, the use of PLA/poloxamer polymer blends can improve drug release due to changes in the interaction of particles with biological surfaces. The aim of this study was developing spray dried biodegradable MTX-loaded microparticles and evaluate PLA interactions with different kinds of Pluronic® (PLUF127 and PLUF68) in order to modulate drug release. The variables included different drug:polymer (1:10, 1:4.5, 1:3) and polymer:copolymer ratios (25:75, 50:50, 75:25). The precision and accuracy of spray drying method was confirmed assessing drug loading into particles (75.0-101.3%). The MTX/PLA microparticles showed spherical shape with an apparently smooth surface, which was dependent on the PLU ratio used into blends particles. XRD and thermal analysis demonstrated that the drug was homogeneously dispersed into polymer matrix, whereas the miscibility among components was dependent on the used polymer:copolymer ratio. No new drug- polymer bond was identified by FTIR analysis. The in vitro performance of MTX-loaded PLA microparticles demonstrated an extended-release profile fitted using Korsmeyer-Peppas kinetic model. The PLU accelerated drug release rate possible due PLU leached in the matrix. Nevertheless, drug release studies carried out in cell culture demonstrated the ability of PLU modulating drug release from blend microparticles. This effect was confirmed by cytotoxicity observed according to the amount of drug released as a function of time. Thus, studied PLU was able to improve the performance of spray dried MTX-loaded PLA microparticles, which can be successfully used as carries for modulated drug delivery with potential in vivo application.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 16 - Espectros de infravermelho do MTX (A) e do PLA (B), no intervalo de 4000 a 400 cm-1. ... 66 Figura 17 - Espectros de infravermelho das micropartículas 1:10, 1:4,5 e 1:3 MTX/PLA, no intervalo de 4000 a 400 cm-1. ... 67 Figura 18 - Espectros de infravermelho de micropartículas de PLUF127 sem fármaco, MTX/PLUF127, blendas PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF127, nas razões polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25 no intervalo de 4000 a 400 cm-1. ... 68 Figura 19 - Espectros de infravermelho de micropartículas de PLUF68 sem fármaco, MTX/PLUF68, blendas PLA-PLUF68 e MTX/PLA-PLUF68, nas razões polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25 no intervalo de 4000 a 400 cm-1. ... 69 Figura 20 - Difratogramas de raios-X para o metotrexato não atomizado e atomizado, micropartículas de PLA sem fármaco e micropartículas de MTX/PLA (1:10, 1: 4,5 e 1:3) em 2θ no intervalo de 5 a 45°. ... 70 Figura 21 - Difratogramas de raios-X para as micropartículas de PLUF127 sem fármaco, MTX/PLUF127, blendas PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF127, nas razões polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25, em 2θ no intervalo de 5º a 45º. ... 72 Figura 22 - Difratogramas de raios-X para as micropartículas de PLUF68 sem fármaco, MTX/PLUF68, blendas PLA-PLUF68 e MTX/PLA-PLUF68, nas razões polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25, em 2θ no intervalo de 5º a 45º. ... 73 Figura 23 - Curvas TG e DSC do metotrexato em atmosfera de N2 100 mL/min, com
razão de aquecimento de 10°C/min. ... 74 Figura 24 - Curvas TG e DSC de micropartículas de poli (ácido láctico), em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ... 75
Figura 25 - Curvas TG e DSC de micropartículas de Pluronic F127, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ... 75
Figura 26 - Curvas TG e DSC de micropartículas de Pluronic F68, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ... 76
Figura 27 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA, em atmosfera de N2 a 100 mL/min,
com razão de aquecimento de 10°C/min. ... 77 Figura 28 - Curvas TG dos sistemas MTX/PLA, em atmosfera de N2 a 100 mL/min,
Figura 30 - Efeito da concentração de PLA na entalpia de fusão (J/g) do PLUF127 (●) e PLUF68 (○). ... 80 Figura 31 - Curvas TG de blendas PLA-PLUF127 (A) e PLA-PLUF68 (B), nas diferentes razões polímero-copolímero, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com
razão de aquecimento de 10°C/min. ... 81 Figura 32 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, na razão 75:25, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de
10°C/min. ... 81 Figura 33 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ... 82
Figura 34 - Curva analítica do metotrexato em tampão fosfato pH 7,4 (0,05 mol/L) por espectrofotometria UV-Vis em 305 nm. ... 83 Figura 35 - Perfil de liberação do MTX a partir de micropartículas de PLA, contendo razões fármaco:polímero 1:10 (■), 1:4,5 (●) e 1:3 (▼). ... 84 Figura 36 - Avaliação do efeito burst do MTX a partir de micropartículas de PLA contendo razões de fármaco:polímero 1:10 (■), 1:4,5 (●) e 1:3 (▼). ... 85 Figura 37 - Perfis de liberação do fármaco a partir dos sistemas 1:4,5 MTX/PLA (A) e 1:3 MTX/PLA (B), após submetidos ao modelo cinético de Korsmeyer-Peppas (Mt/M∞ = lnK + nlnt). ... 87
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASC Área Sob a Curva
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CV Coeficiente de variação
DHFR Diidrofolato redutase
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DOcc Densidade óptica do controle celular DOmt Densidade óptica do material testado
DP Desvio Padrão
DPR Desvio Padrão Relativo
DRX Difração de raios-X
DSC Calorimetria Diferencial Exploratória
EE Eficiência de encapsulação
FDA Food and Drug Administration
FTIR Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier
HCl Ácido clorídrico
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MTX Metotrexato
MTX/PLA Metotrexato incorporado à matriz de poli (ácido láctico)
MTX/PLA-PLU Metotrexato incorporado à blenda de poli (ácido láctico) e Pluronic® MTX/PLU Metotrexato incorporado à matriz de Pluronic®
NaOH Hidróxido de sódio
PEO Poli (óxido de etileno)
PLA Poli (ácido láctico)
PLA-PLU Blenda de poli (ácido láctico) e Pluronic® sem fármaco PLGA Poli (ácido láctico-co-ácido glicólico)
PLUF127 Micropartículas de Pluronic® F127 sem fármaco PLUF68 Micropartículas de Pluronic® F68 sem fármaco
PPO Poli (óxido de propileno)
QTD Quantidade de fármaco determinado no sistema polimérico SPAN Índice de polidispersão
TF Teor de fármaco incorporado ao sistema
TG Termogravimetria
LISTA DE SÍMBOLOS
μm micrometro
pH potencial hidrogeniônico
°C grau Celsius
g grama
cm3 centímetro cúbico
% porcentagem
® marca registrada
pKa constante de dissociação
α alfa
γ gama
mg miligrama
Q0 quantidade inicial de fármaco
Qt quantidade de fármaco liberado em determinado tempo
t tempo
K0 constante de velocidade de ordem zero
KP constante de liberação de primeira ordem
ft fração de fármaco liberado em determinado tempo KH constante de velocidade de dissolução de Higuchi Mt quantidade de fármaco liberado no tempo inicial
M∞ quantidade de fármaco liberado em determinado tempo
a constante que incorpora características estruturais e geométricas da forma farmacêutica
n expoente de liberação
KKP constante de velocidade de dissolução de Korsmeyer-Peppas
m massa
Mw massa molar ponderada
L litro
nm nanômetro
μg micrograma
p nível de significância
mm milímetro
h hora
mL mililitro
min minuto
kV quilovolts
Cu cobre
Ni níquel
θ teta
cm-1 número de ondas
rpm rotação por minuto
R2 coeficiente de correlação
mAU área de pico
ln logaritmo natural
Q massa de fármaco transportada em um determinado tempo
C concentração da substância que se difunde
X distância do local onde o fármaco se acumulado até a superfície de liberação
D coeficiente de difusão
D90 frequência de tamanho de 90% das partículas
D50 frequência de tamanho de 50% das partículas
D10 frequência de tamanho de 10% das partículas
W watts
J Joule
Tonset temperatura inicial
ΔH variação de entalpia
Tg temperatura de transição vítrea
SUMÁRIO
1INTRODUÇÃO... 21
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA... 22
2.1 Sistemas de Liberação de Fármacos... 22
2.2 Micropartículas poliméricas... 22
2.3 Métodos de microencapsulação... 23
2.3.1 Secagem por atomização... 24
2.3.2 Fundamento da técnica spray drying... 25
2.3.3 Parâmetros relevantes no processo... 26
2.3.3.1 Atomização... 26
2.3.3.2 Ar de secagem... 27
2.3.3.3 Temperatura de entrada e saída... 27
2.4 Poli (ácido láctico)... 28
2.4.1 Síntese do PLA... 28
2.4.2 Degradação do PLA... 30
2.4.3 Características físico-químicas... 30
2.5 Poloxâmeros... 31
2.6 Metotrexato... 33
2.6.1 Características físico-químicas... 33
2.6.2 Mecanismo de ação... 34
2.6.3 Farmacocinética e Toxicidade... 35
2.6.4 Uso clínico... 36
2.6.5 Aplicação de Sistemas de liberação de Fármacos contendo Metotrexato... 36
2.7 Modelos matemáticos utilizados na interpretação da cinética de liberação do metotrexato... 38
2.7.1 Cinética de ordem zero... 38
2.7.2 Cinética de primeira ordem... 39
2.7.3 Modelo de Higuchi... 39
2.7.4 Modelo de Korsmeyer-Peppas... 40
3 OBJETIVOS... 41
3.1 Objetivo geral... 41
3.2 Objetivos específicos... 41
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 42
4.1.1 Matérias-primas... 42
4.1.2 Reagentes e Solventes... 42
4.1.3 Equipamentos e Acessórios... 43
4.2 Validação da metodologia analítica do metotrexato por espectrofotometria UV-Vis... 44
4.2.1 Seleção do comprimento de onda... 44
4.2.2 Seletividade... 44
4.2.3 Linearidade... 44
4.2.4 Precisão... 45
4.2.5 Exatidão... 45
4.2.6 Robustez... 45
4.3 Obtenção de micropartículas... 46
4.4 Análise quantitativa do fármaco nas micropartículas por espectrofotometria UV-Vis... 47
4.4.1 Micropartículas de MTX/PLA... 47
4.4.2 Micropartículas de MTX/PLU e blendas MTX/PLA-PLU... 48
4.5 Caracterização físico-química dos sistemas microparticulados... 49
4.5.1 Determinação do tamanho de partícula... 49
4.5.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)... 49
4.5.3 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)... 49
4.5.4 Difração de raios-X (DRX)... 50
4.5.5 Análise térmica... 50
4.6 Estudo do perfil de liberação in vitro dos sistemas microparticulados... 50
4.6.1 Avaliação da cinética de liberação das micropartículas de MTX/PLA... 51
4.7 Avaliação da citotoxicidade... 51
4.8 Análise estatística... 52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 53
5.1 Validação do método e quantificação do metotrexato por espectrofotometria UV-Vis... 53
5.2 Eficiência de encapsulação dos sistemas microparticulados... 57
5.3 Determinação do tamanho de partícula... 60
5.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)... 61
5.5 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)... 65
5.7 Análise térmica... 73
5.8 Perfil de liberação dos sistemas microparticulados... 83
5.8.1 Perfil e cinética de liberação dos sistemas MTX/PLA... 83
5.8.2 Perfil de liberação das blendas MTX/PLA-PLU... 87
5.9 Avaliação da citotoxicidade dos sistemas microparticulados... 89
6 CONCLUSÕES... 93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 94
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, os sistemas de liberação de fármacos vêm sendo desenvolvidos e otimizados para o tratamento do câncer, principalmente para o aumento da eficiência terapêutica devido ao uso limitado dos quimioterápicos (FORMARIZ et al., 2004, 2006; LIANG et al., 2004; COREM-SALKMON et al., 2011; GONG et al., 2012). O uso de micropartículas poliméricas constitui uma estratégia interessante para prolongar a velocidade de liberação e diminuir a toxicidade desses fármacos, aumentando a eficácia no tratamento farmacológico (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008; YANG et al., 2009).
O metotrexato (MTX) é um fármaco utilizado em vários tipos de câncer, atuando na inibição do metabolismo do ácido fólico. Além disso, tem sido usado no tratamento de doenças autoimunes, como a artrite reumatoide e o lúpus eritematoso sistêmico. No entanto, este possui uma rápida eliminação plasmática, o que limita seu tempo de exposição ao câncer, necessitando de administrações frequentes e altas doses (BANERJEE et al., 2002; CARRETERO et al., 2010; XINQIANG et al., 2010; COREM-SALKMON et al., 2011).
O poli (ácido láctico) (PLA) vem sendo estudado em sistemas de liberação de fármacos devido às suas propriedades de biodegradabilidade e biocompatibilidade. Além disso, possui aprovação pelo FDA para uso humano (GARLOTTA, 2001; MANSOUR et al., 2010; LUCKACHAN; PILLAI, 2011; LASPRILLA et al., 2012). O uso de blendas poliméricas de PLA/poloxâmeros se justifica pela possibilidade de incorporar elementos hidrofílicos a uma matriz hidrofóbica de PLA, o que poderia melhorar as propriedades de solubilidade e estabilidade do fármaco (BONACUCINA et al., 2011) e, consequentemente, modular a sua liberação. Além disso, estudos sugerem que os poloxâmeros podem aumentar a biocompatibilidade de matrizes de PLA (KISS; BERTÓTI; VARGHA-BUTLER, 2002).
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Sistemas de Liberação de Fármacos
O uso de novos sistemas de liberação de fármacos para a otimização do efeito farmacológico dos quimioterápicos já existentes vem sendo extensivamente estudado (FORMARIZ et al., 2004, 2006; COREM-SALKMON et al., 2011). O maior obstáculo para o sucesso do tratamento convencional desses fármacos é a resistência farmacológica das células cancerígenas (GONG et al., 2012).
Uma das maiores vantagens dos sistemas de liberação controlada é a escolha de uma cinética de liberação desejada, ou seja, é necessário manter uma concentração ótima do fármaco, dentro da faixa terapêutica, nas células tumorais ou no sangue, não atingindo subdoses, que tornem o tratamento ineficaz, ou sobredoses que sejam tóxicas ao organismo (PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007).
2.2 Micropartículas poliméricas
Figura 1 - Representação esquemática de um sistema matricial (A) e sistema reservatório (B), constituído de fármaco e polímero, em forma de microesferas e microcápsulas, respectivamente.
Fonte: Autoria própria.
A caracterização de micropartículas envolve a análise de um conjunto de parâmetros com o objetivo de garantir que o processo de obtenção utilizado seja adequado. Dentre eles, o tamanho e a forma, as interações fármaco:polímero, a eficiência de encapsulação e o perfil de liberação do fármaco devem ser considerados (PICOS, 2000).
2.3 Métodos de microencapsulação
A microencapsulação pode ser definida como um processo pelo qual uma ou mais substâncias são envolvidas por um filme polimérico, no entanto pode conduzir à obtenção de partículas que estão dispersas em uma matriz polimérica. A escolha do método a ser usado depende de alguns fatores como o tipo de sistema a ser obtido, a solubilidade do polímero e do fármaco, a permeabilidade e espessura da parede, o tipo e a velocidade de liberação, o tamanho, a forma das partículas e a viabilidade do processo (SILVA-JÚNIOR, 2005; SUAVE et al., 2006). A seleção de uma técnica de produção de micropartículas não pode afetar a estabilidade e a atividade biológica do fármaco. Além disso, a eficiência de encapsulação no sistema polimérico deve ser a mais elevada possível, incluindo um perfil de liberação adequado para o uso pretendido (BENITA, 2006).
2.3.1 Secagem por atomização
A técnica de secagem por atomização ou spray drying permite transformar soluções ou suspensões em um produto sólido, através de uma rápida evaporação do solvente, o que favorece a preparação de dispersões sólidas amorfas (PAUDEL et al., 2013).
A primeira citação da aplicação do método de secagem ocorreu no ano de 1860, sendo que sua primeira patente foi registrada somente em 1872. Os dispositivos primitivos do equipamento spray dryer ocasionavam problemas na eficiência, desempenho e segurança do processo. A partir de 1920, a primeira aplicação industrial deste método foi na produção de leite em pó, após a evolução do processo produtivo. Atualmente ainda continua sendo uma das mais importantes aplicações (ÇELIK; WENDEL, 2005;CAL; SOLLOHUB, 2010).
No campo farmacêutico, essa técnica tem sido bastante difundida para secagem de substâncias ativas, excipientes, encapsulação de vitaminas e produtos biofarmacêuticos (proteínas e peptídeos) que podem ser veiculados em formas farmacêuticas de uso parenteral, nasal ou pulmonar, suspensões, pós e aerossois (ÇELIK; WENDEL, 2005; VEHRING; FOSS; LECHUGA-BALLESTEROS, 2007).
Uma das vantagens desta técnica é a possibilidade de controle da morfologia, do tamanho de partícula e propriedades de fluxo, através da seleção adequada de parâmetros e manipulação de variáveis inerentes ao processo (NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011). Tal técnica se torna adequada para materiais termossensíveis devido ao menor tempo de contato entre a amostra e o calor fornecido ao sistema, através de uma rápida evaporação do solvente (ÇELIK; WENDEL, 2005).
2.3.2 Fundamento da técnica spray drying
A técnica compreende três etapas fundamentais no seu processo de funcionamento: a primeira etapa é a atomização do fluido por um dispositivo adequado, em forma de gotículas. Em seguida, estas são submetidas à interação com um gás de secagem a uma temperatura constante. Durante esta fase, o solvente contido na dispersão de gotículas sofre evaporação, o que resulta na formação de partículas sólidas. Na última fase, as partículas secas devem ser separadas do gás de secagem e coletadas em um recipiente adequado (ÇELIK; WENDEL, 2005; CAL; SOLLOHUB, 2010; NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011). Um esquema representativo deste processo está ilustrado na Figura 2.
Figura 2 - Ilustração esquemática da formação de partículas sólidas, utilizando o processo de secagem por atomização.
Fonte: adaptado de NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011.
A simplicidade e a flexibilidade do funcionamento do equipamento spray
dryer permite a obtenção de uma ampla variedade de produtos farmacêuticos. Na
Figura 3 - Ilustração esquemática de um mini-spray dryer durante o processo de funcionamento.
Fonte: adaptado de AGHBASHLO et al., 2012.
2.3.3 Parâmetros relevantes no processo
As propriedades físico-químicas das micropartículas dependem dos parâmetros do processo de secagem por atomização e da composição da formulação (RATTES; OLIVEIRA, 2007). Alguns dos parâmetros mais críticos do processo incluem a temperatura de entrada e saída, as características do líquido de aspersão (viscosidade, tensão superficial, volatilização do solvente e concentração de sólidos) e o tipo de atomizador (PATEL, R.; PATEL, M.; SUTHAR, 2009).
2.3.3.1 Atomização
A atomização consiste no processo pelo qual um líquido se divide em gotículas, sendo considerada a operação mais importante no processo de secagem (ÇELIK; WENDEL, 2005). A bomba peristáltica é responsável pela alimentação do aparelho com a amostra a ser atomizada. A dispersão é formada dentro de um gás de secagem que favorece o aumento da área de superfície das gotículas, facilitando a transferência de calor do gás aquecido para o fluido atomizado, resultando em rápida evaporação do solvente (BETE®, 2005; CAL; SOLLOHUB, 2010).
líquido, diminuindo a eficiência de atomização devido ao aumento do tamanho das gotas e, consequentemente, do tamanho das partículas formadas (BETE®, 2005). Este aumento da viscosidade depende do solvente e do soluto utilizados na formulação. No caso de soluções orgânicas contendo baixas concentrações de poliésteres alifáticos (como o PLA), não há influência no aumento da viscosidade do líquido, diferentemente de hidrogeis, que formam uma solução altamente viscosa, e por isso, este parâmetro deve ser monitorado (SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
Outro parâmetro a ser considerado é a concentração da solução de alimentação, pois quanto mais concentrada for a amostra, maior será o tamanho e a porosidade das partículas devido ao aumento da quantidade de moléculas de fármaco e/ou polímero por gota (BÜCHI, 2002; SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
Por último, o tipo de atomizador é importante para o controle de homogeneidade na distribuição do tamanho das gotas. Isso acontece devido à diminuição ou aumento da energia de atomização, dependendo do tipo de aspersor. Quanto maior for a energia de atomização, menor será o tamanho da gota (ÇELIK; WENDEL, 2005).
2.3.3.2 Ar de secagem
O aspirador, também conhecido como exaustor, influencia na quantidade de ar de secagem no equipamento. Geralmente o ar atmosférico passa por um sistema de filtros, sendo em seguida, aquecido (CAL; SOLLOHUB, 2010). À medida que a velocidade de aspiração é regulada, a quantidade de ar seco pode aumentar ou diminuir, apresentando efeito significativo no rendimento do processo (BÜCHI, 2002; SILVA-JÚNIOR, 2005). O fluxo de ar de atomização é definido como a quantidade de ar pressurizado necessário para atomizar de forma eficiente a dispersão. Quanto maior o fluxo de ar, menor será o tamanho de partículas. Além disso, a umidade do ar residual deve ser considerada na obtenção do produto final, pois pode favorecer o processo de aglomeração de partículas (BETE®, 2005; SILVA-JÚNIOR, 2005).
A temperatura de entrada é entendida como a temperatura de aquecimento na câmara de secagem. Quando a solução, emulsão ou dispersão é atomizada dentro da câmara de secagem, uma temperatura mais alta favorece termodinamicamente a evaporação do solvente. A temperatura de saída é definida como a temperatura da corrente de ar antes que as partículas sólidas entrem no ciclone. A temperatura do ar de secagem é ajustada para permitir melhor eficiência térmica, sem que ocorra degradação da amostra (BÜCHI, 2002; SILVA-JÚNIOR, 2005; CAL; SOLLOHUB, 2010).
O parâmetro que afeta a temperatura de entrada e de saída é a velocidade de alimentação da amostra a ser atomizada. Quanto maior a taxa de transferência da amostra, mais energia é necessária para evaporar o solvente da dispersão. Quando a velocidade de alimentação é superior à taxa de evaporação do solvente na câmara de secagem, pode ocorrer a formação de partículas aglomeradas e acúmulo de líquido nas paredes do cilindro (BÜCHI, 2002).
2.4 Poli (ácido láctico)
O PLA tem sido investigado em sistemas de liberação de fármacos devido à sua biocompatibilidade e habilidade para ser absorvido e degradado in vivo (MATSUMOTO et al., 2005; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008; MANSOUR et al., 2010; SAEIDLOU et al., 2012). Foi aprovado pelo FDA para uso na terapêutica (LUCKACHAN; PILLAI, 2011).
As micro e nanopartículas de poli (ácido láctico) têm sido estudadas para administração prolongada de uma ampla variedade de substâncias ativas, bem como peptídeos e proteínas (MANSOUR et al., 2010). Existem diferentes tipos de PLA no mercado que podem ser diferenciados quanto à massa molar, grau de cristalinidade, viscosidade e proporção de isômeros (D,L) (BRAGAGNI et al., 2013).
2.4.1 Síntese do PLA
foi proposto como carrea et al., 2012).
Na síntese do assimétrico no ácido lácti o D-PLA e, uma racêmic pela policondensação do ocorre formação de água de massa molar eleva promotores de esterific (GARLOTTA, 2001). O massa molar é a polime láctico cíclico é formado condensação é removida isômeros purificados L-lá poliéster por meio de rea final depende da razão (NAMPOOTHIRI; NAIR; J
Figura 4 – Representação e condensação e/ou de polimeri
Fonte: adaptado de GARLOT
reador de fármacos em matrizes biodegrad
do PLA (Figura 4), a presença de um ctico pode originar duas formas opticamen
ica, o D,L-PLA (SAEIDLOU et al., 2012) do ácido lático apresenta baixa massa m
ua como subproduto da polimerização e, p vada é necessário que solventes org ificação sejam utilizados, adicionando c O método mais comum para a obtenção erização através da abertura de anel. O do durante a primeira etapa quando a á ida por evaporação durante o processo. Na láctico, D-láctico ou D,L-láctico (50:50) reações de condensação. O grau de crista
ão de isômeros (-L) e (-D) obtidos d ; JOHN, 2010).
esquemática da síntese do poli (ácido láctico) a erização por abertura de anel.
TTA, 2001.
radáveis (LASPRILLA
m átomo de carbono ente ativas, o L-PLA e 2). O polímero obtido molar. Nessa reação , para obter polímeros orgânicos e agentes custo ao processo ão do PLA com alta O intermediário ácido água do produto de Na segunda etapa, os ) são convertidos ao stalinidade do produto durante o processo
2.4.2 Degradação do PLA
O PLA sofre degradação por hidrólise não enzimática dos grupos ésteres (LASPRILLA et al., 2012), originando subprodutos não tóxicos, como o ácido láctico, os quais são eliminados pelo metabolismo celular (VERNON; LETOURNEAU, 2010). Sua degradação geralmente ocorre pela cisão da cadeia principal e cadeias laterais da macromolécula por processos físicos, químicos e biológicos como ativação térmica, hidrólise, atividade biológica, oxidação, fotólise ou radiólise. Esses fenômenos dependem de fatores como massa molar, cristalinidade, pureza, temperatura, pH e grupos terminais carboxil e hidroxil (NAMPOOTHIRI; NAIR; JOHN, 2010).
2.4.3 Características físico-químicas
O PLA (Figura 5) pode existir como diferentes isômeros, sendo que estes diferem quanto à taxa de degradação, propriedades físicas e mecânicas. O L-PLA e D-PLA têm natureza semicristalina devido à alta regularidade da sua cadeia polimérica, enquanto que o D,L-PLA possui estrutura amorfa (GARLOTTA, 2001; LUCKACHAN; PILLAI, 2011). A cristalinidade é crucial para o controle da taxa de degradação, resistência térmica e mecânica (SAEIDLOU et al., 2012). O L-PLA possui excelente biocompatibilidade e propriedades mecânicas. No entanto, a sua degradação a longo prazo pode causar reações inflamatórias no organismo. Por outro lado, o D,L-PLA é mais rapidamente degradado no organismo em relação aos outros isômeros (FUKUSHIMA; KIMURA, 2008). As propriedades físico-químicas dos isômeros do PLA podem ser encontradas na Tabela 1.
Fonte: GARLOTTA, 2001.
Tabela 1 - Propriedades físico-químicas das formas estereoquímicas do PLA
Fonte: adaptado de SÖDERGARD; STOLT, 2002; NAMPOOTHIRI; NAIR; JOHN, 2010.
O poli (ácido láctico) com quantidade de L-PLA maior que 90% tende a ser cristalino, influenciando na temperatura de transição vítrea (Tg) e na temperatura
de fusão (Tf) do polímero. A entalpia de fusão estimada para o PLA 100% cristalino
(ΔHºf) é de 93 J/g. Para o PLA amorfo, a Tg é um dos principais parâmetros a ser
considerado devido à mobilidade da cadeia polimérica, enquanto que, para o PLA semicristalino, a Tf é determinante nesse processo (LASPRILLA et al., 2012).
As propriedades da matriz polimérica, tais como o comprimento e a flexibilidade da cadeia do polímero, intumescimento, interações entre o polímero e o fármaco, tamanho e porosidade das partículas influenciam diretamente na taxa de liberação do fármaco (MANSOUR et al., 2010). Por isso, é interessante realizar a caracterização físico-química de micropartículas, anteriormente ao estudo de dissolução in vitro, facilitando, assim, a elucidação dos mecanismos de liberação do fármaco.
2.5 Poloxâmeros
Os poloxâmeros, também conhecidos como Pluronics®, são copolímeros não-iônicos dispostos em blocos, que consistem de um grupo hidrofílico poli (óxido de etileno) (PEO) e um outro hidrofóbico poli (óxido de propileno) (PPO), organizados em tribloco PEO-PPO-PEO (Figura 6). Esses copolímeros com diferentes números de unidades PEO e PPO são caracterizados por diferentes equilíbrios hidrófilo-lipófilo (EHL) (BATRAKOVA; KABANOV, 2008).
Formas estereoquímicas do PLA Temperatura de transição vítrea (ºC) Temperatura de fusão (ºC) Densidade
(g/cm3) Solubilidade
L-PLA 50-80 173-178 1,290
Clorofórmio, dioxano, acetonitrila,
cloreto de metileno
D-PLA 40-50 120-150 1,248
Etilacetato, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano,
etillactato
Os principais tipos de poloxâmeros são o poloxâmero 188 (PEO80-PPO27
-PEO80) também conhecido como Pluronic® F68, e o poloxâmero 407 (PEO101-PPO56
-PEO101), mais conhecido como Pluronic® F127 (USP, 2007). Estes apresentam
praticamente a mesma fração de massa de PEO, 80 e 70%, respectivamente, mas o comprimento da cadeia do bloco PPO é maior no PLUF127 que no PLUF68 (ALEXANDRIDIS; TSIANOU,2011).
Fonte: PATEL, H.; PATEL, R.; PATEL, M., 2009.
Devido ao seu caráter anfifílico, os poloxâmeros apresentam propriedades surfactantes, incluindo a habilidade de interagir com superfícies e membranas biológicas, bem como auxiliar na solubilização de fármacos pouco solúveis em água, o que permite seu uso em administração parenteral de agentes quimioterápicos (BONACUCINA et al., 2011). Além disso, estudos revelam que os Pluronics® podem inibir o efluxo de fármacos através da Glicoproteína-P, diminuindo a resistência de células cancerígenas a fármacos antineoplásicos (GIFFORD et al., 1998; BATRAKOVA; KABANOV, 2008; SHIBAYAMA; TAKEDA; YAMADA, 2009).
Os poloxâmeros são ainda utilizados em formulações como agentes emulsificantes, solubilizantes e dispersantes, sendo frequentemente considerados como excipientes funcionais porque constituem componentes essenciais e têm papel fundamental na formulação (PATEL, H.; PATEL, R.; PATEL, M., 2009). Atuam como surfactante não-iônico em uma concentração de 20 a 30% (ALEXANDRIDIS; TSIANOU, 2011).
como formador de matriz in situ, pela formação de gel, para uso em sistemas de liberação de fármacos (GUO et al., 2007; MOEBUS; SIEPMANN; BODMEIER, 2009; BONACUCINA et al., 2011). Estes têm sido bastante utilizados na área médica, farmacêutica e cosméticos, sendo que no campo farmacêutico, há maior interesse em géis, microemulsões, nanopartículas e blendas de polímeros sólidos (GUO et al., 2007).
2.6 Metotrexato
Alguns dos fatores que restringe o uso de fármacos quimioterápicos são o aparecimento de resistência farmacológica e a toxicidade destes compostos. O desenvolvimento de sistemas de liberação controlada vem sendo aprimorado no sentido de diminuir os efeitos adversos de antineoplásicos (MANSOUR et al., 2010; GONG et al., 2012; MEI et al., 2013). O uso do metotrexato foi iniciado empiricamente em 1951 para tratamento da psoríase e artrite reumatoide, mas somente em 1958 ocorreu a publicação dessa descoberta. Em 1972, o MTX foi aprovado pelo FDA para tratamento de psoríase (CARRETERO et al., 2010). Este fármaco apresenta alto índice de resistência e toxicidade, portanto vem sendo investigado em micropartículas biodegradáveis (BANERJEE et al., 2002; SILVA-JÚNIOR, 2005, 2008; PATEL, H.; PATEL, B.; PATEL, V., 2010).
2.6.1 Características físico-químicas
solução alcalina, é classificado como classe III no Sistema de Classificação Biofarmacêutica (alta solubilidade e baixa permeabilidade), encontrando-se na forma ionizada (LINDENBERG; KOPP; DRESSMAN, 2004).
.
Fonte: OLIVEIRA et al., 2013.
2.6.2 Mecanismo de ação
O MTX é análogo do ácido fólico, este possui denominação de N-[4-[[(2-amino-3,4-diidro-4-oxo-6-pteridinil) metil]amino]benzoil]-L-glutâmico (Figura 8), também conhecido como ácido pteroilglutâmico ou vitamina B9 (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010), solúvel em água, é um dos mais importantes componentes do sistema hematopoético, sendo a coenzima que controla a geração de ferro heme no organismo (FLORES et al., 2005).
Fonte: RUBINO, 2001.
Figura 7 - Representação esquemática da estrutura química do metotrexato
O fármaco atua como um antagonista do ácido fólico e tem alta afinidade pela dihidrofolato redutase (DHFR), enzima necessária para a conversão do diidrofolato em tetraidrofolato (forma ativa), importante para a formação de purinas e timidinas. Isso promove a inibição da síntese do DNA e, consequentemente, ocasiona morte celular (CHLÁDEK et al., 1998; RUBINO, 2001; WARREN; GRIFFITHS, 2008; COREM-SALKMON et al., 2011; FDA, 2013). O metotrexato se liga fortemente à enzima DHFR, de forma competitiva. No entanto, essa ligação é reversível. Portanto, um grande número de moléculas do fármaco precisa estar no sítio de ação para manter a inibição (CARRETERO et al., 2010).
2.6.3 Farmacocinética e Toxicidade
O MTX, quando administrado em doses pequenas por via oral, é rapidamente absorvido, enquanto que, em altas doses, a absorção é incompleta por causa da saturação do transporte. Uma vez absorvido, o fármaco é parcialmente inativado no trato intestinal e no fígado, o que significa baixa biodisponibilidade. Níveis séricos do fármaco são conseguidos 1 a 2 horas após administração oral e, de 30 a 60 minutos, após injeção intramuscular (CARRETERO et al., 2010). Seus principais metabólitos são 7-hidroxi-metotrexato e 4-amino-4-deoxi-N10-ácido metilpteroico (RUBINO, 2001).
O tempo de meia-vida de eliminação é de, aproximadamente, 3 a 10 horas para pacientes com psoríase ou artrite reumatoide (HERNANDEZ-BALDIZON, 2012; FDA, 2013). O tempo de meia-vida da fase de absorção é de 10 minutos e da fase de distribuição é de, aproximadamente, 2 horas (RUBINO, 2001). Devido a essa característica, o MTX necessita ser administrado frequentemente para atingir o efeito terapêutico esperado. A excreção do fármaco é 90% (renal) e 10% (gastrointestinal), sendo eliminado praticamente inalterado pela urina por filtração e secreção ativa (CARRETERO et al., 2010; HERNANDEZ-BALDIZON, 2012).
tóxicos é a causa mais frequente de descontinuação do tratamento farmacológico (TIAN; CRONSTEIN, 2007; CARRETERO et al., 2010).
2.6.4 Uso clínico
O uso clínico do MTX inclui o tratamento de diversas neoplasias, como carcinoma da bexiga, cervical, da mama, ovariana, da próstata, do pulmão, renal e testicular (COREM-SALKMON et al., 2011). Utilizado também para o tratamento de leucemia linfocítica aguda, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase e doença de Crohn (BITTENCOURT; BRUNSTEIN, 2006; LIANG et al., 2009; PATEL, H.; PATEL, B.; PATEL, V., 2010).
A artrite reumatoide é uma doença sistêmica autoimune caracterizada por poliartrite simétrica, crônica e deformante que produz incapacidade articular a longo prazo, se não for controlada. O medicamento de escolha para esta enfermidade é o MTX e, tradicionalmente, sua dose inicial recomendada tem sido 7,5 a 10 mg, com doses de ácido fólico de 5 a 10 mg ao dia (HERNANDEZ-BALDIZON, 2012). Apesar de o mecanismo de ação do fármaco na artrite reumatoide ser pouco conhecido, baixas doses de MTX parecem exercer efeito antiinflamatório por ação patofisiológica (LIANG et al., 2009). Estudos revelam que há inibição da produção de citocinas proinflamatórias, promovendo a liberação de adenosina ou ativando células T de apoptose, suprimindo a proliferação de linfócitos e neutrófilos (TIAN; CRONSTEIN, 2007; WARREN; GRIFFITHS, 2008; XINQIANG et al., 2010).
2.6.5 Aplicação de Sistemas de Liberação de Fármacos contendo Metotrexato
para tumores dentro de uma faixa terapêutica desejada (WOLINSKY; COLSON; GRINSTAFF, 2012).
Estudos com micelas poliméricas para incorporação de metotrexato foram realizados por Zhang e colaboradores (2005), que avaliaram as características físico-químicas destes sistemas e a liberação do fármaco in vitro, demonstrando ótimo potencial como carreador de fármacos anticâncer pouco solúveis em água. Além disso, outros sistemas poliméricos, como os dendrímeros, também foram estudados para avaliar a influência na liberação desse fármaco (DHANIKULA; HILDGEN, 2007).
Patel e colaboradores (2010) desenvolveram micropartículas de PLGA contendo metotrexato, obtidas pela técnica de evaporação por solvente, e realizaram a caracterização físico-química desses sistemas, os quais podem ser utilizados para liberação controlada de fármacos antitumorais devido à diminuição da toxicidade do MTX. As micropartículas de α-lactalbumina para controle da liberação desse fármaco foram estudadas por Vijayaragavan et al. (2011), obtidas pela técnica de emulsificação em solução aquosa e estabilizadas por reticulações com glutaraldeído. A α-lactalbumina foi utilizada como novo carreador de fármacos com grande potencial de aplicação na administração do MTX.
Corem-Salkmon et al. (2011) desenvolveram um sistema de nanopartículas ligadas à maghemita superparamagnética para liberação de metotrexato por convecção aprimorada, técnica para a liberação de fármacos diretamente em tumores cerebrais, contendo albumina sérica humana como revestimento para tratamento de gliomas. As nanopartículas de MTX apresentaram eficientes volumes de distribuição e lento tempo de depuramento in vivo, o que sugere a eficácia destas partículas no tratamento farmacológico.
Após revisão da literatura, não foram encontrados trabalhos sobre a obtenção de micropartículas pela técnica de secagem por atomização, contendo blendas poliméricas PLA-Pluronic®, no intuito de modular a liberação do metotrexato. Portanto, o presente trabalho apresenta a estratégia do uso de micropartículas de PLA e blendas PLA-PLU para a melhoria da eficácia terapêutica de quimioterápicos. Devido à biocompatibilidade, biodegradabilidade dos materiais utilizados e à diminuição de toxicidade do fármaco, a presente pesquisa pretende estabelecer sistemas carreadores de fármacos biodegradáveis e estáveis com potencial para uso
in vivo.
2.7 Modelos matemáticos utilizados na interpretação da cinética de liberação do metotrexato
Vários modelos cinéticos descrevem a dissolução do fármaco para sistemas de liberação imediata e modificada. Estes representam o perfil de liberação do fármaco, onde a quantidade de substância dissolvida é representada graficamente em função do tempo. A interpretação dos valores obtidos no ensaio de dissolução é facilitada pelo uso de equações genéricas que traduzem matematicamente a curva de dissolução em função de algum parâmetro relativo à forma farmacêutica (COSTA; LOBO, 2001).
2.7.1 Cinética de ordem zero
A liberação de formas farmacêuticas que não se desagregam e que liberam o fármaco lentamente pode ser expressa da seguinte maneira:
Q0–Qt=K0t (1)
onde, Q0 é a quantidade inicial de fármaco, Qt é a quantidade de fármaco liberado em determinado tempo te K0 a constante de proporcionalidade. Quando se divide a
equação acima por Q0 e simplificando, pode-se dizer que ft = K0t, sendo que ft = 1-
relação pode ser aplicada a formas farmacêuticas de liberação modificada como comprimidos matriciais que contêm fármacos pouco solúveis. As formas farmacêuticas que seguem este perfil liberam a mesma quantidade de fármaco por unidade de tempo, portanto este é o modelo ideal para uso em liberação prolongada (MANADAS; PINA; VEIGA, 2002).
2.7.2 Cinética de primeira ordem
A aplicação deste modelo aos estudos de dissolução foi proposta pela primeira vez por Gibaldi e Feldman (1967 apud COSTA, 2002). Hixson e Crowell adaptaram a equação de Noyes-Whitney [dC/dt = K(Cs – Ct)], onde C é a concentração do soluto no tempo t, Cs é a solubilidade no equilíbrio na temperatura experimental. De um modo simples, este modelo pode ser expresso pela seguinte relação:
log Qt= log Q0+
KP t
2,303 (2)
onde Qt é a quantidade de fármaco liberado em determinado tempo t, Q0 é a quantidade inicial de fármaco e KP é a constante de liberação de primeira ordem. As formas farmacêuticas que contêm fármacos hidrossolúveis em matrizes porosas, que seguem este modelo, liberam o fármaco de forma proporcional à quantidade remanescente, sendo que a quantidade de fármaco liberada por unidade de tempo diminui (MULYE; TURCO, 1995 apud MANADAS; PINA; VEIGA, 2002).
2.7.3 Modelo de Higuchi
Higuchi desenvolveu diversos modelos para analisar a liberação do fármaco a partir de formas farmacêuticas constituídas por matrizes homogêneas esféricas e matrizes não homogêneas planas ou esféricas (MANADAS; PINA; VEIGA, 2002). Genericamente, é possível resumir o modelo de Higuchi à seguinte expressão:
ft = KH t
1
onde KH é a constante de velocidade de dissolução de Higuchi, que descreve a
liberação do fármaco como um processo de difusão baseado na lei de Fick (COSTA, 2002). Este modelo pode ser usado para descrever a dissolução de fármacos a partir de diversas formas farmacêuticas de liberação modificada, tais como alguns sistemas transdérmicos, e comprimidos matriciais com fármacos hidrossolúveis (COSTA; LOBO, 2001).
2.7.4 Modelo de Korsmeyer-Peppas
O modelo semi-empírico de Korsmeyer-Peppas ou lei das Potências é aplicado, permitindo a obtenção dos parâmetros a e n, com a finalidade de ampliar a informação sobre o mecanismo de liberação do fármaco a partir dos sistemas microparticulados (SIEPMAN; PEPPAS, 2012). Este modelo pode ser representado pela seguinte equação:
Mt
M∞= KKP t
n (4)
onde, KKP é uma constante que incorpora características estruturais e geométricas
da forma farmacêutica, n é o expoente de liberação, indicativo do mecanismo de liberação do fármaco, e a função de t é Mt /M∞ (fração do fármaco liberado). Esta
expressão pode ser reescrita da seguinte forma: Mt/M∞ = lnKKP + nlnt.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
• Desenvolver e caracterizar micropartículas de poli (ácido láctico) e blendas poliméricas PLA/poloxâmeros, obtidas pela técnica de secagem por atomização, no intuito de modular a liberação do metotrexato.
3.2 Objetivos específicos
• Validar e aplicar a metodologia analítica do metotrexato;
• Preparar micropartículas de MTX/PLA, nas razões fármaco:polímero (1:10, 1:4,5 e 1:3), MTX/PLUF127 e F68, blendas MTX/PLA-PLUF127 e PLA-PLUF68, na proporção fármaco:polímero (1:3) e polímero:copolímero (25:75, 50:50, 75:25) pela técnica de spray drying;
• Investigar os parâmetros de eficiência de encapsulação e teor de fármaco incorporado aos sistemas microparticulados;
• Determinar o tamanho de partícula dos sistemas microparticulados pela técnica de espalhamento de luz dinâmico;
• Avaliar o tamanho e a forma das partículas por microscopia eletrônica de varredura (MEV);
• Avaliar os sistemas obtidos por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), difração de raios-X (DRX) e análise térmica;
• Avaliar o perfil e cinética de liberação in vitro dos sistemas microparticulados obtidos;
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Matérias-primas
• Metotrexato - DEG (Brasil);
• D,L-PLA (viscosidade inerente 0,67 dL/g a 25°C; massa molar aproximada de 100.000 g/mol) - BIRMINGHAM POLYMERS Inc. (USA);
• Pluronic® F68 (Mw = 8.400 g/mol) – SIGMA-ALDRICH;
• Pluronic® F127 (Mw =12.600 g/mol) – SIGMA-ALDRICH;
4.1.2 Reagentes e Solventes
• Acetato de amônio – QHEMIS (Brasil);
• Acetona – VETEC (Brasil);
• Ácido acético glacial – VETEC (Brasil);
• Ácido clorídrico – LABSYNTH;
• Água purificada (condutividade 0,1 µS/cm a 25°C);
• Água ultrapura (MilliQ®);
• Dimetilsulfóxido (DMSO) – VETEC (Brasil);
• Fosfato de potássio monobásico – VETEC (Brasil);
• Hidróxido de sódio – QHEMIS (Brasil);
• Meio de cultura Leibowitz (L-15) – SIGMA-ALDRICH;
• Metanol grau HPLC – HEXIS CIENTÍFICA;
• 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio brometo (MTT) – SIGMA-ALDRICH;
• Soro fetal bovino (SFB) – INVITROGEN;
• Antibiótico-antimicótico – SIGMA-ALDRICH;
4.1.3 Equipamentos e Acessórios
• Balança analítica – GEHAKA, modelo AG – 200;
• pHmetro – GEHAKA, modelo PG – 1800;
• Lavadora Ultra-sônica – UNIQUE, modelo USC – 1400;
• Espectrofotômetro – UV-Vis BIOCRROM, modelo Libra S32;
• Espectrofotômetro – UV-Vis EVOLUTION, modelo 60S;
• Spray dryer – BÜCHI , modelo 191;
• Cromatógrafo líquido de alta eficiência, dotado de detector de ultravioleta – THERMO SCIENTIFIC, modelo Surveyor Plus LC/MS;
• Difratômetro – RIGAKU, modelo Miniflex II;
• Espectrofotômetro infravermelho – PERKIN ELMER, modelo Spectrum 65;
• Centrífuga – EXCELSA II, modelo 206 BL;
• Microscópico Eletrônico de Varredura – HITACHI, modelo TM 3000;
• Banho termostático – SOLAB, modelo SL-150/22;
• Analisador de partículas Light Scattering – Nanotrac, modelo NPA252;
• Equipamento simultâneo TGA-DSC – TA INSTRUMENTS, modelo SDT Q600;
4.2 Validação da metodologia analítica do metotrexato por espectrofotometria UV-Vis
4.2.1 Seleção do comprimento de onda
Foi realizada a varredura do comprimento de onda da solução de metotrexato em ácido acético 0,1 mol/L em uma concentração de 10 μg/mL, utilizando uma cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico, para obtenção do espectro de absorção na região do ultravioleta (200 a 400 nm).
4.2.2 Seletividade
A seletividade foi analisada comparando os espectros de ultravioleta obtidos da análise da solução do fármaco (MTX), da solução dos polímeros (PLA, PLUF127, PLUF68) e da solução do fármaco contendo os componentes da matriz para avaliar a especificidade do método em relação ao metotrexato.
4.2.3 Linearidade
4.2.4 Precisão
A precisão intra-dia, inter-dia e a reprodutibilidade foram avaliadas a partir do coeficiente de variação obtido em cinco diferentes concentrações de MTX, sendo que duas foram localizadas abaixo, uma intermediária e duas acima do meio da curva analítica. A precisão intra-corrida foi realizada em um estreito intervalo de tempo, a inter-corrida, com intervalo de dois dias e manipuladores distintos entre as análises, e a reprodutibilidade em laboratórios diferentes. Cada ensaio foi realizado em triplicata. Os resultados obtidos foram submetidos ao teste t-Student (nível de significância: p < 0,05).
4.2.5 Exatidão
A exatidão foi avaliada pelo método da recuperação por placebo contaminado. Foi preparada uma solução padrão do fármaco contaminada com PLA. Desta solução, foram obtidas cinco concentrações da curva analítica. Os resultados deste ensaio foram submetidos à ANOVA e aplicados na equação a seguir para obter a % de recuperação do MTX.
Exatidão= Concentração média experimental
Concentração teórica x100 (5)
4.2.6 Robustez
4.3 Obtenção de micropartículas
As micropartículas de PLA contendo metotrexato foram obtidas a partir de soluções atomizadas em aparelho de spray dryer BÜCHI-191, usando aspersor de diâmetro 0,7 mm, em diferentes proporções fármaco:polímero (1:10; 1:4,5; 1:3), com o objetivo de se obter sistemas microparticulados com o máximo de fármaco incorporado. Os componentes foram pesados e dissolvidos em uma mistura de ácido acético glacial e acetona (1:4). Os lotes foram produzidos em triplicata para avaliar a reprodutibilidade do método de produção. Foram também preparadas micropartículas de PLA sem fármaco.
Para a obtenção de micropartículas de MTX/PLUF127 e F68, sistemas contendo blendas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, na razão fármaco:polímero (1:3) e polímero:copolímero (25:75, 50:50 e 75:25), foi realizado o procedimento descrito anteriormente. No entanto, para a preparação de micropartículas sem fármaco, os componentes foram dissolvidos somente em acetona. Após o processo de secagem por atomização, o material foi coletado e armazenado sob vácuo à temperatura ambiente. A razão fármaco:polímero de 1:3, para sistemas MTX/PLU e MTX/PLA-PLU, foi utilizada devido à possibilidade de incorporar uma maior quantidade de fármaco na micropartícula.
Tabela 2 - Parâmetros utilizados durante o processo de secagem por atomização para obtenção de micropartículas.
O processo produtivo e as análises físico-químicas foram realizadas sob condições assépticas adequadas, garantindo a biossegurança do operador por meio do uso de máscaras e luvas. Em relação ao descarte do material, o fármaco e as micropartículas contendo metotrexato, após serem analisados pelas técnicas analíticas, foram descartados em hipoclorito de sódio, utilizando recipiente adequado para seu armazenamento, sendo posteriormente recolhido por empresa especializada para o descarte final dos resíduos.
4.4 Análise quantitativa do fármaco nas micropartículas por espectrofotometria UV-Vis
4.4.1 Micropartículas de MTX/PLA
A quantidade de micropartículas de PLA contendo metotrexato equivalente a 2,5 mg de fármaco foi dissolvida em solução de ácido acético 20% para obter uma solução estoque na concentração de 250 μg/mL. Alíquotas desta solução foram transferidas para balões volumétricos de 10 mL e o volume foi aferido com solução de ácido acético 0,1 mol/L, a fim de obter soluções na concentração de 10 μg/mL, as quais foram analisadas em triplicata, por espectrofotometria UV-Vis, no comprimento de onda de 305 nm, de acordo com a metodologia validada citada anteriormente.
Sistema Temperatura de entrada (°C)
Temperatura de saída (°C)
Fluxo do ar de atomização (NL/h) Fluxo da bomba de alimentação (%) Eficiência do exaustor (%)
MTX/PLA 80 63 500 5 90
PLA 80 63 500 5 90
MTX/PLU 80 63 500 5 90
MTX/PLA-PLUF127 80 63 500 5 90
PLA/PLUF127 60 48 500 5 90
PLUF127 60 48 500 5 90
MTX/PLA-PLUF68 80 63 500 5 90
PLA/PLUF68 50 43 500 5 90
4.4.2 Micropartículas de MTX/PLU e blendas MTX/PLA-PLU
Uma quantidade de micropartículas, equivalente a 2,5 mg de fármaco, foi dissolvida em solução de ácido acético glacial. Em seguida, adicionou-se água purificada e, após filtração, foi obtida uma solução estoque na concentração de 250 μg/mL. Alíquotas desta solução foram transferidas para balões volumétricos de 10
mL e o volume foi aferido com solução tampão acetato de amônio (pH 6,0; 0,05 mol/L) e metanol na razão 75:25 a fim de obter soluções na concentração de 8 μg/mL, as quais foram analisadas em triplicata através de Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE), de acordo com a metodologia previamente validada pelo grupo de pesquisa, utilizando os seguintes parâmetros cromatográficos: detecção UV (λ = 303 nm), fluxo (1 mL/min), coluna de fase reversa (Thermo Hypersil C18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), fase móvel (tampão acetato de amônio:metanol 75:25) e volume de injeção (25 μL). As amostras foram previamente filtradas em membrana de nylon, com diâmetro do poro de 0,22 μm, antes de serem injetadas no equipamento. Uma curva padrão para o doseamento do fármaco foi construída a partir de soluções entre 2,0 a 12,0 μg/mL, em tampão acetato de amônio:metanol 75:25. A eficiência de encapsulação e o teor de fármaco incorporado foram calculados de acordo com as equações a seguir.
EE % = QTD
QTA x 100 (6)
sendo, EE, a eficiência de encapsulação; QTD, a quantidade de fármaco determinado no sistema polimérico e QTA, a quantidade de fármaco teoricamente adicionada ao sistema polimérico.
TF % = TTF x EE
100 (7)
4.5 Caracterização físico-química dos sistemas microparticulados
4.5.1 Determinação do tamanho de partícula
O diâmetro médio e a distribuição de tamanho de partícula foram determinados pela técnica de espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light
Scattering) em um Nanotrac NPA252, utilizando o Programa Flex 10.4.3. As
micropartículas foram dispersas em uma mistura dos solventes hexano e acetato de etila. O diâmetro médio baseado no volume foi utilizado como parâmetro para a distribuição do tamanho de partícula. Os diâmetros correspondentes a 10%, 50% e 90% da distribuição de partículas foram determinados a partir da média de três medidas de cada amostra. O índice de polidispersão (SPAN) da análise granulométrica foi calculado a partir da equação abaixo (SANSONE et al., 2011).
SPAN= D90-D10
D50 (8)
onde, D90 é a frequência de tamanho de 90% das partículas (μm); D50 é a frequência de tamanho de 50% das partículas (μm); D10 é a frequência de tamanho de 10% das partículas (μm).
4.5.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras de metotrexato não atomizado e atomizado, micropartículas de PLA sem fármaco, sistemas MTX/PLA, MTX/PLU e blendas MTX/PLA-PLUF127, MTX/PLA-PLUF68 foram analisadas em um microscópio eletrônico de varredura (HITACHI, TM 3000). As amostras foram colocadas em uma fita adesiva de dupla face impregnada com carbono sob um disco de alumínio, utilizando uma voltagem de elétrons de 15 kV.
4.5.3 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
fármaco e sistemas MTX/PLA-PLU, através de espectroscopia na região do infravermelho no intervalo de 4000-400 cm-1, em um equipamento da marca PERKIN ELMER e modelo SPECTRUM 65, a fim de verificar a presença de grupos funcionais e possíveis interações entre os componentes das micropartículas. Aproximadamente 1,00 mg de amostra foi misturada a 200 mg de brometo de potássio, com o auxílio de gral e pistilo. Em seguida, a mistura foi submetida à prensa hidráulica para obtenção das pastilhas, que foram armazenadas em dessecador antes da análise (SILVA-JÚNIOR, 2005, 2008; SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
4.5.4 Difração de raios-X (DRX)
As análises foram realizadas para amostras contendo metotrexato não atomizado e atomizado, micropartículas de PLA e PLU sem fármaco, sistemas MTX/PLA, MTX/PLU, blendas PLA-PLU sem fármaco e sistemas MTX/PLA-PLU. O equipamento utilizado foi o difratômetro da marca RIGAKU e modelo MINIFLEX II, tipo D Tex Ultra, com intervalo de leitura de 5º a 45º, em ângulo 2θ, utilizando radiação Cu-Kα (λ =1,54 nm) e filtro de Ni (SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
4.5.5 Análise térmica
As amostras foram analisadas por Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) e Termogravimetria (TG) em um equipamento simultâneo TGA-DSC, TA Instruments, modelo SDT Q600. As curvas de TG-DSC foram obtidas na faixa de temperatura de 25ºC a 500°C, sob atmosfera de nitrogênio (N2) em um fluxo de 100
mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min, utilizando cadinho de platina aberto, contendo de 6 - 12 mg de amostra.
4.6 Estudo do perfil de liberação in vitro dos sistemas microparticulados
O ensaio de liberação in vitro foi realizado em banho termostatizado a 37,0°C ± 0,2°C, utilizando meio tampão fosfato pH 7,4 (KH2PO4 0,05 mol/L).
durante 10 minutos, nos quais o sobrenadante foi removido, filtrado em membrana de acetato de celulose, com diâmetro de poro de 0,45 μm, e analisado em comprimento de onda de 305 nm, em tempos previamente determinados, na região do ultravioleta por espectrofotometria. O tampão foi adicionado aos tubos para a reposição do meio de liberação. Todas as análises foram realizadas em sextuplicata. Uma curva padrão utilizada para o doseamento do fármaco foi construída a partir de soluções entre 1,25 a 20,00 μg/mL em tampão fosfato (0,05 mol/L; pH 7,4). A leitura das amostras foi realizada em 305 nm por espectrofotometria UV-Vis (n = 4).
4.6.1 Avaliação da cinética de liberação das micropartículas de MTX/PLA
Os resultados da cinética de liberação foram obtidos a partir da regressão linear dos perfis de dissolução, os quais foram submetidos a modelos matemáticos de ordem zero, primeira ordem, Higuchi e Korsmeyer-Peppas. Os modelos cinéticos aplicados apresentaram um coeficiente de correlação (R2) e uma constante de velocidade de liberação (K), que foram avaliados para cada sistema estudado (COSTA; LOBO, 2001; COSTA, 2002; MANADAS, PINA; VEIGA, 2002; SIEPMANN; PEPPAS, 2012). Os gráficos obtidos para cada modelo matemático utilizado estão presentes nos Apêndices A e B.
4.7 Avaliação da citotoxicidade
